Introduction
Vírus entéricos humanos são importantes causadoras doenças transmitidas pela água 1-3, mas são geralmente presentes em números baixos nas águas ambientais contaminados, tornando difícil a sua detecção, sem concentração. Os procedimentos usados para concentrar os vírus incluem, tipicamente, uma etapa de filtração, seguido por eluição do filtro, e concentração secundária do eluato filtro. Um procedimento de filtração comum se baseia em uso de membranas carregadas, tais como filtros electropositivos (recentemente revisados em 4,5). Estes filtros dependem de captura de vírus em suspensão em água usando interacções electrostáticas entre a superfície de filtro (carregado positivamente) e partículas de vírus segmentados (carregada negativamente). Dois filtros electropositivos que estão disponíveis comercialmente confiam nesta tecnologia, os filtros de vidro / celulose e nano-alumina / fibra de vidro. Os custos de filtro de vidro / celulose são até 10 vezes maior do que a nano-alumina / fibra de vidro, o que limita o uso do vidro / cefiltros llulose para monitoramento de vírus de rotina. Estudos recentes concluíram que as diferenças são nominais entre estes dois filtros em recuperação de enterovírus de 6,7 água do ambiente, o que justifica o uso de um filtro alternativa mais barata. Outras opções de filtros, como filtros electronegativos e de fibra de vidro foram estudadas, no entanto, que quer impor ao pré-tratamento da água de nascente (filtros electronegativos) ou não estão disponíveis comercialmente (filtros de fibra de vidro). O desenvolvimento de processos de concentração de vírus tenha focado principalmente na optimização das técnicas de concentração primária (filtros), a fim de melhorar a recuperação de vírus a partir de água. No entanto, os procedimentos de concentração secundários, os quais reduzem o volume de eluente, tipicamente de 1 L para mililitro volumes, também pode ter um impacto significativo sobre a recuperação de vírus 8.
Concentração Secundária de vírus entéricos normalmente se baseia em um agente de floculação, como alguns tipos de extrato de carne bovina (floccu orgânicamento) ou floculação leite desnatado 9-12 para remover partículas do vírus a partir de superfícies de filtro. Recentemente, um outro processo de concentração secundária utilizando extracto de carne juntamente com a adição de Celite (partícula fina) mostrou-se promissor para a recuperação de adenovírus, enterovírus, e norovírus 8,13,14. Obras de concentração de celite sob princípios semelhantes aos do método de floculação orgânico em que as partículas de vírus para anexar e são libertados de partículas (ou flocos de celite), alterando o pH da solução de suspensão. As comparações entre estas duas técnicas de concentração secundários foram avaliadas em recuperação de adenovírus cravado (Adv) tipos 40 e 41 8. Este estudo concluiu que as duas técnicas de concentração secundários foram estatisticamente semelhantes em recuperação de adenovírus. No entanto, o método de floculação biológica requer um 30 min. de incubação a pH 3,5, enquanto que a técnica de celite requer uma incubação mais curto (10 minutos) a pH 4,0. O flocculat orgânicaião também requer a utilização de equipamento de laboratório caro (centrífugas), para recolher as partículas de flocos durante a concentração terciária, a técnica de celite em contraste utiliza apenas equipamentos básicos de laboratório (filtração no vácuo) para separar as partículas de celite suspensão.
Determinadas combinações de filtros e técnicas de eluição secundárias pode também afectar as recuperações de vírus. Um estudo concluiu que certas combinações de (filtros) electropositivos primárias e secundárias técnicas de concentração (Celite ou floculação orgânica) teve um impacto significativo de recuperação de adenovirus 13. Estes resultados sugerem que a optimização é necessária, a fim de recuperar o vírus alvo de forma óptima a partir de uma dada matriz de água quando se utiliza estas técnicas. Optimization é um demorado, árduo processo muitos pesquisadores evitam ativamente desde inúmeras variáveis serão avaliadas (tipo de filtro / marca, solução de eluição pH, Celite / floculação orgânica).
