Introduction
星形细胞瘤是最常见的原发性脑肿瘤和胶质母细胞瘤（GBM），IV级星形细胞瘤，是最常见的和积极的亚型12-15 1,2个月，中位生存期。弥漫性星形细胞瘤，尤其是大紫荆勋贤，入侵排除手术完全切除，限制了辅助治疗的效果，并不可避免地导致治疗后复发3。患者最初存在要么从头（主）GBM或更低级别星形细胞瘤不可避免地发展到（二级）GBM 4。 GBM是基因组异质性和基因支配三个核心信号通路特征是相互排斥的，共同发生突变：在G1 / S 期 （RB）细胞周期检验点，受体酪氨酸激酶（RTK）和TP53途径5-7。 GBM由四个基因与亚型，类似于大脑不同的细胞类型不同的表达模式，表明GBM亚型是influ原产6,8,9其小区enced。更好的星形细胞瘤模型须在星形细胞瘤的发病机制来定义在特定细胞类型的突变的特定组合的作用。利用这些模型进行更有效的临床药物开发将最终有助于改善患者的预后。当前星形细胞瘤模型包括已建立的人细胞系，来自患者的异种移植物（PDX），遗传修饰的正常人星形细胞和神经干细胞（NSC），以及基因工程化小鼠（GEM）10-14。我们开发了一个替代方案，非生殖细胞创业板（nGEM）模型采用15原发性脑细胞-星形胶质细胞和NSC -从创业板窝藏两侧装接loxP致癌等位基因的不同组合收获。我们的目标是生成星形细胞瘤模型与遗传限定的细胞可以被表型特征在于在体外和在体内和潜在地用于临床药物开发第immune能力的小鼠。
建立的人细胞系是最常用的模型星形细胞瘤的发病机制及在体外和体内的药物反应，它们在技术上是简单的，广泛使用的，并且已经在免疫缺陷小鼠10,11,16-18限定在原位异种移植动力学和致瘤性。其缺点包括不能产生从低级别星形细胞瘤的细胞株，限制研究仅向高级别星形细胞瘤;缺乏定义的起源细胞;的复杂基因组的异常，通常与明显不同的原患者样品的基因组谱的存在;和易感性血清11,17,19-22串行 培养过程中的表型和基因型漂移。在建立人类GBM细胞系个人致癌基因突变的表型结果可以通过多种异常，这实际上是目前，这往往妨碍eluc被屏蔽idation直接基因型 - 表型的影响。
通过病人隔离星形细胞瘤细 胞在免疫缺陷小鼠中，或通过它们的培养中所定义的无血清培养基中之前，原位注射非粘附球状体到免疫缺陷小鼠12,23的脑部皮下通道产生PDX。 PDX更准确地保持人体星形细胞瘤的基因组景观，而是类似建立的人细胞系中，个体的致癌基因突变的表型效果可以由于它们的基因组的复杂性19,24所掩盖。要定义特定的致癌基因突变表型的后果，特别是在应对新的治疗方法，建立了人类细胞系或PDX的面板常常用来建立基因型 - 表型的相关性，显示出普遍性，并尽量减少对细胞的特定影响的可能性。虽然PDX准确地概括星形细胞瘤，INC。的病理特点泸定入侵，建立人类细胞系原位移植瘤一般不21,23,25。另外，正常人星形细胞和NSC已被基因工程化以定义的致癌基因突变，以星形细胞瘤肿瘤的体外和体内 13,14,26建模。这些细胞缺乏建立的人细胞系和PDX的基因组的复杂性，准确地概括人星形细胞瘤组织病理学，但需要异种移植在体内的免疫缺陷的啮齿动物。因为所有的人细胞模型需要免疫缺陷啮齿动物宿主以防止免疫介导的异种移植排斥反应，这些模式不能概括同系系统的天然肿瘤 - 基质相互作用和缺少一个完整的免疫系统，从而限制基质靶向和免疫调节的临床前调查治法10,11。
致癌墓塔预定组合的表型后果创业板证考试期间原位肿瘤发生系统蒸发散体内 。而非条件GEM有所有组织中的突变在整个发展，有条件GEM已经两侧装接loxP的致癌等位基因，使突变的，通过使用细胞类型特异性启动子10,11,15,18限制酶Cre介导的重组到特定的细胞类型定位。有条件的星形细胞瘤GEM已利用一个完整的脑11内阐明在不同的细胞类型中的致癌基因突变的功能角色。 原位 gliomagenesis使用条件GEM的临床前程序是由若干因素，包括1）缺乏体外互相关联，2）难以产生小鼠的大样本与复基因型的原位肿瘤的发展，3）长潜伏期不限，4）和随机肿瘤进展。因为原位肿瘤缺乏对应的体外模型中， 在体外药物测试无法进行瓦特第i个传统的条件创业板模型。在对比其它癌症，脑星形细胞瘤的条件GEM模型由单个致癌基因的突变11很少被诱导。因此，复杂的育种计划必须产生具有多个致癌基因突变的条件GEM。此外，星形细胞瘤起始时具有可变的外显率在这些模型中很长的潜伏期后，而进展到高级别星形细胞瘤一般发生在一个非均匀，随机的方式，最终会引起肿瘤的复杂基因组的风景和快速生长动力学27 28。可变外显率和恶性进展的随机性在有条件的创业板模型要求，个别小鼠经X线影像学筛查的临床前药物试验入组前检测的高级别星形细胞瘤的存在和位置。综合起来，这些限制阻碍了需要公关的产生和创业板条件的大型同伙测试电子临床药物试验。
