Introduction
Menneskelige enteriske virus er viktige utløsende agenter for vannbårne sykdommer 1-3, men er generelt til stede i lave tall i forurenset miljø farvann, noe som gjør deteksjon deres vanskelig uten konsentrasjon. Fremgangsmåtene anvendt for å konsentrere virus typisk omfatte et filtreringstrinn, etterfulgt av filter eluering, og sekundære konsentrasjon av filter eluat. En vanlig filtrering prosedyre er avhengig av bruk av ladede membraner som elektropositive filtre (nylig anmeldt i 4,5). Disse filtrene er avhengige av å fange virus suspendert i vann ved hjelp av elektrostatiske interaksjoner mellom filterflaten (positivt ladet), og målrettede viruspartikler (negativt ladet). To elektropositive filtre som er kommersielt tilgjengelig stole på denne teknologien, de glass / cellulose og nano-alumina / glassfiberfiltre. De glass / cellulose filter kostnadene er opptil 10 ganger så stort som i nano-alumina / glassfiber, som begrenser bruken av glass / cellulose filtre for rutine virus overvåking. Nyere studier har konkludert forskjellene er nominell mellom disse to filtre i utvinningen av enterovirus fra ambient vann 6,7, forklarer bruken av et billigere filter alternativ. Andre filteret slik som elektronegative og glass-ull filtre har vært undersøkt, men de krever enten forbehandling av kilde vann (elektrofiltre) eller ikke er kommersielt tilgjengelige (glass-ull filter). Utviklingen av viruskonsentrasjons prosedyrer har hovedsakelig fokusert på å optimalisere primære konsentrasjonsteknikker (filtre) for å bedre virus inngang fra vann. Men sekundære konsentrasjons prosedyrer, som reduserer volumet av elueringsmiddel vanligvis fra en L til milliliter volumer, kan også ha en betydelig innvirkning på virus inngang 8.
Sekundær konsentrasjon av enteriske virus avhenger typisk av et flokkulerende middel, så som noen typer kjøttekstrakt (organisk floccuning) eller skummet melk flokkulering 9-12 for å fjerne viruspartikler fra filterflater. Nylig har en annen sekundær-konsentrasjonen Fremgangsmåten ved bruk av biff-ekstrakt kombinert med tilsetning av celitt (fine partikler) vist seg lovende for gjenvinning av adenovirus, enterovirus, og norovirus 8,13,14. Celite konsentrasjons arbeider under lignende måte som den for den organiske flokkuleringsmetoden ved at viruspartiklene fester seg til, og blir frigjort fra partiklene (flokkulat eller celitt) ved å endre pH-verdien i suspensjonen løsning. Sammenligninger mellom disse to sekundære konsentrasjons teknikker har blitt evaluert i utvinningen av piggete adenovirus (AdV) typene 40 og 41 8. Denne studien konkluderte med at de to sekundære konsentrasjonsteknikker var statistisk lik i utvinningen av adenovirus. Imidlertid, den organiske flokkulering metoden krever en 30 min. inkubering ved pH 3,5, mens celitt teknikken krever en kortere inkubasjon (10 min) ved pH 4,0. Den organiske flocculation krever også anvendelse av kostbart laboratorieutstyr (sentrifuger) for å samle flokkulatsentre partikler under tertiært konsentrasjon på celitt teknikk i motsetning bare bruker enkel laboratorieutstyr (vakuumfiltrering) for å separere celit-partikler fra suspensjonen.
Visse kombinasjoner av filtre og sekundære elueringsmetoder kan også påvirke virus inngang. En studie konkluderte med at visse kombinasjoner av primære (elektropositive filtre) og sekundære konsentrasjonsteknikker (Celite eller organisk flokkulering) hadde en betydelig innvirkning på utvinning av adenovirus 13. Disse funnene tyder på at en optimalisering er nødvendig for optimalt å gjenvinne target-virus fra en gitt vannmassen ved hjelp av disse teknikkene. Optimalisering er en tidkrevende, krevende prosess mange forskere aktivt unngå siden mange variabler vil bli evaluert (filtertype / merkevare, pH elueringsoppløsning, celitt / organisk flokkulering).
