जल से वायरल एकाग्रता के लिए एक छोटी मात्रा प्रक्रिया

Introduction

मानव आंतों का वायरस जलजनित रोगों ^1-3 की महत्वपूर्ण प्रेरणा का एजेंट कर रहे हैं, लेकिन एकाग्रता के बिना उनके पता लगाने के लिए मुश्किल बना रही है, आम तौर पर दूषित पर्यावरण पानी में कम संख्या में मौजूद हैं। वायरस ध्यान केंद्रित करने के लिए प्रयोग किया जाता प्रक्रियाओं आमतौर पर फिल्टर eluate की एक निस्पंदन फिल्टर क्षालन द्वारा पीछा कदम है, और माध्यमिक एकाग्रता शामिल हैं। एक आम निस्पंदन प्रक्रिया (हाल ही में ^4,5 में समीक्षा) इस तरह के विद्युत धन फिल्टर के रूप में वसूल की झिल्ली के उपयोग पर निर्भर करता है। ये फिल्टर फिल्टर सतह (सकारात्मक आरोप लगाया) और लक्षित वायरस कणों के बीच बातचीत electrostatic का उपयोग कर पानी में निलंबित कर दिया वायरस पर कब्जा करने पर भरोसा करते हैं (नकारात्मक आरोप लगाया)। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं जो दो विद्युत धन फिल्टर इस तकनीक पर भरोसा करते हैं, ग्लास / सेलूलोज और नैनो एल्यूमिना / ग्लास फाइबर फिल्टर। ग्लास / सेल्यूलोज फिल्टर लागत ग्लास / सीई के उपयोग की सीमा जो अप करने के लिए 10 बार नैनो एल्यूमिना / ग्लास फाइबर की है कि कर रहे हैं,दिनचर्या वायरस की निगरानी के लिए llulose फिल्टर। हाल के अध्ययनों से एक सस्ता फिल्टर विकल्प के उपयोग को न्यायोचित ठहरा, मतभेद परिवेश पानी ^6,7 से enteroviruses की वसूली में इन दो फिल्टर के बीच नाममात्र हैं यह निष्कर्ष निकाला है। ऐसे ऋणात्मक और कांच ऊन फिल्टर के रूप में अन्य फिल्टर विकल्पों हालांकि, वे या तो स्रोत पानी (ऋणात्मक फिल्टर) के pretreatment की आवश्यकता होती है या (कांच ऊन फिल्टर) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं, अध्ययन किया गया है। वायरस एकाग्रता प्रक्रियाओं के विकास के ज्यादातर पानी से वायरस वसूलियां में सुधार करने के क्रम में प्राथमिक एकाग्रता तकनीक (फिल्टर) के अनुकूलन पर ध्यान केंद्रित किया है। हालांकि, वॉल्यूम्स मिली लीटर करने के लिए आम तौर पर एक एल से eluant की मात्रा कम हो जो माध्यमिक एकाग्रता प्रक्रियाओं, भी वायरस वसूलियां ⁸ पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है।

आंतों का वायरस के माध्यमिक एकाग्रता आमतौर पर ऐसी गोमांस निकालने के कुछ प्रकार के रूप में एक flocculating एजेंट पर निर्भर करता है (जैविक floccuआबादी) या स्किम्ड दूध flocculation ^9-12 फिल्टर सतहों से वायरस कणों को दूर करने के लिए। हाल ही में, Celite (ठीक कण) के अलावा के साथ युग्मित गोमांस निकालने का उपयोग कर एक और माध्यमिक एकाग्रता प्रक्रिया एडिनोवायरस, Enterovirus, और Norovirus ^8,13,14 उबरने के लिए वादा दिखाया गया है। वायरस है कि कणों में जैविक flocculation विधि के समान सिद्धांतों के तहत Celite एकाग्रता कार्यों के लिए देते हैं और निलंबन समाधान के पीएच बदलकर कणों (floc या Celite) से जारी कर रहे हैं। इन दो माध्यमिक एकाग्रता तकनीकों के बीच तुलना नुकीला एडिनोवायरस (अभिभाषक) प्रकार 40 और 41 ⁸ की वसूली में मूल्यांकन किया गया है। इस अध्ययन में दो माध्यमिक एकाग्रता तकनीक एडिनोवायरस की वसूली में सांख्यिकीय इसी तरह के थे कि संपन्न हुआ। हालांकि, कार्बनिक flocculation विधि एक 30 मिनट की आवश्यकता है। पीएच 3.5 पर ऊष्मायन, Celite तकनीक पीएच 4.0 पर एक छोटी ऊष्मायन (10 मिनट) की आवश्यकता है। जैविक flocculatआयन भी तृतीयक एकाग्रता के दौरान floc कणों इकट्ठा करने के लिए महंगा प्रयोगशाला के उपकरण (सेंट्रीफ्यूज) के उपयोग की आवश्यकता है, इसके विपरीत Celite तकनीक निलंबन से Celite कणों को अलग करने के लिए केवल बुनियादी प्रयोगशाला के उपकरण (निर्वात निस्पंदन) का उपयोग करता है।