将RCAS-TVA GEM系统，它利用禽逆转录病毒（RCAS）载体来感染GEM改造以表达病毒受体（TVA）上的特定神经细胞类型中，已被广泛用于模拟星形细胞肿瘤11。相反，创业板的条件，该模型系统能够引进特定细胞类型的多种致癌突变没有复杂的育种计划的要求。然而，它是由可变外显率，为积极分裂的细胞来实现病毒整合的要求，并在随机插入 转基因到宿主基因组29限定。
非种系GEM（nGEM）模型，其中利用细胞从GEM收获，正变得越来越重要，因为它们克服了许多其他模型系统15的限制。发起于星形细胞瘤发病机制的细胞类型和共同发生突变的作用都难以阻止矿用建立的人GBM细胞系或PDX因为它们是从恶性进展的过程中，已经积累了大量的基因突变中未定义的细胞类型，终末期肿瘤衍生的。相比之下，星形细胞瘤各年级可以使用nGEM通过诱导特异性纯化脑细胞类型11,30中定义的基因突变进行建模。因此，特定的基因突变和在细胞和分子表型细胞类型的影响，可以在体外和体内测定。类似建立的人GBM细胞系中，使用nGEM初始体外药物测试可用于优先级药物的体内试验采用相同的细胞。肿瘤在体内然后可通过同种异体移植nGEM细胞原位成的免疫能力的同基因同窝30的大脑来确定。因此，这些原位移植模型允许在体内试验，不仅传统的细胞毒性á次有针对性的治疗，但免疫调节和基质靶向治疗为好。最后，对肿瘤的发生和发展的微环境的作用，可通过使用相同的突变在相同的细胞类型进行比较nGEM和常规GEM模型之间的结果来确定。
我们和其他人已经开发出星形细胞瘤nGEM使用原代细胞-星形胶质细胞，国科会，还是少突胶质前体细胞（OPC） -由创业板30-34收获。后面的星形细胞瘤nGEM发展的理论基础是建立一个模型，以确定在特定的细胞类型的致癌基因突变，可能在免疫感受态的动物可用于体外临床药物试验和体内表型的影响。我们收获的野生表型星形胶质细胞和NSC非Cre表达，维持在> 94％的C57 / BL6背景，两侧装接loxP Rb途径有条件的创业板-皂苷Rb1 的loxP / loxP位 ，或TgGZT121 -和两侧装接loxP RTK / RAS / PI3K通路- NF1 的loxP / loxP位 ， 嘉仕G12D和PTEN 的loxP / loxP位 -基因的不同组合35-39。我们采用编码Cre重组酶的腺病毒载体诱导的基因重组体外 。因为皮质星形细胞收获含有细胞类型的混合物中，我们使用Ad5GFAPCre载体或显性致癌基因的转基因，如TgGZT 121从人GFAP启动子驱动的，以富 集在这些培养物GFAP +星形胶质细胞。我们定义G 1 / S的表型结果（RB），MAPK和PI3K途径的突变在星形胶质细胞和NSC 的体外和体内 。 MAPK和PI3K途径活化的G1 / S期缺陷型星形胶质细胞的分子拟仿人体前神经GBM，一经原位注射，在一个预先定义的位置的均匀生长动力学，短的等待时间形成的肿瘤，和组织病理学人标志人类GBM 30。 体内纵向监测肿瘤的生长有助于治疗反应40通过治疗组群和肿瘤生长的定量分析的归一化的临床前药物测试。我们通过注射荧光素酶表达星形胶质细胞的小鼠的纵向生物发光成像确定肿瘤的生长动力学。因此，星形胶质细胞和NSC从创业板有条件衍生为的星形细胞瘤相关的基因突变功能的后果和临床前药物开发的潜在模型系统定义中的易处理的模型系统。
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Protocol
所有的动物研究批准了北卡罗莱纳州的机构动物照顾及使用委员会的大学。
1，培养星形胶质细胞从新生小鼠
- 准备
- 揉碎2-3棘手的任务的组织，并放入含70％乙醇的烧瓶的底部。将解剖剪刀，弯钳和2对直微型镊子这个烧瓶中。该组织被用来避免弯曲的微型镊子。
- 加入1 ml HBSS至60毫米组织培养皿。准备一个单独的菜每个动物和菜保持在冰上。
- 麻醉每个机构规定的动物。
- 暖7毫升DMEM中含有10％胎牛血清和1％青霉素 - 链霉素（完全DMEM），用于在37℃的水浴中各动物。注：对于5只小鼠，步骤1.1.1-1.1.4将采取〜15分钟。
- 组织收获
- 牺牲新生小鼠（1-3天）每institutional法规。
- 从乙醇中取出解剖剪刀，让他们滴干，并在皮肤上矢状切下来的脊髓鼻子的头盖骨。
