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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

Modelagem astrocitoma Patogênese Published: August 12, 2014 doi: 10.3791/51763
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 1, 3, 5, 6, 2,3,7
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 2Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina School of Medicine, 3Division of Neuropathology, Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 4Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina School of Medicine, 5Biological and Biomedical Sciences Program, University of North Carolina School of Medicine, 6Department of Radiation Oncology, Emory University School of Medicine, 7Department of Neurology, Neurosciences Center, University of North Carolina School of Medicine

Introduction

Astrocitomas são o tumor cerebral primário mais comum e glioblastoma (GBM), a IV astrocitoma grau, é o subtipo mais comum e agressivo, com uma sobrevida média de 12-15 meses 1,2. Invasão de astrocitomas difusos, particularmente GBM, opõe-se a ressecção cirúrgica completa, limita a eficácia de terapias adjuvantes, e inevitavelmente leva a recorrência pós-tratamento 3. Inicialmente, os pacientes apresentam, quer com de novo (primário) GBM ou com astrocitoma grau menor que inevitavelmente progride para GBM (secundário) 4. GBM é genomicamente heterogêneo e caracterizado por mutações que se excluem mutuamente e que co-ocorrem em genes que governam três principais vias de sinalização: o G 1 / S (Rb) checkpoint do ciclo celular, receptor tirosina quinase (RTK), e TP53 vias 5-7. GBM é composta por quatro subtipos do genoma com perfis de expressão distintos que se assemelham a diferentes tipos de células do cérebro, sugerindo que o GBM subtipo é influciada por sua célula de origem 6,8,9. Modelos astrocitoma melhores são necessários para definir o papel de combinações específicas de mutações em determinados tipos de células durante astrocitoma patogênese. Aproveitando esses modelos para o desenvolvimento de drogas mais eficientes pré-clínico, em última instância ajudar a melhorar os resultados dos pacientes. Astrocitoma modelos atuais incluem linhas celulares estabelecidas humanos, paciente derivado xenotransplantes (PDX), astrócitos humanos normais geneticamente modificados e de células-tronco neurais (NSC) e camundongos geneticamente modificados (GEM) 10-14. Nós desenvolvemos uma alternativa, GEM não germinativa (nGEM) modelo 15 utilizando células cerebrais primários - astrócitos corticais e NSC - colhidas GEM abrigando várias combinações de alelos oncogênicos floxed. O objectivo foi o de gerar modelos astrocitoma com células geneticamente definidas que poderia ser fenotipicamente caracterizadas tanto in vitro como in vivo e potencialmente utilizados para o desenvolvimento pré-clínico de drogas em icamundongos mmune-competentes.

Linhagens de células humanas estabelecidas são o modelo mais comumente usado de patogênese astrocitoma e resposta à droga in vitro e in vivo. Eles são tecnicamente simples, amplamente disponível, e definiram cinética e tumorigenicity sobre xeno ortotópico em ratos imunodeficientes 10,11,16-18 . Suas desvantagens incluem a incapacidade de gerar linhagens celulares estabelecidas de astrocitomas de baixo grau, limitando estudo apenas para astrocitomas de alto grau; falta de uma célula de origem definido; a presença de anormalidades genômicas complexas, muitas vezes com perfis genômicos que diferem acentuadamente a partir da amostra original do doente; e susceptibilidade à fenotípica e genotípica de deriva durante a cultura de série no soro 11,17,19-22. As conseqüências fenotípicas de mutações oncogênicas individuais em linhas de células humanas estabelecidas GBM pode ser mascarado pela multidão de anomalias que estão realmente presentes, que muitas vezes impede elucdação das conseqüências diretas genótipo-fenótipo.

PDX são gerados através da passagem subcutânea de células astrocitoma isolado do paciente em ratos imunodeficientes ou através de sua cultura como esferóides não aderentes em definido, meio sem soro antes da injeção ortotópico em cérebros de ratos imunodeficientes 12,23. PDX manter com maior precisão a paisagem genómico de astrocitomas humanos, mas semelhante às linhas de células humanas estabelecidas, o efeito de mutações oncogénicas fenotípica individuais pode ser mascarado pela sua complexidade genómico 19,24. Para definir as conseqüências fenotípicas de mutações oncogênicas específicas, particularmente em resposta a novas terapias, painéis de linhas de células humanas estabelecidas ou PDX são freqüentemente utilizados para estabelecer correlações genótipo-fenótipo, mostrar generalização, e minimizar a probabilidade de efeitos específicos de linha celular. Enquanto PDX recapitular com precisão as características histopatológicas de astrocitoma humano, including invasão, xenotransplantes ortotópico de linhas de células humanas estabelecidas geralmente não 21,23,25. Além disso, os astrócitos humanos normais e NSC foram geneticamente modificadas com mutações oncogênicas definidas para modelar astrocitoma tumorigênese in vitro e in vivo 13,14,26. Estas células não possuem a complexidade genómico de linhas celulares humanas estabelecidas e PDX e recapitulam precisão histopatologia astrocitoma humano, mas requerem xeno em roedores imunodeficientes in vivo. Como todos os modelos de células humanas exigem hospedeiros roedores imunodeficientes para evitar a rejeição de xenotransplante imunomediada, estes modelos não recapitular as interações tumor-estroma nativas de um sistema singênico e falta de um sistema imunológico intacto, limitando a investigação pré-clínica de alvo-estroma e imunomoduladores terapias 10,11.

GEM exame autorização das conseqüências fenotípicas de combinações pré-determinadas de muta oncogênicoções in vivo durante a tumorigênese situ. Considerando GEM não condicional têm mutações em todos os tecidos ao longo do desenvolvimento, GEM condicional têm floxed alelos oncogênicos que permitem a segmentação de mutações, restringindo recombinação Cre-mediada para tipos específicos de células através do uso de celulares promotores específicos do tipo 10,11,15,18. Condicional GEM astrocitoma foram utilizados para elucidar os papéis funcionais de mutações oncogénicas em tipos de células distintos dentro de um cérebro intacta 11. A utilidade em pré-clínico da gliomagênese situ utilizando GEM condicional é limitada por um certo número de factores, incluindo 1) a ausência de uma correlação in vitro, 2) dificuldade em gerar grandes grupos de ratinhos com genótipos complexos, 3) de comprimento de latência para o desenvolvimento de tumor in situ , 4) e estocástica progressão tumoral. Porque in situ tumorigenesis carece de um modelo correspondente in vitro, testes de drogas in vitro não pode ser realizada wmodelos condicionais convencionais om jóia. Em contraste com outros tipos de câncer, os modelos GEM condicionais de astrocitoma raramente são induzidas por simples mutações oncogênicas 11. Assim, esquemas de melhoramento complexas são necessárias para gerar GEM condicional com múltiplas mutações oncogênicas. Além disso, a iniciação astrocitoma ocorre com penetrância variável depois de um longo período de latência nesses modelos, enquanto a progressão para astrocitomas de alto grau geralmente ocorre de forma não-uniforme, estocástica e, finalmente, dá origem a tumores com paisagens genômicas complexas e cinética de crescimento rápido 27, 28. A penetrância variável e natureza estocástica de progressão maligna em modelos GEM condicional exige que os ratos individuais ser rastreada por radiografia para detectar a presença e localização de astrocitomas de alto grau antes de sua inclusão em estudos pré-clínicos de drogas. Tomados em conjunto, estas limitações impedir a geração e ensaios dos grandes grupos de GEM condicional necessário para prtestes de drogas eClinical.

O sistema GEM RCAS-tva, que utiliza retrovirais aviária (RCAS) vectores para infectar GEM manipuladas para expressar o receptor viral (TVA) em tipos de células neurais específicos, tem sido extensivamente utilizado para modelar astrocitoma tumorigénese 11. Em contraste com a GEM condicional, este sistema modelo permite a introdução de múltiplas mutações oncogénicas em tipos de células específicas, sem a necessidade de sistemas complexos de reprodução. No entanto, é limitado por uma penetrância variável, o requisito para a divisão activa de células para alcançar a integração virai, e a inserção dos transgenes aleatoriamente no genoma do hospedeiro 29.

