Introduction
人間の腸内ウイルスは、水系感染症1-3の重要な原因物質であるが、濃度のないそれらの検出を困難にし、一般的に汚染された環境水中の低い数で存在する。ウイルスを濃縮するために使用される手順は、典型的には濾過フィルター溶出したステップ、およびフィルタ溶出液の二次濃縮を含む。一般的な濾過手順は、そのような電気陽性フィルター（最近4,5にレビュー）のような荷電膜の使用に依存している。これらのフィルタは、フィルタ表面との間の静電相互作用（正に荷電）、および標的ウイルス粒子（負に帯電した）を使用して水に懸濁させたウイルスを捕捉するに依存する。市販されている二つの陽性のフィルタは、この技術は、ガラス/セルロース、ナノアルミナ/ガラス繊維フィルターに依存している。ガラス/セルロースフィルターのコストは、ガラス/ CEの使用を制限するナノアルミナ/ガラス繊維の最大10倍であるルーチンウイルス監視のためのフィルタをllulose。最近の研究では、違いが安く、フィルタの代替の使用を正当化する、周囲の水の6,7からのエンテロウイルスの回復にこれら二つのフィルタの間に、公称である結論に達した。そのような電気陰性及びグラスウールフィルタのような他のフィルタオプションが、それらはいずれかの源水（電気陰性フィルタ）の前処理を必要とするか、または（グラスウールフィルタ）市販されていない、研究されている。ウイルス濃縮手順の開発は、主に水からのウイルス回収率を向上させるために一次濃縮技術（フィルタ）を最適化することに焦点を当ててきた。しかし、ボリュームミリリットルため、典型的には1 Lから溶離剤の量を減少させる二次濃縮手順は、また、ウイルスの回収8に重大な影響を与えることができる。
腸内ウイルスの二次濃度は、典型的には、牛肉エキス、いくつかのタイプとして凝集剤（有機floccuに依存しています設置と）またはスキムミルク凝集9-12フィルタ表面からウイルス粒子を除去する。最近、セライト（微粒子）を添加して結合された牛肉エキスを使用して別の二次濃縮手順は、アデノウイルス、エンテロウイルス、およびノロウイルス8,13,14を回収するための有望性を示している。セライト濃度に付着し、懸濁液のpHを変化させることによって、粒子（フロックまたはセライト）から放出されるウイルス粒子中の有機凝集法と同様の原理で動作します。これら二つの二次濃縮技術との比較は、スパイクアデノウイルス（のAdV）タイプ40及び41 8の回復に評価されてきた。本研究では、2つの二次濃縮技術は、アデノウイルスの回復の統計学的に類似していたと結論付けた。しかし、有機凝集法は、30分を要する。 pH3.5でのインキュベーション、セライト技術はpH4.0で短いインキュベーション（10分）を必要とする。有機flocculatイオンはまた、コントラストセライト技術が懸濁液からセライト粒子を分離するために、基本的な実験装置（減圧濾過）を使用して、第三級濃縮中フロック粒子を収集するために、高価な実験装置（遠心分離機）の使用を必要とする。
フィルタおよび二溶出技術の特定の組み合わせはまた、ウイルス回収率に影響を与えることができる。ある研究では、プライマリ（電気陽性フィルタ）の特定の組み合わせと二次濃縮技術（セライトまたは有機凝集）はアデノウイルス13の回復の重要な影響を与えたと結論付けた。これらの知見は、最適化は、これらの技術を使用する場合に最適に与えられた水マトリックスから標的ウイルスを回収するために必要とされることを示唆している。最適化は、非常に多くの変数が（フィルタータイプ/ブランド、pH溶出液、セライト/有機凝集）が評価されるため、多くの研究者が積極的に避ける時間のかかる、骨の折れるプロセスです。
これはsのtudy、手順は、スパイク、ヒトアデノウイルスを用いて水からのウイルス濃度の最適条件を同定するために開発されたおそらく40,41菌株、各ウイルスタイプはユニークなカプシド形態および特定のキャプシド電荷を表示するので、濃度プロトコルは、すべてのウイルスのために最適化する必要があるかもしれない最適なウイルスの回復を達成するために、標的とする。 ）二次濃縮、および3としての評価1）2、続いて陽性フィルターディスクを用いて水道水にウイルス回収率を評価する）、セライト技術に対する確立された有機凝集法の評価：この研究は、バイのAdV 40,41濃度ためのアプローチを提供三次濃度の溶出バッファー。
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Protocol
ガラス製品とフィルターハウジングの調製
- 特に断りのない限り、15分間121℃で、すべてのガラス製品、フィルターハウジングとソリューションを滅菌する。無菌性を確保するために、滅菌前にアルミ箔またはテープで保護された紙のいずれかですべての開口部または露出した表面を覆う。