फिल्टर और माध्यमिक क्षालन तकनीक के कुछ संयोजन भी वायरस वसूलियां को प्रभावित कर सकते हैं। एक अध्ययन में प्राथमिक (विद्युत धन फिल्टर) के कुछ संयोजन और माध्यमिक एकाग्रता तकनीक (Celite या जैविक flocculation) एडिनोवायरस ¹³ की वसूली का एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ा है कि निष्कर्ष निकाला है। इन निष्कर्षों को इन तकनीकों का उपयोग करते हुए कहा कि जब अनुकूलन बेहतर एक दिया पानी मैट्रिक्स से लक्ष्य वायरस को ठीक करने के क्रम में आवश्यक है सुझाव देते हैं। अनुकूलन कई चर (फिल्टर प्रकार / ब्रांड, पीएच क्षालन समाधान, Celite / जैविक flocculation) मूल्यांकन किया जाएगा, के बाद से कठिन प्रक्रिया कई शोधकर्ताओं के लिए सक्रिय रूप से बचने के लिए एक समय लेने वाली है।

इस S के लिएप्रत्येक वायरस प्रकार एक अद्वितीय कैप्सिड आकृति विज्ञान और विशिष्ट कैप्सिड प्रभारी को प्रदर्शित करता है के बाद से tudy, एक प्रक्रिया है, मुमकिन है नुकीला मानव एडिनोवायरस 40 उपभेदों और 41 का उपयोग कर पानी से वायरस एकाग्रता के लिए इष्टतम स्थितियों की पहचान करने के लिए विकसित किया गया था, एकाग्रता प्रोटोकॉल हर वायरस के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है इष्टतम वायरल वसूली को प्राप्त करने के क्रम में लक्ष्य। 1) विद्युत धन फिल्टर 2 द्वारा पीछा डिस्क) एक माध्यमिक एकाग्रता के रूप में Celite तकनीक बनाम एक स्थापित जैविक flocculation विधि के मूल्यांकन का उपयोग करते हुए नल के पानी में वायरस वसूलियां का मूल्यांकन, और 3) मूल्यांकन: यह अध्ययन अभिभाषक 40 और से 41 एकाग्रता के लिए एक तरीका प्रदान करता है तृतीयक एकाग्रता के लिए क्षालन बफ़र्स।

Protocol

कांच के बने पदार्थ और फिल्टर housings के 1. तैयारी

1. जब तक अन्यथा नोट, 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर सभी कांच के बने पदार्थ, फिल्टर housings और समाधान बाँझ। बाँझपन सुनिश्चित करने के लिए सभी के उद्घाटन या एल्यूमीनियम पन्नी या पूर्व नसबंदी करने के लिए टेप सुरक्षित कागज के साथ या तो उजागर सतहों को कवर किया।
2. 1 एल तरफ हाथ Erlenmeyer फ्लास्क करने के लिए फिल्टर आवास (47 मिमी व्यास) संलग्न द्वारा निस्पंदन उपकरण इकट्ठे। आवश्यक फिल्टर लीजिए: 47 मिमी व्यास ऋणात्मक / विद्युत धन डिस्क फिल्टर।
3. 1 एल 1.5% गोमांस निकालने को तैयार (flocculating; floc कणों का उत्पादन समाधान के पीएच 3.5, या गैर flocculating को उतारा है जब; पीएच 3.5 पर कुल नहीं करता है) गोमांस निकालने की 15 ग्राम में भंग करके, 0.05 एम ग्लाइसिन साथ, एक विआयनीकृत पानी के एल और 3.75 छ ग्लाइसिन जोड़ने।
   नोट: गैर flocculating गोमांस के अर्क से पहले तृतीयक एकाग्रता के लिए Celite के अलावा आवश्यकता होगी।
4. क्षालन additive के सोडियम Polyph जोड़ेंएक 0.1% एकाग्रता में गोमांस निकालने के लिए osphate।
5. , 1 एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड समाधान जोड़ें गोमांस निकालने, वांछित पीएच पीएच समाधान मिश्रण करने के लिए, बुद्धिमान ड्रॉप। 121 डिग्री सेल्सियस पर 15-30 मिनट के लिए आटोक्लेव गोमांस निकाल सकते हैं।
6. ठीक है, मध्यम, या (गैर flocculating गोमांस निकालने के साथ ही इस्तेमाल के लिए) बड़े कण Celite के 0.1 छ उपाय।
7. Erlenmeyer ओर हाथ फ्लास्क और वैक्यूम आउटलेट के लिए संगत ट्यूबिंग संलग्न द्वारा वैक्यूम / सक्शन तैयार करें।