Modelos não-germinativas GEM (nGEM), que utilizam células colhidas de GEM, estão se tornando cada vez mais importante, porque eles superar muitas das limitações de outros sistemas modelo 15. O papel do tipo de célula e de iniciar as mutações que ocorrem simultaneamente em astrocitoma patogénese são de difícil dissuadirmina usando linhas celulares estabelecidas humanas ou GBM PDX porque são derivados a partir de tumores em fase terminal que se acumularam extensas mutações genéticas em tipos de células não definidas durante o curso da progressão maligna. Em contraste, todos os graus de astrocitomas pode ser modelada utilizando nGEM definido por induzir mutações genéticas dentro tipos de células cerebrais específicas purificadas 11,30. Assim, a influência de mutações genéticas específicas e tipo de células em fenótipos celulares e moleculares pode ser determinada in vitro e in vivo. Semelhante às linhas de células humanas estabelecidas GBM, em testes in vitro inicial de droga usando nGEM pode ser usado para dar prioridade drogas para os ensaios in vivo, utilizando as mesmas células. Tumorigénese in vivo pode ser determinada por aloenxerto células nGEM ortotopicamente nos cérebros de ninhada singeneicos imunocompetentes 30. Estes modelos de aloenxerto ortotópico, pois, permitir testes in vivo, não só de um citotóxico convencionalnd terapias-alvo, mas imunomoduladores e de terapias alvo-estroma também. Finalmente, o papel do microambiente no início e progressão do tumor pode ser determinada por comparação dos resultados entre nGEM e modelos GEM convencionais utilizando as mesmas mutações nos mesmos tipos de células.

Nós e outros desenvolveram astrocitoma nGEM usando células primárias - astrócitos, NSC, ou células precursoras de oligodendrócitos (OPC) - colhidas GEM 30-34. A lógica por trás do desenvolvimento de um astrocitoma nGEM era criar um modelo para determinar as conseqüências fenotípicas de mutações oncogênicas em tipos específicos de células que poderiam ser usados ​​para testes de drogas pré-clínicos in vitro e in vivo em animais imunocompetentes. Colhemos astrócitos fenotipicamente WT corticais e NSC de não-Cre expressar, GEM condicional mantida em um> 94% C57 / Bl6 fundo com caminho RB floxed - Rb1 loxP / loxP, ou TgGZT121 - e floxed RTK / RAS / PI3K - Nf1 loxP / loxP, Kras G12D, Pten loxP / loxP - genes em várias combinações 35-39. Nós induzida recombinação genética in vitro utilizando vetores de adenovírus que codificam Cre recombinase. Porque colheitas astrócitos corticais contêm uma mistura de tipos de células, foram utilizados os vectores Ad5GFAPCre ou transgenes oncogénicos dominantes, tais como TgGZT 121 dirigido a partir do promotor GFAP humana, para enriquecer para GFAP + astrócitos corticais nestas culturas. Definimos as consequências fenotípicas de G 1 / S (RB), MAPK, e mutações PI3K em astrócitos corticais e NSC in vitro e in vivo. MAPK e PI3K-ativado via G1 / S-defeituosos astrócitos molecularmente imitou GBM humano proneural e, após a injeção ortotópico, tumores formados em um local pré-definido com cinética de crescimento uniforme, latências curtas, eo histopatológicosal marcas de GBM humano 30. Monitorização longitudinal do crescimento do tumor in vivo ajuda de testes pré-clínicos de drogas através da normalização de coortes de tratamento e análise quantitativa do crescimento do tumor, em resposta ao tratamento com 40. Determinou-se a cinética de crescimento do tumor por imagem de bioluminescência longitudinal de camundongos injetados com luciferase expressando astrócitos corticais. Portanto, os astrócitos corticais e NSC derivados GEM condicional fornecer um sistema modelo tratável para a definição de repercussão funcional de mutações associadas à astrocitoma e um sistema modelo potencial para o desenvolvimento de fármacos pré-clínicos.

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Protocol

Todos os estudos com animais foram aprovados pela Universidade da Carolina do Norte Animal Care Institucional e Comitê de Uso.

1 A cultura Cortical astrócitos de Neonatal Ratos

  1. Preparação
    1. Amassar 2-3 tecidos tarefa delicada e colocar no fundo de um balão que continha 70% de etanol. Coloque tesouras de dissecação, pinças curvas e 2 pares de micro fórceps direto para este frasco. Os tecidos são usados ​​para evitar entortar os micro fórceps.
    2. Adicionar 1 ml de HBSS a 60 milímetros uma cultura de tecidos de. Prepara-se uma placa separada para cada animal e manter pratos sobre gelo.
    3. Anestesiar animais por regulamentos institucionais.
    4. Quente 7 ml de DMEM com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina (DMEM completo) para cada animal de um banho de água a 37 C °. NOTA: Para 5 ratos, os passos 1.1.1-1.1.4 terá ~ 15 min.
  2. Tissue Colheita
    1. Sacrifício rato neonatal (dia 1-3) por institutiregulamentos onal.
    2. Retirar as tesouras de dissecção a partir de etanol, para permitir que eles escorrer, e fazer um corte sagital na pele sobre o crânio a partir da medula espinal para o nariz.
    3. Fazer um corte no crânio ao longo da sutura sagital, a partir da medula espinal e estendendo-se além dos bulbos olfactivos. Ter o cuidado de manter as pontas de tesoura, perto da superfície interior do crânio para minimizar danos no tecido cerebral.
    4. Usando uma pinça curva, descascar delicadamente cada hemisfério do crânio lateralmente longe do cérebro.
    5. Usando micro fórceps retas, aperte suavemente a parte dorsal de cada hemisfério cortical e coloque-o no prato de cultura de tecidos contendo HBSS. Tome cuidado para evitar o cerebelo e bulbo olfatório. Não tome qualquer tecido abaixo do corpo caloso.
    6. Usando um microscópio de dissecação e 2 pares de micro pinça, retire cuidadosamente as meninges de cada hemisfério cortical. Retorne o prato de cultura de tecidos para gelo até começar homogenizatio tecidon.
    7. Repita os passos 1.2.1 através de 1.2.6 para cada animal adicional. NOTA: Para 5 ratos, os passos 1.2.1-1.2.7 terá ~ 30 min.
  3. Homogeneização Tissue
    1. Usando uma lâmina de barbear limpa, finamente corte os hemisférios corticais e mover a placa para uma câmara de cultura de tecidos.
    2. Transfira o tecido cortado em um estéril tubo de 15 ml. Lava-se a placa com 1 ml de HBSS frio de gelo e transferido para o tubo contendo o tecido.
    3. Espere até que o tecido assenta no fundo do tubo, em seguida, remover o excesso de HBSS cuidadosamente usando uma pipeta.
    4. Adicionar 2 ml de temperatura ambiente de tripsina / EDTA. Pipeta ~ 10x com uma pipeta de 1 ml para dissociar mais células.
    5. Incubar a suspensão de células a 37 ° C durante 15 - 20 min. Misturar cuidadosamente por inversão a cada 5 min.
    6. Adicionar 3 ml de DMEM completo para inibir a tripsina. Pipeta ~ 10x com uma pipeta de 1 ml para misturar a solução.
    7. Centrifugar a 200 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
    8. Removero sobrenadante com uma pipeta de 1 ml. Não aspire o meio porque o pellet pode estar solto.
    9. Ressuspender o sedimento em 4 ml de 37 ° C completar DMEM. Transferência da suspensão de células para um balão de 75 centímetros de parafuso superior de cultura de tecidos. NOTA: Para 5 ratos, os passos 1.3.1-1.3.9 terá ~ 50 min.
    10. Aproximadamente 16 horas após a colheita dos astrócitos, lavar o frasco com 4 ml de HBSS a 37 ° C, em seguida, adicionar 4 ml de 37 ° C completar DMEM. Manter os astrócitos corticais a 37 ° C em 5% de CO 2. NOTA: O passo de lavagem é importante para a remoção das células não aderentes e os detritos a partir do prato de cultura.
    11. Quando a cultura é de ~ 95% confluentes, agitar durante a noite a 37 ° C em 5% de CO2, retirar o meio contendo as células isoladas, em seguida lavar o frasco com 4 ml de HBSS a 37 ° C. Adicionar 4 ml de 37 ° C completar DMEM e manter as células a 37 ° C em 5% de CO 2. NOTA: Este passo é importante para enriquecer a cultura de astrócitos corticais, como a contaminação microglia ecélulas progenitoras de oligodendrócito separar com este procedimento e são removidos a partir da cultura 41.
    12. Repita os passos 1.3.1-1.3.11 para cada animal.
  4. A indução de recombinação genética
    1. 24 horas após a conclusão da etapa 1.3.11, substituir o meio com 2 ml de 37 ° C completar DMEM. Adicionar 1 ml de 37 ° C, contendo uma SCM ul de> 10 10 pfu / ml de Ad5CMVCre ou Ad5GFAPCre. Incubar durante 6 horas a 32 ° C em 5% de CO2 .CAUTION: precauções de segurança Use BSL2 ao manusear adenovírus recombinante.
    2. Remover os vírus contendo meio e adicionar 37 ° C DMEM completo sem vírus para os astrócitos do córtex. CUIDADO: Use as precauções de segurança ao manusear BSL2 adenovírus recombinantes e descartar a mídia que contém o vírus por regulamentos institucionais. NOTA: Para 5 culturas de astrócitos, as etapas 1.4.1 - 1.4.3 terá ~ 15 min excluindo a incubação de 6 horas.
    3. Expandir culturas de astrócitos corticais para emvitro e in vivo caracterização. NOTA: Determinar a presença de mutações na sequência Cre-recombinação por PCR com primers específicos para o gene recombinado ou por imunomanchas, quer para a proteína mutada ou as suas consequências específicas de sinalização. O tempo necessário para a estabilização fenotípica das culturas de astrócitos corticais após recombinação Cre será dependente das mutações utilizados e deve ser determinado empiricamente (Figura 2).

