Introduction
Virus enterici umani sono importanti agenti eziologici di malattie trasmesse dall'acqua 1-3, ma sono generalmente presenti in numero ridotto nelle acque ambientali contaminate, rendendo la loro individuazione difficile senza concentrazione. Le procedure utilizzate per concentrare virus includono tipicamente una fase di filtrazione, seguita da filtro eluizione, e concentrazione secondaria dell'eluato filtro. Una procedura di filtrazione comune si basa sull'uso di membrane cariche quali filtri elettropositivi (recentemente recensito in 4,5). Questi filtri si basano sulla cattura virus sospese in acqua utilizzando interazioni elettrostatiche tra la superficie del filtro (carica positiva) e particelle di virus mirati (carica negativa). Due filtri elettropositivi che sono commercialmente disponibili si basano su questa tecnologia, i filtri di vetro / cellulosa e nano-allumina / fibra di vetro. I costi filtro di vetro / cellulosa sono fino a 10 volte quella del nano-allumina / fibra di vetro, che limitano l'uso del vetro / ceFiltri llulose per il monitoraggio virus di routine. Recenti studi hanno concluso differenze sono nominali tra questi due filtri in recupero di enterovirus da 6,7 all'acqua ambiente, giustificare l'uso di una più economica alternativa filtro. Altre opzioni di filtro come filtri elettronegativi e lana di vetro sono stati studiati, tuttavia, richiedono sia il pretrattamento dell'acqua di fonte (filtri elettronegativi) o non sono disponibili in commercio (filtri di lana di vetro). Lo sviluppo di procedure di concentrazione del virus si è prevalentemente concentrata sull'ottimizzazione tecniche di concentrazione primari (filtri) al fine di migliorare i recuperi virus dall'acqua. Tuttavia, le procedure di concentrazione secondarie, che riducono il volume di eluente tipicamente da 1 L a millilitro volumi, possono anche avere un impatto significativo sui recuperi virus 8.
Concentrazione media di virus enterici basa tipicamente su un agente flocculante come alcuni tipi di estratto di carne (floccu organicamento) o il latte scremato flocculazione 9-12 per rimuovere particelle di virus da superfici filtranti. Recentemente, un'altra procedura concentrazione secondaria con estratto di carne insieme con l'aggiunta di celite (particelle fini) ha mostrato risultati promettenti per il recupero adenovirus, enterovirus e norovirus 8,13,14. Opere concentrazione Celite sotto principi simili a quella del metodo di flocculazione organica che particelle virali connettono e vengono rilasciate da particelle (floc o celite) alterando il pH della soluzione di sospensione. Il confronto tra queste due tecniche di concentrazione secondari sono stati valutati nel recupero di adenovirus spillo (ADV) i tipi 40 e 41 8. Questo studio ha concluso che le due tecniche di concentrazione secondari erano statisticamente simili nel recupero di adenovirus. Tuttavia, il metodo richiede una flocculazione organica 30 min. incubazione a pH 3,5, mentre la tecnica celite richiede una breve incubazione (10 min) a pH 4.0. Il flocculat organicaion richiede anche l'uso di costose attrezzature di laboratorio (centrifughe) per raccogliere particelle Floc momento della concentrazione terziaria, la tecnica celite in contrasto utilizza solo attrezzature di laboratorio di base (filtrazione sotto vuoto) per separare particelle Celite da sospensione.
Alcune combinazioni di filtri e tecniche di eluizione secondaria può colpire anche i recuperi di virus. Uno studio ha concluso che alcune combinazioni di primari (filtri elettropositivi) e tecniche di concentrazione secondari (Celite o flocculazione organica) hanno avuto un impatto significativo recupero di adenovirus 13. Questi risultati suggeriscono che l'ottimizzazione è necessaria al fine di recuperare in modo ottimale virus bersaglio da una data matrice acqua quando utilizzando queste tecniche. L'ottimizzazione è un dispendio di tempo, di processo arduo molti ricercatori evitare attivamente poiché numerose variabili saranno valutati (tipo di filtro / marca, soluzione di eluizione pH, celite / flocculazione organica).
