Introduction
וירוסי enteric אדם הם סוכני סיבה חשובים של מחלות המועברות במי 1-3, אבל הם בדרך כלל נוכחים במספרים נמוכים במים המזוהמים סביבתיים, מה שהופך את איתורם קשה בלי ריכוז. נהלים המשמשים להתרכז וירוסים כוללים בדרך כלל שלב סינון, ואחריו elution מסנן, וריכוז המשני של eluate המסנן. הליך סינון נפוץ מסתמך על שימוש בממברנות טעונות כגון מסנני electropositive (נבדקו לאחרונה 4,5). מסננים אלה מסתמכים על לכידת וירוסים תלויים במים באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות בין משטח המסנן (מטען חשמלי חיובי) וחלקיקי נגיף ממוקדים (מטען שלילי). שני מסננים electropositive כי הם זמינים באופן מסחרי להסתמך על טכנולוגיה זו, מסנני זכוכית / תאית וננו-אלומינה / סיבי זכוכית. עלויות פילטר זכוכית / תאית הן עד 10 פעמים כי ננו-אלומינה / סיבי הזכוכית, המגבילות את השימוש בזכוכית / ceמסנני llulose לניטור וירוס שיגרתי. מחקרים שנעשו לאחרונה הגיעו למסקנה הבדלים הם נומינליים בין שני מסננים אלה בהתאוששות של enteroviruses מ6,7 מים הסביבה, המצדיקים את השימוש בחלופה זולה יותר מסנן. אפשרויות סינון נוספות כגון מסנני אלקטרו וזכוכית צמר נחקרו, לעומת זאת, הם גם דורשים הטיפול המקדים של מים מקור (מסנני אלקטרו) או אינם זמינים באופן מסחרי (מסנני זכוכית צמר). הפיתוח של נהלי ריכוז וירוס בעיקר התמקד אופטימיזציה טכניקות ריכוז עיקריות (מסננים) על מנת לשפר את ההחלמה וירוס ממים. עם זאת, הליכי ריכוז משניים, המקטין את הנפח של eluant בדרך כלל מL 1 למיליליטר כרכים, יכולים גם להיות השפעה משמעותית על החלמה וירוס 8.
ריכוז המשני של וירוסי enteric בדרך כלל מסתמך על סוכן flocculating כגון סוגים מסוימים של תמצית בשר בקר (floccu האורגניlation) או הפתתה חלב דל שומן 9-12 להסיר חלקיקי נגיף ממשטחי מסנן. לאחרונה, עוד הליך ריכוז המשני באמצעות תמצית בשר יחד עם התוספת של celite (חלקיקים קטנים) הראה הבטחה לשחזור אדנווירוס, enterovirus, וnorovirus 8,13,14. עבודות ריכוז Celite תחת עקרונות דומים לזה של שיטת הפתתה האורגנית שבחלקיקי הווירוס לצרף ולמשתחררות מחלקיקים (floc או celite) על ידי שינוי pH של תמיסת ההשעיה. השוואות בין שתי טכניקות ריכוז המשניות אלה הוערכו בהתאוששות של אדנווירוס ממוסמר סוגים (עו"ד) 40 ו -41 8. מחקר זה הגיע למסקנה כי שתי טכניקות הריכוז המשניות היו סטטיסטיים דומות בהתאוששות של אדנו-וירוסים. עם זאת, שיטת הפתתה האורגנית דורשת 30 דקות. דגירה ב- pH 3.5, ואילו טכניקת celite דורשת דגירה קצרה יותר (10 דקות) ב- pH 4.0. Flocculat האורגנייון מחייב גם שימוש בציוד יקר מעבדה (צנטריפוגות) כדי לאסוף חלקיקי floc במהלך ריכוז שלישוני, טכניקת celite בניגוד משתמשת בציוד בסיסי בלבד מעבדה (סינון ואקום) כדי להפריד בין חלקיקי celite מהשעיה.
