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Neuroscience

Gleichzeitige Langzeit-Aufnahmen auf zwei neuronale Verarbeitungsstufen in Behaving Honigbienen

doi: 10.3791/51750 Published: July 21, 2014

Summary

Gleichzeitige extrazellulären langfristige Aufnahmen von zwei verschiedenen Hirn Neuropile oder zwei unterschiedliche anatomische Bahnen wurden in Honigbienen etabliert. Diese Aufnahmen ermöglichen die Untersuchung der zeitlichen Aspekte der neuronalen Verarbeitung zwischen verschiedenen Hirnregionen an der einzelnen Neurons als auch auf Ebene des Ensembles in einem Tier verhalten.

Abstract

In beiden Säugetieren und Insekten neuronale Informationen werden in verschiedenen höheren und niedrigeren Auftragsgehirnzentren verarbeitet. Diese Zentren werden über konvergente und divergente anatomischen Verbindungen einschließlich Vorwärts-und Feedback-Verkabelung verbunden. Weiterhin Information des gleichen Ursprungs teilweise über parallele Pfade zu verschiedenen und manchmal in den gleichen Gehirnbereichen gesendet. Um die evolutionären Vorteile sowie die rechnerische Vorteile dieser Verdrahtung Strategien und vor allem ihre zeitliche Abhängigkeiten voneinander zu verstehen, ist es notwendig, den gleichzeitigen Zugriff auf einzelne Neuronen verschiedener Verträge oder Neuropile in der gleichen Vorbereitung mit hoher zeitlicher Auflösung. Hier konzentrieren wir uns auf die Honigbienen durch den Nachweis einer einzigartigen extrazellulären langfristigen Zugang zu Multi-Unit-Aktivität an zwei aufeinanderfolgenden Neuropile 1, Antennallobus (AL), der ersten olfaktorischen Verarbeitungsstufe und dem Pilzkörper (MB), einer höheren Ordnung Integrationszentrum invo aufnehmenLernen und Gedächtnis Aufstellung oder zwei parallele neuronale Traktate 2 Verbinden des AL mit dem MB lved. Letztere wurde als Beispiel gewählt und wird in voller beschrieben werden. In der Video-Unterstützung der Bau und die ständige Einführen von flexiblen Mehrkanal-Drahtelektroden wird demonstriert. Paarweise Differenzverstärkung der Mikrodrahtelektrode Kanäle drastisch verringert das Rauschen und überprüft, dass die Quelle des Signals wird genau auf die Position der Elektrodenspitze zusammen. Die mechanische Flexibilität der verwendeten Drahtelektroden ermöglicht eine stabile invasive Langzeitaufnahmen über mehrere Stunden bis zu Tagen, was ein klarer Vorteil ist im Vergleich zu herkömmlichen extra und intrazellulären in vivo-Aufnahmetechniken.

Introduction

Honigbienen als auch die meisten anderen Insekten stark auf den Geruchssinn. Unter anderem nutzen sie Geruchssinn zur Orientierung, Paarung, Kommunikation mit Artgenossen und Nahrungssuche. Die gut ausge olfaktorische System trägt zu einem reichen Repertoire an Lernverhalten zu floralen Geruch Reize. Diese Verhaltensweisen können leicht unter kontrollierten Laborbedingungen untersucht werden (für eine Übersicht siehe 3-5). Ihre "Mini-Gehirn" (vgl. 6) mit ihrer relativ kleinen Zahl von Neuronen macht die Honigbiene eine gut geeignet Modellorganismus für das Studium olfaktorischen Codierung und Lernen während der Überwachung der neuronalen Aktivität.

Das olfaktorische System in Insekten als auch in Säugetieren zeigt analog Organisation zu einem großen Teil (für eine Übersicht siehe 7,8). In Honigbienen etwa 80.000 Rezeptorneuronen 9 in Sensillen liegt entlang der Antennen 10,11 übersetzen die Umweltgeruchsreiz in eine neuronal-Signal. Axone von olfaktorischen Rezeptorneuronen innervieren die Antennallobus (AL), die eine glomeruläre Organisation vergleichbar mit der Wirbelriechkolben hat. Die AL umfasst etwa 164 Glomeruli miteinander durch etwa 4.000 lokale Inter (LN) miteinander verbunden sind (für einen Überblick siehe 12). Vor allem in der Honigbiene wurde vor kurzem gezeigt, dass LK bieten lückenSeiten Konnektivität und dass verschiedene Bevölkerungsgruppen besitzen elementare und konfigurale Riech Codiereigenschaften 13,14. Die AL wurde gezeigt, in eine ventrale und dorsale Hemi Lappen, die zu den medialen und lateralen Antennalloben-Darm-Trakt (m-und l-ALT unterteilt werden, früher genannt m-und l-APT für medial-und Quer Antennalloben Protocerebralbrücke Trakt 15-17). Hier wird eine neue Terminologie-Darm-Trakt durch eine aktuelle Aufwand für eine einheitliche Nomenklatur der Insektengehirn eingeführt werden verwendet, 18 werden. Beide ALTs (L-und M-ALT) kombinieren entweder 410 (l-ALT) oder 510 (m-ALT) uniglomerular Projection Neuronen (PN) bzw. 15,16,19. PNs der beiden Verträge wurden vor kurzem um Code Gerüche parallel 2 gezeigt (für eine Übersicht siehe 17,20), und beide Verträge synaptisch bilden divergierenden Verbindungen mit Kenyon-Zellen (KC), der Pilzkörper (MB) Haupt Neuronen. Jedes MB enthält etwa 172.000 KCs 21-23. Die MBs sind bei Stimulus-Integration, Lernen und Gedächtnisbildung beteiligt sein. Die Dendriten der axo KCs bilden den Stiel (der Pilz Stiel), die zwei Hauptausgang Regionen hat: die Vertica oder alpha-Lappen und die horizontale oder Beta-Lappen 22,24. Der Ausgang des MB konvergiert nur etwa 400 extrinsischen Neuronen (EN) 24. ENS für olfaktorische Informationsverarbeitung zuständig meist innervieren die ventrale Aspekt der vertikalen Lappen 22 auf. Kürzlich wurde gezeigt, dass eine EN in diesem Bereich aufgezeichnet kodieren die Geruchs Belohnung Verband 25.