Para este study, foi desenvolvido um processo para identificar as condições óptimas para a concentração de vírus a partir da água utilizando adenovírus humano cravado estirpes 40 e 41. Presumivelmente, uma vez que cada tipo de vírus exibe uma morfologia única e capsídeo cápside carga específica, protocolos de concentração pode necessitar de ser optimizado para cada vírus alvo, a fim de alcançar a recuperação viral ideal. Este estudo fornece uma abordagem para AdV 40 e 41 concentração por: 1) avaliar as recuperações de vírus na água da torneira usando discos de filtro electropositivos seguidos de 2) avaliação de um método de floculação orgânica estabelecida versus a técnica de celite como uma concentração secundária, e 3) avaliação da tampões de eluição para a concentração terciária.
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Protocol
1. Preparação de material de vidro e Carcaças de filtro
- Salvo disposição em contrário, esterilizar todos os copos, caixas de filtro e soluções a 121 ° C por 15 min. Para garantir a esterilidade, cobrir todas as aberturas ou as superfícies expostas, quer com a folha de alumínio ou papel fixada com fita antes da esterilização.
- Montar aparelho de filtração, anexando carcaça do filtro (47 mm de diâmetro) para 1 L Erlenmeyer braço lateral. Recolha filtros necessários: 47 milímetros de diâmetro electropositivos / electronegative filtros de disco.
- Prepare 1 L de 1,5% de extracto de carne de bovino (floculação; produz partículas de flocos quando o pH da solução é reduzido para 3,5, ou não-floculação, o que não agregar a pH 3,5), com 0,05 M de glicina, por dissolução de 15 g de extracto de carne em 1 L de água desionizada e adição de 3,75 g de glicina.
NOTA: extractos de carne não-floculantes irá requerer a adição de celite antes da concentração terciária. - Adicionar eluição polyph aditivo de sódioosphate de extracto de carne a uma concentração de 0,1%.
- Adicionar uma solução de ácido clorídrico M, gota a gota, a mistura de extrato de carne, o pH da solução de pH desejado. Extracto de carne autoclave durante 15-30 min a 121 ° C.
- Meça 0,1 g de pó fino, médio ou grande celite de partículas (para uso com o não-floculação apenas extrato de carne).
- Prepare vácuo / aspiração, anexando tubo compatível para Erlenmeyer de braço lateral e para a saída de vácuo.
2. Preparação de Soluções e vírus Stock
- Prepare 1 litro de 1 M de HCl.
- Prepare 1 L de NaOH 1M.
- Preparar a solução de PBS 1x (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 1,47 mM de K 2 PO 4, e 4,3 mM de NaH 2 PO 4).
- Ajustar o pH de 1x PBS a 9,0 usando NaOH 1 M.
- Prepare e diluir vírus estoque para 10 4 -10 5 número mais provável (NMP) ml -1 misturando 1 ml de vírus estoque com 9 ml de PBS (pH7), como anteriormente descrito 8,13. Armazenar a -80 ° C em alíquotas de 1 ml.
- Esterilizar estoque de vírus por meio de filtragem seringa (0,22 tamanho dos poros) para remover contaminantes potenciais.
- Água da torneira sem cloro
- Medida 1 L de água da torneira esterilizada utilizando um cilindro graduado estéril e despeje em um copo de 2 L contendo uma barra magnética.
- Adicionar 0,7 g de tiossulfato de sódio e misturar até dissolver grânulos. Ajustar o pH da água da torneira para 7-7,5, se necessário usando 1 M HCl ou solução de NaOH 1 M.
- Spike vírus Thaw (1 ml) e adicionar volume inteiro de pico para 1 L de água sem cloro torneira esterilizada. Mistura-se durante 10 min.
- Preparar um método em branco (sem água declorada adenovírus) com cada experimento e processo da mesma maneira como a amostra enriquecida.