שילובים מסוימים של מסננים וטכניקות elution המשניות יכולים להשפיע גם על החלמה וירוס. מחקר אחד למסקנה כי שילובים מסוימים של (מסנני electropositive) ראשוניים ומשניות טכניקות ריכוז (celite או הפתתה אורגנית) היו השפעה משמעותית של התאוששות של אדנו-וירוס 13. ממצאים אלה מראים כי אופטימיזציה נדרשת על מנת להתאושש בצורה אופטימלית וירוס יעד ממטריצת מים שניתנו בעת השימוש בטכניקות אלה. אופטימיזציה היא זמן רב, חוקרים רבים תהליך מפרך באופן פעיל להימנע מאז משתנים רבים יוערכו (סוג המסנן / מותג, פתרון elution pH, celite / הפתתה אורגנית).
לשם כך זהTudy, הליך פותח כדי לזהות תנאים אופטימליים לריכוז וירוס ממים באמצעות אדנווירוס אדם ממוסמר זני 40 ו 41. יש להניח, שכן כל סוג וירוס מציג מורפולוגיה קפסיד ייחודית ותשלום קפסיד ספציפי, פרוטוקולי ריכוז עשויים צריכים להיות מותאמים לכל וירוס היעד כדי להשיג התאוששות ויראלי אופטימלית. מחקר זה מספק גישה לעו"ד 40 ו -41 על ידי ריכוז: 1) הערכת החלמה וירוס במים ברז באמצעות תקליטורי electropositive מסנן ואחריו 2) הערכה של שיטת הפתתה אורגנית הוקמה לעומת טכניקת celite כריכוז משנית, ו 3) הערכה מאגרי elution לריכוז שלישוני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת כלי הזכוכית ומרכבי סינון
- אלא אם צוין אחרת, לעקר את כל כלי הזכוכית, המארזים ופתרונות הסינון ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. כדי להבטיח סטריליות, לכסות את כל הפתחים או משטחים חשופים או עם רדיד אלומיניום או נייר מובטח קלטת לפני העיקור.
- להרכיב מנגנון סינון על ידי הצמדת בית מסנן (קוטר 47 מ"מ) לארלנמייר זרוע צד L 1. לאסוף מסננים הנדרשים: מסנני דיסק electropositive / אלקטרו-47 מ"מ קוטר.
- הכן תמצית 1 L של 1.5% בשר בקר (flocculating; מייצר חלקיקי floc כאשר pH של תמיסה הוא הוריד ל -3.5, או שאינו flocculating; שלא מצטבר ב- pH 3.5), עם 0.05 מ 'גליצין, על ידי המסת 15 גרם של תמצית בשר בקר ב 1 ליטר של מים deionized והוספת 3.75 גליצין g.
הערה: תמציות בשר בקר ללא flocculating תדרוש תוספת של celite לפני ריכוז שלישוני. - להוסיף polyph נתרן תוסף elutionosphate לתמצית בשר בקר בריכוז 0.1%.
- הוסף פתרון חומצה הידרוכלורית M 1, טיפה חכמה, לערבוב תמצית בשר בקר, פתרון pH לpH הרצוי. תמצית בשר בקר החיטוי במשך 15-30 דקות ב 121 מעלות צלזיוס.
- למדוד 0.1 גרם של קנס, בינוני, או celite חלקיקים הגדול (לשימוש עם תמצית בשר בקר שאינו flocculating בלבד).
- הכן ואקום / יניקה על ידי הצמדת צינור תואם לבקבוק בצד זרוע Erlenmeyer ולשקע ואקום.
2. הכנת הפתרונות ומניות וירוס
- הכן L 1 של 1 M HCl.
- הכן L 1 של 1 M NaOH.
- הכן פתרון PBS 1x (137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 1.47 מ"מ K 2 PO 4, ו -4.3 מ"מ לאא 2 PO 4).
- התאם את ה- pH של 1x PBS ל 9.0 באמצעות 1 M NaOH.
- הכן ולדלל מניות וירוס עד 10 4 5 -10 מספר הסביר ביותר (MPN) מיליליטר -1 ידי ערבוב 1 מיליליטר של מניית וירוס עם 9 מיליליטר של PBS (pH7), כפי שתואר לעיל 8,13. חנות ב -80 ° C בaliquots 1 מיליליטר.
