Introduction
Human enterale virussen zijn belangrijke verwekkers van water overgebrachte ziekten 1-3, maar zijn over het algemeen aanwezig in lage aantallen in vervuilde milieu wateren, het maken van hun detectie moeilijk zonder concentratie. Procedures gebruikt om virussen te concentreren typisch een filtratiestap, gevolgd door elutie filter en secundaire concentratie van het filter eluaat. Een gemeenschappelijke filtratie procedure berust op het gebruik van geladen membranen zoals elektropositieve filters (onlangs besproken in 4,5). Deze filters vertrouwen op het vastleggen van virussen gesuspendeerd in water met behulp van elektrostatische interacties tussen het filter oppervlak (positief geladen) en gerichte virusdeeltjes (negatief geladen). Twee elektropositieve filters die commercieel verkrijgbaar zijn vertrouwen op deze technologie, de glas / cellulose en nano-alumina / glasvezelfilters. De glas / cellulose filter kosten tot 10 keer die van de nano-alumina / glasvezel, die het gebruik van het glas / ce beperkenllulose filters voor routine-virus monitoring. Recente studies hebben gesloten verschillen zijn nominale tussen deze twee filters in het herstel van enterovirussen van omgevingstemperatuur water 6,7, rechtvaardigt het gebruik van een goedkopere filter alternatief. Andere filter opties zoals elektronegatieve en glaswol filters werden onderzocht, maar ze hetzij de voorbehandeling van bronwater (elektronegatieve filters) of niet in de handel verkrijgbaar (glaswol filters). De ontwikkeling van het virus concentratie procedures is vooral gericht op het optimaliseren van de primaire concentratie technieken (filters) om virus terugvorderingen verbeteren van water. Echter, secundaire concentratie procedures, waarbij het volume van eluant verminderen meestal van 1 L tot volumes milliliters, kunnen ook een belangrijke impact op virus terugvorderingen 8.
Secundaire concentratie van enterale virussen berust meestal op een uitvlokkingsmiddel zoals sommige soorten rundvlees extract (organische floccuning) of magere melk flocculatie 9-12 om virusdeeltjes uit de filter oppervlakken te verwijderen. Recentelijk andere secundaire concentratieprocedure met vleesextract combinatie met de toevoeging van celiet (fijne deeltjes) blijkt belofte voor terugwinnen adenovirus, enterovirus en norovirus 8,13,14. Celite concentratie werken onder dezelfde beginselen die van de biologische flocculatie werkwijze die virusdeeltjes hechten aan en vrijkomen uit deeltjes (vlokken of celite) Door het veranderen van de pH van de suspensie-oplossing. Vergelijkingen tussen deze twee secundaire concentratie technieken zijn geëvalueerd in het herstel van spiked adenovirus (adv) typen 40 en 41 8. Deze studie concludeerde dat de twee secundaire concentratie technieken waren statistisch vergelijkbaar in het herstel van adenovirussen. De biologische flocculatie methode vereist een 30 min. incubatie bij pH 3,5, terwijl de celite techniek vereist een kortere incubatie (10 min) bij pH 4,0. De organische flocculation vereist ook het gebruik van dure laboratoriumapparatuur (centrifuges) tot vlokken deeltjes verzamelen tijdens tertiaire concentratie, de celite techniek daarentegen worden alleen elementaire laboratoriumapparatuur (vacuümfiltratie) om celite deeltjes scheiden van suspensie.
Bepaalde combinaties van filters en secundaire elutietechnieken kan ook van invloed virus terugvorderingen. Een onderzoek werd geconcludeerd dat bepaalde combinaties van primaire (elektropositief filters) en secundaire concentratie technieken (celliet of organische flocculatie) had een belangrijke impact op herstel van adenovirus 13. Deze bevindingen suggereren dat optimalisatie nodig om optimaal te herstellen doelwit virus uit een bepaalde watermatrix bij gebruik van deze technieken. Optimalisatie is een tijdrovend, lastig proces veel onderzoekers actief te vermijden, omdat tal van variabelen zal worden geëvalueerd (filter type / merk pH elutieoplossing, celliet / organische flocculatie).