2. A cultura Neural Stem Cells de Neonatal Ratos

  1. Preparação
    1. Antes de iniciar a dissecção, preparar 4 ml de solução de digestão por cérebro adicionando 3,1 mg de papaína e 1,3 mg de cisteína e 4 ml de meio de dissociação - 98 mM de Na 2 SO 4, 30 mM de K 2 SO 4, MgCl 5,8 mM, 2, 0,25 mM de CaCl2 , HEPES 1 mM (a partir de 1 M de HEPES pH 7,4 estoque) glicose 20 mM, 0,001% de vermelho de fenol, e NaOH a 0,125 mM. A adição de papaínae cisteína ao meio dissociação vai virar o amarelo solução.
    2. Incubar a 37 ° C em banho-maria durante 15 min. Misturar por inversão periódica.
    3. Adicionar NaOH 0,1 M gota a gota, até que a solução digestão retorna à luz de cor vermelha.
    4. Num capuz de cultura de tecidos, estéril de filtração a solução de digestão usando um filtro de seringa (0,22 um de tamanho de poro). Manter a solução em gelo a digestão.
    5. Preparar 50 ml de Células Estaminais Médio (SCM) por mistura de 44,5 ml de Meio Basal NSC, NSC suplemento de 5 ml, 0,5 ml de penicilina-estreptomicina, 50 mL de 0,2% de heparina, 10 ul de 100 ug / ml de EGF, e 10 ul a 100 ug / ml bFGF. SCM é estável durante uma semana, quando armazenados a 4 ° C.
    6. Prepare HBSS completo (cHBSS) por mistura de 50 ml de HBSS 10x, 1,25 ml de 1 M de HEPES (pH 7,4), 15 ml de 1 M de D-glucose, 5 ml de 100 mM de CaCl2, 5 ml de 100 mM de MgSO 4, e 2 ml de 1 M de NaHCO3. Levar o volume total a 500 ml com ddH 2 O.
    7. Filtro de esterilizar cHBSS sagacidadeha 0,2 m poros do filtro tamanho e armazenar a 4 ° C.
    8. Amassar 2-3 tecidos tarefa delicada e colocar no fundo de um balão que continha 70% de etanol. Coloque tesouras de dissecação, pinças curvas, e 2 pares de micro fórceps direto para este frasco. Os tecidos são usados ​​para evitar entortar os micro fórceps. NOTA: Para 5 ratos, os passos 2.1.1-2.1.8 terá ~ 45 min.
  2. Tissue Colheita
    1. Sacrifício neonatal (dia 1-3) camundongos por regulamentos institucionais.
    2. Retirar as tesouras de dissecção a partir de etanol a 70%, para permitir que eles escorrer, e fazer um corte sagital na pele sobre o crânio a partir da medula espinal para o nariz.
    3. Fazer um corte no crânio ao longo da sutura sagital, a partir da medula espinal e estendendo-se além dos bulbos olfactivos. Ter o cuidado de manter as pontas de tesoura, perto da superfície interior do crânio para minimizar danos no tecido cerebral.
    4. Usando uma pinça curva, descascar delicadamente cada hemisfério do crânio lateralmente para longe docérebro.
    5. Remova cuidadosamente todo o cérebro e colocar em gelo cHBSS frio.
    6. Usando um microscópio de dissecção, retire cuidadosamente meninges do cérebro com ferramentas de dissecação multa.
    7. Coloque o cérebro na superfície inferior e remover cerebelo / hindbrain e bulbo olfatório / córtex frontal com vertical (coronal) corta com um bisturi tamanho 11.
    8. Gire o cérebro restante, 90 ° para colocá-lo na parte caudal, gerando, assim, uma visão coronal do cérebro. Localize os ventrículos laterais.
    9. Cortar uma secção cúbica contendo a zona subventricular (SVZ).
    10. Transferir SVZ contendo tecido de um tecido 60 milímetros prato de cultura fresca com gelo cHBSS frio e tritura com tecido de tamanho 11 bisturi.
    11. Transferir o tecido moído para um tubo de 15 mL estéril. Colocar o tubo em gelo.
    12. Lava-se a placa de Petri com 1-2 ml de gelo cHBSS frio. Transferir a solução de lavagem para o tubo contendo o tecido.
    13. Repita os passos 2.2.1-2.2.12 com neonata adicionall camundongos se necessário. Transferir todos os tubos de 15 ml para um capuz de cultura de tecidos para o restante do protocolo. NOTA: Para 5 ratos, os passos 2.2.1 - 2.2.13 terá ~ 45 min.
  3. Homogeneização Tissue
    1. Coloque a solução de digestão (preparado no passo 2.1.1) em um banho de água a 37 C ° durante 5 min. Além disso, quente SCM 2 ml por cérebro em um banho de água a 37 ° C.
    2. Remover o sobrenadante cuidadosamente do tecido moído com uma pipeta de 1 ml. Não aspirar.
    3. Adicionar solução de digestão 2 ml a 37 ° C por 15 ml tubo e misture cuidadosamente por inversão.
    4. Incubar a 37 ° C em banho-maria durante 15 min. Misture por inversão a cada 5 min.
    5. Adicionar mais 2 ml de solução de 37 ° C a digestão para cada tubo e repita o passo 2.3.4.
    6. Permitir que as células se depositam no fundo do tubo, por gravidade, em seguida, remover o sobrenadante a partir do tecido digerido utilizando uma pipeta de 1 ml.
    7. Adicionar 2 ml de 10 mM E-64 diluído em cHBSS e mistura-se cuidadosamente por inversão.
    8. Permitir que as células se depositam no fundo do tubo, por gravidade, em seguida, remover o sobrenadante a partir do tecido digerido.
    9. Adicionar 1 ml de 37 ° C cHBSS e homogeneizar com uma ponta de pipeta de 1 ml (~ 20 golpes). Evite injetar bolhas de ar durante a homogeneização do tecido.
    10. Passar o homogeneizado de tecido através de um filtro de células 40 um de tamanho de poro, e depois enxaguar o filtro com 5 ml de 37 ° C cHBSS.
    11. Centrifuga-se o tecido homogeneizado a 125 x g durante 5 min.
    12. Retirar 95% de sobrenadante com uma pipeta de 1 ml, sem perturbar o sedimento celular. Pellet celular cuidadosamente ressuspender em 200 ul de 37 ° C com uma pipeta de SCM ponta 200 ul.
    13. Adicionar 1,8 ml de 37 ° C SCM e transferir a suspensão de células para um poço de uma placa de 6 poços estéril. NOTA: Para 5 ratos, os passos 2.3.1-2.3.14 terá ~ 75 min.
  4. Neural Stem Cell Cultura
    1. Reabastecer o meio depois de 3 dias, adicionando mais 2 ml 37 °C SCM.
    2. Após 7 dias, transferir os neurospheres para um tubo de 15 ml e deixar os neurospheres resolver pela força da gravidade para> 5 min.
    3. Remover o sobrenadante e adicionar 2 ml 37 ° C SCM.
    4. Transferir as neuroesferas para um novo poço de uma placa de 6 poços.
    5. Adicionar 2 ml de 37 ° C a cada 3-4 dias SCM, e mudar completamente meio cada 7 dias.
    6. Se neuroesferas são> 100 um de diâmetro, dissociar cuidadosamente com solução de dissociação de células estaminais e replate NSC à densidade celular desejada.
  5. A indução de recombinação genética
    1. Adicionar 1 ml de 37 ° C, contendo 1 ul SCM> 10 10 pfu / ml de Ad5CMVCre ou Ad5GFAPCre para o 2 ml de SCM actualmente nas células. CUIDADO: Use as precauções de segurança ao manusear BSL2 adenovírus recombinante.
    2. Incuba-se durante 6 horas a 32 ° C em 5% de CO 2.
    3. Transferir SCM com neurospheres em um tubo de 15 ml e deixe esferas resolver pela força da gravidade para 5 min.
    4. Retirar o sobrenadante em primeiro lugar com uma pipeta de 1 ml, em seguida, com uma pipeta de 200 uL. CUIDADO: Use as precauções de segurança ao manusear BSL2 adenovírus recombinantes e descartar a mídia que contém o vírus por regulamentos institucionais.
    5. Adicionar 2 ml de 37 ° C SCM sem vírus para o NSC, em seguida, transferir para uma placa de 6 poços. NOTA: Para 5 culturas NSC, passos 2.5.1-2.5.5 terá ~ 15 min excluindo a incubação de 6 horas.
    6. No dia seguinte, repetir os passos 2.5.1-2.5.5, seguido por neuroesfera passaging quando necessário. As esferas podem agora ser ampliado para 2-3 passagens antes de caracterização in vitro e injeção ortotópico no cérebro do rato in vivo. NOTA: Determinar a presença de mutações na sequência Cre-recombinação por PCR com primers específicos para o gene recombinado ou por imunomanchas, quer para a proteína mutada ou as suas consequências específicas de sinalização. O tempo necessário para a estabilização fenotípica das culturas NSC após recombinação Cre-se ser dependentesobre as mutações utilizados e deve ser determinado empiricamente (Figuras 2 e 3).