- 1Lのサイドアームの三角フラスコに、フィルタハウジング（直径47mm）を取り付けることにより、ろ過装置を組み立てる。 47ミリメートル直径電気陰性/電気陽性ディスクフィルター：必要なフィルターを収集します。
- （凝集pHは3.5で集計しない;フロック溶液のpHを3.5に低下させ、粒子、または非凝集生成）1.5％牛肉エキス1リットル調製牛肉抽出物15gを溶解させて、0.05 Mグリシンを脱イオン水1 L及び3.75グラムのグリシンを添加する。
注：非凝集牛肉抽出物は、前三次濃度にセライトの追加が必要になります。 - 溶出添加剤のナトリウムpolyphを追加0.1％の濃度で、牛肉エキスにosphate。
- 牛肉エキス、所望のpHへのpHの溶液を混合し、滴下し、1 M塩酸溶液を加える。 121℃で15〜30分間のオートクレーブ牛肉エキス。
- 細かい、中、または（非凝集牛肉エキスのみで使用するための）大粒子セライトの0.1グラムを測定します。
- エルレンサイドアームフラスコに、真空排気口に互換性のあるチューブを取り付けることにより、真空/吸引を準備します。
ソリューションおよびウイルスストックの調製
- 1MのHClの1 Lを準備します。
- 1 M NaOHを1リットルを準備します。
- 1×PBS溶液を調製する（137ミリモルのNaCl、2.7のKCl、1.47 mMのK 2 PO 4、及び4.3ミリモルのNaH 2 PO 4）。
- 1 M NaOHを用いて9.0に1×PBSのpHを調整する。
- 準備し、9のPBS（pHのストックウイルスの1ミリリットルを混合することにより、10 4〜10 5最確数（MPN）ミリリットル-1にストックウイルスを希釈7）、以前に8,13に記載のように。 1ミリリットルのアリコートで-80℃で保存。
- 潜在的な汚染物質を除去するために、シリンジフィルター（0.22μmの孔径）によってウイルスストックを滅菌する。
- 脱塩素水道水
- メジャー滅菌を使用して滅菌水道水1Lメスシリンダーおよび磁気撹拌棒を含む2リットルのビーカーに注ぐ。
- チオ硫酸ナトリウムの0.7グラムを加え、顆粒が溶解するまで混合する。必要であれば、1 M HClまたは1MのNaOH溶液を用いて7-7.5に水道水のpHを調整する。
- 融解ウイルススパイク（1ml）および脱塩素滅菌水道水1Lにスパイクの全体積を加える。 10分間混ぜる。
- スパイクされたサンプルと同じ方法で、各実験とプロセスとメソッドの空白（アデノウイルスのない脱塩素水道水）を準備します。
ミリポアフィルタ装置の調製
- フィルターハウジングの上に無菌のカバーを外します。確保濾過中のサンプルの漏れを回避するために、フィルタハウジング上部ボウルと下部フィルタスクリーンとの間の適切なフィット。
- 1Lの三角フラスコから無菌のカバーを外します。フィルタユニットのコルクは、良好なシールを作成、三角フラスコの上部開口にぴったりとフィットしていることを確認してください。
- 下部フィルタ画面からフィルターユニットの上部ボウルを外し、滅菌ピンセットで画面上で真正面から47ミリメートル電気陽性フィルタディスクを置く。下の画面にフィルターハウジングボウルを取り付け、反時計回りにねじることによって所定の位置にロック。
4.水道水濾過（一次濃縮）
- ウイルスの100ミリリットルを測定し、滅菌メスシリンダーを使って水道水をスパイクした。
- ウイルスの100mlを47ミリメートルプリーツガラス/セルロースフィルタ又はナノアルミナ/グラスファイバーディスクフィルターのいずれかを含むフィルタハウジング内に水道水を混ぜ入れる。
- 水がゆっくりとフィルターを通過することを許可する。 O残りの残差を除去するために穏やかな真空を適用しますフィルター表面からfの水道水。
- トリプシン処理を使用する場合は、表面をフィルタリングし、5分間インキュベートし、0.25％トリプシンの5ミリリットルを追加します。
- 滅菌脱イオン水50mlを用いてフィルタ表面からトリプシンを洗う。
フィルターから5.ウイルス溶出
- 2 L三角フラスコからフィルターハウジングを外し、250ミリリットルサイドアームフラスコに配置します。
- メスシリンダーを使用して、牛肉エキスの100ミリリットルを測定します。ゆっくりとフィルターハウジングに牛肉エキスの100ミリリットルを注ぐ。
- 小さな（250ミリリットル）の三角フラスコに牛肉エキスをキャプチャ、牛肉エキスがフィルターを注ぐようにします。フィルタからの残留牛肉エキスを通して引くために真空を適用します。
6.セライト二次濃縮