Hiervoor study, een procedure die is ontwikkeld om optimale omstandigheden voor virus concentratie identificeren van water met behulp van spiked menselijk adenovirusstammen 40 en 41. Vermoedelijk, omdat elk type virus toont een unieke capside morfologie en specifieke capside lading, kan het nodig zijn concentratie protocollen worden geoptimaliseerd voor elk virus richten met het oog op een optimale virale herstel te bereiken. Deze studie geeft een aanpak voor adv 40 en 41 concentratie door: 1) het evalueren virus terugvorderingen in leidingwater met behulp elektropositief filter schijven gevolgd door 2) evaluatie van een gevestigde biologische flocculatie methode versus de celliet techniek als een secundaire concentratie, en 3) de evaluatie van elutiebuffers voor tertiaire concentratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van glaswerk en behuizingen Filter
- Tenzij anders vermeld, steriliseren alle glaswerk, filterhuizen en oplossingen bij 121 ° C gedurende 15 min. Om de steriliteit te verzekeren, hebben betrekking op alle openingen of blootgestelde oppervlakken met ofwel aluminiumfolie of-tape vastgemaakt papier voorafgaand aan sterilisatie.
- Assembleren filtratieinrichting door het aanbrengen van filterhuis (47 mm diameter) aan 1 L zijarm erlenmeyer. Verzamel filters nodig: 47 mm diameter elektropositief / elektronegatief disc filters.
- Bereid 1 liter 1,5% vleesextract (flocculanten, produceert vlokken deeltjes bij pH van de oplossing wordt verlaagd tot 3,5 of non-flocculatie, die niet bij pH 3,5 heeft aggregaat), met 0,05 M glycine, door oplossen van 15 g vleesextract in 1 liter gedeïoniseerd water en toevoegen van 3,75 g glycine.
OPMERKING: Niet-uitvlokkend rundvlees extracten zal de toevoeging van celliet voorafgaand aan tertiaire concentratie vereisen. - Voeg elutie additief natrium Polyphosphate rundvlees extract in een concentratie van 0,1%.
- Voeg 1 M zoutzuur, druppelsgewijs, te mengen rundvlees extract, pH oplossing om de gewenste pH. Autoclaaf vleesextract gedurende 15-30 min bij 121 ° C.
- Meet 0,1 g fijne, middelgrote of grote deeltje celliet (voor gebruik met niet-flocculanten rundvlees alleen extract).
- Bereid vacuum / zuig door het aanbrengen van compatibele slang aan Erlenmeyer zijarm kolf en om het vacuüm uitlaat.
2. Voorbereiding van Solutions en Virus Stock
- Bereid 1 L 1 M HCl.
- Bereid 1 L 1 M NaOH.
- Bereid 1x PBS-oplossing (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,47 mM K 2 PO 4 en 4,3 mM NaH 2PO 4).
- Stel de pH van 1x PBS tot 9,0 met 1 M NaOH.
- Bereiden en verdun voorraad virus tot 10 4 -10 5 meest waarschijnlijke aantal (MPN) ml -1 door het mengen van 1 ml van de virus met 9 ml PBS (pH7), zoals eerder beschreven 8,13. Bewaren bij -80 ° C in 1 ml porties.
- Steriliseren virus voorraad door spuit filtering (0,22 pm poriegrootte) om mogelijke verontreinigingen te verwijderen.
- Gedechloreerd Tap Water
- Maatregel 1 L steriel leidingwater met een steriele maatcilinder en giet het in een 2 L beker die magnetische roerstaaf.
- Voeg 0,7 g natriumthiosulfaat en meng tot granules lossen. Stel de pH van het leidingwater om 7-7,5 indien nodig met behulp van 1 M HCl of 1 M NaOH-oplossing.
- Dooi virus spike (1 ml) en voeg gehele volume van spike tot 1 L van gedechloreerd steriel leidingwater. Meng gedurende 10 min.
- Bereid een methode leeg (gedechloreerd leidingwater zonder adenovirus) met elk experiment en proces op dezelfde wijze als het verrijkte monster.
3. Bereiding van Millipore filterinrichting
- Verwijder steriele deksel over het filterhuis. Verzekereneen goede fit tussen filterhuis bovenste kom en onderste filter scherm om monster lekken tijdens filtratie te voorkomen.