3. Preparação de filtro Millipore Aparelho
- Retirar cobertura estéril sobre caixa do filtro. Garantirbom ajuste entre a caixa do filtro bacia superior e inferior da tela do filtro para evitar a fuga de amostra durante a filtração.
- Retirar cobertura estéril a partir de 1 frasco L Erlenmeyer. Assegure-se que a cortiça da unidade de filtro se encaixa perfeitamente na abertura superior do balão de Erlenmeyer, criar uma boa vedação.
- Remover bacia superior do filtro do filtro de tela menor e coloque 47 milímetros disco filtro electropositive diretamente sobre a tela com uma pinça estéril. Anexar caixa do filtro tigela para a tela de fundo e bloquear no lugar por torção anti-horário.
4. Toque em Filtragem de água (Concentração Primário)
- Medir 100 ml de vírus cravado água da torneira usando estéril proveta graduada.
- Despeje 100 ml de vírus cravado a água da torneira em carcaça de filtro contendo um filtro de 47 milímetros de vidro plissado / celulose ou de um filtro de disco de fibra nano-alumina / vidro.
- Deixe a água passar lentamente pelo filtro. Aplicar vácuo suave para remover os resíduos restantes oágua da torneira f da superfície do filtro.
- Se utilizando tratamento com tripsina, adicionar 5 ml de tripsina a 0,25% para filtrar superfície e incubar durante 5 min.
- Lavar tripsina da superfície do filtro com 50 ml de água desionizada estéril.
5. Vírus de eluição Filtrar
- Remover caixa do filtro de 2 balão L Erlenmeyer, e coloque-frasco de 250 ml de braço lateral.
- Medir 100 ml de extrato de carne usando proveta graduada. Juntar cuidadosamente 100 ml de extrato de carne em carcaça de filtro.
- Permitir extrato de carne bovina para derramar através do filtro, captando extrato de carne em um pequeno (250 ml) Erlenmeyer. Aplicar vácuo para puxar através de extrato de carne residual de filtro.
6. Celite Concentração Secundário
- Frascos de transferência contendo os vírus eluídas a uma placa de agitação. Adicionar estéril barra magnética e lugar na placa de agitação, mistura para criar ligeiro vórtice.
- Adicionar 0,1 g de celiteem pó a 100 ml de extracto de carne e permitir celite para dispersar. Coloque sonda pH estéril em extrato de carne.
- Adicionar gota a gota 1 M HCl de extrato de carne bovina para atingir pH 4.0. Permitir que a mistura lentamente, durante 10 min.
- Colocar 47 milímetros pré-filtro no alojamento do filtro (como descrito anteriormente) utilizando um balão de Erlenmeyer de 2 L.
- Despeje 100 ml de extrato de carne / mistura celite sobre pré-filtro. Permitir extrato de carne bovina para derramar through. Aplique uma leve vácuo para puxar através de extrato de carne residual de filtro.
- Coloque clipe de tubo de metal no final do bico caixa do filtro. Anexar estéril 15 ml tubo de coleta de polipropileno para o clipe tubo de metal. Coloque caixa do filtro de volta para Erlenmeyer.
- Adicionar 5 ml de tampão 1x PBS, pH 9.0 sobre celite recolhido em pré-filtro.
- Permitir PBS a gotejar através de pré-filtro. Aplique uma leve vácuo para puxar através PBS residual em 15 ml tubo de coleta.
7. Floculação Organic Concentração Secundário
- Transfira os copos contendo o vírus eluída a uma placa de agitação. Adicionar estéril barra magnética a 100 ml de extrato de carne e misture para criar ligeiro vórtice.
- Coloque sonda pH estéril em extrato de carne.
- Adicione 1 HCl M gota a gota a extrato de carne e ajustar o pH para 3,5. Mistura-se durante 30 min.
- Verter o eluído em 250 ml de tubos de centrífuga cónicos e centrifugar a 2500 xg durante 15 min a 4 ºC.