For denne study, en prosedyre ble utviklet for å identifisere optimale forhold for virus konsentrasjon fra vann ved hjelp av piggete menneskelige adenovirus stammer som 40 og 41. Antagelig siden hver virus type viser en unik capsid morfologi og spesifikk capsid kostnad, kan konsentrasjonsprotokoller må være optimalisert for alle virus målrette for å oppnå optimal viral utvinning. Denne undersøkelsen gir en tilnærming for AdV 40 og 41 konsentrering ved: 1) å evaluere virusgjenvinninger i springvann ved hjelp av elektropositive filterskiver, etterfulgt av 2) evaluering av en etablert organisk flokkuleringsmetoden versus celitt teknikken som en sekundær konsentrasjon, og 3) evaluering av elueringsbuffere for høyere konsentrasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av Glass og filterhus
- Med mindre annet er angitt, sterilisere alle glass, filterhus og løsninger ved 121 ° C i 15 min. For å sikre sterilitet, dekke alle åpninger eller utsatte overflater med enten aluminiumsfolie eller tape-sikret papir før sterilisering.
- Montere filtreringsapparat ved å feste filterhuset (47 mm diameter) til 1 L sidearm Erlenmeyerkolbe. Samle filtre som kreves: mm diameter 47 elektropositive / elektroskivefiltre.
- Forbered 1 liter 1,5% kjøttekstrakt (flokkulering; produserer flokkulatsentre partikler når pH i oppløsningen senket til 3,5, eller ikke-flokkulerende, som ikke tilslag ved pH 3,5), med 0,05 M glysin, ved å oppløse 15 g oksekjøtt-ekstrakt i 1 liter deionisert vann og tilsetning av 3,75 g glycin.
MERK: Ikke-flokkulerings biff ekstrakter vil kreve tillegg av celitt før tertiær konsentrasjon. - Legg eluering additiv natrium polyphosphate til kjøttekstrakt på en 0,1% konsentrasjon.
- Tilsett 1 M saltsyreløsning, dråpevis, til blande biff-ekstrakt, pH-løsningen til det ønskede pH-verdi. Autoklav biff-ekstrakt etter 15-30 min ved 121 ° C.
- Måle 0,1 g fine, medium eller stor partikkel celitt (for bruk med ikke-flokkulering biff ekstrakt bare).
- Forberede vakuum / suging ved å feste kompatibel slangen til Erlenmeyer side-arm kolbe og til vakuumuttaket.
2. Utarbeidelse av løsninger og virus Stock
- Forberede en L 1 M HCl.
- Forberede en L 1 M NaOH.
- Forbered 1 x PBS-oppløsning (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,47 mM K 2 PO 4, og 4,3 mM NaH 2PO 4).
- Justere pH på 1x PBS til 9,0 ved hjelp av en M NaOH.
- Forberede og fortynne lager virus til 10 4 -10 fem mest sannsynlige antall (MPN) ml -1 ved å blande 1 ml lager virus med 9 ml PBS (pH7), som tidligere beskrevet 8,13. Oppbevares ved -80 ° C i 1 ml porsjoner.
- Sterilisere virus lager ved sprøyte filtrering (0,22 mikrometer porestørrelse) for å fjerne potensielle forurensninger.
- Dechlorinated vann fra springen
- Tiltak 1 L sterilt vann fra springen ved hjelp av en steril målesylinder og hell i en 2 L beger inneholder magnetisk oppsikt bar.
- Legg 0,7 g natriumtiosulfat og bland til granuler oppløses. Justere pH i vann fra springen til 7-7,5 om nødvendig ved hjelp av en M HCl eller 1 M NaOH løsning.
- Tine virus spike (1 ml) og legge hele volumet av pigg til en L av deklorert sterilt vann fra springen. Bland i 10 minutter.
- Tilbered en fremgangsmåte emnet (deklorerte springvann uten adenovirus) med hvert eksperiment og prosessen på samme måte som den piggete prøven.
3. Fremstilling av Millipore-filter Apparat
- Fjern steril dekker over filterhuset. Sikreriktig passform mellom filterhuset øvre bolle og nedre filter skjermen for å unngå prøve lekkasje under filtrering.
- Fjern steril belegget fra en L Erlenmeyer-kolbe. Sørg for at korken av filterenheten sitter godt i toppåpningen Erlenmeyerkolbe, skaper en god forsegling.