- 使在颅骨的切口沿矢状缝，从脊髓开始和过去嗅球延伸。注意保持剪刀头颅骨的内表面附近，以尽量减少脑组织损伤。
- 用弯钳，轻轻剥离颅骨的每个半球横向远离大脑。
- 采用直板微型镊子，轻轻捏每个客场半球皮质的背部分，将其放入含有的HBSS的组织培养皿。小心避免小脑和嗅球。不要把下面的胼胝体的任何组织。
- 用解剖显微镜和2对微型镊子，轻轻地从每个半球皮质去除脑膜。返回的组织培养皿冰，直到开始组织homogenizatioñ。
- 重复步骤1.2.1至1.2.6每增加动物。注：对于5只小鼠，步骤1.2.1-1.2.7将采取〜30分钟。
- 组织匀浆
- 用干净的刀片，细切块的半球皮质和板移动到组织文化引擎盖。
- 转移切块组织成一个无菌的15 mL锥形管。用1ml冰冷的HBSS洗涤平板，并转移到含有组织的试管中。
- 等到组织沉降到管底，然后用移液管小心地除去过量的HBSS中。
- 加入2毫升室温胰蛋白酶/ EDTA。吸管〜10倍以1毫升吸管进一步分解细胞。
- 孵育的细胞悬浮液，在37℃下进行15 - 20分钟。通过倒置仔细混合，每隔5分钟。
- 加入3 ml完全DMEM中抑制胰蛋白酶。吸管〜10倍以1毫升吸管混合的解决方案。
- 离心机在200×g离心5分钟，在室温下进行。
- 删除上清液用1毫升移液管。不要吸出培养基，因为颗粒可能松动。
- 悬浮于4毫升37°的小球C完整的DMEM。细胞悬液转移到75厘米螺杆顶端的组织培养烧瓶中。注：对于5只小鼠，步骤1.3.1-1.3.9将采取〜50分钟。
- 大约星形胶质细胞采收后16小时，用4毫升37℃的HBSS洗烧瓶中，再加入4毫升37°C完整的DMEM。保持在37℃，在5％CO 2中的星形胶质细胞。注：该洗涤工序是用于去除未贴壁的细胞和碎片从培养皿重要。
- 当培养物是〜95％汇合时，摇动过夜，于37℃在5％CO 2中 ，删除包含分离的细胞的培养基，然后用4ml的37℃下的HBSS洗烧瓶。加4毫升37℃，5％CO2完全DMEM，并维持细胞在37℃。注意：这一步是非常重要的，以丰富的文化为星形胶质细胞，如污染小胶质细胞和少突胶质细胞祖细胞的分离与此过程，并从培养41被除去。
- 每个动物重复步骤1.3.1-1.3.11。
- 诱导基因重组
- 24小时完成步骤1.3.11后，用2ml的37°更换培养基C完成的DMEM。加入1毫升37℃单片机含1微升Ad5CMVCre或Ad5GFAPCre> 10 10 PFU /毫升。处理时，使用BSL2安全防范措施重组腺病毒：在5％CO 2 .CAUTION孵育6小时，在32℃。
- 删除病毒载媒体及无病毒增加37℃，完全DMEM的星形胶质细胞。注意：处理BSL2使用安全注意事项时，重组腺病毒并放弃每制度规定含有病毒的媒介。注：对于5星形胶质细胞培养，步骤1.4.1 - 1.4.3将采取〜15分钟，不包括6小时的潜伏期。
- 展开皮质星形胶质细胞培养物中体内和体外表征。注：确定突变的下列酶Cre-重组，通过PCR用特异于重组基因或通过免疫印迹对任一特定突变的蛋白质或它的信令后果的引物存在下进行。 Cre的重组后所需的皮质星形细胞培养的表型稳定的时间将取决于所利用的突变，并且必须凭经验确定（ 图2）。
从新生小鼠2培养神经干细胞
- 准备
- 在开始解剖前，准备每脑4毫升消化溶液中加入3.1毫克木瓜蛋白酶和1.3毫克半胱氨酸到4ml解离介质- 98毫米的Na 2 SO 4，30mM的K 2 SO 4，5.8毫米MgCl 2，0.25mM的氯化钙 ，1毫米肝素钠（1 M羟乙基pH为7.4股），20毫米的葡萄糖，0.001％酚红，和0.125毫米氢氧化钠。除了木瓜蛋白酶和半胱氨酸的分解介质，有可能使溶液变黄。
- 孵育37℃水浴15分钟。颠倒定期混匀。
- 添加0.1 M氢氧化钠滴，直到消化液返回到亮红色。
- 在组织培养罩，无菌过滤器使用注射器滤器（0.22μm孔径）的消化液。置于冰上的消化液。
- 通过混合44.5毫升NSC基础培养基，加入5ml NSC补充，0.5 ml的青霉素 - 链霉素，50微升0.2％的肝素，10微升100微克/毫升的EGF，和10微升100微克/毫升制备50毫升干细胞培养基（SCM）的bFGF的。 SCM是稳定1个星期保存在4℃下时。
- 完整的HBSS（cHBSS）通过混合50毫升10×HBSS，1.25毫升的1M HEPES（pH7.4）中，制备15毫升的1M D-葡萄糖，加入5ml的100mM的CaCl 2，加入5ml的100mM MgSO 4干燥，和2ml 1 M的NaHCO 3。使总体积至500ml与DDH 2 O。