- 撹拌プレートに溶出したウイルスを含むトランスファーフラスコ。わずかな渦を作成するために混合、撹拌プレート上の滅菌磁気撹拌棒及び場所を追加する。
- セライトの0.1グラムを追加します。牛肉エキスの100ミリリットルに粉末、セライトを分散させることができます。牛肉エキスに無菌のpHプローブを配置します。
- pHが4.0を達成するために牛肉エキスに賢明1MのHClをドロップ追加します。 10分間かけて徐々に混在させることができます。
- 2Lの三角フラスコを用いて、（上述したように）フィルタハウジング上に47ミリメートルプレフィルタを配置する。
- プレフィルター上で100ミリリットル牛肉エキス/セライト混合物を注ぐ。牛肉エキスが通過注ぐできるようにします。フィルターから残留牛肉エキスを通じて引っ張ってわずかな真空を適用します。
- フィルターハウジング注ぎ口の端に金属チューブクリップを配置します。金属管クリップに滅菌15ミリリットルポリプロピレンコレクションチューブを取り付けます。バック三角フラスコにフィルターハウジングを置きます。
- プレフィルター上に回収し、セライト上で1×PBS緩衝液5ml、pHが9.0を加える。
- PBSは、プレフィルターを介してドリップすることを許可する。 15ミリリットルのコレクションチューブに残留PBSを引っ張ってわずかな真空を適用します。
7.オーガニック凝集二次濃縮
- 撹拌プレートに溶出されたウイルスを含有するビーカーに移す。牛肉エキス100mlに無菌の磁気撹拌棒を追加して、わずかに渦を作成するために混ぜる。
- 牛肉エキスに無菌のpHプローブを配置します。
- 1 M HClを牛肉エキスに滴下し、pHを3.5に調整追加します。 30分間混ぜる。
- 4ºCで15分間2500×gで250ミリリットル遠心コニカルチューブと遠心分離機に溶出液を注ぐ。
- 上清をペレットを破壊しないようにしないように注意しながら捨てる。 1×PBS、pHが9 5mlにペレットを再懸濁する。
- 4ºCで10分間4000×gでサスペンションを遠心。上清を捨て、ペレットを捨てる。
- 7-7.5のpHを調整し、フィルターを-80℃で0.22μmのシリンジフィルターを通して滅菌し、凍結。
8.ウイルス核酸抽出
- 製造業者の説明書に従って、適切な市販のキットを用いてウイルス核酸を抽出する。
- 8,13が公開されているプライマーおよびプローブ、ならびに反応混合物及び熱サイクルプロファイルを使用。
注：分析のための検出の推定限界は反応あたり約5 qPCRの単位である。 - 以下のような濃度でPCR増幅混合物の成分を追加します。10 mMトリス（pHは8.3）、50mMのKCl、4.5のMgCl 2、10mMのdNTPを、10μMのプライマーおよび1μMのプローブおよびポリメラーゼ0.5μlの45の最終的なボリュームになるようμlを96ウェルPCR反応プレート内のウェルの適切な数に加えることができる。
- 96ウェル、速い反応PCRプレートの各ウェルに、適切なPCR増幅混合物の45μlの負荷。
- DNAの5μl加えPCRプレートの適切なウェルにサンプルを抽出した。
- 耐熱カバーシールでプレートをカバーし、PCRプレートのウェルの底に任意の液滴を移動させるために、プレートをスピン。
- follとしてPCR増幅サイクルを設定するOWS：10分間95℃、1分15秒、60℃、95℃の40サイクル。
10.データ分析
- 5：1：1に及ぶサンプルの連続5倍希釈の3回の測定を分析625希釈範囲のウイルス粒子の最確数（MPN）を決定するために、以前に8,13に記載のように。
- 5：1：1に及ぶウイルス実験スパイクの連続5倍希釈を分析15625希釈範囲のウイルス粒子の最確数（MPN）を決定するために。
- EPA MPN計算器（http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html）を使用して、希釈液のタイプ（1：5または1:10）を説明するために計算機を調整し、実行さ希釈液の数、および数希釈系列でサンプルを複製する。
- などボリューム（ 例えば 、1ミリリットル、100ミリリットル、の単位に正規化することにより、その後、データの10変換をログ実行
- 異なる実験変数の影響を評価する（ 例えば、別のセライト種類、pH範囲、別のフィルタタイプと異なる二次濃縮技術）（ 例えば 、t検定、1つまたは2つのパラメトリックまたはノンパラメトリック統計検定を行うことでのAdV回収にデータの分布と実験的な設計に依存）ANOVAを分割バグレー。
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Representative Results
セライトの選択