Zeitliche als29 - Aspekte innerhalb des olfaktorischen Systems von Insekten sowie Wirbeltiere ein wichtiger und bedeutender Aspekt als eine mögliche Codierung Prinzip 26 zu werden. Um gleichzeitig aufnehmen mehrere Neuronen von verschiedenen Standorten mit hoher zeitlicher Auflösung zu sein, haben wir Doppel Multi Unit Aufnahmetechniken mit maßgeschneiderten, verschiedene Zielregionen in der Biene olfaktorische System eingeführt Mehrkanal-Drahtelektroden. Dieser Ansatz ermöglicht es uns, bei der Honigbiene olfaktorische System auf der Ebene der einzelnen Neuronen und Neuronenpopulationen entweder zwischen parallel Riechbahnen, die Doppel olfaktorischen 2 oder zwischen verschiedenen nachfolgenden Neuropilen 1 analysieren und vergleichen zeitlichen Verarbeitung. Zuletzt mit einem ähnlichen experimentellen Ansatz in der Johannis olfaktorische System 30 mit einer anderen Konfiguration von Elektroden konnten räumlich-zeitliche Kodierung Mechanismus für Hintergrund-invariant Geruchserkennung 31 zu analysieren. Thuns, die etablierten Dual-Aufnahmen ermöglichen die räumliche Informationen über die gleichzeitige neuronale Aktivitätsprofile sammeln.

Im Vergleich zu den breiteren räumlichen Abtastung von Calcium Imaging erhalten diese Methode ermöglicht die Aufnahme von nur zwei Punkten. Ist der Vorteil im Vergleich zu Calcium-Imaging-Techniken ist jedoch die hohe zeitliche Präzision der Aktionspotentialaufzeichnungen, die weder durch herkömmliche CCD-Bilderzeugung oder 2-Photonen-Bildgebung Erfassung bereitgestellt werden kann. Die hier beschriebenen extrazellulären Elektroden dauerhaft implantiert und in Bezug auf die Gehirn-und Kopfkapsel Vermeidung Meßkettendrift fixiert. Dies ist im Vergleich zu der Verwendung von scharfen intrazellulären Elektroden ein klarer Vorteil. Ein weiterer Vorteil im Vergleich zu intrazellulären Kalzium-Imaging-Aufnahmen und ist die erweiterte neuronale Beobachtungszeit von vielen Stunden bis Tagen. Dies ist eine wichtige Voraussetzung für die neuronalen Korrelate von Lernen und Gedächtnisbildung zu untersuchen. Zusätzliche Vorteile von MultiEinheit Aufnahmen werden in der Diskussion Abschnitt beschrieben.

In dieser Übersicht wird die methodische Vorgehensweise der Herstellung von kundenspezifischen Design-Drahtelektroden gezeigt werden wird, von 32,33 angepasst und geeignet für langfristige Multi-Unit-Aufnahmen im Gehirn der Honigbiene. Zusätzlich ist ein Beispiel, wie diese Art von Elektroden dauerhaft an zwei verschiedenen Stellen innerhalb der Aufnahme Honigbiene olfaktorische System implantiert, um gleichzeitig aufnehmen die L-und die m-ALT über lange Zeiträume zu vielen Stimulationsprotokolle zu ermöglichen, wird 2 dargestellt. Für die Überprüfung der Aufnahmepositionen ein Beispiel und Protokoll für die Färbung und nach Aufnahme Visualisierung der Aufnahme Websites bereitgestellt.

Protocol

1. Elektrode Gebäude (1)

  1. Herstellung einer Elektrode Adapter, der die Elektrodenschnittstellenkarte von kommerziellen Mehrkanal-Verstärkersysteme 1,2,25 passt.
    1. Mit einem kleinen Plexiglasplatte zu einem 18 Pin-Anschluss-Sockel geklebt.
    2. Schließen Sie die Basis mit 3 kurze Stücke von isolierten Draht an 3 separate Lötfahnen auf die Plexiglasplatte geschraubt (Abbildung 1 A1-A3).
    3. Legen Sie eine Nut in die Plexiglasplatte, in der eine Glaskapillare leicht bewegen und an Ort und Stelle durch eine Schraube gehalten werden (Abbildung 1 B1).
    4. Verlängern Sie die Glaskapillare etwa 5 mm unter Verwendung eines Minutien-Pin.
    5. Bringen Sie die Mikroelektrodendrähte entlang der Minutien Stift und der Glaskapillare zur Stabilisierung und Unterstützung zu garantieren.
  2. Multi-Kanal-Mikrodrahtproduktion (ab 32,33 Ryuichy Okada übernommen)
    1. Span 3 Mikrodrähte (Polyurethan beschichteten Kupferdraht, 15um Durchmesser) in einer Weise, dass sie nebeneinander angeordnet sind (Fig. 1 B2).
    2. Verwenden Sie eine Nadel Löten 12 V, einen dünnen Film des niedrigen Schmelzdentalwachs (50 ° C), teilweise entlang der Drähte zu verbreiten, um sie zusammen zu kleben (Elektrodenspitze) (Abbildung 1 B3). Lassen Sie ein paar Zentimeter unglued (Elektrodenende), wie dieser Abschnitt wird später verwendet werden, um die Mikrodrähte mit der Elektrode-Adapter verbinden.
  3. Schließen Sie den Multikanal-Mikrodraht an die Elektrode Adapter
    1. Entfernen Sie die Glaskapillare aus der Halterung und befestigen Sie es mit der Minutien Pin auf der Elektrodenspitze. Bringen sie in eine Position parallel zu der Mikroelektrode (Abbildung 1 B3).
    2. Kleben Sie die Elektrodenspitze in die Minutien Stift mit niedrigem Schmelzdentalwachs und schneiden Sie die Mikroelektrode an der Spitze, hervorstehende 2-3 cm von der Minutien Stift und am Elektrodenende (kleine Pfeile Abbildung 1 B3).
    3. Schieben Sie die Kapillare slightly zurück in die Elektrode Adapter. Benutzen Sie die Schraube, um es zu beheben (Abbildung 1 B4).
    4. Löten die losen Enden der drei Drähte an die Lötfahnen mit einem Lötkolben mit einer Temperatur von ca. 360 ° C zum Schmelzen der Isolierung (1 B4) zu gewährleisten. Nach dem Löten sicherzustellen, dass ein ausreichender elektrischer Kontakt (~ 300 kOhm).
    5. Montieren Sie eine der Elektroden (Master) an der Elektrode-Schnittstellenkarte des heads und befestigen Sie die anderen Mehrkanalelektrode (Slave) auf einem separaten Adapter. Schließen Sie die Kanäle des Slaves an den Master-Elektrode (Abbildung 1 C1). Zusätzlich löten die Referenz sowie Muskel-Elektroden an den Master Elektrodenbasis (Abbildung 1 C2).