Per questo study, una procedura è stata sviluppata per individuare le condizioni ottimali per la concentrazione del virus da acqua utilizzando spillo adenovirus umano ceppi 40 e 41. Presumibilmente, dal momento che ogni tipo di virus visualizza una morfologia capside unica e carica capside specifico, possono avere bisogno di essere ottimizzato per ogni virus protocolli di concentrazione obiettivo per raggiungere il recupero virale ottimale. Questo studio fornisce un approccio per AdV 40 e 41 concentrazione mediante: 1) valutare recuperi virus in acqua di rubinetto utilizzando dischi filtranti elettropositivi seguiti da 2) valutazione di un metodo di flocculazione organica stabilita rispetto alla tecnica celite come concentrazione secondaria, e 3) valutazione buffer di eluizione per la concentrazione terziaria.
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Protocol
1. Preparazione di cristalleria e Filter Contenitori
- Se non diversamente specificato, sterilizzare tutti i bicchieri, contenitori e soluzioni di filtro a 121 ° C per 15 minuti. Per garantire la sterilità, coprire tutte le aperture o le superfici esposte sia con fogli di alluminio o di carta nastro fissato prima della sterilizzazione.
- Montare apparato di filtrazione allegando alloggiamento del filtro (diametro di 47 mm) a 1 L braccio laterale beuta. Raccogliere filtri necessari: 47 mm di diametro filtri a disco elettropositivi / electronegative.
- Preparare 1 L di estratto di carne bovina 1,5% (flocculanti; produce particelle Floc quando pH della soluzione si abbassa a 3,5, o non flocculante, che non fa aggregato a pH 3,5), con 0,05 M glicina, sciogliendo 15 g di estratto di carne bovina in 1 L di acqua deionizzata e l'aggiunta di 3,75 g di glicina.
NOTA: estratti di carne non floccaggio richiedono l'aggiunta di celite prima concentrazione terziaria. - Aggiungi eluizione polyph additivo sodioosphate di estratto di carne bovina ad una concentrazione di 0,1%.
- Aggiungere 1 soluzione di acido cloridrico M, gocciolamento, di miscelazione estratto di carne, pH della soluzione a pH desiderato. Estratto di carne bovina Autoclave per 15-30 minuti a 121 ° C.
- Misura 0,1 g di fine, media, o grande celite particelle (per l'utilizzo con estratto di carne non-flocculanti solo).
- Preparare vuoto / aspirazione collegando tubazioni compatibile beuta braccio laterale e alla presa di vuoto.
2. preparazione di soluzioni e virus Stock
- Preparare 1 L di 1 M HCl.
- Preparare 1 L di 1 M NaOH.
- Preparare la soluzione PBS 1x (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.47 mm K 2 PO 4 e 4,3 mm NaH 2 PO 4).
- Regolare il pH di 1x PBS a 9,0 con 1 M NaOH.
- Preparare e diluire magazzino virus per 10 4 -10 5 numero più probabile (MPN) ml -1 mescolando 1 ml di virus con 9 ml di PBS (pH7), come precedentemente descritto 8,13. Conservare a -80 ° C in aliquote di 1 ml.
- Sterilizzare virus magazzino filtrando siringa (0,22 micron dimensione dei pori) per rimuovere potenziali contaminanti.
- Declorata Tap Water
- Misura 1 L di acqua di rubinetto sterile utilizzando una sterile cilindro graduato e versare in un bicchiere contenente 2 L ancoretta magnetica.
- Aggiungere 0,7 g di tiosolfato di sodio e mescolare fino a granuli si dissolvono. Regolare il pH dell'acqua di rubinetto a 7-7,5 se necessario con 1 M HCl o soluzione 1 M NaOH.
- Spike virus Thaw (1 ml) e aggiungere intero volume di picco per 1 L di acqua di rubinetto sterili senza cloro. Mescolare per 10 min.
- Preparare un metodo vuoto (acqua di rubinetto declorurata senza adenovirus) con ogni esperimento e processo nello stesso modo come il campione spillo.