- Fjern toppen bolle med filterenhet fra nedre filter skjermen, og plassere 47 mm elektropositivt filter disk holdent over hele skjermen med steril pinsett. Fest filterhuset bolle til nederste skjermen og lås på plass ved å vri mot klokken.
4. Tap Water Filtration (Primary Konsentrasjon)
- Mål 100 ml virus piggete vann fra springen ved hjelp av steril målesylinder.
- Hell 100 ml av virus tilsatt vann fra springen i filterhuset inneholder enten en 47 mm plissert glass / cellulose filter eller en nano-alumina / glassfiber disk filter.
- La vannet sakte passere gjennom filteret. Bruke milde vakuum for å fjerne gjenværende rester of tappe vann fra filteroverflaten.
- Ved hjelp av trypsinbehandling, tilsett 5 ml 0,25% trypsin for å filtrere overflate og inkuberes i 5 min.
- Vask trypsin fra filterflaten ved hjelp av 50 ml sterilt avionisert vann.
5. Virus Elusjon fra Filter
- Fjern filterhuset fra to L Erlenmeyerkolbe, og plasser den på 250 ml sidearm kolbe.
- Mål 100 ml kjøttekstrakt ved hjelp av målesylinder. Sakte hell 100 ml kjøttekstrakt inn i filterhuset.
- Tillat biff-ekstrakt for å helle gjennom filteret, fange biff-ekstrakt i et lite (250 ml) Erlenmeyerkolbe. Påfør vakuum for å trekke gjennom rest biff ekstrakt fra filteret.
6. Celitt Sekundær Konsentrasjon
- Overførings kolber som inneholder eluted virus til en røre plate. Legg steril magnetisk oppsikt bar og plass på oppstuss plate, miksing å skape svak vortex.
- Tilsett 0,1 g av celittpulver til 100 ml av biff-ekstrakt, og at celitt for å dispergere. Plasser sterile pH sonde inn kjøttekstrakt.
- Legg slippe klok 1 M HCl til kjøttekstrakt for å oppnå pH 4,0. La det sakte blander i 10 minutter.
- Plasser 47 mm pre-filter på filterhuset (som beskrevet tidligere) under anvendelse av en 2 liters Erlenmeyer-kolbe.
- Hell 100 ml biff ekstrakt / celitt blandingen over pre-filter. Tillate oksekjøtt ekstrakt å helle gjennom. Legge litt vakuum for å trekke gjennom rest biff ekstrakt fra filteret.
- Plassere metall tube klipp på slutten av filterhuset tut. Fest steril 15 ml polypropylen samling rør til metall tube klipp. Plasser filterhuset tilbake i Erlenmeyerkolbe.
- Tilsett 5 ml av 1 x PBS-buffer, pH 9,0 over celitt oppsamlet på forfilteret.
- Tillate PBS å dryppe gjennom pre-filter. Legge litt vakuum for å trekke gjennom rest PBS i 15 ml samling rør.
7. Organic Flokkulering Sekundær Konsentrasjon
- Overfør begrene inneholder elueres virus til en røre plate. Legg steril magnetisk rørestav til 100 ml av kjøttekstrakt og bland for å lage små hvirvel.
- Plasser sterile pH sonde inn kjøttekstrakt.
- Tilsett 1 M HCl dråpevis til kjøttekstrakt og justere pH til 3,5. Bland i 30 minutter.
- Hell eluatet i 250 ml sentrifuge koniske rør og sentrifuger ved 2500 xg i 15 min ved 4 ° C.
- Hell av supernatant ta vare ikke å ikke å forstyrre pelleten. Resuspender pelleten i 5 ml 1 x PBS, pH 9.
- Sentrifuger suspensjonen ved 4000 xg i 10 min ved 4 ° C. Hell av supernatanten og kast pelleten.
- Justere pH til 7-7,5, filtersteriliser gjennom 0,22 um sprøytefilter og fryse ved -80 ° C.
8. Viral nukleinsyreekstraheringsenheten
- Pakk virale nukleinsyrer ved hjelp av en passende kommersiell kit i henhold til produsentens instruksjoner.