- 过滤消毒cHBSS机智HA 0.2微米孔径过滤器和储存在4℃。
- 揉碎2-3棘手的任务的组织，并放入含70％乙醇的烧瓶的底部。将解剖剪刀，弯钳和2对直微型镊子这个烧瓶中。该组织被用来避免弯曲的微型镊子。注：对于5只小鼠，步骤2.1.1-2.1.8将采取〜45分钟。
- 组织收获
- 牺牲每个机构的规定新生儿（1-3天）小鼠。
- 从70％的乙醇去除解剖剪刀，让他们滴干，并在皮肤上矢状切下来的脊髓鼻子的头盖骨。
- 使在颅骨的切口沿矢状缝，从脊髓开始和过去嗅球延伸。注意保持剪刀头颅骨的内表面附近，以尽量减少脑组织损伤。
- 用弯钳，轻轻剥离颅骨的每个半球横向距离大脑。
- 轻轻地取出整个大脑和发生在冰冷cHBSS。
- 用解剖显微镜下，小心地从大脑解剖细移除工具脑膜。
- 将大脑其底面和去除小脑/后脑和嗅球/额叶皮层与垂直（日冕）削减了大小11手术刀。
- 旋转90°，剩下的大脑将其放置在尾部分，从而产生脑的冠状图。找到侧脑室。
- 切出含有脑室下区（SVZ）一个立方体部分。
- 转让SVZ含组织，以60毫米组织培养皿新鲜冰冷cHBSS切末组织与规模11手术刀。
- 转移组织糜到无菌的15ml试管中。放置在冰上的管中。
- 洗培养皿1-2毫升冰冷cHBSS。传送洗涤溶液含有组织的试管中。
- 重复额外neonata步骤2.2.1-2.2.12升鼠如果必要的。转让全部15ml试管，以组织培养罩的协议的其余部分。注：对于5只小鼠，步骤2.2.1 - 2.2.13将采取〜45分钟。
- 组织匀浆
- 将在37℃水浴消解液（步骤2.1.1准备）5分钟。此外，温暖的2毫升单片机每大脑在37℃水浴。
- 小心地用1毫升移液管取出的组织糜的上清液。不要吸。
- 添加每15ml试管2毫升37℃消化解决方案，并通过倒置精心搭配。
- 孵育37℃水浴15分钟。通过倒置混合，每隔5分钟。
- 添加另外2毫升37℃消化解决方案，以每管并重复步骤2.3.4。
- 使细胞沉降到管通过重力的底部，然后用1毫升移液管取出从消化的组织上清。
- 加入2毫升10微米的E-64稀释在cHBSS并通过倒置仔细混匀。
- 使细胞沉降到管通过重力的底部，然后从消化的组织上清。
- 加入1毫升37℃cHBSS，均质1毫升枪头（〜20次）。避免组织均化过程中注入空气泡。
- 通过40微米孔径的细胞过滤器的组织匀浆，然后用清水冲洗过滤用5毫升37℃cHBSS。
- 离心匀浆以125×g离心5分钟。
- 而不干扰细胞沉淀除去95％的上清液用1毫升移液管。仔细重悬细胞沉淀在200微升37℃单片机与200微升枪头。
- 添加1.8毫升37℃SCM与细胞悬浮液转移到一个无菌的6孔板的孔中。注：对于5只小鼠，步骤2.3.1-2.3.14将采取〜75分钟。
- 神经干细胞培养
- 通过添加另一个2毫升37°补充后第3天的培养基中Ç单片机。
- 7天后，传输神经球，以15毫升管，让神经球解决了重力> 5分钟。
- 除去上清液，加入2mL 37℃单片机。
- 转移的神经球到6孔板的一个新井。
- 加入2毫升37℃单片机每隔3-4天，并改变中完全每隔7天。
- 如果神经球是> 100微米直径，仔细游离干细胞分离液和replate国科会在需要的细胞密度。
- 诱导基因重组
- 加入1毫升37℃的SCM含有1微升Ad5CMVCre或Ad5GFAPCre> 10 10 PFU / ml的给2毫升单片机目前在细胞上。注意：处理重组腺病毒使用时BSL2的安全防范措施。
- 在5％CO 2温育6小时，在32℃。
- 传送单片机与神经球入15ml试管并让球解决由重力5分钟。
- 用1毫升吸管先取出上清液，然后用200微升吸管。注意：处理BSL2使用安全注意事项时，重组腺病毒并放弃每制度规定含有病毒的媒介。
- 无病毒加入2毫升37℃单片机到NSC，然后转移到一个6孔板。注：对于5 NSC文化，步骤2.5.1-2.5.5将采取〜15分钟，不包括6小时的潜伏期。
- 第二天，重复步骤2.5.1-2.5.5，接着神经球传代时必要的。该领域现在可以扩大体外表征和原位注射在小鼠的大脑在体内之前2-3代。注：确定突变的下列酶Cre-重组，通过PCR用特异于重组基因或通过免疫印迹对任一特定突变的蛋白质或它的信令后果的引物存在下进行。酶Cre-重组后需要国科会的文化表型稳定的时间将取决于上使用的突变，并且必须凭经验确定（ 图2和3）。
3，原位注射核重组细胞进入收件人Iimmunocompetent小鼠脑
- 5％甲基纤维素制备方法