3. injeção ortotópico de células recombinadas no cérebro de Destinatário Iimmunocompetent Ratos

  1. Preparação de 5% metil celulose
    1. Dissolve-se 5 g de 15 cPs metil-celulose em água destilada para um volume final de 50 ml em 100 ml de tampão de parafuso garrafa. Adicionar o pó lentamente enquanto se agitava a 4 ° C para evitar aglomeração. Pode levar-se a 24 horas de agitação a 4 ° C durante toda a celulose de metilo, para introduzir solução.
    2. Pesar o frasco e registrar o peso.
    3. Autoclave a solução de metilcelulose a 5%. Uma vez autoclavado, a metil-celulose irá tornar-se um gel semi-sólido.
    4. Pesa-se o frasco e calcular o peso perdido durante a autoclavagem.
    5. Assepticamente adicionar 1 ml de água estéril para cada grama de peso perdida.
    6. Coloque sobre o gelo e adicione 50 ml de gelo frias 2x DMEM. </ Li>
    7. Misturar durante a noite utilizando um agitador magnético, a 4 ° C. Use uma técnica estéril para dividir a solução de metilcelulose a 5% em 20 ml de partes alíquotas. Armazenar alíquotas a 4 ° C por até seis meses ou até que o 2x DMEM expira. NOTA: Preparação de solução de metil-celulose a 5% em passos 3.1.1-3.1.7 terá ~ 2,5 dias.
  2. Preparação de Cortical astrócitos para Injeção
    1. Astrócitos corticais colheita, quando ~ 90% confluentes.
    2. Para a colheita, aspirado de DMEM completo e lava-se as placas com um volume igual de 37 ° C HBSS.
    3. Adicionar tripsina suficiente para cobrir a chapa. Incline e toque no prato até que as células começam a destacar.
    4. Inactivar a tripsina com um volume igual de 37 ° C completar DMEM.
    5. Transferir as células para um tubo de 50 ml e lava-se a placa com o mesmo volume de 37 ° C em DMEM completo usado 3.2.4.
    6. Transferência de mídia de lavagem para o tubo contendo células. Centrifugar a 200 xg durante 3 min.
    7. Aspirar supernatant células e ressuspender em 1 ml de 37 ° C completar DMEM.
    8. Contagem de suspensão de células utilizando um hemocitómetro ou outro marcador de células apropriado para determinar o número de células / ul.
    9. Transferir o número desejado de células para um novo tubo cónico de 15 ml. Centrifugar a 200 xg durante 3 min.
    10. Ressuspender as células em 800 mL de 37 ° C completar DMEM. Determinar o volume do sedimento de células (o volume total de suspensão de células - 800 ul). NOTA: É essencial para alcançar uma concentração de células precisa injectável. Assim, o volume do sedimento celular deve ser determinada nessa fase, a fim de calcular o volume de 5% de celulose de metilo, para adicionar no passo 3.2.12.
    11. Transferir as células para um tubo esterilizado de microcentrífuga de 1,5 ml e depois centrifugar a 200 xg durante 3 min.
    12. Aspirar o sobrenadante do pellet celular e ressuspender os astrócitos corticais no volume adequado de gelado 5% de celulose de metilo (volume total desejado - volume dea pelete de células) para se obter o número desejado de células / mL.
    13. Colocar as células em gelo até injecção.
    14. Coloque uma seringa de vidro de 250 mL em um Antigen dispensador de repetição em seguida, coloque um contundente 18 G agulha na seringa.
    15. Retirar o êmbolo devagar com a agulha na suspensão de astrócitos cortical; haverá uma bolha de ar acima das células que devem ser removidas, uma vez que as bolhas de ar irá comprimir e reduzir o volume realmente injectada no cérebro.
    16. Manter a ponta da agulha imediatamente a suspensão acima dos astrócitos cortical e empurrar o êmbolo para dentro rapidamente. A bolha de ar se movem mais rapidamente do que a suspensão de células e será principalmente expulso.
    17. Repetir o passo 3.2.16 até que todas as bolhas de ar são removidas da agulha.
    18. Encha a seringa para cerca de ~ 200 mL, em seguida, mantenha a agulha para cima e puxar o êmbolo para trás até que ele pare. Pequenas bolhas de ar podem ser removidos, mantendo a ponta da agulha para cima e empurrando o êmbolo se rapidamente em cerca de 50 ul então lentamente retirando a plena capacidade.
    19. Mantenha a ponta de pé e repita o passo 3.2.18 4-5x.
    20. Descarte a agulha de calibre 18 e encaixar uma agulha 27 G na seringa.
    21. Pressione o botão no dispenser antigénios até que o fluido é expelido a partir da agulha. NOTA: Para obter uma linha de células de astrócitos, as etapas 3.2.1-3.2.21 terá ~ 60 min.
  3. Preparação do NSC para Injeção
    1. Quando neurospheres forem> 100 m de diâmetro, a transferência para tubos de 15 ml e deixar os neurospheres resolver pela força da gravidade para> 5 min.
    2. Remover o sobrenadante e se dissociam as neuroesferas com um reagente de dissociação suave, tal como solução de dissociação de células estaminais ou Accutase de acordo com as instruções do fabricante ou com 0,05% de tripsina-EDTA como descrito 42.
    3. Inibir os reagentes de dissociação de acordo com as instruções do fabricante, sem expor o NSC soro. Centrifugar a 100 xg por 5 min.
    4. Contar as células utilizando um hemocitómetro ou outro marcador de células apropriado para determinar o número de células / ul.
    5. Transferir o número desejado de NSC para um novo tubo cónico de 15 ml. Centrifugar a 100 xg por 5 min.
    6. Ressuspender as células em 800 ul de 37 ° C HBSS. Determinar o volume do sedimento de células (o volume total de suspensão de células - 800 ul). NOTA: É essencial para alcançar uma concentração de células precisa injectável. Assim, o volume do sedimento celular deve ser determinada nessa fase, a fim de calcular o volume de 5% de celulose de metilo, para adicionar no passo 3.3.9.