- Bruke primere og prober, samt reaksjonsblanding og termiske profiler som publisert 8,13.
MERK: Estimert deteksjonsgrense for analysen er ca 5 qPCR enheter per reaksjon. - Legg komponenter av PCR-amplifikasjon blandinger ved konsentrasjoner som følger: 10 mM Tris (pH 8,3), 50 mM KCl, 4,5 mM MgCl2, 10 mM dNTP, 10 mM primere og probe 1 uM og 0,5 pl av polymerase, slik at endelig volum av 45 pl kan tilsettes passende antall brønner i en 96-brønners PCR-reaksjonsplate.
- Lasten 45 ul av PCR-amplifikasjon blanding til hver brønn av en passende 96-brønners, rask reaksjon PCR-plate.
- Tilsett 5 ul av DNA ekstrahert prøve til hensiktsmessige brønner av PCR-plate.
- Dekk plate med varmebestandig dekselpakning, snurre platen til å flytte noen dråper til bunnen av PCR-plate brønner.
- Satt PCR amplifiseringscykluser som Føllstrømmer: 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser av 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 1 min.
10. data Analyser
- Analyser triplikate målinger av de serielle fem-gangers fortynninger av prøvene som strekker seg over 1: 5 til 1: 625 fortynning område for å bestemme det mest sannsynlige antall (MPN) av de virale partikler, som tidligere beskrevet 8,13.
- Analyser serielle fem-gangers fortynninger av adenovirus eksperimentelle pigger som strekker seg over 1: 5 til 1: 15.625 fortynning område for å bestemme det mest sannsynlige antall (MPN) av de virale partikler.
- Bruke EPA MPN kalkulator (http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html), justerer kalkulatoren til å gjøre rede for type fortynning (1: 5 eller 1:10), antall fortynninger utført, og antall replikere prøver i fortynning serien.
- Utføre log 10 transformasjon av dataene, fulgt ved å normalisere til en volumenhet (f.eks, 1 ml, 100 ml, etc.
- Evaluere effekten av de forskjellige eksperimentelle variabler (for eksempel forskjellige typer celit, pH-områder, forskjellige filtertyper og forskjellige sekundære konsentrasjonsteknikker) på AdV gjenvinninger ved å utføre parametriske og ikke-parametriske statistiske tester (f.eks, paret t-test, en eller to -veis ANOVA), avhengig av fordelingen av de data og den eksperimentelle design.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Celitt utvalg
Tre forskjellige typer celitt ble testet før valg av beste resultater variant. Celites med fin mellomstore partikler produsert de høyeste adenovirus inngang. Bruk av større celites gitt lavere inngang for både AdV40 og 41 (område 32% -100%) (figur 1). Gjennomsnittlig gjenfunn av adenovirus 40 var 144% ± 52% (fin), 115% ± 28% (medium) og 82% ± 53% (stor) partikkel celites og for AdV41, 132% ± 39% (bot), 83% ± 25% (medium) og 50% ± 11% (stor). Enveis ANOVA antydet den optimaliserte celitt teknikk utvinnes statistisk lignende nivåer av AdV40 (P = 0,7920) og 41 (P = 0,1439) som i det organiske flokkuleringsmetoden, som gjenvinnes 75% ± 19% og 109% ± 16%, respektivt Fig. 1 illustrerer forskjellene mellom sekundære konsentrasjonsteknikker og mellom AdV typer.