सॉल्यूशंस और वायरस शेयर की 2. तैयारी

1. 1 एम एचसीएल के एक एल तैयार करें।
2. 1 एम NaOH के एक एल तैयार करें।
3. 1x पीबीएस समाधान तैयार (137 मिमी NaCl, 2.7 मिमी KCl, 1.47 मिमी कश्मीर ₂ पीओ _4, और 4.3 मिमी नाह ₂ पीओ _4)।
   1. 1 एम NaOH का उपयोग कर 9.0 1x पीबीएस के पीएच को समायोजित करें।
4. तैयार है और 9 पीबीएस के मिलीलीटर (पीएच के साथ शेयर वायरस के 1 मिलीलीटर के मिश्रण से 10 ⁴ -10 ⁵ सबसे संभावित संख्या (MPN) मिलीलीटर ^-1 के लिए शेयर वायरस पतला7), के रूप में पहले ^8,13 का वर्णन किया। 1 मिलीलीटर aliquots में -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
   1. संभावित contaminants को दूर करने के लिए सिरिंज फिल्टरिंग (0.22 माइक्रोन रोमकूप आकार) द्वारा वायरस शेयर जीवाणुरहित।
5. Dechlorinated नल का पानी
   1. उपाय एक बाँझ का उपयोग कर बाँझ पानी के नल की एक एल सिलेंडर स्नातक और चुंबकीय हलचल पट्टी युक्त 2 एल बीकर में डाल देना।
   2. सोडियम Thiosulfate के 0.7 जी जोड़ें और granules भंग जब तक मिश्रण। 1 एम एचसीएल या 1 एम NaOH समाधान का उपयोग अगर जरूरत 7-7.5 को नल के पानी का पीएच को समायोजित करें।
   3. पिघलना वायरस स्पाइक (1 मिलीलीटर) और dechlorinated बाँझ पानी के नल की एक एल कील की पूरी मात्रा में जोड़ें। 10 मिनट के लिए मिश्रण।
   4. नुकीला नमूने के रूप में एक ही तरीके से एक प्रयोग है और इस प्रक्रिया के साथ एक विधि रिक्त (एडिनोवायरस बिना dechlorinated नल का पानी) तैयार करें।

Millipore फ़िल्टर उपकरण 3. तैयारी

1. फिल्टर आवास से अधिक बाँझ कवर निकालें। सुनिश्चित करेंफिल्टर आवास ऊपरी कटोरा और निचले फिल्टर स्क्रीन के बीच उचित फिट छानने के दौरान नमूना रिसाव से बचने के लिए।
2. 1 एल Erlenmeyer फ्लास्क से बाँझ कवर निकालें। एक अच्छा मुहर बनाने, फिल्टर यूनिट की काग Erlenmeyer फ्लास्क के शीर्ष उद्घाटन में फिट बैठता है सुनिश्चित करें।
3. कम फिल्टर स्क्रीन से फिल्टर यूनिट के शीर्ष कटोरा निकालें, और बाँझ संदंश के साथ स्क्रीन पर squarely के 47 मिमी विद्युत धन फिल्टर डिस्क जगह है। नीचे स्क्रीन करने के लिए फिल्टर आवास कटोरा देते हैं और वामावर्त घुमा द्वारा जगह में ताला।