セライトの3つの異なるタイプの前最高のパフォーマンス変異体の選択に試験した。中サイズの粒子に罰金セライトは、最高のアデノウイルスの回収を生産した。大きなセライトの使用はAdV40 41（範囲32％-100％）（ 図1）の両方の回収率の低下をもたらした。アデノウイルス40の平均回収率は115％±28％の（中）と82％±53％で（大）粒子セライトとAdV41ために、132パーセント±39％（ファイン）、83％±144％±52％で（ファイン）であった25％（培地）および50％±11％（大）。一方向ANOVAは、最適化されたセライト技術は、それぞれ19％および109％±16％、±75％、回収した有機凝集法、のそれにAdV40（P = 0.7920）と41（P = 0.1439）の統計的に同じようなレベルを回復示さ。 図1は 、二次濃縮技術の中とのADVタイプの違いを示している。
_content ">フィルタタイプ評価ウイルス - スパイクし、水道水の100ミリリットルの体積は、プリーツガラス/セルロースまたはナノアルミナ/グラスファイバーディスクフィルターのいずれかを使用して濃縮し、セライトまたは有機凝集法のいずれかを用いて処理した。フィルタは、フィルタからのAdV粒子を溶出において最も効果的であるかを決定するためにpHを7.5、9.0、9.5、10、11及び12での牛肉抽出物を用いて溶出した。 pHが10セライトで牛肉エキスと結合したガラス/セルロースフィルターを、 図2に示されているAdV40（52％±22％）とAdV41（64％±4％）のために（定量PCR / MPNによる）最高回収率を生産し3。 AdV40が同様に従っている間、しかし幾分弱い傾向（P値の範囲：0.025から0.042）：牛肉エキスのpHは10は、他のすべてのpH値よりも有意に高いAdV41（0.0045から0.041 P値の範囲）を回収した。ガラス/セルロースフィルターは、有機flocculatioと組み合わせて評価したn個の方法。 AdV40については、有意に高い回収率は、牛肉エキスのpHは10（40％±10％）（P値の範囲：0.010から0.027）を使用して得られた、及びAdV41ために、両方のpHは9.5及び10は、他のすべての牛肉エキスのpHを試験した（P値の範囲を上回っ：0.023から0.027）（ 図2および図3）。全体的に、牛肉エキスのpHが10を用いてセライト技術は、両方のAdV株を回収するための直接的な比較において、有機凝集法よりも優れていることが判明した。
牛肉エキス添加物の最適化
0.1％ポリリン酸ナトリウムと牛肉エキスを補充0.25％トリプシン及び2の1）添加）：最適化された方法（セライト二濃度に結合された牛肉エキスのpHが10を使用して、ガラス/セルロースフィルター）は、2つの他の治療法と比較した。トリプシンの添加は、<（それぞれ回収し、AdV40の14％、41入力±わずか16％±6％、24％などのAdVの回復を改善するようには見えなかった強い>図4）。 0.1％のポリリン酸ナトリウムを補充した牛肉エキスは、前に最適化する方法に比べてAdV40及び41の最高回収率が得られた。 AdV40の回復は13％増加すると登場し、AdV41の回復は、以前の方法よりも7％増加したが、いずれも統計学的に有意（P値 ：0.146）であった。ポリリン酸ナトリウムのより高い割合が1％、3％、5％（データは示していない）の使用は、二次濃縮中4.0にこれらの溶液のpHを調整するために酸を大量に必要とし、効果がないことが判明した。
図1のAdV-40とのAdV-41の回収率は、二次濃縮法（有機フロック対セライト）に基づいて、セライトのタイプが使用。エラーバーは標準偏差を示す（n = 3）で8。
図2：牛肉エキス、様々なpHレベルでの二次濃縮法（セライトおよび有機フロック）の2つのタイプとの2種類のフィルタ（ガラス/セルロース·ナノアルミナ/ガラス）を使用してのAdV-40の回収率。エラーバーは標準偏差を示す（n = 3）を13。
図3：牛肉エキス、様々なpHレベルでの二次濃縮法（セライトおよび有機フロック）の2つのタイプとの2種類のフィルタ（ガラス/セルロース·ナノアルミナ/ガラス）を使用してのAdV-41の回収率。エラーバーは標準偏差を示す（n = 3）を13。
図4：のAdV 40とADV 41の回復に溶出添加剤の効果は、二次濃縮技術及びガラス/セルロースなどのセライトを用いて濃縮した。エラーバーは標準偏差を示す（n = 3）を13。
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Discussion