_content "> Filter type evalueringEtt hundre milliliter mengder virus-piggete, vann fra springen ble konsentrert ved hjelp av enten en plissert glass / cellulose eller nano-alumina / glass fiber plate filter og ble behandlet ved hjelp av enten celitten eller organisk flokkuleringsmetoden. Filtrene ble eluert med okse ekstrakter ved pH 7,5, 9,0, 9,5, 10, 11 og 12 for å bestemme hvilke vil være mest effektiv i å eluere AdV partikler fra filtrene. Glasset / cellulosefilter koblet med oksekjøtt-ekstrakt ved pH 10 og celitt, produserte de høyeste gjenvinninger (ved qPCR / MPN) for AdV40 (52% ± 22%) og AdV41 (64% ± 4%) som er vist i figurene 2 og 3. Kjøttekstrakt pH 10 gjenvunnet betydelig høyere AdV41 enn alle andre pH-verdier (P-verdi Område: 0,0045 til 0,041), mens AdV40 fulgt en lignende, men noe svakere utvikling (P value range: 0,025 til 0,042). Et glass / cellulosefilter ble også evaluert i forbindelse med det organiske flocculation metode. For AdV40, var signifikant høyere gjenvinninger vunnet ved hjelp av biff-ekstrakt pH 10 (40% ± 10%) (P-verdiområde: 0,010 til 0,027), og for AdV41, både pH 9,5 og 10 bedre enn alle andre kjøttekstrakt pH testet (P verdiområde : 0,023 til 0,027) (figur 2 og 3). Generelle, celite teknikken med oksekjøtt-ekstrakt pH 10 ble funnet å være overlegen i forhold til den organiske flokkuleringsmetoden i direkte sammenligninger for gjenvinning av både AdV-stammer.
Optimaliseringer av oksekjøtt ekstrakt tilsetningsstoffer
Den optimaliserte fremgangsmåte (glass / cellulosefilteret ved bruk av biff-ekstrakt pH 10 kombinert med celitt sekundær konsentrasjon) ble sammenlignet med to andre behandlinger: 1) tilsetning av 0,25% trypsin og 2) å supplere kjøttekstrakt med 0,1% natriumpolyfosfat. Tilsetningen av trypsin synes ikke å øke utvinningen av AdV som bare 16% ± 6% og 24% ± 14% av AdV40 og 41 innganger, henholdsvis ble utvunnet (< strong> figur 4). Biff-ekstrakt supplert med 0,1% natriumpolyfosfat ga de høyeste inngang på AdV40 og 41 sammenlignet med den tidligere optimalisert fremgangsmåte. AdV40 utvinning syntes å øke med 13%, og AdV41 utvinning økte med 7% fra forrige metoden, men heller ikke var statistisk signifikant (P-verdi: 0,146). Bruk av høyere prosentandeler av natriumpolyfosfat 1%, 3% og 5% (data ikke vist) ble funnet å være ineffektiv, noe som krever store volumer av syre for å justere pH av disse løsninger til 4,0 i løpet av sekundær konsentrasjon.
Figur 1: Prosent gjenvinning av AdV-40 og AdV-41 basert på sekundære konsentrasjon teknikk (Celite versus Organic fnokk) og typen Celite anvendes. Feilfelt representerer standardavvik (n = 3) 8.
Figur 2: Prosent utvinning av AdV-40 ved hjelp av to typer sekundære konsentrasjonsteknikker (Celite og organisk flokkulatsentre) og to typer filtre (Glass / Cellulose og Nano-alumina / Glass) ved varierende pH-nivåer av kjøttekstrakt. Feilstolpene representerer standardavvik (n = 3) 13.
Figur 3: Prosentvis utvinning av AdV-41 ved hjelp av to typer sekundære konsentrasjonsteknikker (Celite og organisk flokkulatsentre) og to typer filtre (Glass / Cellulose og Nano-alumina / Glass) ved varierende pH-nivåer av kjøttekstrakt. Feilstolpene representerer standardavvik (n = 3) 13.
Figur 4: Virkning av eluering tilsetningsstoffer på utvinning av AdV 40 og AdV 41 konsentrert ved anvendelse av kiselgur som en sekundær konsentrasjon teknikk og Glass / Cellulose. Feilstolpene representerer standardavvik (n = 3) 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Elektropositive filtre er nyttige i å konsentrere virus fra vann; men disse filtre kan variere i deres struktur og sammensetning som i sin tur kunne forandre deres effektivitet. Compounding dette problemet, kapsidbindende strukturer og kostnadene varierer mellom virusstammer som krever konsentrasjon teknikker skreddersys for å sikre optimal utvinning 15. Gjennom enkle modifikasjoner av eksisterende konsentrasjonsteknikker (f.eks elektropositive filtre, kjøttekstrakt elusjonstester), mer effektiv konsentrasjon av målet virus kan oppnås 16,17.