4. नल का पानी छानने का काम (प्राथमिक एकाग्रता)

1. वायरस की 100 मिलीलीटर बाँझ सिलेंडर स्नातक की उपाधि प्राप्त का उपयोग कर पानी का दोहन नुकीला उपाय।
2. वायरस की 100 मिलीलीटर एक 47 मिमी pleated ग्लास / सेल्यूलोज फिल्टर या एक नैनो एल्यूमिना / ग्लास फाइबर डिस्क फिल्टर या तो युक्त फिल्टर आवास में पानी के नल नुकीला डालो।
3. पानी धीरे-धीरे फिल्टर के माध्यम से पारित करने की अनुमति दें। ओ शेष बच दूर करने के लिए कोमल वैक्यूम लागू करेंफिल्टर सतह से च नल का पानी।
4. ट्रिप्सिन उपचार का उपयोग करते हैं, तो सतह फिल्टर और 5 मिनट के लिए सेते 0.25% trypsin के 5 मिलीलीटर जोड़ें।
5. बाँझ विआयनीकृत पानी की 50 मिलीलीटर का उपयोग कर फिल्टर सतह से trypsin धो लें।

फ़िल्टर से 5. वायरस क्षालन

1. 2 एल Erlenmeyer फ्लास्क से फिल्टर आवास निकालें, और 250 मिलीलीटर की ओर हाथ कुप्पी पर जगह है।
2. सिलेंडर स्नातक की उपाधि प्राप्त का उपयोग कर गोमांस निकालने की 100 मिलीलीटर उपाय। धीरे धीरे फिल्टर आवास में गोमांस निकालने की 100 मिलीलीटर डालना।
3. गोमांस निकालने एक छोटी सी (250 मिलीलीटर) Erlenmeyer फ्लास्क में गोमांस निकालने पर कब्जा, फिल्टर के माध्यम से डालना करने की अनुमति दें। फिल्टर से अवशिष्ट गोमांस निकालने के माध्यम से खींचने के लिए वैक्यूम लागू करें।

6. Celite माध्यमिक एकाग्रता

1. एक हलचल थाली करने के लिए eluted वायरस युक्त स्थानांतरण बोतल। मामूली भंवर बनाने के लिए मिश्रण, हलचल प्लेट पर बाँझ चुंबकीय हलचल पट्टी और जगह जोड़ें।
2. Celite का 0.1 जी जोड़ेंगोमांस निकालने की 100 मिलीलीटर के लिए पाउडर और Celite फैलाने के लिए अनुमति देते हैं। गोमांस निकालने में बाँझ पीएच जांच रखें।
3. पीएच 4.0 प्राप्त करने के लिए गोमांस निकालने के लिए बुद्धिमान 1 एम एचसीएल बूंद जोड़ें। धीरे-धीरे 10 मिनट के लिए मिश्रण करने के लिए अनुमति दें।
4. एक दो एल Erlenmeyer फ्लास्क का उपयोग कर (पहले वर्णित) फिल्टर आवास पर 47 मिमी पूर्व फिल्टर रखें।
5. पूर्व फ़िल्टर पर 100 मिलीलीटर गोमांस निकालने / Celite मिश्रण डालो। गोमांस निकालने के माध्यम से डालना करने की अनुमति दें। फिल्टर से अवशिष्ट गोमांस निकालने के माध्यम से खींचने के लिए मामूली निर्वात लागू करें।
6. फिल्टर आवास टोंटी के अंत पर धातु ट्यूब क्लिप रखें। धातु ट्यूब क्लिप करने के लिए बाँझ 15 मिलीलीटर polypropylene संग्रह ट्यूब संलग्न। वापस Erlenmeyer फ्लास्क में फिल्टर आवास रखें।
7. पूर्व फ़िल्टर पर एकत्र Celite अधिक 1x पीबीएस बफर के 5 मिलीलीटर, पीएच 9.0 जोड़ें।
8. पीबीएस पूर्व फिल्टर के माध्यम से ड्रिप करने की अनुमति दें। 15 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में अवशिष्ट पीबीएस के माध्यम से खींचने के लिए मामूली निर्वात लागू करें।