2. Bee Vorbereitung (Abbildung 2)

In dieser beschriebenen Experimenten wurde die Honigbiene (Apis mellifera), die ein wirbelloses Tier istund erfordert daher keine besondere ethische Genehmigungen für die Nutzung ist, verwendet.

  1. Fangen Honigbiene Häcksler (A. mellifera) am Flugloch am Morgen wie von anderen 34,35 gezeigt.
  2. Kühlen Sie die Bienen auf Crushed Ice bis Immobilisierung (5 bis 10 min) und fixieren Sie ein in einem Standard-Plexiglashalter-oder Metallrohr in einer Weise, dass der Kopf ausgesetzt ist (Abbildung 2 A). Zur Minimierung von Kopfbewegungen verwenden niedrig schmelzenden Dentalwachs (~ 50 ° C) und befestigen Sie den Kopf vorsichtig auf den Inhaber rund um die Basis der Verbindung Augen und den Hals.
  3. Verwenden niedrig schmelzendes Wachs, um die SCAPI der Antennen auf der Kopfkapsel (Abb. 2 B) ohne Berührung der Geißel zu fixieren. Die Geißel der Antenne braucht, um vorwärts gerichtet werden. Stellen Sie sicher, dass die Biene kann frei seinen Rüssel zu bewegen.
  4. Rasur der Kopfkapsel auf einen ungestörten Blick und Zugang zur Oberseite des Kopfes zu gewährleisten.
  5. Führen Sie die Biene mit einem 30% Saccharose-Lösung bis saturatiauf, um eine ausreichende Benetzung von Hirngewebe und eine gute Überlebensfähigkeit des Tieres (Abbildung 2 C) zu gewährleisten.
  6. Stellen vorsichtig Einschnitte vertikal entlang der Grenzen der Facettenaugen und horizontal über den Antennensockel sowie unter der Augenflecken und entfernen Sie den gelösten Stück Nagelhaut (Abbildung 2 D).
  7. Beiseite Hypopharynxdrüsen vorsichtig eingestellt und entfernen Sie die Luftröhre, um eine klare Sicht und Zugang zum Gehirn vor dem Einsetzen (2E, 2F) Elektrode zu gewährleisten.

3. Elektroden Insertion

In der in Fig. 2 dargestellten Beispielfall ist eine Elektrode, die auf die L-ALT, das andere Ziel auf der m-ALT 2 positioniert. Mit besonderen Sehenswürdigkeiten sind auch andere Zielregionen auch möglich, beispielsweise die AL und Ausgangsbereiche 1 MB.

  1. Positionieren Sie die Elektroden mit Mikromanipulatoren in der Region von Interesse ( 3A). Um die Elektrode zwischen der AL und medial von der vertikalen Lappen der MB-Ziel der m-ALT statt. Sicherstellen, dass die Einstichstelle oberhalb der Verzweigungsstelle der mediolateral ALT PNs. Ragen die Elektrode in das Gehirn mit einer Tiefe von etwa 180 um (Fig. 2E). Für l-ALT PN Aufnahme Ort die Elektrode unterhalb der seitlichen Protocerebrum (LH) in der Mitte einer gedachten Linie zwischen der lateralen Seite des Vertikalkeule und der Mitte der AL. Legen Sie die Elektrode mit einer Tiefe von etwa 300 um (2E)
  2. Legen Sie die Referenz (Silberdraht, etwa 25 Mikrometer Durchmesser) in die Verbindung ipsilateralen Auge durch einen kleinen Schnitt in der Nagelhaut. Legen Sie eine andere Silberdraht in den Muskel Projektionsbereich unterhalb der seitlichen Augenflecken. HINWEIS: Bei Bedarf kann das Lernverhalten der Bienen mit hoher zeitlicher Präzision durch Aufzeichnung der Muskel M17, die ich beteiligt ist, überwacht werdenn der Rüssel Erweiterung Antwort (PER) des Bienen 36, wie in 25 beschrieben.
  3. Um fest zu verankern, die Elektroden im Gehirn und der Kopfkapsel, decken den gesamten Raum über dem Gehirn mit Zwei-Komponenten-Silizium (2H), die das Gehirn vor dem Austrocknen zu verhindern. HINWEIS: die Aufnahmen für Stunden bis Tage dauern, und die Bienen können beispielsweise bei einem klassischen Konditionierungsverfahren (2H) aufgezeichnet oder mit einer großen Gruppe von verschiedenen Gerüchen stimuliert werden.

4. Datenerfassung und Vorverarbeitung

  1. Verwenden Sie geeignete Erfassungssoftware, die die folgenden Anforderungen erfüllt: Abtastrate von 25 kHz min; Analog-oder Digital 1,25 2 Quer Differenzierung zwischen den Elektrodenkanäle; Bandpass-Filter von 300 Hz bis 8000 Hz, um Spike Ereignisse zu extrahieren.
  2. Verwenden Sie zur Verfügung Spike Sortiersoftware zu extrahieren Einheit Aktivität, beispielsweise templaß passenden Techniken wie in der Spike2 Software (Abbildung 3) enthalten.
  3. Zur weiteren Analyse verwenden die Zeitstempel der extrahierten Einheiten Einheit zu berechnen gemittelt Geruch Antworten (Abbildung 4) oder der Bevölkerungs Vektoren für die Hauptkomponentenanalyse (PCA) zu berechnen (Abbildung 5) mit kommerziell erhältlichen Software. Weiter zu analysieren Einheit und Bevölkerungs Latenz vergleichen Sie bitte aktuellen Veröffentlichungen 1,2,25.