- Deitar fora sobrenadante tomando cuidado para não para não perturbar o sedimento. Ressuspender o sedimento em 5 ml de 1x PBS, pH 9.
- Centrifugar a suspensão a 4000 xg durante 10 min a 4 ºC. Retirar o sobrenadante e descartar o pellet.
- Ajustar o pH a 7-7,5, filtro de esterilização através de filtro de seringa de 0,22 um e congelamento a -80 ° C.
8. Viral Extraction Nucleic Acid
- Extrai-se os ácidos nucleicos virais utilizando um kit comercial adequado de acordo com as instruções do fabricante.
- Use iniciadores e sondas, bem como mistura de reacção e perfis de ciclos térmicos como publicado 8,13.
NOTA: O limite de detecção estimado para o ensaio é de cerca de 5 unidades de qPCR por reacção. - Adicionar componentes de misturas de amplificação por PCR em concentrações como se segue: Tris 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, 4,5 mM de MgCl 2, 10 mM dNTPs, 10 uM iniciadores e sonda de 1 uM e 0,5 jil de polimerase de modo a que os volumes finais de 45 ul pode ser adicionado ao número adequado de poços no prazo de uma placa de 96 poços de reacção de PCR.
- Carga 45 ul de mistura de amplificação de PCR a cada poço adequado de uma de 96 poços, de reacção rápida placa de PCR.
- Adiciona-se 5 ul de amostra de ADN extraído a poços apropriados da placa de PCR.
- Espelho com vedação da tampa resistente ao calor, girar a placa para mover as gotas para o fundo da PCR poços da placa.
- Definir ciclos de amplificação de PCR como Follows: 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 seg e 60 ° C durante 1 min.
10. Análise de Dados
- Analisar as medições em triplicado de diluições em série de 5 vezes das amostras distribuidas 1: 5 a 1: 625 de diluição intervalo, a fim de determinar o número mais provável (MPN) das partículas virais, como anteriormente descrito 8,13.
- Analise diluições em série de 5 vezes de picos experimentais adenovirus abrangendo 1: 5 a 1: 15.625 gama de diluição, a fim de determinar o número mais provável (MPN) das partículas virais.
- Usando a calculadora EPA MPN (http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html), ajustar a calculadora para contabilizar tipo de diluição (1: 5 ou 1:10), o número de diluições realizadas e número de duplicados de amostras em séries de diluição.
- Realizar log 10 de transformação dos dados, seguido por normalização para uma unidade de volume (por exemplo, 1 ml, 100 ml, etc.
- Avaliar o efeito das diferentes variáveis experimentais (por exemplo, diferentes tipos de Celite, gamas de pH, os diferentes tipos de filtros e diferentes técnicas de concentração secundários) sobre recuperações por AdV realizar testes estatísticos paramétricos ou não-paramétricos (por exemplo, teste-t emparelhado, um ou dois -way ANOVA), dependendo da distribuição dos dados e do desenho experimental.
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Representative Results
Seleção Celite
Três tipos diferentes de celite foram testados antes da selecção da variante com melhor desempenho. Celites com multa de partículas de tamanho médio produzido as maiores recuperações de adenovírus. Uso de celites maiores percentagens de recuperação mais baixas para ambos AdV40 e 41 (gama de 32% -100%) (Figura 1). A recuperação média de adenovirus 40 eram de 144% ± 52% (multa), 115% ± 28% (média) e 82% ± 53% celites (grande) de partículas e para AdV41, 132% ± 39% (multa), 83% ± 25% (média) e 50% ± 11% (grande). ANOVA de uma via indicada a técnica de celite optimizado recuperado níveis estatisticamente semelhantes de AdV40 (P = 0,7920) e 41 (P = 0,1439) para a do método de floculação orgânica, que se recuperou 75% ± 19% e 109% ± 16%, respectivamente . A figura 1 ilustra as diferenças entre as técnicas de concentração secundárias e entre tipos de adv.