Forskning hittil har vanligvis fokusert på utvinning av virus ved å endre primære konsentrasjon (filtre) trinn, men lite oppmerksomhet har blitt gitt til påfølgende konsentrasjons prosedyrer som også kan påvirke virus utvinning 18. Det er blitt vist at forskjellige sekundære konsentrasjonsteknikker kan påvirke virus inngang 6,13,19,20. Celite konsentrasjon har vist seg å gjenvinne tilsvarende nivåer av virus som for andre sekundære konsentrasjonsmetoder 8,14 fra en rekke matrikser, ved bruk raskere og enklere prøvebehandlingsprosedyrer.
På grunn av varierende ytre kapsidbindende strukturer, kan visse virus blir fysisk innesperret i filtermassen 21, som nødvendiggjør bedømmelsen av forskjellige additiver for å filtrere eluering protokoller. For eksempel, tilsetning av overflateaktivt middel, forbedret natriumpolyfosfat både bakteriell og viral utvinning under primær konsentrasjon 6,13,22-24. På den annen side lave gjenvinninger som observeres etter tilsetning av trypsin indikerer at proteaser ikke hjelpe til spalting av proteinfibrene på den ytre virale kapsid. Videre, mens det ikke uvanlig 7,25,26, er det verdt å merke seg at en del av de gjenvinninger var i overkant av 100%. Som tidligere vist 7,25,26, er dette sannsynligvis på grunn av klumper av laboratoriet utarbeidet virus brukes som spiss.
Det lille volum (100 ml virus tilsatt vann) konsentrasjon tilnærming presenteres kan være en praktisk måte for å utvikle og optimalisere virus konsentrasjonsmetoder, på grunn av sin enkelhet og lavt forbruk av ressurser sammen med hurtigprøvebehandlingstiden. Ved anvendelse av slike små mengder vann, er konsentrasjonen av PCR-inhibitorer i prøven også minimert, men det anbefales at hver kilde vann evalueres for tilstedeværelse av PCR-inhibitorer før eksperimentering. Siden mange valg av både filtre og sekundære konsentrasjons teknikker eksisterer, små volum konsentrasjonsteknikker tillate for raske evalueringer av mange variabler. Håpet er at disse teknikkene kan bli utplassert før storskala filtrering eksperimentering for å hjelpe til med å identifisere hvilke forholdene er optimale for målet virus konsentrasjon per gitte vann matriser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenovirus 40 stock | ATCC | VR-931 | |
| Adenovirus 41 stock | ATCC | VR-930 | |
| Sodium Thiosulfate | Fluka Chemical Co. | 72051 | |
| Celites #577 | Fluka Chemical Co. | 22142 | |
| NanoCeram 47 mm | Argonide | N/A | |
| 1MDS 47 mm | 3M | 6408502 | |
| AP-20 Prefilter 47 mm | Millipore Corp. | AP2004700 | |
| Glycine | Sigma | 50046-1KG | |
| Sodium Polyphosphate | Acros Organics | 390930010 | |
| Trypsin | Gibco | 25200 | |
| PBS | Sigma | P5368 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A481-212 | |
| BBL Beef Extract | BD Biosciences | 212303 | |
| Difco Beef Extract | BD Biosciences | 211520 | |
| ABI 7900 Real-time PCR system | ABI | N/A | |
| Stainless Steel Filter Housing | Millipore Corp. | XX2004720 | |
| Blood DNA Extraction Kit | Qiagen | 51104 | |
| EPA MPN Calculator | http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html |
References
- Sinclair, R. G., Jones, E. L., Gerba, C. P. Viruses in recreational water-borne disease outbreaks: a review. Journal of Applied Microbiology. 107, 1769-1780 (2009).
- WHO. Guidelines for Safe Recreational Water Environments. , World Health Organization. Geneva. (2003).
- Westrell, T., et al. Norovirus outbreaks linked to oyster consumption in the United Kingdom. Euro Surveillance : Bulletin Europeen Sur les Maladies Transmissibles = European Communicable Disease Bulletin. 15, Norway, France, Sweden and Denmark. (2010).
- Wong, K., Fong, T. T., Bibby, K., Molina, M. Application of enteric viruses for fecal pollution source tracking in environmental waters. Environment International. 45, 151-164 (2012).
- Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. Journal of Applied Microbiology. 115, 1-11 (2013).