    7. Transferência das células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril e depois centrifugar a 100 xg durante 5 min.
    8. Aspirar o sobrenadante e acabar de preparar as células para injeção ortotópico como em 3.2.12-3.2.21. NOTA: Para obter uma linha celular NSC, passos 3.3.1-3.3.9 terá ~ 60 min.
  4. Preparação do mouse para Injeção
    1. Anestesiar o animal receptor por meio de uma injecção IP de 250 mg / kg de Avertin (2,2,2 tribromoetanol) ou 100 mg / kg de cetamina, mais 10 mg / kg de xilazina, por orientações IACUC institucional. NOTA: aqui utilizados são ratos em 3-6 meses de idade como anfitriões aloenxerto. Ratos em idades diferentes podem ser utilizados para investigar o impacto microambiental da idade do desenvolvimento cerebral na tumorigênese.
    2. Raspar o couro cabeludo sobre o local da incisão com cortadores ou tesouras.
    3. Esteriliza-se o local cirúrgico com 3 cotonetes alternados de etanol a 70% e betadine.
    4. Aplicar pomada oftálmica nos olhos para evitar qualquer dano devido à perda de piscar reflexo.
    5. Avaliar profundidade da anestesia por interdigital (tep pitada) de reflexo. NOTA: Para 5 ratos, os passos 3.4.1-3.4.5 terá ~ 15 min.
  5. Implantação Ortotópico
    1. Prenda o animal no quadro estereotáxico.
    2. Makum e uma incisão ao longo da sutura sagital de aproximadamente 0,5 cm de comprimento entre os olhos e ouvidos.
    3. Localize o ponto de intersecção das suturas coronal e sagital (bregma), bem como a intersecção das suturas lambdóide e sagital (lambda). Certifique-se de que a Bregma e Lambda estão no mesmo plano horizontal.
    4. Introduzir a seringa que contém a suspensão celular e repetindo antigénio dispensador para a moldura estereotáxica sobre a cabeça. Traga a ponta da agulha 27 G em contacto com bregma. Esta é a origem que irá ser utilizado para a manipulação de coordenadas tridimensionais.
    5. Levante a agulha um pouco fora da superfície do crânio e mover 2 mm lateral e um milímetro rostral do Bregma.
    6. Abaixe a agulha com cuidado através do crânio para seu mm ventral de Bregma destino 4. NOTA: Nós utilizamos estas coordenadas estereotáxica para atingir os gânglios basais. Diferentes coordenadas estereotáxica pode ser utilizada para investigar o impacto de diferentes microambientalregiões do cérebro na tumorigênese.
    7. Injectar 5 ul da suspensão de células através da activação do dispensador de repetição do antigénio uma vez. Deixar a agulha no lugar durante 2 minutos para permitir que a pressão intracraniana para equilibrar.
    8. Retirar a agulha lentamente ao longo de um período de 30 seg. Utilize um cotonete para aplicar pressão sobre qualquer sangramento que possa ocorrer.
    9. Aproximar as bordas da ferida e fechar a incisão com cola de tecido. Administrar 20 ul de lidocaína por via subcutânea no local da incisão. NOTA: Para 5 ratos, os passos 3.5.1-3.5.9 terá ~ 50 min. A UNC IACUC aprovou o uso pós-operatório de anestesia local apenas. Consulta com IACUC institucional local é recomendado em relação aos requisitos para uso de analgésicos no pós-operatório após este procedimento.
  6. Cuidados pós-cirúrgicos
    1. Coloque os animais em um ambiente limpo, quente gaiola para se recuperar. Os animais não devem ser colocados diretamente na cama, como pode ocorrer aspiração acidental.
    2. Observe oanimais para a retomada de um comportamento normal, como aliciamento, alimentação e defecação. NOTA: Retomada do comportamento normal pode demorar ~ 60 min.

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Representative Results

Foi desenvolvido um sistema de modelo nGEM com astrócitos corticais e NSC colhidas de abrigar GEM neonatal floxed alelos oncogênicos condicional que pode ser fenotipicamente caracterizados in vitro e in vivo (Figura 1). A fim de investigar os efeitos de mutações oncogénicas especificamente em astrócitos do córtex in vitro, que é crítico para o primeiro enriquecimento em astrócitos. Colheitas de astrócitos corticais conter uma mistura de microglia, astrócitos, oligodendrócitos, neurónios, e OPC, mas os métodos mecânicos e genéticos podem ajudar na astrócito enriquecimento. Considerando que os neurónios morrem em condições de cultura normais, microglia e oligodendrócitos podem ser removidos por agitação durante a noite 41,43. Além disso, a recombinação genética entre alelos, floxed oncogénicos direccionadas para GFAP + astrócitos, utilizando um Ad5GFAPCre pode enriquecer em astrócitos. Usamos esse método para infectar colheitas corticais de filhotes Rb1 loxP / loxP GEM com floxo Nf1 loxP / loxP e / ou Pten loxP alelos / loxP. Ad5GFAPCre infecção causada uma vantagem proliferativa em GFAP recombinado + astrócitos, que aumentou de astrócitos pureza de 59% para> 90% após 5-9 passagens em cultura (Figura 2A e 2B). Em alternativa, nós enriquecido para astrócitos, expressando T 121 sob o controlo do promotor para induzir a PGFA uma vantagem proliferativa em astrócitos colhidas a partir de ratinhos TgGZT 121 (Figura 2C). Embora os astrócitos corticais crescer aderente à placa de cultura (Figura 2C), NSC crescer como neuroesferas não aderentes in vitro (Figura 3A). Ambos WT NSC e NSC com recombinados, floxed alelos oncogênicos - TgGZT 121 (T), Kras G12D (R), e eliminação Pten homozigoto (P - / -), conhecido como TRP- / - - Expressam o marcador Sox2 NSC, NSC enquanto apenas colhidas a partir de GEM contendo TgGZT 121 expressar T 121 após recombinação mediada por Cre (Figura 3B).