- 溶解将5克去离子水中的15厘泊的甲基纤维素于50毫升的100毫升的最终体积螺丝帽瓶中。添加的粉末慢慢地在4℃下搅拌的同时，以防止结块。它最多需要在4℃下搅拌所有的甲基纤维素进入溶液中的24小时。
- 称量瓶中，并记录重量。
- 高压釜中加入5％的甲基纤维素溶液。一旦蒸压，甲基纤维素将成为半固体凝胶。
- 称量瓶中，并计算在高压灭菌过程中丢失的重量。
- 在无菌条件下加入1毫升无菌水为每克重量的丢失。
- 放置于冰上，加入50毫升冰水中冷的2×DMEM。</ LI>
- 隔夜混合使用磁力搅拌器在4℃。使用无菌技术来划分的5％甲基纤维素溶液20毫升等分试样。店内分装在4℃下长达六个月或直至2倍的DMEM到期。注：在5％的甲基纤维素溶液中的步骤制备3.1.1-3.1.7将采取〜2.5天。
- 注射制剂皮质星形胶质细胞
- 嘉实星形胶质细胞时〜90％汇合。
- 收获，抽吸完全DMEM并用37℃的HBSS等体积的洗涤板。
- 加入足够的胰蛋白酶覆盖板。轻轻倾斜和酶标板，直到细胞开始分离。
- 胰蛋白酶失活与37°等体积的C完整的DMEM。
- 转移细胞到50ml锥形管中，用37℃的完全DMEM同一体积中3.2.4用于洗涤平板。
- 洗涤介质转移到含有细胞的试管中。离心机在200×g离心3分钟。
- 吸Šupernatant和悬浮细胞在1毫升37°C完整的DMEM。
- 计数使用血球或其他适当的细胞计数器，以确定细胞/微升数量的细胞悬液。
- 单元的期望数量转移到一个新的15毫升锥形管中。离心机在200×g离心3分钟。
- 悬浮细胞在800微升37℃，完全DMEM。确定细胞沉淀的体积（细胞悬浮液的总体积 - 800微升）。注：重要的是要实现精确的细胞浓度注射。因此，将细胞沉淀的体积必须在此步骤，以便计算的5％甲基纤维素的量，以在步骤3.2.12添加确定。
- 转移细胞到无菌的1.5 ml离心试管中，然后离心分离，在200×g离心3分钟。
- 从细胞沉淀中吸出上清，重悬在冰冷的5％甲基纤维素的适当量的星形胶质细胞（所需的总体积 - 体积将细胞沉淀物），得到细胞/微升的期望数目。
- 将细胞置于冰上，直到注射。
- 将250μL玻璃注射器插入重复抗原饮水机然后把钝18G的针头到注射器中。
- 在皮质星形胶质细胞悬液针拔出柱塞慢;会有气泡以上，必须除去的细胞中，由于气泡将压缩和减少实际注入到大脑的体积。
- 持针刚好高于皮质星形细胞悬浮液的前端和推动柱塞在很快。气泡会移动比细胞悬浮液更快，将大部分排出。
- 重复步骤3.2.16，直到所有气泡从针取出。
- 填充注射器约〜200微升，然后按住针上拉活塞，直到其停止。小气泡可以由保持针尖和迅速推动柱塞在约5被移除0微升然后慢慢退出来满负荷生产。
- 保持尖端直立并重复步骤4-5倍3.2.18。
- 弃18号针头和适应27G的针头到注射器中。
- 按下抗原饮水机的按钮，直到液体从针头排出。注：1星形胶质细胞，步骤3.2.1-3.2.21将采取〜60分钟。
- 注射制剂国科会
- 当神经球是> 100微米直径，转移至15ml试管，让神经球解决了重力> 5分钟。
- 除去上清液，并解离用温和解离试剂的神经球，例如干细胞解离溶液，或根据制造商的说明书或％0.05胰蛋白酶-EDTA作为描述42的Accutase。
- 根据不暴露NSC血清制造商的说明抑制解离试剂。离心机在100×g离心5分钟。
- 算使用血细胞计数器或另一合适的细胞计数以确定细胞/微升的数目的细胞。
- NSC所需数量转移到新的15 mL锥形管。离心机在100×g离心5分钟。
- 重悬在800微升37℃HBSS细胞。确定细胞沉淀的体积（细胞悬浮液的总体积 - 800微升）。注：重要的是要实现精确的细胞浓度注射。因此，将细胞沉淀的体积必须在此步骤，以便计算的5％甲基纤维素的量，以在步骤3.3.9添加确定。
- 将细胞转移到无菌的1.5 ml离心试管中，然后离心分离，在100×g离心5分钟。
- 吸出上清液，并最终制成细胞原位注射在3.2.12-3.2.21。注：1 NSC细胞系，步骤3.3.1-3.3。9将用时约60分钟。
- 注射制剂的鼠标
- 通过腹腔注射250毫克/千克阿佛丁（2,2,2三溴乙醇）或100毫克/公斤氯胺酮加10毫克/公斤甲苯噻嗪，每个机构IACUC准则麻醉受体动物。注：本文所用的小鼠在3-6个月的年龄移植主机。小鼠在不同的年龄可被利用来研究发育大脑年龄对肿瘤发生的微环境的影响。
- 剃过的头皮切口部位用指甲刀或剪刀。
- 带3交替的70％乙醇和聚维酮碘的棉签消毒手术部位。
- 应用眼药膏眼睛，防止因眨眼反射损失的任何损害。