3. Preparazione di Millipore Filtro Apparatus
- Rimuovere copertura sterile su filtro. Garantirela misura adeguata tra il corpo del filtro ciotola superiore e schermo del filtro inferiore per evitare perdite campione durante la filtrazione.
- Rimuovere copertura sterile dal 1 boccetta L Erlenmeyer. Assicurarsi che il tappo del gruppo filtrante adatta comodamente in cima apertura beuta, creando una buona tenuta.
- Rimuovere ciotola superiore dell'unità filtrante dallo schermo del filtro inferiore e portare 47 millimetri disco filtro elettropositivo esattamente sopra lo schermo con una pinza sterile. Attaccare il filtro ciotola alloggi a schermo inferiore e bloccare in posizione ruotando in senso antiorario.
4. Toccare filtrazione dell'acqua (concentrazione primaria)
- Misurare 100 ml di virus a spillo l'acqua del rubinetto con sterile cilindro graduato.
- Versare 100 ml di virus spillo l'acqua del rubinetto in scatola del filtro contenente sia un / filtri di cellulosa 47 millimetri di vetro pieghettata o un filtro rigido in fibra di nano-allumina / vetro.
- Consentire all'acqua di passare lentamente attraverso il filtro. Applicare delicato vuoto per rimuovere residui residui oacqua di rubinetto f dalla superficie del filtro.
- Se si utilizza il trattamento tripsina, aggiungere 5 ml di 0,25% tripsina per filtrare la superficie e incubare per 5 min.
- Lavare tripsina dalla superficie del filtro con 50 ml di acqua deionizzata sterile.
5. Virus eluizione da filtro
- Smontare la scatola del filtro da 2 fiasco L Erlenmeyer, e posizionarlo sul pallone da 250 ml braccio laterale.
- Misurare 100 ml di estratto di carne utilizzando cilindro graduato. Versare lentamente 100 ml di estratto di carne in scatola del filtro.
- Lasciare estratto di carne bovina per versare attraverso il filtro, catturando estratto di carne in un piccolo (250 ml) beuta. Applicare il vuoto per tirare attraverso estratto di carne residuo dal filtro.
6. Celite Concentrazione secondaria
- Flaconi di trasferimento contengono i virus eluiti ad una piastra scalpore. Aggiungere sterile ancoretta magnetica e posto sul piatto mescolare, mescolare per creare una leggera vortice.
- Aggiungere 0,1 g di celitepolvere 100 ml di estratto di carne e consentire celite per disperdere. Posizionare la sonda pH sterile in estratto di carne.
- Aggiungere goccia a goccia 1 M HCl per estratto di carne per raggiungere pH 4,0. Lasciare miscelare lentamente per 10 min.
- Mettere 47 millimetri di pre-filtro sul corpo del filtro (come descritto in precedenza) con un pallone 2 L Erlenmeyer.
- Versare 100 ml di estratto di manzo / miscela celite over pre-filtro. Lasciare estratto di carne bovina per versare attraverso. Applicare leggero vuoto per tirare attraverso estratto di carne residuo dal filtro.
- Posizionare la clip tubo metallico sulla fine del becco filtro. Attaccare sterile 15 ml tubo di raccolta in polipropilene a clip di tubo di metallo. Posizionare la scatola del filtro di nuovo in beuta.
- Aggiungere 5 ml di tampone 1x PBS, pH 9.0 su celite raccolte sul pre-filtro.
- Lasciare PBS goccioli attraverso pre-filtro. Applicare leggero vuoto per tirare attraverso residuo PBS in 15 ml tubo di raccolta.
7. Flocculazione Organic Concentrazione secondaria
- Trasferire i bicchieri contenenti il virus eluito a un piatto mescolare. Aggiungere sterile ancoretta magnetica a 100 ml di estratto di carne e mescolare per creare una leggera vortice.
- Posizionare la sonda pH sterile in estratto di carne.
- Aggiungere 1 M HCl goccia saggio estratto di carne e aggiustare il pH a 3,5. Mescolare per 30 min.