7. कार्बनिक flocculation माध्यमिक एकाग्रता

1. एक हलचल थाली करने के लिए eluted वायरस युक्त बीकर स्थानांतरण। गोमांस निकालने की 100 मिलीलीटर बाँझ चुंबकीय हलचल बार जोड़ें और मामूली भंवर बनाने के लिए मिश्रण।
2. गोमांस निकालने में बाँझ पीएच जांच रखें।
3. गोमांस निकालने के लिए बुद्धिमान 1 एम एचसीएल बूंद जोड़ें और 3.5 पीएच को समायोजित करें। 30 मिनट के लिए मिश्रण।
4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 2500 XG पर 250 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र शंक्वाकार ट्यूबों में eluate और सेंट्रीफ्यूज डालो।
5. गोली बाधित करने के लिए नहीं करने के लिए नहीं सतह पर तैरनेवाला देखभाल बंद डालो। 1x पीबीएस, पीएच 9 से 5 मिलीलीटर में गोली resuspend।
6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 4000 XG पर निलंबन अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला डालो और गोली त्यागें।
7. 7-7.5 पीएच को समायोजित, फिल्टर -80 डिग्री सेल्सियस पर 0.22 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर और फ्रीज के माध्यम से बाँझ।

8. वायरल न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण

1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक उपयुक्त वाणिज्यिक किट का उपयोग वायरल न्यूक्लिक एसिड निकालें।

<पी वर्ग = "jove_title"> 9। अभिभाषक 40/41 qPCR

1. ^8,13 प्रकाशित रूप में प्राइमरों और जांच, साथ ही प्रतिक्रिया मिश्रण और थर्मल साइकिल प्रोफ़ाइल का उपयोग।
   नोट: परख के लिए पता लगाने के अनुमानित सीमा प्रतिक्रिया प्रति लगभग 5 qPCR के यूनिट है।
2. इस प्रकार के रूप सांद्रता में पीसीआर प्रवर्धन मिश्रण के घटकों को जोड़ने: 10 मिमी Tris (पीएच 8.3), 50 मिमी KCl, 4.5 मिमी ₂ MgCl, 10 मिमी dNTPs, 10 माइक्रोन प्राइमरों और 1 माइक्रोन जांच और पोलीमर्स के 0.5 μl इतना है कि 45 वर्ष की अंतिम संस्करणों μl एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्रतिक्रिया प्लेट के भीतर कुओं की उपयुक्त संख्या में जोड़ा जा सकता है।
3. एक 96 अच्छी तरह से, तेजी से प्रतिक्रिया पीसीआर थाली के प्रत्येक उचित अच्छी तरह से करने के लिए पीसीआर प्रवर्धन मिश्रण का लोड 45 μl।
4. डीएनए के 5 μl पीसीआर थाली के उचित कुओं के लिए नमूना निकाले जोड़ें।
5. , गर्मी प्रतिरोधी कवर मुहर के साथ प्लेट कवर पीसीआर थाली कुओं के नीचे करने के लिए किसी भी बूंदों स्थानांतरित करने के लिए थाली स्पिन।
6. Foll के रूप में सेट पीसीआर प्रवर्धन चक्रOWS: 15 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्र और 1 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस के द्वारा पीछा किया 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस,।

10. डेटा विश्लेषण

1. 5-1: 1 फैले नमूने के धारावाहिक 5 गुना dilutions की तीन प्रतियों माप का विश्लेषण 625 कमजोर पड़ने रेंज वायरल कणों का सबसे संभावित संख्या (MPN) निर्धारित करने के लिए, पहले से ^8,13 वर्णित है।
2. 5-1: 1 फैले एडिनोवायरस प्रयोगात्मक spikes के धारावाहिक 5 गुना dilutions विश्लेषण 15,625 कमजोर पड़ने रेंज वायरल कणों का सबसे संभावित संख्या (MPN) निर्धारित करने के लिए।
3. EPA के MPN कैलकुलेटर (http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html) का उपयोग करना, कमजोर पड़ने के प्रकार के लिए खाते में कैलकुलेटर समायोजित (1: 5 या 1:10), dilutions की संख्या का प्रदर्शन किया है, और संख्या की कमजोर पड़ने श्रृंखला में नमूने पेश करता है।
4. प्रदर्शन करना मात्रा की एक इकाई के लिए आदि (जैसे, 1 मिलीग्राम, 100 मिलीग्राम, सामान्य से पीछा डेटा के ₁₀ परिवर्तन लॉग इन करें
5. विभिन्न प्रयोगात्मक चर के प्रभाव का मूल्यांकन (जैसे, विभिन्न Celite प्रकार, पीएच पर्वतमाला, अलग फिल्टर प्रकार और विभिन्न माध्यमिक एकाग्रता तकनीक) (जैसे, बनती टी परीक्षण, एक या दो पैरामीट्रिक या गैर पैरामीट्रिक सांख्यिकीय परीक्षण के प्रदर्शन से अभिभाषक वसूलियां पर डेटा के वितरण और प्रयोगात्मक डिजाइन पर निर्भर करता है) एनोवा -way।