- Ikner, L. A., Soto-Beltran, M., Bright, K. R. New method using a positively charged microporous filter and ultrafiltration for concentration of viruses from tap water. Applied and Environmental Microbiology. 77, 3500-3506 (2011).
- Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water. Applied and Environmental Microbiology. 75, 2393-2399 (2009).
- McMinn, B. R., Cashdollar, J. L., Grimm, A. C., Fout, G. S. Evaluation of the celite secondary concentration procedure and an alternate elution buffer for the recovery of enteric adenoviruses 40 and 41. Journal of Virological Methods. 179, 423-428 (2012).
- Katzenelson, E., Fattal, B., Hostovesky, T. Organic flocculation: an efficient second-step concentration method for the detection of viruses in tap water. Applied and Environmental Microbiology. 32, 638-639 (1976).
- Fout, G. S., Schaefer, F. W. 3rd, Messer, J. W., Dahling, D. R. ICR microbial laboratory manual. 178, US Environmental Protection Agency. Washington, D.C. (1996).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153, 79-83 (2008).
- Calgua, B., et al. Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas. Water Research. 47, 2797-2810 (2013).
- McMinn, B. R. Optimization of adenovirus 40 and 41 recovery from tap water using small disk filters. Journal of Virological Methods. 193 (2), 284-290 (2013).
- Brinkman, N. E., Haffler, T. D., Cashdollar, J. L., Rhodes, E. R. Evaluation of methods using celite to concentrate norovirus, adenovirus and enterovirus from wastewater. Journal of Virological Methods. 193, 140-146 (2013).
- Albinsson, B., Kidd, A. H. Adenovirus type 41 lacks an RGD alpha(v)-integrin binding motif on the penton base and undergoes delayed uptake in A549 cells. Virus Research. 64, 125-136 (1999).
- He, C., Lian, J. S., Jiang, Q. Electronic structures and hydrogen bond network of high-density and very high-density amorphous ices. The Journal of Physical Chemistry. B. 109, 19893-19896 (2005).
- Sedmak, G., Bina, D., Macdonald, J., Couillard, L. Nine-year study of the occurrence of culturable viruses in source water for two drinking water treatment plants and the influent and effluent of a Wastewater Treatment Plant in Milwaukee, Wisconsin. 71, 1042-1050 (2005).
- Soto-Beltran, M., Ikner, L. A., Bright, K. R. Effectiveness of poliovirus concentration and recovery from treated wastewater by two electropositive filter methods. Food and Environmental Virology. 5, 91-96 (2013).
- Haramoto, E., Katayama, H. Application of acidic elution to virus concentration using electropositive filters. Food and Environmental Virology. 5, 77-80 (2013).
- Lee, H., et al. Evaluation of electropositive filtration for recovering norovirus in water. Journal of Water and Health. 9, 27-36 (2011).
- Gibbons, C. D., Rodriguez, R. A., Tallon, L., Sobsey, M. D. Evaluation of positively charged alumina nanofibre cartridge filters for the primary concentration of noroviruses, adenoviruses and male-specific coliphages from seawater. Journal of Applied Microbiology. 109, 635-641 (2010).
- Hill, V. R., et al. Development of a rapid method for simultaneous recovery of diverse microbes in drinking water by ultrafiltration with sodium polyphosphate and surfactants. Applied and Environmental Microbiology. 71, 6878-6884 (2005).
- Polaczyk, A. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. Evaluation of 1MDS electropositive microfilters for simultaneous recovery of multiple microbe classes from tap water. Journal of Microbiological Methods. 68, 260-266 (2007).
- Rhodes, E. R., Hamilton, D. W., See, M. J., Wymer, L. Evaluation of hollow-fiber ultrafiltration primary concentration of pathogens and secondary concentration of viruses from water. Journal of Virological Methods. 176, 38-45 (2011).
- Melnick, J. L., et al. Round robin investigation of methods for the recovery of poliovirus from drinking water. Applied and Environmental Microbiology. 47, 144-150 (1984).
- Schwab, K. J., De Leon, R., Sobsey, M. D. Concentration and purification of beef extract mock eluates from water samples for the detection of enteroviruses, hepatitis A virus, and Norwalk virus by reverse transcription-PCR. Applied and Environmental Microbiology. 61, 531-537 (1995).