5. Visualisierung von Relative Elektrodenposition (Abbildung 4)

  1. Tauchen die Elektroden Spitzen in einer Lösung von entweder 5% Alexa 568 Hydrazid oder 5% Alexa 488 Hydrazid, die in 0,5 M Kaliumchlorid-Lösung vor der Aufzeichnung Experimente gelöst.
  2. Entfernen Sie die Elektroden und die Abdeckung Silizium sorgfältig nach den Experimenten, spülen das Gehirn mit Biene Ringer-Lösung, entfernen Drüsen und der Luftröhre und setzen winzige Kristalle von tetramethylrhodamin Dextran oder legen Sie eine 5% ige Lösung in 1,0 M K-Acetat in die AL gelöst, um die ALT-Displays anterograd kennzeichnen. Führen Sie die folgenden Schritte in der Dunkelheit.
  3. Damit der Farbstoff aufgenommen und durch die Projektionsneuronen transportiert entlang ihrer axonalen Bahnen (30-45 min) (Fig. 4A), vor dem Waschen des Gehirns mit Bienenringerlösung dreimal für einen weiteren 30-45 min.
  4. Kühlen Sie die Biene auf Eis, bis Immobilisierung und entfernen Sie vorsichtig das Gehirn aus dem Kopf-Kapsel. Fixieren Sie das Gehirn durch Spülen in einer 0,1 M PBS-Lösung mit 4% Formaldehyd und halten Sie sie über Nacht bei 4 ° C
  5. Warten Sie mindestens 12 Stunden vor dem Waschen das Gehirn zweimal in 0,1 M PBS (10 min jeweils).
  6. Waschen des Gehirns 3x 20 min in 0,2% Triton X-100 in 0,1 M PBS, bevor Entwässern in einer aufsteigenden Alkoholreihe (30%, 50%, 70%, 90%, 95%, 3 x 100% Ethanol, 20 min verdünnt jede Stufe).
  7. Betten Sie die dehydriert Gehirn in Methylsalicylat auf einen Objektträger und seal sie mit einem Deckglas.
  8. Verwenden Sie ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop und scannen das Gehirn als optische Schnitte jeder 2-5 um unter Verwendung einer Verbindung Harmonic Plan Apochromat Objektiv (10x 0.4 NA Immersion). Anregung mit 568 nm Wellenlänge für Tetramethylrhodamin Dextran und einer Wellenlänge von 488 nm für die Position der Elektrode in das Gewebe.
  9. Rekonstruieren Sie die gefärbten Hirnstrukturen und Elektrodenwege von den Bildstapel in 3D mit Rekonstruktionssoftware (zB. AMIRA oder Fidschi) (Abbildung 4).

Representative Results

"Das vorliegende Protokoll ermöglicht die gleichzeitige Aufnahmen in zwei verschiedenen Verarbeitungsstufen innerhalb der einzelnen Honigbienen und ermöglicht zusätzlich die zugrunde liegenden Mechanismen von Lernen und Gedächtnis über zB testen., PER Anlage in zurückhaltHonigBienen." Dies ist eine Voraussetzung für die Analyse von zeitlichen Aspekte der neuronalen Verarbeitung. Die Methode ist leicht anpassbar für unterschiedliche wissenschaftliche Ansätze, die neuronale Netzwerk von der Biene olfaktorischen System zu entwirren. Zum Beispiel wird dieses Verfahren (i) verwendet, um die zeitliche Verarbeitung der PNs im dualen olfaktorischen der Honigbiene, der L-und M-ALT PNs (Fig. 5) zu analysieren. In 5A ein Beispiel für eine l-ALT PN gleichzeitig mit einer PN des m-ALT aufgezeichnet als zehn Test Durchschnitt und zeigt ihre Reaktion Stärke und Latenz in Bezug auf fünf verschiedene Geruchskonzentrationen als farbcodierte Wärme Handlung. Bei einem Durchschnitt von sieben Bienen mit 11 l-und 13 mALT PNs (5B, 5C) zeigt, daß sowohl die Reaktionskraft sowie die Latenz, bis zu einem gewissen Grad reflektiert Odormittelkonzentration. Dabei PNs in diesem Beispiel erhöhen ihre Antwortstärke, während mit zunehmender Geruchsstoffkonzentration ihrer Latenz gesunken (Abbildungen 5B, 5C). Dieses Ergebnis ist sehr begrenzt und nur für den Geruchsstoff analysiert gültig, aber immer noch in Übereinstimmung mit den letzten Rechenmodelle der AL 37. Ob Geruchskonzentration Codierung in der Biene AL zugrunde liegt, nicht-lineare Berechnungen zugrunde liegt, oder andere Codiereigenschaften muss noch in der Zukunft untersucht werden. Weiterhin kann das Verfahren (ii) verwendet, um die zeitliche Aspekte in der Population Aktivität bei zwei aufeinanderfolgenden Verarbeitungsstufen, dem Al-und MB-Ausgang (6) zu vergleichen. Auftraggeber Komponentenanalyse (PCA) veranschaulicht, dass Geruch Berechnung wird verlängert und überdauern die gesamte Geruchs Präsentation auf der PN-Ebene, während in ENs nur der Geruch an und aus Satz wurden in der Bevölkerung Aktivität (Abbildung 6) vertreten. Dadurch wird die EN Bevölkerung erreicht ihre maximale Aktivität bereits zu einem Zeitpunkt, wenn die PN-Aktivität noch in der Entwicklung (vgl. Film 1).