Para determinar como G 1 / S (Rb), MAPK e / ou da via PI3K alterações afectam o crescimento de astrócitos GFAP + in vitro, a proliferação foi avaliada utilizando dois métodos. MTS e contagem de células mostraram que a expressão de T 121 e Kras G12D aumento da proliferação de astrócitos corticais (Figuras 4A e 4B). Da mesma forma, homozigoto Rb1 (Rb) e Nf1 (N), exclusão combinada com heterozigotos Pten (P +/-) deleção também aumento da proliferação dos astrócitos cortical (Figura 4C). As células transformadas têm capacidade proliferativa ilimitada. Os efeitos de mutações de transformação pode ser medida in vitro utilizando colensaios de formação de ony. Por isso, testou os efeitos transformadores da T 121 e Kras G12D expressão e exclusão Pten homozigoto em TRP - / - astrócitos corticais pelo ensaio de formação de colônia, como descrito anteriormente 44. Considerando astrócitos WT não formam colônias, astrócitos T formado colônias na eficiência de 1,03%. Notavelmente, TRP - / - astrócitos apresentou a maior eficiência de formação de colónias a 6,40% (Tabela 1). De modo a ser adequado para o teste de drogas pré-clínico, é importante que em modelos de tumores in vitro ser facilmente manipulado geneticamente. Alterações genéticas adicionais podem ser estavelmente introduzidas em astrócitos corticais de plasmídeo ou vectores virais. Como um exemplo, transduzidas estavelmente o gene da luciferase em TRP - / - astrócitos (TRP - / - luc) usando um pseudotipado VSV-pMSCV vector retroviral. A expressão de luciferase aumentou luminescência ~ 1.000 vezes em comparação com células parentais ( in vitro. Nós mostramos anteriormente que o tratamento com uma dose baixa de PI-103, um inibidor de mTOR dupla / PI3K, inibiu a sinalização de PI3K, sem afectar a viabilidade das células 30. No entanto, os efeitos citostáticos / citotóxicos de altas doses PI-103 não foram determinadas. Assim, testou-se a PI-103 pode reduzir TRP - crescimento de astrócitos in vitro, - /. PI-103 provocou uma redução de 88% no máximo de TRP - crescimento de astrócitos (Figura 4E) - /. Nós já utilizados enxertos ortotópico de TRP - / - astrócitos para testar outras terapias clinicamente relevantes in vivo (Schmid et al, manuscrito submetido.) 45,46. Estes dados sugerem que os astrócitos corticais transformadas colhidas GEM condicional pode fornecer um sistema modelo flexível, em que a realização de testes pré-clínicos de drogas em mic competente imunológicoe.

Xenoenxertos de linhas de células humanas estabelecidas e PDX exigem hospedeiros imunodeficientes. Em contraste com PDX, muitas linhas de células humanas estabelecidas GBM não recapitular as características histopatológicas do GBM. Por exemplo, xenoenxertos U87MG ortotópicos formado tumores circunscritos que não invadem cérebro normal (Figura 5A). Em contraste, a injeção de TRP - / - astrócitos no cérebro de camundongos, sing�icas imunocompetentes produziram tumores invasivos que retomados as características histológicas de suas contrapartes humanas, particularmente invasão do cérebro normal (Figura 5B). Para quantificar longitudinalmente TRP - / - o crescimento do enxerto, os ratos foram sacrificados a cada 5 dias após a injecção das células e a carga tumoral foi determinada por quantificação da área do tumor em secções de cérebro de H & E-coradas. Área do tumor aumentou exponencialmente com o tempo (Figura 5C). Injeção ortotópico de 10 5 TRP - / - astrócitos em rcérebros ecipient levou a morbidade neurológica, com uma sobrevida mediana de 22 dias (Figura 5D). Além de astrócitos corticais, realizamos injeções ortotópico TRP - / - NSC. TRP - / - Os tumores foram derivados NSC-T 121 positivo, proliferativa, e mantida a expressão do marcador Sox2 NSC (Figura 6). De nota, a injeção de astrócitos corticais e NSC colhidas WT C57BL / 6, bem como os astrócitos corticais fenotipicamente WT ou NSC com unrecombined, floxed alelos oncogênicos do GEM condicional não conseguiu obter tumorigenesis durante este período de tempo (dados não mostrados). Longitudinal imagiologia in vivo, foi utilizado para monitorizar a cinética de crescimento do tumor, em resposta a tratamentos com medicamentos 40. Assim, TRP - / - astrócitos luc foram injectados nos cérebros de ninhada imunocompetentes singénicos e o crescimento do tumor foi determinado por imagem de bioluminescência série. Bioluminescência aumentou 15 vezes em relação a 16 dias(Figuras 7A e 7B). Nós demonstramos que os astrócitos corticais e NSC colhidas GEM condicional podem ser geneticamente modificadas e fenotipicamente caracterizadas in vitro e in vivo para a definição da genética e biologia celular de astrocitoma patogênese e potencialmente usado para o desenvolvimento de fármacos pré-clínicos.

Figura 1
Figura 1 Esquema de astrócitos corticais e NSC colheita de nGEM. Fenotipicamente WT astrócitos corticais e NSC foram colhidos GEM com alelos oncogênicos condicionais. A recombinação genética foi induzida in vitro com um vector AdCre. As células transformadas foram fenotipicamente caracterizadas in vitro por vários métodos, e in vivo por injecção ortotópico no cérebro de imuno-competente,ninhada sing�icas.

Figura 2
Figura 2 Enriquecimento de astrócitos GFAP + mediante passagens em série in vitro. Imagens de imunofluorescência mostrando representativos GFAP + colhidas a partir de astrócitos Rb1 loxP / crias loxP GEM com Nf1 loxP / loxP e / ou Pten loxP / loxP em que a recombinação genética foi induzida com Ad5GFAPCre e as células de subculturas n vezes (PX) (A). Quantificação de enriquecimento de GFAP + astrócitos do painel A. As barras representam o erro padrão 3-24 repetições (B). Representante de imunofluorescência (topo) e contraste de fase (inferior) imagens de astrócitos corticais aderentes colhidas a partir de 121 crias TgGZT GEM que expressam T 121 a partir do promotor de GFAP em passe9 anos de idade, após recombinação com Ad5CMVCre in vitro (C). Os astrócitos foram quantificados como o número de GFAP + (verde) células, dividido pelo número total de núcleos corados DAPI (azul) a cada outra passagem. As imagens foram tiradas a 10X a ampliação original (A, C). Barras de escala representam 100 mm (A, C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3 WT e recombinados NSC colhida de TRP - / - GEM. Imagens de contraste de fase representativos de fenotipicamente WT (topo) e TRP - / - (inferior) NSC como neuroesferas cultivadas in vitro (A). Imunofluorescência Representante para T 121 (verde) e Sox2(Vermelho) expressão em WT (topo) e TRP - / - (inferior) neuroesferas (B). Barras de escala representam 100 mm (A, B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4 Caracterização de astrócitos do córtex in vitro. Crescimento de WT e TR astrócitos corticais foi determinada pela contagem de células em 1-7 dias (D). A densidade óptica relativa (OD) de astrócitos corticais WT e de TR foi determinada por MTS (B). O crescimento relativo do WT e Rb1 recombinado - / -; Nf1 - / -; Pten +/- (RbNP +/-) astrócitos foi determinada pela MTS (C). Luminescência de TRP parental - / - e luciferase expressar TRP - / - astrócitos (TRP - / - luc) (D). OD Relativa de TRP - / - tratados com astrócitos PI103 durante 5 dias, tal como determinado pela MTS (E). Proliferação ea dose resposta foi calculada usando a equação de crescimento exponencial no GraphPad Prism 5. Barras representam o erro padrão de 6 repetições por condição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5 In vivo gliomagênese. Representante seção H & E manchada de um xenotransplante U87MG apresenta margens tumorais discretos (A). Representante H & E seção manchada de um TRP - / - enxerto mostra invasão difusa do cérebro normal (B). As barras de escala em imagens de H & E para a esquerda e direita representam 1 mm e 100 mm, respectivamente. Área do tumor foi determinado pela análise secções H & E manchadas de formol fixa, embebidos em parafina de cérebros, ninhada sing�icas imuno-competentes injetados com 10 5 TRP - / - astrócitos e sacrificados em intervalos de cinco dias após a injecção. (C). Kaplan-Meier análise de sobrevivência de TRP - / - ratos aloenxerto com idade a morbidade mostra uma sobrevida mediana de 22 dias (D).