- Versare l'eluato in 250 ml provette coniche e centrifugare a 2500 xg per 15 minuti a 4 ° C.
- Eliminare il surnatante facendo attenzione a non a non disturbare il pellet. Risospendere il pellet in 5 ml di PBS 1x, pH 9.
- Centrifugare la sospensione a 4.000 xg per 10 minuti a 4 ° C. Eliminare il surnatante e scartare il pellet.
- Regolare il pH a 7-7.5, filtrare sterilizzare attraverso 0,22 micron filtro siringa e congelamento a -80 ° C.
8. Viral Nucleic Acid Extraction
- Estrarre gli acidi nucleici virali utilizzando un kit commerciale adeguata secondo le istruzioni del produttore.
- Utilizzare primer e sonde, nonché miscela di reazione e profili cicli termici come pubblicato 8,13.
NOTA: limite stimato di rilevamento per il dosaggio è di circa 5 unità qPCR per reazione. - Aggiungere componenti di miscele di amplificazione PCR a concentrazioni come segue: Tris 10 mM (pH 8,3), 50 mM KCl, 4,5 mM MgCl 2, 10 mM dNTPs, 10 mM primer e della sonda 1 mM e 0,5 ml di polimerasi in modo che i volumi finali di 45 microlitri può essere aggiunto al numero appropriato di pozzetti in una piastra di reazione PCR da 96 pozzetti.
- Carico 45 ml di miscela di amplificazione PCR per ciascun pozzetto appropriata di un pozzo 96, reazione veloce PCR piastra.
- Aggiungere 5 ml di DNA estratto campione adeguati pozzetti della piastra PCR.
- Coprire piastra con calore guarnizione del coperchio resistente, girare la piastra per spostare eventuali gocce di fondo dei pozzetti della piastra PCR.
- Impostare PCR cicli di amplificazione come follOWS: 95 ° C per 10 minuti, seguiti da 40 cicli di 95 ° C per 15 sec e 60 ° C per 1 min.
10. Analisi dei dati
- Analizzare misurazioni in triplicato delle diluizioni seriali 5-fold dei campioni abbracciano 1: 5 a 1: 625 gamma di diluizione per determinare il numero più probabile (MPN) delle particelle virali, come precedentemente descritto 8,13.
- Analizzare diluizioni seriali 5-fold di picchi sperimentali adenovirus abbracciano 1: 5 a 1: 15.625 serie di diluizione per determinare il numero più probabile (MPN) delle particelle virali.
- Utilizzando la calcolatrice EPA MPN (http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html), regolare la calcolatrice per spiegare il tipo di diluizione (1: 5 o 1:10), il numero di diluizioni effettuate, e il numero di replicare campioni in serie di diluizioni.
- Eseguire log 10 trasformazione dei dati, seguiti normalizzando ad una unità di volume (ad esempio, 1 ml, 100 ml, etc.
- Valutare l'effetto delle diverse variabili sperimentali (ad esempio, diversi tipi Celite, intervalli di pH, diversi tipi di filtro e diverse tecniche di concentrazione secondari) sui recuperi Adv eseguendo test statistici parametrici e non parametrici (es paired t-test, uno o due -way ANOVA) a seconda della distribuzione dei dati e il disegno sperimentale.
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Representative Results
Selezione Celite
Tre diversi tipi di celite stati testati prima della selezione della variante migliore performante. Celites con ammenda di particelle di medie dimensioni realizzati i più alti recuperi adenovirus. L'uso di grandi celites comportato recuperi inferiori sia AdV40 e 41 (range 32% -100%) (Figura 1). Recuperi medi di adenovirus 40 erano 144% ± 52% (fine), 115% ± 28% (medio) e il 82% ± 53% celites (grande) di particelle e per AdV41, 132% ± 39% (fine), 83% ± 25% (medio) e 50% ± 11% (grande). Un ANOVA indicata la tecnica celite ottimizzato recuperato livelli statisticamente simili di AdV40 (P = 0,7920) e 41 (P = 0,1439) a quella del metodo di flocculazione organica, che recupera il 75% ± 19% e 109% ± 16%, rispettivamente, . La Figura 1 illustra le differenze tra le tecniche di concentrazione secondarie e tra tipi Adv.