陽性のフィルタは、水からのウイルスを濃縮するのに有用である。しかし、これらのフィルタは、順番にそれらの有効性を変えることができ、その構造と組成が異なることができる。この問題を配合、カプシド構造と料金は、最適な回復15を確保するように調整することが濃縮技術を必要とするウイルス株の間で変動する。既存の濃縮技術（ 例えば、電気陽性フィルタ、牛肉エキス溶出）の簡単な変更を介して、標的ウイルスのより効果的な濃度は、16,17を達成することができる。
これまでの研究は、通常、プライマリ濃度（フィルター）の手順を変更することにより、ウイルスの回収に焦点を当ててきたが、少し注意がまたウイルスの回収18に影響を与える可能性があり、その後の濃度の手続きに与えられている。これは、異なる二次濃縮技術は、ウイルス回収6,13,19,20に影響を与えることができることが実証されている。チェリ迅速かつ簡単なサンプル処理手順を使用しながらテ濃度は、マトリックスの種々の他の二次濃縮方法8,14のものとウイルスの同様のレベルを回復することが示されている。
により変動する外側のカプシド構造に、ある種のウイルスは、物理的に溶出プロトコルをフィルタリングするために種々の添加剤の評価を必要と、フィルタマトリックス21内に捕捉さになることができます。例えば、界面活性剤の添加は、ポリリン酸ナトリウム、一次濃度6,13,22-24中の両方の細菌やウイルスの回復を改善した。一方、トリプシンの添加後に観察された低い回収率は、プロテアーゼは、外側ウイルスキャプシド上のタンパク質繊維の切断を補助しないことを示している。 7,25,26珍しくないしながらさらに、それは我々の回収の一部が100％を超えていたことは注目に値する。以前7,25,26に示すように、これは、研究室の凝集に起因する可能性が高いviの調製コーラスは、スパイクとして使用。
濃度のアプローチが提示少量の（100ミリリットルウイルス水スパイク）を開発し、その単純かつ迅速な試料処理時間とともにリソースの低消費に、ウイルス濃縮方法を最適化するための実用的な方法であることができる。水のような小さなボリュームを使用して、サンプル内のPCR阻害剤の濃度も最小化され、しかし、それは、各ソース水は実験前のPCR阻害剤の存在について評価することをお勧めします。フィルタおよび二次濃縮技術の両方の多数の選択肢が存在するので、小さな体積濃度技術は、多数の変数の迅速な評価を可能にする。それは、これらの技術は与えられた水行列あたりの標的ウイルス濃度に最適でどのような条件の識別を支援するために大規模なろ過実験の前に展開することができることが期待される。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenovirus 40 stock | ATCC | VR-931 | |
| Adenovirus 41 stock | ATCC | VR-930 | |
| Sodium Thiosulfate | Fluka Chemical Co. | 72051 | |
| Celites #577 | Fluka Chemical Co. | 22142 | |
| NanoCeram 47 mm | Argonide | N/A | |
| 1MDS 47 mm | 3M | 6408502 | |
| AP-20 Prefilter 47 mm | Millipore Corp. | AP2004700 | |
| Glycine | Sigma | 50046-1KG | |
| Sodium Polyphosphate | Acros Organics | 390930010 | |
| Trypsin | Gibco | 25200 | |
| PBS | Sigma | P5368 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A481-212 | |
| BBL Beef Extract | BD Biosciences | 212303 | |
| Difco Beef Extract | BD Biosciences | 211520 | |
| ABI 7900 Real-time PCR system | ABI | N/A | |
| Stainless Steel Filter Housing | Millipore Corp. | XX2004720 | |
| Blood DNA Extraction Kit | Qiagen | 51104 | |
| EPA MPN Calculator | http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html |
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