Figur 1
... Abbildung 1 Herstellung drei-Kanal-Mikrodrahtelektroden A1) Die Endungen der drei Drähte sind an einem IC-Pin-Anschluss in den Positionen 11, 13 und 16 A2) Vier Lötfahnen werden auf einem Plexiglas-Kunststoff-Bodenplatte verschraubt gelötet; Minutien ein Stift in die Spitze einer Glaskapillare, die dann an der Kunststoffplatte. A3) Die Kunststoffplatte wird auf der Oberseite eines IC-Pin-Stecker und dem freien Ende von jedem Draht geklebt befestigt eingesetzt ist, um eine der oben angelötet Laschen. <strong> B1) Um die Elektrodenhalter mit den feinen Kupferdrähten auszustatten, hat die Kapillare noch einmal. B2 herausgenommen werden) Der Boden des Halters wird dann in einer benutzerdefinierten Festausrichter gemacht. Drei Kupfermikrodrähte entlang der Nut an jedem Ende ausgerichtet und mit Klebeband fixiert B3) Die parallelen Mikrodrähte zusammen mit Dentalwachs geklebt und die Kapillare in Ort (lange Pfeile) zurückgestellt. die geklebten Mikrodrähte werden dann an die Kapillare mit Dentalwachs und seine Enden werden abgeschnitten (kurze Pfeile). B4) befestigt Die drei losen Enden der Kupferdrähte sind mit den drei oberen Lötfahnen so bringt sie in elektrischen Kontakt mit den gelöteten IC-Pin-Anschluss. C1) zwei vollständig montierten Elektroden können miteinander zur Verwendung mit einem einzigen heads. C2) Zu diesem Zweck werden die Stifte der einen Elektrode (links, Slave) über isolierte Drähte mit der anderen Elektrode verbunden (rechts verbunden werden, Master), die auf die Kopfstufe verbunden ist; die heads verbunden Elektrode kann auch Eingang sammeln von einem Muskel (M17) und Referenzelektrode (Ref).

Figur 2
Abbildung 2. Vorbereitung und permanente Elektrode Einsetzen in die Bienengehirns. A) Eine Biene nach der Immobilisierung auf Eis in einer Plexiglashalter eingesetzt. Antennen mit Geißel (FL) und Scapus (SC) werden angezeigt. B) Der Kopf und die Antennen werden mit Dentalwachs fixiert. C) Die Kopfkapsel wird rasiert und die Biene ist mit Zuckerwasser. D zugeführt) Die Kopfkapsel ist geöffnet. E) Nach dem Entfernen Drüsen und der Luftröhre von der Spitze des Gehirns können die verschiedenen Neuropile und wichtigsten Sehenswürdigkeiten leicht unterschieden werden. Die Bahnen der ALT-Displays zusammen mit deuteteine Marke, wo die Elektroden eingesetzt sind. (MB: Pilzkörper, AL: Antennallobus, OL: Optische Lappens, α: Alpha Lappen oder vertikale Lappen, ALT: Antennalloben Wege, E1: Elektrodeneinführungsseite für m-ALT-Aufnahmen, E2: Elektrodeneinführungsseite für l-ALT Aufnahmen). F) Referenz (Ref) und Muskelelektroden (M17) durch kleine Löcher in der Oberhaut oder die Verbindung Auge. G) Die Drahtelektroden sind an den jeweiligen Standorten. H in das Gehirn eingeführt) Nach dem in die Kopfkapsel eingesetzt Befestigung der Elektroden an Ort und Stelle mit zwei Komponenten-Silikon, die Biene zeigt immer noch PER und konditioniert werden kann (zB., mit Zuckerwasser).

Fig. 3
Abbildung 3. Extrazelluläre Aufnahme an zwei Nervenbahnen und Einzel Unit Extraction (Spike Sortierung). A B.) Gleichzeitige Aufnahmen von der L-und M-ALT PNs (grün und lila Spuren) zeigt erregende Reaktionen auf beiden Flächen in einen 500 msec Duftstimulation von Honig in Wasser-Lösung in einer Konzentration 1:100 bei 33 ° C Jeder aufgetragene Linie die differenzierte Kanäle als farbcodierten Etikett von den Elektroden Lötfahnen in A. Bar:. UV 50 C) Nachdem Spike Sortierverfahren einzelne Aktionspotenziale werden sortiert und farblich codiert. Overlay der sortierten Einheiten veranschaulicht die Trennung der Wellenformen. D) Spike Intervallhistogramm zeigt die Trennqualität der sortierten Einheiten Nachweis ausreichender Spitzensortierung. Hinweis: Es gibt keine Spitze innerhalb Refraktärzeit der Einheit. E) Zwei Ansichten (E1, E2) ausein 3D-Clustering des sortierten Einheit mit Hauptkomponentenanalyse, welche den Abstand der sortierten Einheiten miteinander zeigt. Kreise zeigen die 2,5-fache Mahalanobis-Distanz, die die SD im Raum ähnelt und zeigt eine deutliche Differenzierung der Cluster in der Hauptkomponentenraum F) Farbe codierten Einheiten stellen die Aktionspotentiale in einer Vergrößerung von drei Kanäle von einem Trakt Aufnahme sichtbar. Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Fig. 4
Abbildung 4. Post-Visualisierung und 3D-Aufnahme-Rekonstruktion der Aufnahmeposition. A) Projektionsansicht ortho-Scheiben entlang der z-Achse mit maximaler Intensität Ausrichtung einer anteround Rückverfüllung der dem MB und LH vorstehende von der AL uniglomerular Projektionsneuronen. Die intrazelluläre Tracer Microruby (Tetramethylrhodamin Dextran) wurde nach den Aufnahme-Experimente in die AL eingefügt. Bunt Glomeruli innerhalb der AL Beweis richtige PN Färbung. B) Projektionsansicht des ortho Scheiben entlang der z-Achse mit maximaler Intensität Ausrichtung von einer Färbung der beiden Elektroden mit Alexa 488 Hydrazid, das die Elektrodenplatzierung für die m-ALT (E1, Pfeil ) und L-ALT (E2, Pfeil). Der Tracer Alexa 488 Hydrazid wandert zu der Elektrode umgebenden Gewebe und färbt die Elektrodeneinstichstelle. Beachten Sie, dass der prominente Färbung in der AL ist eine oberflächliche Artefakt. C) 3D-Rekonstruktionen der gefärbten Zielzellen (PNs) und der Elektrodeneinstichstelle von A, B (rechts) zusammen mit einer schematischen Überblick über die Honigbiene olfaktorischen System (links Seite) mit der Angabe der L-und M-ALT-Trajektorien. Beachten Sie, dass nur uniglomerdere PN Wege gezeigt. AN: Antennennerv, AL: Antennallobus, LH: Seitenhorn, MB: Pilzkörper, E1, E2: Elektrode Insertionsstellen, m-ALT: medial Antennalloben-Darm-Trakt, l-ALT: Seiten Antennalloben Wege, c: Schwanz, r: rostral, m: medial, l:. seitlichen Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 5
Abbildung 5. Beispiel der Geruchsstoffkonzentration im dualen Kodierung olfaktorischen. A) Wärmegrundstücke veranschaulichen die Reaktion eines einzelnen l-ALT (grün) und Einzel m-ALT PN (lila) gleichzeitig erworben von einem einzelnen Honigbiene in Reaktion auf die Geruchs Hexanal bei steigenden Geruchskonzentrationen (von 1: 10 -6 bis 1:100). Jede Zeile ist ein Durchschnitt von zehn Test stimulation. Die Brennrate wird als relative Intensitätsänderung, die die Feuerrate in Bezug auf die spontane Aktivität subtrahiert. B) Bevölkerungs Latenz von 11 l und 13-m-ALT PNs 7 aufgezeichnet Bienen gezeigt. In jedem Bienen die PNs von beiden Flächen wurden gleichzeitig aufgezeichnet. Die Bevölkerung Latenz zeigt eine abnehmende Latenzzeit mit zunehmender Geruchskonzentration in PNs von beiden Bahnen. Der Geruch Reaktion bei Beginn der Antennen 99 msec wurde über Elektroantennogramme aufgezeichnet und von dem PN-Latenzzeiten subtrahiert. Beachten Sie, dass bei den niedrigsten Konzentrationen Antworten sind zu schwach für Latenz und daher wurden. C) Bevölkerung Reaktion ausgeschlossen Feuerrate von PNs gleiche wie in B. Mit zunehmender Geruchskonzentration der Reaktionsstärke nimmt zu. Die l-ALT zeigt eine stärkere Reaktion Stärke. In B, C der Mittelwert und SD angegeben.