Representative Results

Celite चयन

Celite के तीन अलग अलग प्रकार से पहले अच्छा प्रदर्शन संस्करण का चयन करने के लिए परीक्षण किया गया। मध्यम आकार के कणों को ठीक से Celites उच्चतम एडिनोवायरस वसूलियां का उत्पादन किया। बड़ा celites का प्रयोग AdV40 और 41 (सीमा 32% -100%) (चित्रा 1) दोनों के लिए कम वसूलियां में हुई। एडिनोवायरस 40 की औसत वसूलियां 144% ± 52% (ठीक), 115% ± 28% (मध्यम) और 82% ± 53% (बड़े) कण celites थे और AdV41, 132% ± 39% (ठीक), 83% ± के लिए 25% (मध्यम) और 11% (बड़े) ± 50%। एक तरह से एनोवा अनुकूलित Celite तकनीक क्रमश: 19% और 109% ± 16%, ± 75% बरामद, जो जैविक flocculation विधि, की है कि AdV40 (पी = 0.7920) और 41 (पी = 0.1439) के सांख्यिकीय समान स्तर बरामद संकेत दिया । चित्रा 1 माध्यमिक एकाग्रता तकनीकों के बीच और अभिभाषक प्रकार के बीच अंतर को दिखाता है।

_content "> फिल्टर प्रकार मूल्यांकन

वायरस-नुकीला, नल के पानी से एक सौ मिली लीटर संस्करणों एक pleated ग्लास / सेलूलोज या नैनो एल्यूमिना / ग्लास फाइबर डिस्क फिल्टर का उपयोग ध्यान केंद्रित किया गया है और Celite या जैविक flocculation विधि का उपयोग संसाधित किया गया। फिल्टर फिल्टर से अभिभाषक कणों eluting में सबसे प्रभावी होगा जो निर्धारित करने के लिए पीएच 7.5, 9.0, 9.5, 10, 11 और 12 में गोमांस के अर्क के साथ eluted थे। पीएच 10 और Celite में गोमांस निकालने के साथ युग्मित ग्लास / सेल्यूलोज फिल्टर, आंकड़े 2 और में दिखाया जाता है जो AdV40 (52% ± 22%) और AdV41 (64% ± 4%) के लिए (qPCR / MPN) के द्वारा उच्चतम वसूलियां उत्पादित 3। AdV40 एक समान पीछा करते हुए, हालांकि, कुछ हद तक कमजोर प्रवृत्ति (पी मूल्य रेंज: 0.025-0.042): बीफ निकालने पीएच 10 अन्य सभी पीएच मान की तुलना में काफी अधिक AdV41 (.0045-0.041 पी मूल्य रेंज) बरामद किया। एक गिलास / सेल्यूलोज फिल्टर भी जैविक flocculatio के साथ संयोजन के रूप में मूल्यांकन किया गया थाएन विधि। AdV40 के लिए, काफी अधिक वसूलियां गोमांस निकालने पीएच 10 (40% ± 10%) (पी मूल्य रेंज: 0.010-0.027) का उपयोग कर प्राप्त की कर रहे थे, और AdV41 के लिए, दोनों पीएच 9.5 और 10 अन्य सभी गोमांस निकालने पीएच परीक्षण किया (पी मूल्य सीमा से बेहतर प्रदर्शन : .023-0.027) (आंकड़े 2 और 3)। कुल मिलाकर, मांस निकालने पीएच 10 के साथ Celite तकनीक दोनों अभिभाषक उपभेदों की वसूली के लिए प्रत्यक्ष तुलना में जैविक flocculation विधि से बेहतर हो पाया था।