_content "> valutazione Tipo di filtroUn centinaio di volumi millilitro di acqua di rubinetto virus-spillo erano concentrate utilizzando un pieghe di vetro / cellulosa o di nano-allumina / vetro filtro disco fibre e sono stati elaborati utilizzando il Celite o metodo di flocculazione biologico. I filtri sono stati eluiti con estratti di carne a pH 7,5, 9,0, 9,5, 10, 11 e 12 per determinare quale sarebbe più efficace in eluendo particelle adv dai filtri. Il filtro di vetro / cellulosa accoppiato con estratto di carne a pH 10 e celite, prodotto i recuperi elevati (da qPCR / MPN) per AdV40 (52% ± 22%) e AdV41 (64% ± 4%), che sono mostrati nelle figure 2 e 3. Manzo estratto pH 10 recuperato AdV41 significativamente più elevati di tutti gli altri valori di pH (range valore P: ,0045-0,041), mentre AdV40 seguito un simile, anche se di tendenza po 'più debole (campo di valori P: 0,025-0,042). Un filtro di vetro / cellulosa è stata valutata anche in combinazione con il flocculatio organicaMetodo n. Per AdV40, recuperi significativamente più elevati sono stati ottenuti utilizzando estratto di carne pH 10 (40% ± 10%) (campo di valori P: 0,010-0,027), e per AdV41, sia pH 9,5 e 10 hanno superato tutti gli altri estratto di carne pH testato (campo di valori P : 0,023-0,027) (figure 2 e 3). Nel complesso, la tecnica celite con estratto di carne pH 10 è risultata essere superiore al metodo flocculazione organica confronti diretti per il recupero di entrambi i ceppi Adv.
Ottimizzazioni degli additivi estratto di carne
Il metodo ottimizzato (vetro / filtro di cellulosa con estratto di carne pH 10 accoppiato con celite concentrazione secondaria) è stato confrontato con altri due trattamenti: 1) aggiunta di 0,25% tripsina e 2) che completa l'estratto di carne con 0,1% sodio polifosfato. L'aggiunta di tripsina non sembra migliorare il recupero di AdV come solo il 16% ± 6% e 24% ± 14% di AdV40 e 41 ingressi, rispettivamente, sono stati recuperati (< strong> Figura 4). Estratto di carne integrato con 0,1% di sodio polifosfato prodotto massimi recuperi di AdV40 e 41 rispetto a quella del precedente metodo ottimizzato. Recupero AdV40 sembra aumentare del 13%, e il recupero AdV41 aumentato del 7% rispetto al metodo precedente, ma non era statisticamente significativa (valore di P: 0.146). Uso di percentuali elevate di polifosfato di sodio 1%, 3% e 5% (dati non mostrati) è risultata inefficace, richiedono grandi quantità di acido per regolare il pH di queste soluzioni a 4,0 durante la concentrazione secondaria.
Figura 1: Percentuale di recupero AdV-40 e adv-41 basato su tecnica di concentrazione secondaria (Celite rispetto floc biologici) e il tipo di Celite utilizzato. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard (n = 3) 8.
Figura 2: recupero Percentuale di AdV-40 utilizzando due tipi di tecniche di concentrazione secondari (Celite e Floc organica) e due tipi di filtri (vetro / cellulosa e Nano-allumina / vetro) a diversi livelli di pH di estratto di carne. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard (n = 3) 13.
Figura 3: recupero Percentuale di AdV-41 utilizzando due tipi di tecniche di concentrazione secondari (Celite e Floc organica) e due tipi di filtri (vetro / cellulosa e Nano-allumina / vetro) a diversi livelli di pH di estratto di carne. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard (n = 3) 13.
Figura 4: L'effetto degli additivi eluizione sul recupero della AdV 40 e 41 AdV concentrata usando Celite come tecnica di concentrazione secondaria e vetro / cellulosa. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard (n = 3) 13.