- לעקר מניות וירוס על ידי סינון מזרק (0.22 מיקרומטר גודל נקבובית) להסרת מזהמים פוטנציאליים.
- Dechlorinated ברז
- מדד 1 ליטר של מים ברז סטרילי באמצעות סטרילי סיים גליל ויוצקים לתוך מבחנה המכילה 2 ליטר בר מערבבים מגנטי.
- להוסיף 0.7 גרם של נתרן תיוסולפט ומערבבים עד שגרגרים לפזר. התאם את ה- pH של מים ברז ל7-7.5 במידת הצורך באמצעות 1 M HCl או 1 פתרון M NaOH.
- ספייק וירוס הפשרה (1 מיליליטר) ולהוסיף נפח שלם של ספייק לי 1 ליטר של מים ברז סטרילי dechlorinated. מערבבים במשך 10 דקות.
- הכן ריק שיטה (מי ברז dechlorinated ללא אדנווירוס) עם כל ניסוי ותהליך באופן זהה למדגם ממוסמר.
3. הכנת מכשירי סינון Millipore
- הסר כיסוי סטרילי מעל בית מסנן. ודאהתאמה נכונה בין בית המסנן קערה עליונה ומסך מסנן נמוך כדי למנוע דליפה מדגם במהלך סינון.
- הסר כיסוי סטרילי מבקבוק 1 ליטר Erlenmeyer. ודא שהפקק של יחידת המסנן מתאים בנוחות בפתח העליון של ארלנמייר, יצירת חותם טוב.
- הסר קערה העליונה של יחידת מסנן מהמסך מסנן נמוך, ולמקם את מסנן electropositive דיסק 47 מ"מ ישר מעל מסך עם מלקחיים סטרילית. צרף קערת בית מסנן למסך תחתון וננעלו במקומו על ידי סיבוב נגד כיוון השעון.
4. סינון מי ברז (ריכוז ראשי)
- מדוד של וירוס 100 מיליליטר זינק ברז מים באמצעות סטרילי סיים גליל.
- יוצקים של וירוס 100 מיליליטר זינק ברז מים לבית מסנן המכיל גם 47 מ"מ זכוכית קפלים / מסנן תאית או מסנן סיבי דיסק ננו-אלומינה / זכוכית.
- מאפשר למים לעבור באיטיות דרך מסנן. החל ואקום עדין להסרת שאריות שנותרו oמים ברז ו ממשטח מסנן.
- אם באמצעות טיפול טריפסין, להוסיף 5 מיליליטר של טריפסין 0.25% לסינון שטח ודגירה של 5 דקות.
- לשטוף טריפסין ממשטח מסנן באמצעות 50 מיליליטר של מים סטריליים deionized.
5. Elution וירוס ממסנן
- הסר בית מסנן מבקבוק 2 ליטר Erlenmeyer, והנח על בקבוק 250 מיליליטר בצד זרוע.
- מדוד של תמצית בשר בקר 100 מיליליטר באמצעות סיים גליל. לאט לאט לשפוך של תמצית בשר בקר 100 מיליליטר לבית מסנן.
- לאפשר לתמצית בשר בקר לשפוך דרך מסנן, לכידת תמצית בשר בקר ב( 250 מיליליטר) בקבוק קטן Erlenmeyer. החל ואקום למשוך באמצעות תמצית בשר בקר שייר ממסנן.
6. ריכוז משני Celite
- צלוחיות העברה המכילות וירוסי eluted לצלחת ומערבבים. להוסיף בר סטרילי מגנטי מערבבים ומניחים על צלחת ומערבבים, ערבוב כדי ליצור מערבולת קלה.
- להוסיף 0.1 גרם של celiteאבקה לתמצית בשר בקר 100 מיליליטר ולאפשר celite להתפזר. הנח בדיקה pH סטרילי לתוך תמצית בשר בקר.
- להוסיף טיפה חכמה 1 M HCl לתמצית בשר בקר להשיג pH 4.0. לאפשר לערבב לאט במשך 10 דקות.