गोमांस निकालने additives के अनुकूलन

0.25% trypsin के 1) के अलावा और 2) 0.1% सोडियम polyphosphate साथ गोमांस निकालने का सप्लीमेंट: अनुकूलित विधि (ग्लास / सेल्यूलोज फिल्टर Celite माध्यमिक एकाग्रता के साथ युग्मित गोमांस निकालने पीएच 10 का प्रयोग करके) दो अन्य उपचार की तुलना में था। trypsin के अलावा <(क्रमशः, केवल 16% ± 6% और 24% AdV40 के 14% और 41 आदानों ± के रूप में अभिभाषक की वसूली में सुधार करने के लिए प्रकट नहीं किया था बरामद किए गए मजबूत> चित्रा 4)। 0.1% सोडियम polyphosphate के साथ पूरक बीफ निकालने पिछले अनुकूलित विधि की तुलना में AdV40 और 41 के उच्चतम वसूलियां झुकेंगे। AdV40 वसूली 13% की वृद्धि करने के लिए दिखाई दिया, और AdV41 वसूली पिछले पद्धति पर 7% की वृद्धि हुई है, लेकिन न तो सांख्यिकीय महत्वपूर्ण था (पी मूल्य: 0.146)। सोडियम polyphosphate के उच्च प्रतिशत 1%, 3% और 5% (नहीं दिखाया डेटा) का प्रयोग माध्यमिक एकाग्रता के दौरान 4.0 के लिए इन समाधान के पीएच को समायोजित करने के लिए एसिड की बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है, अप्रभावी हो पाया था।

चित्रा 1: माध्यमिक एकाग्रता तकनीक (Celite कार्बनिक floc बनाम) और इस्तेमाल Celite के प्रकार के आधार पर अभिभाषक-40 और अभिभाषक-41 का प्रतिशत वसूली। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं (एन = 3) ^8।

"के लिए: रख-together.within पृष्ठ =" हमेशा ">
चित्रा 2: माध्यमिक एकाग्रता तकनीकों के दो प्रकार (Celite और जैविक floc) और मांस निकालने के अलग पीएच स्तर पर फिल्टर के दो प्रकार (ग्लास / सेलूलोज़ और नैनो-एल्यूमिना / ग्लास) का उपयोग अभिभाषक-40 का प्रतिशत वसूली। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन (एन = 3) ¹³ प्रतिनिधित्व करते हैं।

चित्रा 3: माध्यमिक एकाग्रता तकनीकों के दो प्रकार (Celite और जैविक floc) और मांस निकालने के अलग पीएच स्तर पर फिल्टर के दो प्रकार (ग्लास / सेलूलोज़ और नैनो-एल्यूमिना / ग्लास) का उपयोग अभिभाषक-41 का प्रतिशत वसूली। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन (एन = 3) ¹³ प्रतिनिधित्व करते हैं।

">
चित्रा 4: अभिभाषक 40 और अभिभाषक 41 की वसूली पर क्षालन additives के प्रभाव एक माध्यमिक एकाग्रता तकनीक और ग्लास / सेल्यूलोज रूप Celite का उपयोग करते हुए ध्यान केंद्रित किया। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन (एन = 3) ¹³ प्रतिनिधित्व करते हैं।

Discussion

विद्युत धन फिल्टर पानी से वायरस ध्यान केंद्रित करने में उपयोगी होते हैं; हालांकि इन फिल्टर बदले में उनकी प्रभावशीलता को बदल सकता है जो उनकी संरचना और संरचना में अलग कर सकते हैं। इस समस्या को और जटिल, कैप्सिड संरचनाओं और आरोपों एकाग्रता तकनीक इष्टतम वसूली ¹⁵ को सुनिश्चित करने के आधार पर किया जा आवश्यकता होती है वायरस उपभेदों के बीच बदलती हैं। (जैसे, विद्युत धन फिल्टर, मांस निकालने क्षालन), लक्ष्य वायरस के और अधिक प्रभावी एकाग्रता ^16,17 प्राप्त किया जा सकता मौजूदा एकाग्रता तकनीकों का सरल संशोधनों के माध्यम से।