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Discussion
Filtri electropositive sono utili nella concentrazione virus dall'acqua; Tuttavia questi filtri possono differire nella loro struttura e composizione che potrebbe a sua volta alterare la loro efficacia. Ad aggravare questo problema, le strutture e le spese del capside variano tra i ceppi virali che richiedono tecniche di concentrazione essere adattati per garantire il recupero ottimale 15. Attraverso semplici modifiche delle tecniche di concentrazione esistenti (ad esempio, filtri elettropositivi, manzo estratto eluizione), la concentrazione più efficace di virus di destinazione possono essere raggiunti 16,17.
La ricerca fino ad oggi si è tipicamente concentrata sul recupero di virus modificando concentrazione primaria (filtri) passi, ma poca attenzione è stata data alle procedure successiva concentrazione che potrebbe anche influenzare il recupero virus 18. È stato dimostrato che diverse tecniche di concentrazione secondarie possono influenzare recuperi virus 6,13,19,20. Celiconcentrazione te è stato dimostrato per recuperare livelli simili di virus a quella di altri metodi di concentrazione secondari 8,14 da una varietà di matrici, utilizzando semplici procedure di elaborazione del campione più veloce e.
A causa variando strutture capside esterno, alcuni virus possono diventare fisicamente intrappolati all'interno della matrice del filtro 21, che richiede la valutazione di diversi additivi per filtrare protocolli di eluizione. Ad esempio, l'aggiunta di tensioattivo, polifosfato di sodio migliorato sia il recupero batteriche e virali durante la concentrazione primaria 6,13,22-24. D'altra parte, i recuperi bassi osservati dopo aggiunta di tripsina indicano che le proteasi non aiuto nella scissione delle fibre proteiche sul capside virale esterno. Inoltre, pur non infrequente 7,25,26, è da notare che alcuni dei nostri recuperi erano superiore al 100%. Come precedentemente indicato 7,25,26, questo è probabilmente dovuto al aggregazione del laboratorio preparati virus usato come picco.
Il piccolo volume (100 ml virus spillo acqua) approccio concentrazione presentato può essere un modo pratico per sviluppare e ottimizzare i metodi di concentrazione di virus, grazie alla sua semplicità e basso consumo di risorse insieme con il tempo di elaborazione del campione veloce. L'uso di tali piccoli volumi di acqua, la concentrazione di inibitori della PCR nel campione è anche minimizzato, ma si raccomanda che ciascuna acqua fonte valutato per la presenza di inibitori della PCR prima sperimentazione. Poiché esistono numerose scelte di entrambi i filtri e le tecniche di concentrazione secondarie, tecniche di concentrazione del volume piccoli consentono rapide valutazioni di numerose variabili. Si spera che queste tecniche possono essere utilizzati prima che la sperimentazione su larga scala di filtrazione per aiutare a identificare quali condizioni sono ottimali per la concentrazione di virus bersaglio per date matrici acqua.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenovirus 40 stock | ATCC | VR-931 | |
| Adenovirus 41 stock | ATCC | VR-930 | |
| Sodium Thiosulfate | Fluka Chemical Co. | 72051 | |
| Celites #577 | Fluka Chemical Co. | 22142 | |
| NanoCeram 47 mm | Argonide | N/A | |
| 1MDS 47 mm | 3M | 6408502 | |
| AP-20 Prefilter 47 mm | Millipore Corp. | AP2004700 | |
| Glycine | Sigma | 50046-1KG | |
| Sodium Polyphosphate | Acros Organics | 390930010 | |
| Trypsin | Gibco | 25200 | |
| PBS | Sigma | P5368 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A481-212 | |
| BBL Beef Extract | BD Biosciences | 212303 | |
| Difco Beef Extract | BD Biosciences | 211520 | |
| ABI 7900 Real-time PCR system | ABI | N/A | |
| Stainless Steel Filter Housing | Millipore Corp. | XX2004720 | |
| Blood DNA Extraction Kit | Qiagen | 51104 | |
| EPA MPN Calculator | http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html |
References
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