Fig. 6 Abbildung 6. Vergleicht Bevölkerung Aktivität an zwei nachfolgenden Verarbeitungsstufen entlang olfaktorischen der Honigbiene. Die Daten wurden in 20 Tieren, die mit 1-Hexanol und 2-Octanon. A) stimuliert wurden aufgezeichnet Jede Linie steht für die Falschfarben kodiert mittleren Feuerrate von einem Vorsprung Neuron (PN) in 10 Wiederholungen Geruch von 1-Hexanol berechnet. Geruch Präsentation beginnt zum Zeitpunkt 0 und dauerte drei Sekunden. B) zeigt die gleichen wie in A), aber für die Pilzkörper extrinsischen Neuronen (EN). Die) in A gezeigt Matrix kann als PN Bevölkerung Vektor während Duftstimulation mit 1-Hexanol zu sehen. Wir berechneten die gleiche Art von Bevölkerung Vektor während Duftstimulation mit 2-Octanon und benutzte beide Vektoren in einer Hauptkomponentenanalyse (PCA) halten die zeitliche Dimension. C) Die ersten drei Hauptkomponenten (PC1, 2 und 3) warengegeneinander aufgetragen, um den Geruch Trennung im Ensemble PN Aktivität am Antennalloben Ausgangs illustrieren. Die Zeit vor Beginn Geruch ist schwarz markiert. Aktivität während drei Sekunden nach Stimulation durch 1-Hexanol ist blau dargestellt. Die Aktivität während der Stimulation mit 2-Octanol ist in rot dargestellt. Darüber hinaus zeigen wir 1,5 Sekunden (post) der Aktivität nach Geruch von Satz 1-Hexanol (hellblau) und 2-octanonen (pink). Beachten Sie, dass bei der PN-Ensemble Ebene, beide Gerüche erinnert sehr unterschiedliche Flugbahnen in einem "festen Punkt", die überdauert die ganze Geruch Stimulationsperiode zu begleichen. Erst nach Geruch versetzt die Bahnen zurück in die Grundaktivität zu bewegen, ohne Duftstimulation. D) Die gleiche Analyse wurde an der EN-Ensemble Ebene, die die Aktivität an der Pilzkörper Ausgang getan. Verglichen mit dem PN-Aktivität Gerüche evozieren eine weniger deutliche Weise. Weiterhin ist eine "Festpunkt" ist nicht zu beobachten. Die zunächst Geruch induzierte Trajektorien integrierenrmingle mit Baseline-Aktivität, obwohl der Geruch ist immer noch vorhanden. Nur der Geruch versetzt evozierte eine zusätzliche Weise.

. Film ein Zeitaufgelöste Auswertung eines Geruchs induzierte Flugbahn nach Hauptkomponentenanalyse eines PN-Bevölkerung Vektor-(links) und einem EN Bevölkerung Vektor. (rechts;. cp Abbildung 6) Die Oberteile sind die ersten drei Hauptkomponenten (PC1, 2 und 3) gegeneinander aufgetragen. Die unteren Platten zeigen die Auswertung von PC1, 2 und 3 über die Zeit. Geruch Stimulation wird durch die grauen Balken markiert. Alle Platten wurden synchronisiert. Beachten Sie, dass die Bevölkerung EN Aktivität beginnt kurz vor der Population Aktivität PN kann ein Phänomen, das contraintuitive zu sein scheint, sondern durch die Verbindung und Eigenschaften der beteiligten Schichten, die früher 1 diskutiert wird erläutert.