- מניחים 47 מ"מ מראש מסנן על בית מסנן (כפי שתואר לעיל) באמצעות בקבוק 2 ליטר Erlenmeyer.
- יוצקים 100 מיליליטר תמצית בשר בקר / תערובת celite מעל לפני מסנן. לאפשר לתמצית בשר בקר לשפוך דרך. החל ואקום קל למשוך דרך לחלץ בשר שייר ממסנן.
- הנח קליפ צינור מתכת בסוף זרבובית בית המסנן. צרף צינור איסוף פוליפרופילן סטרילי 15 מיליליטר לקליפ צינור מתכת. הנח בית מסנן בחזרה לארלנמייר.
- הוסף 5 מיליליטר של חיץ 1x PBS, pH 9.0 מעל celite נאסף על קדם-מסנן.
- לאפשר PBS לטפטף דרך קדם-מסנן. החל ואקום קל למשוך דרך PBS שייר ל -15 מיליליטר צינור איסוף.
ריכוז משני הפתתה אורגנית 7.
- העבר את הכוסות המכילות את נגיף eluted לצלחת ומערבבים. להוסיף בר ומערבב מגנטי סטרילי של תמצית בשר בקר 100 מיליליטר ומערבבים כדי ליצור מערבולת קלה.
- הנח בדיקה pH סטרילי לתוך תמצית בשר בקר.
- הוסף 1 טיפת M HCl חכמה תמצית בשר בקר ולהתאים את ה- pH 3.5. לערבב למשך 30 דקות.
- יוצקים את eluate לתוך 250 מיליליטר צינורות חרוטי צנטריפוגה ו צנטריפוגות ב 2500 XG במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- יוצקים את טיפול לקיחת supernatant לא לא לשבש את גלולה. Resuspend גלולה ב 5 מיליליטר של 1x PBS, pH 9.
- צנטריפוגה ההשעיה ב 4000 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. יוצקים את supernatant וזורקים את הכדור.
- התאם את ה- pH ל7-7.5, מסנן לעקר באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר והקפאה ב -80 מעלות צלזיוס.
8. ויראלי חומצות גרעין Extraction
- לחלץ חומצות גרעין נגיפיות באמצעות ערכה מסחרית מתאימה בהתאם להוראות יצרן.
- השתמש בצבעי יסוד ובדיקות, כמו גם תערובת תגובה ופרופילי רכיבה תרמית כפי שפורסם 8,13.
הערה: מגבלה משוערת של גילוי עבור assay היא כ 5 יחידות qPCR לכל תגובה. - הוספת מרכיבי תערובות ההגברה PCR בריכוזים כדלקמן: 10 מ"מ טריס (pH 8.3), 50 מ"מ KCl, 4.5 מ"מ MgCl 2, 10 מ"מ dNTPs, 10 מיקרומטר פריימרים ובדיקת 1 מיקרומטר ו 0.5 μl של פולימראז כך שכמויות סופיות של 45 ניתן להוסיף μl למספר מתאים של בארות בצלחת תגובת 96-גם PCR.
- עומס 45 μl של תערובת ההגברה PCR היטב כל אחד המתאים של 96-היטב, תגובה מהירה צלחת PCR.
- הוסף 5 μl של DNA שחולץ מדגם לבארות מתאימות של צלחת PCR.
- כיסוי צלחת עם כיסוי עמיד חותם חום, לסובב את הצלחת לעבור כל טיפות לתחתית בארות צלחת PCR.
- מחזורי הגברה PCR קבעו כfollOWS: 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואחרי 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ו 60 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות.
10. ניתוח נתונים
- ניתוח מדידות בשלושה עותקים של דילולים פי 5 הסידוריים של הדגימות פורש 1: 5 ל -1: טווח 625 דילול כדי לקבוע את המספר הסביר ביותר (MPN) של החלקיקים הנגיפיים, כפי שתואר בעבר 8,13.
- לנתח דילולים פי 5 סידוריים של קוצים ניסיוניים אדנווירוס פורש 1: 5 ל -1: מגוון 15625 דילול כדי לקבוע את המספר הסביר ביותר (MPN) של החלקיקים הנגיפיים.