- 评估麻醉踏板撤离（趾捏）反射的深度。注：对于5只小鼠，步骤3.4.1-3.4.5将采取〜15分钟。
- 原位移植
- 确保动物在立体定位架。
- 麦ê切口在矢状缝耳朵和眼睛之间约为0.5厘米长。
- 找到冠状面和矢状缝（前囟门）的交汇点，以及人字和矢状缝（拉姆达）的交叉点。确保前囟和Lambda是在同一水平面上。
- 附上含有细胞悬浮液，并重复抗原分配器的立体框架的头注射器。把27G的针尖与前囟门接触。这是将用于三维坐标的操作的起点。
- 提高针稍微偏离颅骨表面移动2毫米横向和前囟门1毫米喙。
- 通过头骨的前囟门目的地4毫米腹侧小心地将针头。注意：我们利用这些坐标立体定向到目标基底神经节。不同的立体定向坐标可以被利用来研究不同的微环境的影响大脑区域对肿瘤的发生。
- 注入5μl的细胞悬浮液通过激活的重复抗原分配器一次。离开针就位，持续2分钟，以允许颅内压力达到平衡。
- 拔出针头慢慢地过了一段30秒。用棉签将压力施加到任何可能发生的出血。
- 接近伤口边缘，并使用组织粘合剂关闭切口。辖20μL利多卡因皮下的切口部位。注：对于5只小鼠，步骤3.5.1-3.5.9将采取〜50分钟。联合国军司令部IACUC批准术后仅使用局部麻醉。咨询当地的机构IACUC建议就在此过程后，术后镇痛药的使用要求。
- 手术后的护理
- 将动物在一个干净，温暖的笼子收回。动物不应该被直接放到床上用品，因为可能会发生意外的愿望。
- 观察动物恢复正常的行为，如梳洗，进食，排便。注：正常的行为恢复可能需要〜60分钟。
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Representative Results
我们开发了一种nGEM模型系统与星形胶质细胞和NSC从新生儿GEM窝藏收获的两侧装接loxP的条件致癌等位基因可表型特征在于在体内和体外 （ 图1）。为了研究的致癌基因突变特异性的体外大鼠星形胶质细胞的影响，它给第一个丰富 的星形胶质细胞是至关重要的。皮质星形胶质细胞的收获包含小胶质细胞，星形胶质细胞，少突胶质细胞，OPC和神经细胞的混合物，但机械和基因的方法可以在星形胶质细胞的富集帮助。而神经元的正常培养条件下死，小胶质细胞和少突胶质细胞可通过摇动过夜41,43被移除。此外，两侧装接loxP，有针对性地GFAP +星形胶质细胞致癌等位基因使用Ad5GFAPCre的基因重组可以丰富星形胶质细胞。我们用这种方法来感染从皂苷Rb1 的loxP / loxP位创业板幼崽与FLO皮质收成固定的NF1 的loxP / loxP位和/或奔腾科技的loxP / loxP序列的等位基因。 Ad5GFAPCre感染引起的增生性优势，在重组GFAP +星形胶质细胞，其中59％为> 90％后，5增加星形胶质细胞纯度- 9代培养（ 图2A和2B）。 另外，我们通过表达T 121下的GFAP启动子的控制，诱导增殖优势在星形胶质细胞从TgGZT 121小鼠（ 图2C）收获富集的星形胶质细胞。而皮质星形胶质细胞生长附着于培养皿（ 图2C），NSC成长为在体外（ 图3A）的非粘附的神经球。既WT NSC和NSC与重组，两侧装接loxP的致癌等位基因- TgGZT 121（T）的Kras G12D（R），以及纯合子的Pten缺失（P - / - ），简称TRP- / - -表达NSC标记物Sox2基因，而只NSC从GEM含有TgGZT 121收获表达Ť121的Cre介导的重组（ 图3B）后。
要确定如何G1 / S 期 （RB），MAPK和/或PI3K信号通路的改变会影响胶质纤维酸性蛋白的生长+星形胶质细胞在体外增殖，用两种方法检测。 MTS和细胞计数显示，那件T 121和嘉仕G12D的表达增加星形胶质细胞（ 图4A和4B）的增殖。同样，纯合皂苷Rb1（RB）和NF1（N），缺失结合杂合的Pten基因 （P +， - ）缺失也增加皮质星形胶质细胞的增殖（ 图4C）。转化细胞具有无限增殖能力。突变的转化作用可以在体外用彩色来测量ONY形成测定。因此，我们测试了牛逼121和嘉仕G12D表达和PTEN基因的纯合缺失的转化作用的色氨酸- / -星形胶质细胞克隆形成实验如前所述44。而野生型星形胶质细胞没有形成菌落，T星形胶质细胞形成的1.03％的效率殖民地。值得注意的是，TRP - / -星形胶质细胞具有最高的集落形成效率为6.40％（ 表1）。为了适合于临床前药物测试，但重要的是在体外肿瘤模型中很容易被操纵基因。额外的基因变异可以稳定地引入星形胶质细胞通过质粒或病毒载体。用VSV-假型化的pMSCV逆转录病毒载体，例如，我们稳定转导的荧光素酶基因插入TRP - / -星形胶质细胞（luc的TRP - / - ）。荧光素酶表达增加发光〜1,000倍，相比于亲本细胞（