Figura 6
Figura 6 Imunofluorescência de TRP +/- aloenxertos NSC. Imagens de imunofluorescência representativos mostram que TRP +/- NSC injetada no cérebro de ninhada, sing�icas imuno-competentes expressar T 121 (verde) e Sox2 (branco) e proliferar, como determinado por EdU (vermelho) incorporação. Ratos foram perfundidos com o Edu e sacrificados 6 semanas após a injeção e seus cérebros perfundidos com paraformaldeído. Barra de escala representa 20 m. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7
Figura 7 imagiologia longitudinal do TRP - / - aloenxertos luc. Imagens representativas de bioluminescência (A) e a quantificação de fluxo de luciferase ao longo do tempo (B) mostra o crescimento de TRP - / - aloenxerto em ratinhos singeneicos, imuno-competentes injectados com 10 5 TRP - / - astrócitos corticais luc e fotografada em dias indicados pós injecção.g "target =" _blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Genótipo Eficiência de plaqueamento (%) SEM
WT 0 0
T 1.03 0,15
TRP - / - 6,40 0.83

Tabela 1 A formação de colónias de astrócitos corticais. WT, T e TRP - / - astrócitos corticais foram plaqueadas em triplicado em 4000, 2000, e 250 células / poço, respectivamente. Colônias foram coradas com cristal violeta 14 dias após o plaqueamento, fotografada, e coUnted usando ImageJ. Plaqueamento eficiência foi calculada como o número de colónias, dividido pelo número de células plaqueadas.

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Discussion

Os passos mais críticos para assegurar a colheita e a cultura de astrócitos do córtex são 1) adequada para excisar o córtex sem tomar tecido abaixo do corpo caloso, 2) para remover as meninges, 3) para dissociar completamente as células, e 4) para o enriquecimento para a GFAP + astrócitos. Embora utilizando mecânica (agitação), e genética (restrição de recombinação genética com um vector Ad5GFAPCre ou utilização de um transgene transformadora dominante (TgGZT 121) sob o controlo do promotor GFAP) métodos para o enriquecimento em astrócitos GFAP +, outras técnicas têm sido utilizadas para purificar cortical astrócitos. Por exemplo, a contaminação microglia pode ser removido por tratamento de culturas confluentes com um inibidor mitótico seguido de éster metílico de L-leucina 47. Os perfis de expressão de morfologia e de astrócitos mecanicamente purificadas e cultivadas em meios contendo soro diferem dos astrócitos agudamente isolados, com o ex hipótesezed para representar tanto células astrocitárias mais imaturos ou um astrócitos fenótipo reativa 48,49. Mais recentemente, um método immunopanning foi desenvolvido para purificar prospectivamente astrócitos roedores corticais e os seus perfis de expressão mais estreitamente imitou agudamente astrócitos purificadas quando cultivadas em crescimento, meio isento de soro suplementado com factor de 49. O impacto do método convencional, a mecânica de enriquecimento de astrócitos cortical e cultura em relação ao método immunopanning mais recentemente desenvolvida nos fenótipos investigados aqui permanecem obscuros. Independentemente do método utilizado, que é essencial para enriquecer para GFAP + astrócitos corticais para determinar as consequências fenotipicas de mutações oncogénicas especificamente dentro deste tipo de células.

As etapas críticas para a apanha NSC são: 1) para localizar com precisão o ZSV, 2) para minimizar os danos ao ZSV durante a dissecação, e 3) para filtrar as células após dissociação antes do plaqueamento. Precise NSC técnica de dissecção é necessário localizar e colher o ZSV. Porque NSC crescer em cultura em suspensão, que é essencial para filtrar a suspensão de células depois de dissociação para reduzir a quantidade de detritos flutuantes. Apesar de termos utilizados crescimento em SCM a seleccionar para NSC, NSC pode ser isolado por prospectivamente activadas por fluorescência de células do tecido homogeneizado SVZ 50. Após a indução de recombinação genética in vitro, é importante controlar as características celulares do astrócito e culturas corticais NSC através passagens. Porque nós não prospectivamente para enriquecer astrócitos ou NSC durante a colheita de tecidos, que em série monitorado enriquecimento e pureza quantificada do tipo de célula de interesse pela técnica de imunofluorescência com marcadores específicos conhecidos do tipo celular (GFAP para astrócitos, Sox2 para NSC). Além disso, recomendamos monitorar sistematicamente as conseqüências esperadas de sinalização de mutações oncogênicas antes e em cada passagem após Cre-mediatod recombinação por immunoblotting e fenotipicamente caracterizar células, na primeira passagem em que a pureza é maximizada e mutação induzida alterações de sinalização estabilizar.

Uma consideração importante na utilização de culturas de células primárias é a sua capacidade de replicação e o impacto inerente fenotípica das mutações induzidas. Fenotipicamente WT astrócitos murinos têm limitado capacidade de replicação e só podem ser passadas 3-4 vezes na cultura antes de sofrer envelhecimento replicativo 31. Além disso, muitas mutações associadas cancro, particularmente nos genes da via de MAPK, causa senescência induzida por oncogene in vitro 51. Assim, se as mutações induzidas falhar para imortalizar células e protegê-los de senescência induzida pelo oncogene, eles não podem ser passados ​​em série para a caracterização fenotípica in vitro. As oncoproteínas virais, tais como o HPV E6 / E7 e antigénio T grande de SV40 têm sido extensivamente utilizada para imortalizar muitos mu humana etipos de células Rine na cultura, incluindo os astrócitos 13,26,30. Nós mostramos anteriormente que a ablação do G1 / S do ciclo celular com T checkpoint foi suficiente para imortalizar os astrócitos do córtex cerebral, mas não suficiente para provocar a astrocitomas letais in vivo. Em contraste, a activação de MAPK e PI3K sinalização em TRP - / - astrócitos levou à formação de GBM no sistema modelo de aloenxerto ortotópico 30. Assim, os efeitos das mutações de T, R, P e na transformação de astrócitos de murídeo, in vitro, tal como definido por meio de ensaios de formação de colónias in vivo correlacionaram com tumorigénese em aloenxertos ortotópicos.

Como todos os modelos que requerem o implante cirúrgico de células tumorais, injecção ortotópico de células transformadas, nGEM em cérebros de rato singeneicos, provocará uma resposta de ferida aguda, denominada gliose reativa. Durante esta resposta, células neurais, incluindo os astrócitos, células progenitoras de oligodendrócito (NG2 +), as células da glia e microglia, prolifercomeu e adquirir um estado de diferenciação mais primitivo, em grande parte em resposta a proteínas secretadas como o Sonic hedgehog 52,53. No entanto, a fase proliferativa da gliose reactiva em resposta a ferimentos facada é relativamente curto, tipicamente uma semana 53. Já mostramos anteriormente que a injeção de TRP - / - astrócitos induz eficiente tumorigenesis durante este período de tempo, produzindo astrocitomas de baixo grau que freqüentemente evoluem para astrocitomas de alto grau, incluindo GBM. Em contraste, a injeção de T ou TP - / - astrócitos raramente desenvolvem em astrocitomas de baixo grau em 1-3 semanas após a injecção e estes tumores não conseguem progredir para alto grau de astrocitoma 30. Além disso, a injecção de fenotipicamente de tipo selvagem astrócitos corticais e NSC sozinho não consegue induzir a tumorigénese (dados não mostrados). Descobrimos que TRP - / - de crescimento do enxerto aumenta exponencialmente 2-3 semanas após a injecção, um período de tempo durante o qual a fase proliferativa de reagirive gliosis já terminou (Figuras 5 e 7). Para dar conta de influências microambiente potenciais sobre tumorigenesis após a injecção de células transformadas, nGEM nos cérebros sing�icas rato, particularmente durante a fase proliferativa da gliose reativa, recomendamos a realização de injeções de controle de astrócitos corticais fenotipicamente WT ou NSC ao investigar novas combinações de unrecombined, floxed oncogênico alelos. Recomenda-se também monitorar a eficiência de desenvolvimento de neoplasias de ambos (recombinados) células fenotipicamente WT e transformadas em intervalos semanais durante o primeiro mês pós-injeção, como já descrito anteriormente 30.