- שימוש במחשבון EPA MPN (http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html), להתאים את המחשבון לחשבון לסוג של דילול (1: 5 או 1:10), מספר דילולים ביצע, ומספר לשכפל דגימות סדרת דילול ב.
- בצע כניסה 10 טרנספורמציה של הנתונים, ואחריו נרמול ליחידת הנפח (מיליליטר לדוגמא, 1, 100 מיליליטר, וכו '
- להעריך את ההשפעה של המשתנים הניסיוניים השונים (למשל, סוגים שונים celite, טווחי pH, סוגים שונים של מסנן וטכניקות ריכוז משניים שונות) על החלמה עו"ד על ידי ביצוע בדיקות סטטיסטיות פרמטרית או אי-פרמטרית (למשל, מבחן t מזווג, אחד או שתיים -way ANOVA) בהתאם להתפלגות של הנתונים ועיצוב ניסיוני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בחירת Celite
שלושה סוגים שונים של celite נבדקו לפני הבחירה של גרסת הביצועים הטובה ביותר. Celites עם קנס לחלקיקים בגודל בינוני המיוצר על ההחלמה אדנווירוס הגבוהה ביותר. השימוש בcelites הגדול הביא להחלמה נמוכה יותר עבור שניהם AdV40 ו -41 (טווח של 32% -100%) (איור 1). החלמה הממוצעת של אדנווירוס 40 היו 144% ± 52% (קנס), 115% ± 28% (בינוני) ו- 82% ± 53% celites חלקיקים (גדולים) ולAdV41, 132% ± 39% (קנס), 83% ± 25% (בינוני) ו- 50% ± 11% (גדול). כיוון אחד ANOVA הצביע על טכניקת celite מותאמת התאוששה רמות סטטיסטית דומות של AdV40 (P = .7920) ו -41 (P = .1439) לזה של שיטת הפתתה האורגנית, שהתאוששה 75% ± 19% ו -109% ± 16%, בהתאמה . איור 1 מדגים את ההבדלים בין טכניקות ריכוז המשניות ובין סוגי עו"ד.
> הערכת _content "סוג המסנןמאה כרכי מיליליטר של מים ברז-זינק וירוס היו מרוכזים או באמצעות זכוכית / תאית קפלים או מסנן דיסק סיבים / זכוכית ננו-אלומינה ועובדו או באמצעות celite או שיטת הפתתה אורגנית. מסננים היו eluted עם תמציות בשר בקר ב- pH 7.5, 9.0, 9.5, 10, 11 ו -12 כדי לקבוע שיהיה יעיל ביותר במשחררי חלקיקי עו"ד ממסננים. מסנן זכוכית / תאית בשילוב עם תמצית בשר בקר ב- pH 10 וcelite, הפיק את ההחלמה הגבוהה ביותר (על ידי qPCR / MPN) לAdV40 (52% ± 22%) וAdV41 (64% ± 4%) שמוצגים באיורים 2 ו 3. pH תמצית בשר בקר 10 התאושש AdV41 גבוה יותר באופן משמעותי מכל ערכי pH האחרים (טווח ערכים P: .0045-0.041), ואילו AdV40 אחרי דומה, אם כי מגמה חלשה במקצת (טווח ערכים P: .025-.042). מסנן זכוכית / תאית היה גם העריך בשיתוף עם flocculatio האורגנישיטת n. לAdV40, החלמה גבוהה באופן משמעותי היו צברה באמצעות תמצית בשר בקר pH 10 (40% ± 10%) (טווח ערכי P: 0.010-.027), ועבור AdV41, שני pH 9.5 ו -10 ביצועים טובים יותר בכל (טווח ערכי P pH תמצית בשר בקר אחר שנבדק : .023-0.027) (איורים 2 ו -3). בסך הכל, טכניקת celite עם תמצית בשר בקר pH 10 נמצאה עדיף על שיטת הפתתה האורגנית בהשוואה ישירה להתאוששות של שני זני עו"ד.