- Verwijder steriele afdekking van 1 L erlenmeyer. Zorg ervoor dat de kurk van de filter unit past precies in de bovenste opening van de Erlenmeyer, het creëren van een goede afdichting.
- Verwijder de bovenste kom van filtereenheid uit lagere filter scherm, en plaats 47 mm elektropositief filter schijf vierkant op het scherm met een steriel pincet. Bevestig filterhuis kom naar onderkant scherm en sluit het door het draaien tegen de klok in.
4. Tap Water Filtration (Primary Concentratie)
- Meet 100 ml van het virus spiked kraanwater met steriele maatcilinder.
- Giet 100 ml van het virus spiked kraanwater in filterhuis die ofwel een 47 mm geplooid glas / cellulose filter of een nano-alumina / glasvezel schijf filter.
- Laat het water langzaam passeren filter. Pas lichte vacuüm om de resterende resten te verwijderen of leidingwater uit filter oppervlak.
- Bij gebruik van trypsine behandeling, voeg 5 ml van 0,25% trypsine aan Oppervlaktefilter en incubeer gedurende 5 min.
- Was trypsine uit filter oppervlak met behulp van 50 ml steriel gedeïoniseerd water.
5. Virus elutie uit Filter
- Verwijder filter behuizing van 2 L Erlenmeyer, en de plaats op 250 ml side-arm kolf.
- Meet 100 ml van rundvlees extract met behulp maatcilinder. Giet langzaam 100 ml van rundvlees extract in filterhuis.
- Laat vleesextract te gieten door het filter, vastleggen vleesextract in een klein (250 ml) Erlenmeyer kolf. Toepassing vacuüm te trekken door middel van resterende rundvlees uittreksel uit filter.
6. Celite Secundaire Concentratie
- Transfer kolven met de uitgewassen virussen aan een roer plaat. Voeg steriele magnetische roerstaaf en plaats op roerplaat, mengen tot lichte vortex creëren.
- Voeg 0,1 g celitepoeder tot 100 ml van rundvlees extract en laat celliet te verspreiden. Plaats steriele pH-sonde in rundvlees extract.
- Voeg druppelsgewijs 1 M HCl tot vleesextract om pH 4,0 te bereiken. Laat roerend gedurende 10 min.
- Plaats 47 mm voorfilter op filterbehuizing (zoals eerder beschreven) met een 2 L Erlenmeyer kolf.
- Pour vleesextract / celite mengsel van 100 ml gedurende voorfilter. Laat rundvlees extract door te gieten. Oefen lichte vacuüm te trekken door middel van resterende rundvlees uittreksel uit filter.
- Plaats metalen buis clip aan het einde van het filterhuis uitloop. Bevestig steriele 15 ml polypropyleen collectie buis metalen buis clip. Plaats filterhuis terug in erlenmeyer.
- Voeg 5 ml 1x PBS, pH 9,0 over celite verzameld op de pre-filter.
- Laat PBS te druppelen door middel van pre-filter. Oefen lichte vacuüm te trekken door middel van de resterende PBS in 15 ml collectie buis.
7. Biologische Flocculatie Secundaire Concentratie
- Breng de bekers die het geëlueerde virus naar een roerplaat. Voeg steriele magnetische roerstaaf tot 100 ml van rundvlees extract en meng tot lichte vortex creëren.
- Plaats steriele pH-sonde in rundvlees extract.
- Voeg 1 M HCl druppelsgewijs aan rundvlees-extract en de pH op 3,5. Meng gedurende 30 min.
- Giet het eluaat in 250 ml conische centrifugebuis en centrifugeer bij 2500 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
- Giet supernatant maar zorg er voor dat u de pellet te verstoren. Resuspendeer de pellet in 5 ml 1x PBS, pH 9.
- Centrifugeer de suspensie bij 4000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Giet het supernatant en de pellet weggooien.
- Stel de pH 7-7.5, filter gesteriliseerd door 0,22 urn spuitfilter en bevriezen bij -80 ° C.
8. Virale Nucleïnezuur Extraction
- Extract virale nucleïnezuren met een geschikte commerciële kit volgens de instructies van de fabrikant.
- Gebruik primers en probes, evenals reactiemengsel en thermische cycli profielen gepubliceerd 8,13.