Através da manipulação genética de qualquer das células injectadas ou do próprio hospedeiro de aloenxertos, o sistema modelo astrocitoma nGEM pode ser utilizado para modelar muitos aspectos da patogénese astrocitoma, incluindo interacções tumor do estroma. Como um exemplo, engenharia TRP - / - astrocy corticaltes para expressar luciferase para definir a cinética de crescimento do tumor in vivo (Figura 7). Alternativamente, as células nGEM poderia ser geneticamente modificados para expressar uma proteína fluorescente e ortotopicamente injectados nos cérebros de GEM com neurónios ou vasculatura marcados com fluorescência para definir as interacções entre as células tumorais e as células normais do cérebro 54. A influência de microambiental região do cérebro ou idade de desenvolvimento em gliomagênese pode ser determinado por injecção de células ortotopicamente nGEM em diferentes locais ou em diferentes ratinhos envelhecidos. Apesar de latência curta tumor e sobrevivência é benéfico para os exames toxicológicos pré-clínicos, o desenvolvimento do tumor rápida pode não ser ideal para modelar alguns aspectos da patogênese astrocitoma, incluindo progressão maligna, invasão e interações tumor-estoma. A sobrevivência do aloenxerto nGEM hospedeiros podem ser facilmente manipulados através da alteração do número de células injectadas e monitorização sistemática penetrância do tumor e 3 latência0.

Astrocitomas humanos são genomicamente complexo e exibem extensa intra e inter-tumor heterogeneidade 5-7,55,56. As fontes potenciais de essa heterogeneidade incluem as mutações somáticas que iniciam tumorigênese, as mutações adquiridas durante o processo evolutivo de progressão maligna, eo potencial de desenvolvimento das células em que ocorrem essas mutações. Projetos de seqüenciamento de larga escala identificaram muitas mutações associadas à astrocitoma e seus padrões de co-ocorrência 7. Estes estudos têm invocado algoritmos de bioinformática para identificar mutações que ocorrem freqüentemente e de nomear mutações que possam oncogênico, ie. "mutações do controlador" que iniciam tumorigenesis ou unidade progressão maligna. No entanto, o potencial oncogénico dos muitos destas mutações, e o seu potencial especificidade tipo célula, não tem sido investigado sistematicamente em sistemas modelo. Propomos que os modelos nGEM utilizing astrócitos corticais e NSC como descritos aqui, bem como outros tipos de células neuronais que podem ser purificadas e produzidas em cultura, proporcionar um sistema versátil para realizar essas investigações. A suficiência e da necessidade de transformação de novas mutações candidatos identificados através de projetos de seqüenciamento em larga escala pode, então, ser sistematicamente investigada usando gain- genético convencional e perda de função se aproxima com tipos específicos de células nGEM abrigar mutações comuns co-ocorrem nas vias GBM fundamentais para que GEM condicional existem 5. Nós ainda propor que os painéis de nGEM abrigando diversas combinações de mutações em vários tipos de células neurais será útil na modelagem da heterogeneidade da genômica de astrocitomas humanos. Além disso, os modelos de astrocitoma nGEM com astrócitos corticais e NSC derivados do GEM condicional pode fornecer um modelo tratável para o desenvolvimento pré-clínico de drogas porque o teste inicial in vitro de ambas as terapias mono e combinação podeser realizada nestas células para dirigir mais eficiente em testes de drogas in vivo, em ratinhos singeneicos, imuno-competentes. Além disso, a modulação imunológica e terapias alvo-estroma pode ser testada em modelos astrocitoma nGEM com imunes competentes, sing�icas anfitriões aloenxerto. Assim, modelos com astrocitoma nGEM astrócitos corticais transformadas e NSC são um sistema modelo útil para determinar as consequências funcionais de combinações de mutações oncogénicas em tipos específicos de células e pode ser útil em testes pré-clínicos de drogas.

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Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) Invitrogen 11995065 DMEM can also be purchased from other suppliers including GIBCOSigma and Cellgro
Fetal Bovine Serum, Regular Cellgro 35-010-CV
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122
Sharp-Pointed Dissecting Scissors Fisher Scientific 08-395
Cartilage Thumb Forceps, Curved Fisher Scientific 1631
Miltex 17-301 Style 1 Jeweler Style Forceps, Fine, 4 Miltex 17-301
Ethanol (200 proof) Decon Labs 2710
Razor Blades VWR 55411-050
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid Invitrogen 14175-095
TrypLE Express (1x), Phenol Red Invitrogen 12605-010 Other trypsin solutions are also suitable for cortical astrocyte havest and culture
Culture Dish, 60 x 15 mm Thomas Scientific 9380H77
15 ml Tubes BD Biosciences 352096
50 ml Tubes BD Biosciences 352070
Adenovirus stock Gene Transfer Vector Core, U. Iowa Ad5CMVCre Store in 5 µl aliquots at -80 °C. Hazardous. Use Bsl2 safety precautions
Sodium sulfate (Na2SO4)  Sigma-Aldrich 238597
Potassium sulfate (K2SO4) Sigma-Aldrich 221325
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M8266
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich 746495
HEPES potassium salt Sigma-Aldrich H0527
D-(+)- Glucose Sigma-Aldrich G8270 
Phenol Red Sigma-Aldrich P3532
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S5881
Papain Worthington LS003127
L-Cysteine-HCl Sigma-Aldrich C1276
Syringe filter (0.22 µm pore size) Millipore SLGP033NS
Neurocult proliferation kit, mouse Stemcell Technologies 5702 This kit contains the NeuroCult NSC Basal Medium and NeuroCult NSC supplement needed for NSC culture
0.2% Heparin solution Stemcell Technologies 7980
EGF  Invitrogen PMG8041
bFGF  Invitrogen PHG0261
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (10x) Invitrogen 14185-052
Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma-Aldrich M7506
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761
E-64 Sigma-Aldrich E3132 Make 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C
6-well Plates Fisher Scientific 07-200-83
Cell strainer (40 µm pore size) Corning 352340
Stem cell dissociation solution Stemcell Technologies 5707 Alternatively, use gentle enzyme solutions such as Accutase
Methyl cellulose 15 cP Sigma-Aldrich M7027
Dulbecco's Modified Eagle's Media 2x Millipore SLM-202-B For making 5% methyl cellulose solution
1.7 ml Snap Cap Microcentrifuge Tube Corning 3620
Hamilton syringe, 250 µl LT no needle Fisher Scientific 14-815-92
PB600-1 Antigen Dispenser Hamilton  83700
Disposable 18 G needles Fisher Scientific NC9015638
27 ga 1/2" luer tip needle Fisher Scientific 14-826-48
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) Sigma-Aldrich T48402
Betadine Fisher Scientific NC9386574
Puralube Opthalmic Ointment Fisher Scientific NC9689910
Model 900 Stereotaxic frame Kopf Instruments
VETBOND Fisher Scientific NC9259532  Tissue adhesive 
Lidocaine  ShopMedVet RXLIDO-EPI
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) Promega G3580
Anti-Sox2 Millipore AB5603
Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Dako Z0334 
IVIS Kinetic PerkinElmer For in vivo imaging
D-Luciferin - K+ Salt Bioluminescent Substrate PerkinElmer 122796 For in vivo bioluminescence imaging
EdU Imaging Kit Invitrogen C10340
MSCV Luciferase PGK-hygro Addgene 18782

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References

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Neurociência Edição 90 astrocitoma astrócitos corticais ratos geneticamente modificados glioblastoma as células-tronco neurais enxerto ortotópico
Modelagem astrocitoma Patogênese<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Usando Cortical astrócitos ou células-tronco neurais de condicional, Geneticamente Modificadas Ratos
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McNeill, R. S., Schmid, R. S., Bash, … More

McNeill, R. S., Schmid, R. S., Bash, R. E., Vitucci, M., White, K. K., Werneke, A. M., Constance, B. H., Huff, B., Miller, C. R. Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice. J. Vis. Exp. (90), e51763, doi:10.3791/51763 (2014).

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