אופטימיזציות של תוספי תמצית בשר בקר
השיטה מותאמת (זכוכית / מסנן תאית באמצעות תמצית בשר בקר pH 10 בשילוב עם ריכוז המשני celite) הושוותה לשני טיפולים אחרים: 1) תוספת של טריפסין 0.25% ו -2) משלים את תמצית הבשר עם 0.1% polyphosphate נתרן. התוספת של טריפסין לא הופיעה כדי לשפר את ההתאוששות של עו"ד כמו שרק 16% ± 6% ו- 24% ± 14% מAdV40 ו -41 כניסות, בהתאמה נמצאו (< strong> איור 4). תמצית בשר בקר בתוספת 0.1% polyphosphate נתרן הניבה ההחלמה הגבוהה ביותר של AdV40 ו -41 בהשוואה לזה של השיטה מותאמת הקודמת. התאוששות AdV40 הופיעה להגדיל ב -13%, והתאוששות AdV41 צמחה ב -7% בהשוואה לשיטה הקודמת, אבל לא היה מובהק סטטיסטי (ערך P: .146). שימוש בשיעור גבוה יותר של נתרן polyphosphate 1%, 3% ו -5% (נתונים לא מוצגים) נמצא לא יעיל, הדורש כמויות גדולות של חומצה להתאים pH של פתרונות אלה לרמה של 4.0 בריכוז המשני.
איור 1: התאוששות באחוזים של עו"ד-40 ועו"ד-41 מבוססים על טכניקה משנית ריכוז (Celite לעומת floc האורגנית) והסוג של Celite בשימוש. ברים שגיאה מייצגים סטיית תקן (n = 3) 8.
איור 2: התאוששות באחוזים של עו"ד-40 באמצעות שני סוגים של טכניקות ריכוז המשניות (Celite וfloc האורגני) ושני סוגים של מסננים (זכוכית / תאית וננו-אלומינה / זכוכית) ברמות pH השונות של תמצית בשר בקר. ברים שגיאה מייצגים סטיית תקן (n = 3) 13.
איור 3: התאוששות באחוזים של עו"ד-41 באמצעות שני סוגים של טכניקות ריכוז המשניות (Celite וfloc האורגני) ושני סוגים של מסננים (זכוכית / תאית וננו-אלומינה / זכוכית) ברמות pH השונות של תמצית בשר בקר. ברים שגיאה מייצגים סטיית תקן (n = 3) 13.
איור 4: ההשפעה של תוספי elution על התאוששותו של עו"ד 40 ועו"ד 41 מרוכז באמצעות Celite כטכניקת ריכוז משנית וזכוכית / תאית. ברים שגיאה מייצגים סטיית תקן (n = 3) 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מסנני electropositive שימושיים בריכוז וירוסים ממים; עם זאת מסננים אלה יכולים להיות שונים במבנה שלהם ובהרכב אשר בתורו יכול לשנות את האפקטיביות שלהם. ההרכבה בעיה זו, מבני קפסיד וחיובים משתנים בין זני וירוס הדורשים טכניקות ריכוז להיות מותאמות כדי להבטיח התאוששות אופטימלית 15. באמצעות שינויים פשוטים של טכניקות ריכוז הקיימות (למשל, מסנני electropositive, elution תמצית בשר בקר), ריכוז יעיל יותר של וירוסי היעד יכול להיות מושגת 16,17.
מחקר עד כה בדרך כלל מתמקד בהתאוששות של וירוס על ידי שינוי ריכוז עיקרי (מסננים) צעדים, אבל מעט מאוד תשומת לב ניתנה לנהלי ריכוז לאחר שגם יכול להשפיע על התאוששות וירוס 18. הוכח כי טכניקות ריכוז משניים שונות יכולות להשפיע על החלמה וירוס 6,13,19,20. Celiריכוז te הוכח לשחזר רמות דומות של וירוס לזה של שיטות אחרות המשניות ריכוז 8,14 ממגוון רחב של מטריצות, תוך שימוש מהיר ותהליכי עיבוד מדגם פשוט יותר.