OPMERKING: Geschatte detectiegrens van de test is ongeveer 5 qPCR eenheden per reactie. - Componenten van PCR-amplificatie mengsels Voeg bij concentraties als volgt: 10 mM Tris (pH 8,3), 50 mM KCI, 4,5 mM MgCl2, 10 mM dNTPs, 10 uM primers en 1 pM probe en 0,5 pl polymerase zodat eindvolume van 45 pl kunnen passende aantal putten toegevoegd in een 96-wells PCR reactieplaat.
- Belasting 45 pi PCR amplificatie mengsel aan elk geschikte putje van een 96 putjes, snelle reactie PCR plaat.
- Voeg 5 ul geëxtraheerd DNA monster aan geschikte putjes van de PCR-plaat.
- Bedek plaat met hittebestendige deksel afdichting, draai de plaat om eventuele druppels verhuizen naar onderkant van PCR-plaat putten.
- Stel PCR amplificatiecycli als follows: 95 ° C gedurende 10 min, gevolgd door 40 cycli van 95 ° C gedurende 15 sec en 60 ° C gedurende 1 min.
10. Gegevens Analyses
- Analyseer drievoudige metingen van de seriële 5-voudige verdunningen van de monsters overspant 1: 5 tot 1: 625 verdunning assortiment naar de meest waarschijnlijke aantal (MPN) van de virale deeltjes te bepalen, zoals eerder beschreven 8,13.
- Analyseer seriële 5-voudige verdunningen van adenovirus experimentele spikes spanning 1: 5 tot 1: 15.625 verdunning assortiment naar de meest waarschijnlijke aantal (MPN) van de virale deeltjes te bepalen.
- Met behulp van de EPA MPN rekenmachine (http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html), passen de rekenmachine om rekening te houden met het type van verdunning (1: 5 of 1:10), het aantal verdunningen uitgevoerd, en het aantal repliceren monsters in verdunningsreeks.
- Voer 10 log transformatie van de gegevens, gevolgd door het normaliseren van een volume-eenheid (bijvoorbeeld 1 ml, 100 ml, etc.
- Evalueer het effect van de verschillende experimentele variabelen (bijvoorbeeld verschillende soorten celite, pH-trajecten, verschillende filter en verschillende secundaire concentratietechnieken) op AdV terugwinning door het uitvoeren van parametrische en niet-parametrische statistische testen (bijvoorbeeld gepaarde t-test, één of twee -weg ANOVA) afhankelijk van de verdeling van de gegevens en de experimentele opzet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Celliet selectie
Drie verschillende types van celite werden getest voor de selectie van de best presterende variant. Celites met fijne tot middelgrote deeltjes die de hoogste adenovirus terugvorderingen. Het gebruik van grotere celites resulteerde in lagere realisaties zowel AdV40 en 41 (tussen 32% -100%) (Figuur 1). Gemiddeld terugvorderingen van adenovirus 40 waren 144% ± 52% (fijn), 115% ± 28% (gemiddeld) en 82% ± 53% (groot) deeltje celites en voor AdV41, 132% ± 39% (fijn), 83% ± 25% (gemiddeld) en 50% ± 11% (groot). One-way ANOVA aangegeven geoptimaliseerde celite techniek gewonnen statistisch vergelijkbaar niveau van AdV40 (P = 0,7920) en 41 (P = 0,1439) tot die van de biologische flocculatie methode welke 75% respectievelijk teruggewonnen ± 19% en 109% ± 16%, . Figuur 1 illustreert de verschillen tussen secundaire concentratietechnieken en tussen AdV types.