तिथि करने के लिए अनुसंधान आमतौर पर प्राथमिक एकाग्रता (फिल्टर) चरणों को संशोधित करके वायरस की वसूली पर ध्यान केंद्रित किया है, लेकिन थोड़ा ध्यान भी वायरस वसूली ¹⁸ को प्रभावित कर सकता है, जो बाद में एकाग्रता प्रक्रियाओं को दिया गया है। यह अलग माध्यमिक एकाग्रता तकनीक वायरस वसूलियां ^6,13,19,20 प्रभावित कर सकते हैं कि प्रदर्शन किया गया है। CELIतेज और सरल नमूना प्रसंस्करण प्रक्रिया का उपयोग करते समय ते एकाग्रता, matrices के एक विभिन्न प्रकार से अन्य माध्यमिक एकाग्रता विधियों ^8,14 की है कि वायरस के समान स्तर को ठीक करने के लिए दिखाया गया है।

कारण बाहरी कैप्सिड संरचनाओं बदलती करने के लिए, कुछ वायरस शारीरिक रूप से क्षालन प्रोटोकॉल फिल्टर करने के लिए विभिन्न additives के मूल्यांकन की जरूरत महसूस, फिल्टर मैट्रिक्स ²¹ के भीतर फंसे हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, surfactant के अलावा, सोडियम polyphosphate प्राथमिक एकाग्रता ^6,13,22-24 दौरान दोनों बैक्टीरियल और वायरल वसूली में सुधार हुआ। दूसरी ओर, trypsin के अलावा निम्नलिखित मनाया कम वसूलियां प्रोटिएजों बाहरी वायरल कैप्सिड पर प्रोटीन फाइबर की दरार में सहायता नहीं करते हैं कि संकेत मिलता है। इसके अलावा, असामान्य नहीं ^7,25,26, जबकि यह हमारे वसूलियां की कुछ 100% से अधिक में थे कि उल्लेखनीय है। पहले से ^7,25,26 दिखाया गया है, इस वजह से प्रयोगशाला की clumping को छठी तैयार होने की संभावना हैरस कील के रूप में इस्तेमाल किया।

एकाग्रता दृष्टिकोण प्रस्तुत छोटी मात्रा में (100 मिलीलीटर वायरस पानी नुकीला) को विकसित करने और इसकी वजह से सादगी और त्वरित नमूना प्रसंस्करण समय के साथ-साथ संसाधनों की कम खपत करने के लिए, वायरस एकाग्रता तरीकों का अनुकूलन करने के लिए एक व्यावहारिक तरीका हो सकता है। पानी के इस तरह के छोटे संस्करणों का प्रयोग, नमूना के भीतर पीसीआर अवरोधकों की एकाग्रता भी कम से कम है, लेकिन यह प्रत्येक स्रोत पानी से पहले प्रयोग करने के लिए पीसीआर अवरोधकों की उपस्थिति के लिए मूल्यांकन किया जाना है कि सिफारिश की है। फिल्टर और माध्यमिक एकाग्रता तकनीक दोनों के कई विकल्प मौजूद हैं, के बाद से, छोटी मात्रा एकाग्रता तकनीक कई चर के त्वरित मूल्यांकन के लिए अनुमति देते हैं। यह इन तकनीकों दिया पानी matrices के प्रति लक्ष्य वायरस एकाग्रता के लिए इष्टतम हैं जो स्थितियों की पहचान करने में सहायता करने के लिए बड़े पैमाने पर निस्पंदन प्रयोग करने के लिए पहले से तैनात किया जा सकता है कि आशा की जाती है।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenovirus 40 stock	ATCC	VR-931
Adenovirus 41 stock	ATCC	VR-930
Sodium Thiosulfate	Fluka Chemical Co.	72051
Celites #577	Fluka Chemical Co.	22142
NanoCeram 47 mm	Argonide	N/A
1MDS 47 mm	3M	6408502
AP-20 Prefilter 47 mm	Millipore Corp.	AP2004700
Glycine	Sigma	50046-1KG
Sodium Polyphosphate	Acros Organics	390930010
Trypsin	Gibco	25200
PBS	Sigma	P5368
Hydrochloric Acid	Fisher	A481-212
BBL Beef Extract	BD Biosciences	212303
Difco Beef Extract	BD Biosciences	211520
ABI 7900 Real-time PCR system	ABI	N/A
Stainless Steel Filter Housing	Millipore Corp.	XX2004720
Blood DNA Extraction Kit	Qiagen	51104
EPA MPN Calculator			http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html