_content "> avaliação Tipo de FiltroUma centena de volumes mililitros de, a água da torneira cravado-virus foram concentrados usando um plissado vidro / celulose ou nano-alumina / vidro filtro de disco de fibra e foram processados utilizando o método de floculação celite ou orgânica. Os filtros foram eluídos com extractos de carne, a pH 7,5, 9,0, 9,5, 10, 11 e 12 para determinar qual seria mais eficaz em partículas eluindo AdV de filtros. O filtro de vidro / celulose acoplado com extracto de carne de bovino, a pH 10 e celite, produziu as maiores recuperações (por qPCR / NMP) para AdV40 (52% ± 22%) e AdV41 (64% ± 4%), que são mostrados nas Figuras 2 e 3. Beef extrato pH 10 recuperou AdV41 significativamente maiores do que todos os outros valores de pH (variação de valor P: ,0045-0,041), enquanto AdV40 seguiu um semelhante, embora um pouco mais fraca tendência (faixa de valor P: 0,025-0,042). Um filtro de vidro / celulose também foi avaliada em conjunto com o flocculatio orgânicaMétodo n. Para AdV40, recuperações significativamente maiores foram obtidas utilizando extrato de carne pH 10 (40% ± 10%) (faixa de valor P: 0,010-0,027), e para AdV41, tanto pH 9,5 e 10 superou todas as outras extrato de carne pH testada (faixa de valor P : 0,023-0,027) (Figuras 2 e 3). Em geral, a técnica de celite com extracto de carne de pH 10 foi encontrado para ser superior ao do método de floculação orgânico em comparações directas para a recuperação de ambas as estirpes de AdV.
Otimizações dos aditivos extrato de carne bovina
O método optimizado (filtro de vidro / celulose usando extracto de carne pH 10 acoplado com a concentração de derivado de celite) foi comparado com dois outros tratamentos: 1) adição de 0,25% de tripsina e 2) completa o extracto de carne de vaca com polifosfato de sódio a 0,1%. A adição de tripsina não pareceu melhorar a recuperação de AdV como apenas 16% ± 6% e 24% ± 14% de AdV40 e 41 entradas, respectivamente, foram recuperados (< forte> Figura 4). Extracto de carne de bovino suplementado com polifosfato de sódio a 0,1% produziu as maiores recuperações de AdV40 e 41 em comparação com a do método optimizado anterior. Recuperação AdV40 pareceu aumentar em 13%, e recuperação AdV41 aumentou 7% em relação ao método anterior, mas também não foi estatisticamente significativa (valor P: 0,146). A utilização de maiores percentagens de polifosfato de sódio a 1%, 3% e 5% (dados não mostrados) verificou-se ser ineficaz, o que requer grandes volumes de ácido para ajustar o pH destas soluções a 4,0 durante a concentração secundária.
Figura 1: Percentagem de recuperação AdV- 40 e AdV-41 com base na técnica de concentração secundária (Celite contra flocos orgânica) e do tipo de Celite utilizado. As barras de erro representam o desvio padrão (n = 3) 8.
Figura 2: Percentagem de recuperação AdV-40 com dois tipos de técnicas de concentração secundários (Celite e flocos orgânica) e dois tipos de filtros (Vidro / Celulose e Nano-alumina / vidro) em diferentes níveis de extrato de carne de pH. As barras de erro representam o desvio padrão (n = 3) 13.
Figura 3: Percentagem de recuperação AdV-41 com dois tipos de técnicas de concentração secundários (Celite e flocos orgânica) e dois tipos de filtros (Vidro / Celulose e Nano-alumina / vidro) em diferentes níveis de extrato de carne de pH. As barras de erro representam o desvio padrão (n = 3) 13.
Figura 4: O efeito de aditivos sobre a recuperação de eluição de AdV 40 e 41 AdV concentrada utilizando Celite como uma técnica de concentração secundária e vidro / celulose. As barras de erro representam o desvio padrão (n = 3) 13.