建立人类细胞系和PDX的移植需要免疫缺陷宿主。相反，PDX，许多已建立的人类GBM细胞系不重述GBM的组织病理学特征。例如，U87MG原位异种移植物形成的外切肿瘤未侵入正常脑（ 图5A）。相比之下，注射TRP的- / -星形胶质细胞为免疫能力，同基因小鼠的大脑产生浸润性肿瘤的概括他们的人同行，尤其是入侵正常脑组织（ 图5B）的组织学特征。纵向量化TRP - / -异体移植生长，处死小鼠细胞注射后每5天及肿瘤负荷物通过H＆E染色的脑切片进行定量肿瘤面积来确定。肿瘤面积指数随时间增加（ 图5C）。原位注射10 5色氨酸- / -星形胶质细胞转变为Recipient大脑导致神经系统的发病率，为22天（ 图5D）的中位存活。除了 皮质星形胶质细胞，我们进行了使用TRP原位注射- / -国科会。 TRP - / - NSC衍生的肿瘤是ŧ121阳性，增殖性，并保持了NSC标记物Sox2的表达（ 图6）。注，注射皮质星形胶质细胞和NSC来自WT C57BL / 6小鼠，以及表型WT大鼠星形胶质细胞或NSC收获与unrecombined的，两侧装接loxP的致癌等位基因从有条件GEM失败这个时间帧期间以引发肿瘤形成（数据未显示）。 体内纵向成像已经被用于监测肿瘤生长动力学响应于药物治疗40。因而，TRP - / - luc的星形胶质细胞分别注入的免疫能干同源同窝小鼠和肿瘤生长的大脑通过串行生物发光成像测定。生物发光超过16日数增加15倍（ 图7A和7B）。我们已经表明，星形胶质细胞和NSC从有条件GEM收获可遗传修饰和表型特征在于在体内和体外对遗传学和星形细胞瘤发病的细胞生物学的定义和潜在的用于临床前的药物开发。
图1示意皮质星形胶质细胞和NSC收获nGEM的 。野生表型星形胶质细胞和NSC从创业板收获有条件致癌等位基因。基因重组诱导体外用AdCre矢量。转化的细胞表型，其特征在体外通过各种方法和在体内通过原位注射至免疫能力的大脑，同系窝。
在体外连续传代如图2富集的GFAP +星形胶质细胞 。显示来自皂苷Rb1 的loxP收获GFAP +星形胶质细胞免疫代表图像/ loxP位创业板幼崽与NF1 的loxP / loxP位和/或PTEN的loxP位/ loxP位 ，其中基因重组诱导用Ad5GFAPCre和传代X倍（PX）的细胞（A）。对GFAP +星形胶质细胞在面板A.酒吧富集的定量表示，从3-24个重复（B）标准误差。代表性的免疫荧光（顶部）和相位对比（下部）从TgGZT 121 GEM幼仔收获贴壁皮质星形胶质细胞表达Ť121从GFAP启动子在遍图像9岁的重组与Ad5CMVCre 在体外 （c）之后。星形细胞量化为GFAP +（绿色）的细胞用DAPI染色的细胞核（蓝色）的总数目在每一个其他通道分割的数目。图片拍摄于原来的10倍的放大倍率（A，C）。标尺代表100微米（A，C）。 请点击这里查看该图的放大版本。
/ - -创业板图3野生型和重组国科会从TRP收获 。 - / -表型的WT（顶部）和TRP的代表相位对比图像（下图）NSC培养神经球在体外 （A）。代表免疫荧光染色对于T 121（绿色）和Sox2（红色）的表达在野生型（顶部）和TRP - / - （底部）的神经球（B）。标尺代表100微米（A，B）。 请点击这里查看该图的放大版本。
图体外星形胶质细胞的4表征 。的WT和TR星形胶质细胞的生长是由在1-7天（ 一）细胞计数测定。的WT和TR星形胶质细胞的相对光密度（OD），通过MTS（B）中确定的。 WT的相对增长和重组皂苷Rb1 - / - ; NF1 - / - ;奔腾科技+/-（RbNP +， - ）星形胶质细胞通过MTS（三）确定。 / - -路西法父母激进党的发光日月光表示色氨酸- / -星形胶质细胞（TRP - / -吕克）（D）。 / - - TRP相对外径与PI103由MTS（ 五）确定治疗5天的星形胶质细胞。使用的GraphPad棱镜的指数增长方程5条代表每状态6个重复的标准误差扩散和剂量反应进行了计算。 请点击这里查看该图的放大版本。
图5 在体内 gliomagenesis。 àU87MG异种移植的代表，H＆E染色部分显示离散肿瘤边缘（A）。 / - -激进党代表的H＆E染色部分移植可见弥漫性浸润正常脑组织（B）。比例尺在左和右H＆E染色的图像代表在1mm和100微米。 - / -肿瘤面积通过分析福尔马林固定，石蜡包埋的大脑的H＆E染色的切片从注射10 5 TRP免疫能力的，同基因同窝测定星形胶质细胞和牺牲以5天的间隔后喷射。 （C） / - - TRP的Kaplan-Meier生存分析来岁发病移植的小鼠显示为22天（d），中位生存期。