_content "> Filter type evaluatieHonderd milliliter volumes-virus spiked, kraanwater werden geconcentreerd met behulp van een geplooide glas / cellulose of nano-alumina / glasvezel disc filter en werden verwerkt met behulp van de celliet of organische flocculatie methode. Filters werden geëlueerd met rundvlees extracten bij pH 7,5, 9.0, 9.5, 10, 11 en 12 te bepalen welke het meest effectief elueren AdV deeltjes filters zouden zijn. De glas / cellulose filter gekoppeld vleesextract bij pH 10 en celite, produceerde de hoogste terugvorderingen (door qPCR / MPN) voor AdV40 (52% ± 22%) en AdV41 (64% ± 4%) die getoond in figuren 2 en 3. Vleesextract pH 10 herstelde aanzienlijk hoger AdV41 dan alle andere pH-waarden (P-waarde range: ,0045-0,041), terwijl AdV40 volgde een gelijkaardig, hoewel enigszins zwakkere trend (P-waarde range: 0,025-0,042). Een glas / cellulose filter werd ook geëvalueerd in combinatie met de organische flocculation methode. Voor AdV40, waren significant hoger herstel mogelijk via vleesextract pH 10 (40% ± 10%) (P waardebereik: 0,010-0,027), en AdV41 zowel pH 9,5 en 10 overtrof alle vleesextract pH getest (P waardebereik : 0,023-0,027) (figuren 2 en 3). Over het algemeen, de celliet techniek met rundvlees extract pH 10 werd gevonden superieur aan de biologische flocculatie methode in directe vergelijkingen voor het herstel van zowel AdV stammen te zijn.
Optimalisaties van het rundvlees extract additieven
De geoptimaliseerde methode (glas / cellulose filter met vleesextract pH 10 gekoppeld celite secundaire concentratie) werd vergeleken met twee andere behandelingen: 1) toevoeging van 0,25% trypsine en 2) vullen het rundvlees extract met 0,1% natriumpolyfosfaat. De toevoeging van trypsine bleek geen herstel van AdV verbeteren slechts 16% ± 6% en 24% ± 14% van AdV40 en 41 inputs respectievelijk teruggewonnen (< strong> Figuur 4). Vleesextract aangevuld met 0,1% natriumpolyfosfaat leverde de hoogste terugwinning van AdV40 en 41 vergeleken met die van de eerdere geoptimaliseerde methode. AdV40 herstel leek te verhogen met 13%, en AdV41 herstel steeg 7% ten opzichte van de vorige methode, maar geen van beiden was statistisch significant (p-waarde: 0,146). Het gebruik van hogere percentages natriumpolyfosfaat 1%, 3% en 5% (gegevens niet getoond) bleek ineffectief, waar grote hoeveelheden zure pH van deze oplossingen tot 4,0 passen tijdens secundaire concentratie.
Figuur 1: Percentage terugwinning van AdV-40 en AdV-41 gebaseerd op secundaire concentratietechniek (Celite versus organische vlokken) en het soort gebruikte Celite. Foutbalken standaarddeviatie (n = 3) 8.
Figuur 2: Percentage terugwinning van AdV-40 met gebruik van twee secundaire concentratietechnieken (Celite en organische vlokken) en twee soorten filters (Glas / Cellulose en Nano-alumina / Glass) bij verschillende pH-niveaus van vleesextract. Foutbalken standaarddeviatie (n = 3) 13.
Figuur 3: Percentage terugwinning van AdV-41 met gebruik van twee secundaire concentratietechnieken (Celite en organische vlokken) en twee soorten filters (Glas / Cellulose en Nano-alumina / Glass) bij verschillende pH-niveaus van vleesextract. Foutbalken standaarddeviatie (n = 3) 13.
Figuur 4: Het effect van elutie additieven op herstel van AdV 40 en AdV 41 geconcentreerd met behulp van Celite als secundaire concentratietechniek en glas / cellulose. Foutbalken standaarddeviatie (n = 3) 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Elektropositief filters zijn nuttig bij het concentreren van virussen uit het water; maar deze filters kunnen verschillen in hun structuur en samenstelling die op hun beurt kunnen veranderen hun doeltreffendheid. Compounding dit probleem, capside structuren en kosten variëren tussen de virusstammen die concentratie vereisen technieken worden afgestemd op optimaal herstel 15 te verzekeren. Door eenvoudige aanpassingen van de bestaande concentratie technieken (bijv elektropositieve filters, vleesextract elutie), meer effectieve concentratie van target virussen kan worden bereikt 16,17.