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Discussion
Filtros electropositiva são úteis na concentração vírus de água; no entanto, estes filtros podem diferir na sua estrutura e composição, que por sua vez poderia alterar a sua eficácia. Para agravar este problema, as estruturas do capsídeo e encargos variam entre cepas de vírus que requerem ser adaptados técnicas de concentração para garantir a recuperação óptima 15. Através de modificações simples das técnicas de concentração existentes (por exemplo, filtros electropositivos, extracto de carne de eluição), a concentração mais eficaz de vírus alvo podem ser obtidos 16,17.
A pesquisa atual tipicamente focado na recuperação de vírus, modificando a concentração primária (filtros) passos, mas pouca atenção tem sido dada aos processos de concentração subseqüentes que também pode influenciar na recuperação do vírus 18. Tem sido demonstrado que as diversas técnicas de concentração secundários podem afectar as recuperações de vírus 6,13,19,20. Celiconcentração de te foi mostrado para recuperar níveis semelhantes de vírus ao de outros métodos de concentração secundários 8,14 a partir de uma variedade de matrizes, enquanto utilizando procedimentos de processamento mais simples e mais rápida da amostra.
Devido a diferentes estruturas do capsídeo externo, certos vírus pode tornar-se fisicamente preso no interior da matriz do filtro 21, sendo necessária a avaliação de diferentes aditivos para filtrar protocolos de eluição. Por exemplo, a adição de surfactante, polifosfato de sódio melhorou tanto a recuperação bacteriana e viral durante a concentração primária 6,13,22-24. Por outro lado, as recuperações baixos observados após a adição de tripsina indicam que as proteases não ajudar na clivagem das fibras de proteína da cápside viral no exterior. Além disso, embora não seja raro 7,25,26, é de notar que alguns dos nossos recuperações foram em excesso de 100%. Como anteriormente mostrado 7,25,26, esta é provavelmente devido à aglomeração de laboratório preparada virus usado como pico.
O pequeno volume (100 ml vírus cravado água) abordagem concentração apresentada pode ser uma maneira prática para desenvolver e otimizar métodos de concentração de vírus, devido à sua simplicidade e baixo consumo de recursos, juntamente com rápido tempo de processamento da amostra. Utilizando tais pequenos volumes de água, a concentração de inibidores de PCR dentro da amostra também é minimizada, no entanto, recomenda-se que cada fonte de água ser avaliadas quanto à presença de inibidores de PCR antes da experimentação. Uma vez que existem diversas opções de ambos os filtros e técnicas de concentração secundários, técnicas de concentração de volume pequenas para permitir a avaliação rápida de numerosas variáveis. Espera-se que estas técnicas podem ser utilizados antes de filtração experimentação em larga escala para ajudar a identificar quais as condições são ideais para a concentração de vírus alvo per dadas as matrizes de água.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenovirus 40 stock | ATCC | VR-931 | |
| Adenovirus 41 stock | ATCC | VR-930 | |
| Sodium Thiosulfate | Fluka Chemical Co. | 72051 | |
| Celites #577 | Fluka Chemical Co. | 22142 | |
| NanoCeram 47 mm | Argonide | N/A | |
| 1MDS 47 mm | 3M | 6408502 | |
| AP-20 Prefilter 47 mm | Millipore Corp. | AP2004700 | |
| Glycine | Sigma | 50046-1KG | |
| Sodium Polyphosphate | Acros Organics | 390930010 | |
| Trypsin | Gibco | 25200 | |
| PBS | Sigma | P5368 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A481-212 | |
| BBL Beef Extract | BD Biosciences | 212303 | |
| Difco Beef Extract | BD Biosciences | 211520 | |
| ABI 7900 Real-time PCR system | ABI | N/A | |
| Stainless Steel Filter Housing | Millipore Corp. | XX2004720 | |
| Blood DNA Extraction Kit | Qiagen | 51104 | |
| EPA MPN Calculator | http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html |
References
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