בשל משתנה מבני קפסיד חיצוניים, וירוסים מסוימים יכולים להיות לכוד פיזי בתוך מטריצת המסנן 21, המחייבים את ההערכה של תוספים שונים לסינון פרוטוקולי elution. לדוגמא, תוספת של חומרים פעילי שטח, polyphosphate נתרן השתפרה גם התאוששות חיידקי וירוסים בריכוז עיקרי 6,13,22-24. מצד השני, החלמה נמוכה נצפתה הבא תוספת של טריפסין מצביעה על כך שפרוטאזות לא לסייע במחשוף של סיבי החלבון בקפסיד הנגיפי החיצוני. יתר על כן, בעוד שלא 7,25,26 נדירים, ראוי לציין כי חלק מההחלמה שלנו היה בעודף של 100%. כפי שניתן לראות 7,25,26 בעבר, זה כנראה עקב ההצטברויות של מעבדה מוכנה virus משמש כספייק.
הנפח הקטן (100 מיליליטר וירוס ממוסמר מים) גישת ריכוז הציגה יכול להיות דרך מעשית לפיתוח ולייעל את שיטות ריכוז וירוס, בשל הפשטות שלה וצריכה נמוכה של משאבים יחד עם זמן עיבוד מדגם מהיר. שימוש בכמויות קטנות כל כך של מים, הריכוז של מעכבי PCR בתוך המדגם גם ממוזער, אך מומלץ שכל מים מקור להעריך את קיומו של מעכבי PCR לפני ניסויים. מאז אפשרויות רבות של שני מסננים וטכניקות ריכוז משניים קיימות, טכניקות ריכוז נפח קטנות מאפשרות הערכות מהירות של משתנים רבים. יש לקוות כי טכניקות אלה יכולים להתפרס לפני ניסויים סינון בקנה מידה גדולה כדי לסייע בזיהוי שהתנאים אופטימליים לריכוז וירוס היעד למטריצות מים נתון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenovirus 40 stock | ATCC | VR-931 | |
| Adenovirus 41 stock | ATCC | VR-930 | |
| Sodium Thiosulfate | Fluka Chemical Co. | 72051 | |
| Celites #577 | Fluka Chemical Co. | 22142 | |
| NanoCeram 47 mm | Argonide | N/A | |
| 1MDS 47 mm | 3M | 6408502 | |
| AP-20 Prefilter 47 mm | Millipore Corp. | AP2004700 | |
| Glycine | Sigma | 50046-1KG | |
| Sodium Polyphosphate | Acros Organics | 390930010 | |
| Trypsin | Gibco | 25200 | |
| PBS | Sigma | P5368 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A481-212 | |
| BBL Beef Extract | BD Biosciences | 212303 | |
| Difco Beef Extract | BD Biosciences | 211520 | |
| ABI 7900 Real-time PCR system | ABI | N/A | |
| Stainless Steel Filter Housing | Millipore Corp. | XX2004720 | |
| Blood DNA Extraction Kit | Qiagen | 51104 | |
| EPA MPN Calculator | http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html |
References
- Sinclair, R. G., Jones, E. L., Gerba, C. P. Viruses in recreational water-borne disease outbreaks: a review. Journal of Applied Microbiology. 107, 1769-1780 (2009).
- WHO. Guidelines for Safe Recreational Water Environments. , World Health Organization. Geneva. (2003).
- Westrell, T., et al. Norovirus outbreaks linked to oyster consumption in the United Kingdom. Euro Surveillance : Bulletin Europeen Sur les Maladies Transmissibles = European Communicable Disease Bulletin. 15, Norway, France, Sweden and Denmark. (2010).
- Wong, K., Fong, T. T., Bibby, K., Molina, M. Application of enteric viruses for fecal pollution source tracking in environmental waters. Environment International. 45, 151-164 (2012).
- Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. Journal of Applied Microbiology. 115, 1-11 (2013).
- Ikner, L. A., Soto-Beltran, M., Bright, K. R. New method using a positively charged microporous filter and ultrafiltration for concentration of viruses from tap water. Applied and Environmental Microbiology. 77, 3500-3506 (2011).
- Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water. Applied and Environmental Microbiology. 75, 2393-2399 (2009).
- McMinn, B. R., Cashdollar, J. L., Grimm, A. C., Fout, G. S. Evaluation of the celite secondary concentration procedure and an alternate elution buffer for the recovery of enteric adenoviruses 40 and 41. Journal of Virological Methods. 179, 423-428 (2012).
- Katzenelson, E., Fattal, B., Hostovesky, T. Organic flocculation: an efficient second-step concentration method for the detection of viruses in tap water. Applied and Environmental Microbiology. 32, 638-639 (1976).
- Fout, G. S., Schaefer, F. W. 3rd, Messer, J. W., Dahling, D. R. ICR microbial laboratory manual. 178, US Environmental Protection Agency. Washington, D.C. (1996).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153, 79-83 (2008).
- Calgua, B., et al. Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas. Water Research. 47, 2797-2810 (2013).
- McMinn, B. R. Optimization of adenovirus 40 and 41 recovery from tap water using small disk filters. Journal of Virological Methods. 193 (2), 284-290 (2013).
- Brinkman, N. E., Haffler, T. D., Cashdollar, J. L., Rhodes, E. R. Evaluation of methods using celite to concentrate norovirus, adenovirus and enterovirus from wastewater. Journal of Virological Methods. 193, 140-146 (2013).
- Albinsson, B., Kidd, A. H. Adenovirus type 41 lacks an RGD alpha(v)-integrin binding motif on the penton base and undergoes delayed uptake in A549 cells. Virus Research. 64, 125-136 (1999).
- He, C., Lian, J. S., Jiang, Q. Electronic structures and hydrogen bond network of high-density and very high-density amorphous ices. The Journal of Physical Chemistry. B. 109, 19893-19896 (2005).
- Sedmak, G., Bina, D., Macdonald, J., Couillard, L. Nine-year study of the occurrence of culturable viruses in source water for two drinking water treatment plants and the influent and effluent of a Wastewater Treatment Plant in Milwaukee, Wisconsin. 71, 1042-1050 (2005).
- Soto-Beltran, M., Ikner, L. A., Bright, K. R. Effectiveness of poliovirus concentration and recovery from treated wastewater by two electropositive filter methods. Food and Environmental Virology. 5, 91-96 (2013).
- Haramoto, E., Katayama, H. Application of acidic elution to virus concentration using electropositive filters. Food and Environmental Virology. 5, 77-80 (2013).
- Lee, H., et al. Evaluation of electropositive filtration for recovering norovirus in water. Journal of Water and Health. 9, 27-36 (2011).
- Gibbons, C. D., Rodriguez, R. A., Tallon, L., Sobsey, M. D. Evaluation of positively charged alumina nanofibre cartridge filters for the primary concentration of noroviruses, adenoviruses and male-specific coliphages from seawater. Journal of Applied Microbiology. 109, 635-641 (2010).
- Hill, V. R., et al. Development of a rapid method for simultaneous recovery of diverse microbes in drinking water by ultrafiltration with sodium polyphosphate and surfactants. Applied and Environmental Microbiology. 71, 6878-6884 (2005).
- Polaczyk, A. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. Evaluation of 1MDS electropositive microfilters for simultaneous recovery of multiple microbe classes from tap water. Journal of Microbiological Methods. 68, 260-266 (2007).
- Rhodes, E. R., Hamilton, D. W., See, M. J., Wymer, L. Evaluation of hollow-fiber ultrafiltration primary concentration of pathogens and secondary concentration of viruses from water. Journal of Virological Methods. 176, 38-45 (2011).
- Melnick, J. L., et al. Round robin investigation of methods for the recovery of poliovirus from drinking water. Applied and Environmental Microbiology. 47, 144-150 (1984).
- Schwab, K. J., De Leon, R., Sobsey, M. D. Concentration and purification of beef extract mock eluates from water samples for the detection of enteroviruses, hepatitis A virus, and Norwalk virus by reverse transcription-PCR. Applied and Environmental Microbiology. 61, 531-537 (1995).