Onderzoek tot op heden is meestal gericht op het herstel van het virus door het wijzigen van de primaire concentratie (filters) stappen, maar weinig aandacht is besteed aan de volgende concentratie procedures die ook van invloed kunnen zijn viruswinning 18. Het is aangetoond dat verschillende secundaire concentratietechnieken beïnvloeden virus herstel 6,13,19,20. Celite concentratie is aangetoond dat soortgelijke niveaus van virus herstellen tot die van andere secundaire concentratie methoden 8,14 uit diverse matrices, terwijl met snellere en eenvoudigere monster verwerking procedures.
Vanwege wisselende buitenste capside structuren, kunnen bepaalde virussen fysiek klem komen te zitten in de filter matrix 21, noodzakelijk de evaluatie van de verschillende additieven om elutie protocollen te filteren. Bijvoorbeeld, toevoeging van surfactant, natriumpolyfosfaat verbeterde zowel bacteriële en virale herstel in primaire concentratie 6,13,22-24. Anderzijds, lage herstel waargenomen na toevoeging van trypsine aan dat proteasen niet helpen bij klieving van het eiwit vezels op de buitenste virale capside. Hoewel voorts niet ongewoon 7,25,26, is het opmerkelijk dat sommige terugvorderingen waren dan 100%. Zoals eerder aangetoond 7,25,26, is dit waarschijnlijk te wijten aan de kluiten laboratorium vervaardigde virus gebruikt als spike.
Het kleine volume (100 ml virus spiked water) concentratie aanpak gepresenteerd kan een praktische manier te ontwikkelen en te optimaliseren virus concentratie methoden, vanwege zijn eenvoud en lage verbruik van middelen, samen met snelle monster verwerking tijd. Het gebruik van dergelijke kleine hoeveelheden water, wordt de concentratie van de PCR-remmers binnen de steekproef ook tot een minimum beperkt, maar wordt aanbevolen dat elke bron water worden gecontroleerd op de aanwezigheid van PCR remmers voorafgaand aan het experimenteren. Sinds vele keuzes van beide filters en secundaire concentratie technieken bestaan, klein volume concentratie technieken zorgen voor een snelle evaluatie van een groot aantal variabelen. Het is te hopen dat deze technieken voorafgaand aan grootschalige filtratie experimenten kunnen worden ingezet om te helpen bij het identificeren van welke omstandigheden optimaal zijn voor doelwit virus concentratie per gegeven water matrices zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenovirus 40 stock | ATCC | VR-931 | |
| Adenovirus 41 stock | ATCC | VR-930 | |
| Sodium Thiosulfate | Fluka Chemical Co. | 72051 | |
| Celites #577 | Fluka Chemical Co. | 22142 | |
| NanoCeram 47 mm | Argonide | N/A | |
| 1MDS 47 mm | 3M | 6408502 | |
| AP-20 Prefilter 47 mm | Millipore Corp. | AP2004700 | |
| Glycine | Sigma | 50046-1KG | |
| Sodium Polyphosphate | Acros Organics | 390930010 | |
| Trypsin | Gibco | 25200 | |
| PBS | Sigma | P5368 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A481-212 | |
| BBL Beef Extract | BD Biosciences | 212303 | |
| Difco Beef Extract | BD Biosciences | 211520 | |
| ABI 7900 Real-time PCR system | ABI | N/A | |
| Stainless Steel Filter Housing | Millipore Corp. | XX2004720 | |
| Blood DNA Extraction Kit | Qiagen | 51104 | |
| EPA MPN Calculator | http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html |
References
- Sinclair, R. G., Jones, E. L., Gerba, C. P. Viruses in recreational water-borne disease outbreaks: a review. Journal of Applied Microbiology. 107, 1769-1780 (2009).
- WHO. Guidelines for Safe Recreational Water Environments. , World Health Organization. Geneva. (2003).
- Westrell, T., et al. Norovirus outbreaks linked to oyster consumption in the United Kingdom. Euro Surveillance : Bulletin Europeen Sur les Maladies Transmissibles = European Communicable Disease Bulletin. 15, Norway, France, Sweden and Denmark. (2010).
- Wong, K., Fong, T. T., Bibby, K., Molina, M. Application of enteric viruses for fecal pollution source tracking in environmental waters. Environment International. 45, 151-164 (2012).
- Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. Journal of Applied Microbiology. 115, 1-11 (2013).