Discussion

Dieser Artikel zeigt die Herstellung und Nutzung von kundenspezifischen Mehrkanal-Mikrodraht-Elektroden. Die beschriebenen Elektroden eignen sich für die Aufnahme als Einzeleinheit und der Bevölkerung, die besonders nützlich für die Latenz und andere zeitliche Antworteigenschaften von verschiedenen Neuronen und verschiedenen Neuropilen innerhalb einer einzelnen Probe (Details siehe 1,2,25) ist. Außerdem haben wir gezeigt, wie man dauerhaft umzusetzen Mikrodrahtelektroden stabile Langzeitaufzeichnungen in verhalten Honigbienen, die für Stunden bis Tage dauern kann.

Extrazelluläre Multi-Unit-Aufnahmen wurde ein günstiges Tool, um hohe zeitliche Auflösung in Verbindung mit räumlichen Informationen zu erreichen. In unserem Fall sind dies entweder parallel neuronalen Bahnen 2 oder zwei verschiedene Neuropilen ein. Mehrere Neuronen können aufgezeichnet und analysiert werden an der einzigen Neuron Ebene parallel und mit hoher zeitlicher Auflösung. Multi-Unit-Rekord41 - gen wurden zunächst in Säugetieren 38 auch bei Insekten 39 angelegt und später. Erhebliche Fortschritte wurden mit der Weiterentwicklung und Verbesserung der extrazellulären Mehrkanal-Aufnahmetechniken 42,43 erreicht. Dies umfasst beispielsweise die Entwicklung neuer Elektroden 44 oder neuartige Spike-Sortier-und Clustering-Algorithmen 45. Allgemeine Methoden der extrazellulären Multi-Unit-Aufnahmetechniken sind gut beschrieben 46-48. Die in diesem Video gezeigt selbstgebauten Elektroden zusätzlich durch Zugabe von mehr Mikrodrähte pro Elektrode oder die Mikrodrähte verdrillt, um messbare konstanten Abständen zwischen den Spitzen zu gewinnen angepasst werden. Beide Verfahren würden jedoch zur Verringerung Flexibilität und Erhöhung der Dicke der Elektrode führen.

Im Vergleich zu Silizium-Sonden häufig für extrazellulärer Ableitungen in viel größeren Insekten wie der Habicht Motte, Johannis und Kakerlake 40,49 verwendet - 51 die beschriebenen Mikrodraht-Elektroden kleiner sind, flexibel und kann leicht mit potenziellen Gehirn Bewegungen zu bewältigen und damit zuverlässig in kleinen sozialen Insekten wie Ameisen, Bienen und ein viel breiteres Verhaltensrepertoire zeigen, verwendet werden. Die meisten Silikon-Sonden haben scharfe Schneiden Schaft Strukturen Axonen und Nervengewebe entlang ihrer Einschubkanal, während die beschriebenen Mikrodrähte sind rund, flexibel und kleiner und sind somit weniger schädlich für das umgebende Gewebe, die eine klare Vorteil ist, wenn das Ziel ist, um zu studieren lange Zeitplastizität in einer intakten und verhalten Tier. Ein weiterer Vorteil der Mikrodrahtelektroden ist ihre kostengünstige Produktion und die einfache Handhabung. Statt sorgfältiger Reinigung eine teure Silikon Sonde die Elektrodendrähte werden frisch vor dem Einsetzen Gehirn geschnitten und daher mangel Probleme der Verkehrsüberlastung. Weiterhin ist es möglich, mehr als einen Mikrodrahtelektrode in der gleichen Zubereitung entweder in verschiedenen Neuropile 1 o eingefügt verwendenr Wege 2, wie wir hier zeigen. Dieser Ansatz ist besonders günstig, analysieren und vergleichen zeitliche Aspekte wie Latenzzeiten und Wechselwirkungen bei verschiedenen neuronalen Verarbeitungsebenen.

Wir sind uns der Tatsache bewusst, dass eine extrazelluläre aufgezeichnete Signal spiegelt nicht Einzelzellaktivität an sich. Es ist immer eine Verbindung der Spannungs Aktivität um die Elektrodenspitze. Um die Quelle des Signals die Differenz von zwei benachbarten Mikrodraht Kanäle innerhalb einer Elektrode wird immer berechnet, genau zu bestimmen. So ist die Quelle für die Spitzensignale verwendet werden, um einzelne Einheit Aktivität extrahieren waren immer sehr nah an einer oder der anderen Elektrode Kanal, was zu leicht zu unterscheiden Spike Wellenformen. Signale, die von weiter weg, wie Muskelaktivität oder der Aktivität der Nachbar Neuropilen, erreichen beide Elektroden gleichzeitig erinnert vergleichbare Formen und Amplituden und wird durch dieses Verfahren verworfen werden. Mit dem Template-Matching-Technik von Spike2,wir sind sehr zuversichtlich, Einheit-Aktivität, die nicht das gleiche zu erreichen, aber sehr nahe an einzelnen Neuronen-Aktivität. Allerdings könnte die Frage der Spitze Sortierung über intrazelluläre Aufnahme-Techniken vermieden werden.

Einzelzellableitungen entweder mit scharfen Elektroden oder Patch-Pipetten ermöglichen vertiefte Wissen über physiologische Eigenschaften eines einzelnen Neurons. Aufgrund der geringen Größe der Insekten Neuronen und ihre Neuriten (zB., Weniger als 1 um für die Honigbiene PNs 52) nur kurzfristige Aufnahmen sind überschaubar. Außerdem könnte intrazelluläre Aufnahmen invasiv und könnte die Zelle, die möglicherweise ein weiterer Grund für die zeitlichen Beschränkungen schaden. In vivo intrazelluläre Ableitungen in Insekten überdauern nur selten eine Stunde. Ein Zeitfenster, das ausreichend für die Pionierarbeit von Martin Hammer 53, die intrazelluläre aus einem einzigen Neuron identifiziert, der ventralen ungepaarten maxilar Neuron # 1 (VUMmx1) aufgenommen wurde. Er konnte lTinte seine Tätigkeit direkt auf die Belohnung Weg. Juliane Mauelshagen 54 intrazellulär die Aktivität eines identifizierten Pilzkörper extrinsischen Neuronen registriert, die pedunculus extrinsische Neuron # 1 (PE1) während der klassischen Konditionierung. Das gleiche Neuron war in den Fokus der Manz Menzel und 55, wenn sie gefunden LTP nach elektrischer Stimulation der Kenyon-Zellen. Allerdings Okada und Kollegen den 56 intrazellulär gut charakterisierten Spick-Muster (Doppel-und Dreispitzen) für die Identifizierung des PE1 während extrazellulärer Ableitungen verwenden. Denn eine Kombination beider Methoden könnte intrazelluläre Ableitungen von identifizierten Neuronen und extrazelluläre Langzeitaufnahmen ein leistungsfähiges Werkzeug für zukünftige Untersuchungen sein.