- Ikner, L. A., Soto-Beltran, M., Bright, K. R. New method using a positively charged microporous filter and ultrafiltration for concentration of viruses from tap water. Applied and Environmental Microbiology. 77, 3500-3506 (2011).
- Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water. Applied and Environmental Microbiology. 75, 2393-2399 (2009).
- McMinn, B. R., Cashdollar, J. L., Grimm, A. C., Fout, G. S. Evaluation of the celite secondary concentration procedure and an alternate elution buffer for the recovery of enteric adenoviruses 40 and 41. Journal of Virological Methods. 179, 423-428 (2012).
- Katzenelson, E., Fattal, B., Hostovesky, T. Organic flocculation: an efficient second-step concentration method for the detection of viruses in tap water. Applied and Environmental Microbiology. 32, 638-639 (1976).
- Fout, G. S., Schaefer, F. W. 3rd, Messer, J. W., Dahling, D. R. ICR microbial laboratory manual. 178, US Environmental Protection Agency. Washington, D.C. (1996).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153, 79-83 (2008).
- Calgua, B., et al. Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas. Water Research. 47, 2797-2810 (2013).
- McMinn, B. R. Optimization of adenovirus 40 and 41 recovery from tap water using small disk filters. Journal of Virological Methods. 193 (2), 284-290 (2013).
- Brinkman, N. E., Haffler, T. D., Cashdollar, J. L., Rhodes, E. R. Evaluation of methods using celite to concentrate norovirus, adenovirus and enterovirus from wastewater. Journal of Virological Methods. 193, 140-146 (2013).
- Albinsson, B., Kidd, A. H. Adenovirus type 41 lacks an RGD alpha(v)-integrin binding motif on the penton base and undergoes delayed uptake in A549 cells. Virus Research. 64, 125-136 (1999).
- He, C., Lian, J. S., Jiang, Q. Electronic structures and hydrogen bond network of high-density and very high-density amorphous ices. The Journal of Physical Chemistry. B. 109, 19893-19896 (2005).
- Sedmak, G., Bina, D., Macdonald, J., Couillard, L. Nine-year study of the occurrence of culturable viruses in source water for two drinking water treatment plants and the influent and effluent of a Wastewater Treatment Plant in Milwaukee, Wisconsin. 71, 1042-1050 (2005).
- Soto-Beltran, M., Ikner, L. A., Bright, K. R. Effectiveness of poliovirus concentration and recovery from treated wastewater by two electropositive filter methods. Food and Environmental Virology. 5, 91-96 (2013).
- Haramoto, E., Katayama, H. Application of acidic elution to virus concentration using electropositive filters. Food and Environmental Virology. 5, 77-80 (2013).
- Lee, H., et al. Evaluation of electropositive filtration for recovering norovirus in water. Journal of Water and Health. 9, 27-36 (2011).
- Gibbons, C. D., Rodriguez, R. A., Tallon, L., Sobsey, M. D. Evaluation of positively charged alumina nanofibre cartridge filters for the primary concentration of noroviruses, adenoviruses and male-specific coliphages from seawater. Journal of Applied Microbiology. 109, 635-641 (2010).
- Hill, V. R., et al. Development of a rapid method for simultaneous recovery of diverse microbes in drinking water by ultrafiltration with sodium polyphosphate and surfactants. Applied and Environmental Microbiology. 71, 6878-6884 (2005).
- Polaczyk, A. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. Evaluation of 1MDS electropositive microfilters for simultaneous recovery of multiple microbe classes from tap water. Journal of Microbiological Methods. 68, 260-266 (2007).
- Rhodes, E. R., Hamilton, D. W., See, M. J., Wymer, L. Evaluation of hollow-fiber ultrafiltration primary concentration of pathogens and secondary concentration of viruses from water. Journal of Virological Methods. 176, 38-45 (2011).
- Melnick, J. L., et al. Round robin investigation of methods for the recovery of poliovirus from drinking water. Applied and Environmental Microbiology. 47, 144-150 (1984).
- Schwab, K. J., De Leon, R., Sobsey, M. D. Concentration and purification of beef extract mock eluates from water samples for the detection of enteroviruses, hepatitis A virus, and Norwalk virus by reverse transcription-PCR. Applied and Environmental Microbiology. 61, 531-537 (1995).