Allerdings mit scharfen Elektroden um mehrere Zellen (Einheiten) zu verschiedenen Bearbeitungsebenen über viele Stunden bis Tage aufzeichnen gleichzeitig ihrer zeitlichen Wirkungsbeziehungen und / oder sogar plastische Veränderungen analysieren iist fast unmöglich.

Mit dem ersten Kalzium-Imaging-Ansätze in der Honigbiene mit 57,58 Calcium-sensitiven Farbstoffen die Analyse der räumlichen Muster der Geruch Antworten waren zugänglich 59-62. In vielen Fällen die Calcium-sensitiven Farbstoffen haben jedoch auf das Hirngewebe über invasive Manipulationen, die wiederum die Lebensdauer der Bienen und der intrinsischen Eigenschaften der untersuchten Zellen zu begrenzen eingeführt werden. Dieses Problem wird auch in anderen Modellorganismen wie der Fruchtfliege mit gentechnisch eingeführt Kalzium-Sensoren 63,64 zu überwinden. Aber im Allgemeinen, Calcium-Sensoren können andere Beschränkungen einzuführen, da sie als Kalziumpuffer, die wahrscheinlich die zeitlichen Eigenschaften der Geruch Antworten beeinflussen wirken können. Gleichzeitige Aufnahmen in Kombination mit intrazellulären Kalzium-Imaging oder computergestützte Ansätze nachweisen kann, die richtige zeitliche Auflösung der Bildgebung verarbeitet 65,66. Die zeitliche Auflösung des Abbildungsprozesses selbst ist jedoch Rather begrenzt. Optische Messsysteme verwenden meist CCD-Bildgebung mit einer zeitlichen Auflösung von 5-20 Hz 67, obwohl 2-Photonen-Imaging vielleicht in der Lage, schneller zu Sequenzen 68 zu erwerben. Die Erhöhung Abtastrate geht immer mit einem Verlust an räumlicher Auflösung. Darüber hinaus sind die in der Honigbiene verwendet Calcium-sensitiven Farbstoffen unterziehen Bleichen, was auch die Akquisitionszeit 69.

Im Vergleich zu anderen physiologischen Aufnahmetechniken bei Insekten unserer flexiblen Mehrkanal-Mikrodrahtelektroden sorgen für eine lange Zeitzugriff auf einzelne Einheit und Bevölkerungs neuronale Aktivität in Bienen verhalten.

Wir haben gezeigt, wie zwei dieser Elektroden in verschiedenen Verarbeitungsstufen in der gleichen Tier, das die Analyse der zeitlichen Codierung Aspekte zwischen den verschiedenen Standorten erleichtert die Aufnahme zu verwenden. Abhängig von der Forschungsproblem und dem Modell der Insekten grundlegende Methode der Elektrode Gebäude hier demonstriert wird einfach erweiternLage-und / oder angepasst werden. Zum Beispiel ist es denkbar, mehr als die drei Einzeldrähte verwenden, um Mehrkanal-Elektroden herzustellen. Darüber hinaus kann die Anzahl der Aufzeichnungs Websites verlängert und Beobachten zeitliche Aspekte von mehr als zwei Bahnen oder Neuropilen möglich ist. Unsere Hoffnung ist, dass diese Methode viele Wissenschaftler begeistern und positiv auf das Verständnis der anspruchsvollen neuronale Verarbeitung in kleinen Gehirn beitragen.

Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paraffin oil Fluka 76235
Odors Sigma Aldrich 
PBS pH 7.2
4% Formaldehyde ThermoScientific 28908 Methanol free
Triton X BioChemica A1388
Methylsalicylate Roth 4529.1
Tetramethylrhodamin dextran, 10,000 MW (Microruby) Invitrogen D7162 keep dark
Alexa 488 hydrazide Invitrogen A-10436 keep dark
Alexa 568 hydrazide Invitrogen A-10437 keep dark
Bee Ringer Solution see Brill et al.2
Polyurethane-coated copper wire Elektrisola 15 µm diameter & P155 insulation
Dental Wax  Densply Detrey 64103015S1 moderate melting point
Dental Wax Flexaponal  124-202-00 low melting Wax
KWIK SIl WPI 03L
18 Pin Socket Conrad Electronic 189634-62
Hot melting glue Conrad Electronic 827673
Soldering needle Conrad Electronics 830283 12 V
Soldering terminal lug  Conrad Electronic 531901
Glaselectrodes WPI 1B100F-3
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-20 V2A 0.2 x 12 mm
Switchable headstage Tucer Davis Technologies SH16
Headstage connection module NPI INT-03M
Amplifier Module NPI PDA-2F
Data Acquisition boards National Instruments NI-6123, Ni-6143
Acquisition Software National Instruments Lab View 8.2 custom design
Spike-Sorting  CED  Spike 2 v7.11
Matlab Mathworks R2008B
Micromanipulator Leitz manual
AG-wires WPI AGT05100
Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP2 AOBS
AMIRA Mercury Computer Systems  2/5/2000

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References

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Gleichzeitige Langzeit-Aufnahmen auf zwei neuronale Verarbeitungsstufen in Behaving Honigbienen
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Brill, M. F., Reuter, M., Rössler, W., Strube-Bloss, M. F. Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees. J. Vis. Exp. (89), e51750, doi:10.3791/51750 (2014).More

Brill, M. F., Reuter, M., Rössler, W., Strube-Bloss, M. F. Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees. J. Vis. Exp. (89), e51750, doi:10.3791/51750 (2014).

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