图6免疫的激进党+/- NSC移植 。代表性的免疫荧光图像表明，TRP +/- NSC注入的免疫能力的，同基因的同窝小鼠的脑中表达Ť121（绿色）和Sox2（白色）和扩散，由埃杜（红色）掺入法。小鼠灌注用EdU和处死后6周注射和他们的大脑灌注多聚甲醛。比例尺代表20微米。 请点击这里查看该图的放大版本。
TRP图7纵向成像- / -吕克移植 。代表性的生物发光图像（A）和定量荧光素酶的磁通随时间变化（B）表示的TRP的生长- / -在免疫能力的，同基因小鼠同种异体移植物注射10 5 TRP - / - luc的星形胶质细胞和成像在所指示的天后注射。G“目标=”_ blank将“>请点击这里查看该图的放大版本。
| 基因型 | 电镀效率（％） | 扫描电镜 |
| WT | 0 | 0 |
| 牛逼 | 1.03 | 0.15 |
| 色氨酸- / - | 6.40 | 0.83 |
表1集落形成皮层星形胶质细胞。 WT，T和色氨酸- / -星形胶质细胞是在4000，2000和250分别细胞/孔接种一式三份 。集落用结晶紫染色电镀后14天，成像和共unted使用ImageJ。电镀效率计算为菌落铺板细胞的数量除以数。
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Discussion
最关键的步骤，以确保适当的收获和培养星形胶质细胞的有：1）切除皮质而不采取组织下面的胼胝体，2）以除去脑膜，3），彻底解离的细胞，以及4）以富集GFAP +星形胶质细胞。虽然我们使用机械（摇动）和遗传（遗传重组的限制与显性转化的转基因的Ad5GFAPCre载体或利用（TgGZT 121）根据GFAP启动子控制）的方法来富集GFAP +胶质细胞，其他的技术已被用来净化皮质星形胶质细胞。例如，污染的小胶质细胞可以通过将汇合的培养物用有丝分裂抑制剂，并以l-亮氨酸甲酯47被除去。星形胶质细胞机械地纯化和培养在含血清的介质的形态和表达谱从急性分离的星形胶质细胞的不同，前者hypothesiZED代表任何更多的不成熟星形胶质细胞或星形胶质细胞反应型48,49。最近，一个immunopanning方法已经开发出来，前瞻性净化皮质啮齿类星形胶质细胞和它们的表达谱更密切模仿急性纯化的星形胶质细胞的培养时，在生长因子补充的无血清培养基49。本文的皮质星形胶质细胞的富集和培养对上研究了表型的较近期开发的immunopanning方法以往，机械方法产生的影响还不清楚。无论使用哪种方法，它是必不可少的，丰富的GFAP +星形胶质细胞，以确定具体此细胞类型中的致癌基因突变的表型的影响。
为收获NSC关键步骤是：1）准确地定位在SVZ，2）以最小化夹层中的SVZ损坏，以及3）对镀前下离解筛选细胞。 PRECI国科会本身解剖技术是必要的定位和收获SVZ。因为NSC生长在悬浮培养物，它是必不可少的离解后过滤细胞悬液，以减少漂浮物的量。虽然我们利用生长在SCM中选择用于NSC，NSC可溯分离的SVZ组织匀浆50的荧光激活细胞分选。诱导体外基因重组后，它监测皮质星形胶质细胞的跨通道的细胞特征和NSC培养物是重要的。因为我们没有前瞻性的组织过程中收获丰富的星形胶质细胞或NSC，我们依次通过免疫荧光染色与已知的细胞类型特异性标志物（GFAP星形胶质细胞，Sox2的国科会）监测富集感兴趣的细胞类型和量化的纯度。此外，我们建议之前和在Cre重组酶，中介在每个通道系统监测的致癌基因突变的预期信号后果通过免疫印迹和表型的，在这纯洁的最大化和突变诱导的信号改变平抑国内最早通过表征细胞ð重组。
在利用原代细胞培养物的一个重要的考虑因素是其固有的复制能力和诱导突变的表型的影响。表型上的WT小鼠星形胶质细胞具有有限的复制能力，并且只能传代-3 -中培养4次它们经受复制衰老31之前。此外，许多癌症的体外 51相关的突变，特别是在MAPK途径的基因，导致癌基因诱导的衰老。因而，如果诱发突变不能无限增殖化细胞，并保护它们免受致癌基因诱导的衰老，它们不能被连续传代对体外表型特征。病毒癌蛋白如人乳头瘤病毒E6 / E7和SV40大T抗原已被广泛地用于许多永生化人类和亩在培养麻黄碱类型的细胞，包括星形细胞13,26,30。我们以前曾表明在G1 / S期细胞周期检查点的消融和T就足以不朽星形胶质细胞，但不足以造成致命性星形细胞瘤在体内 。相反，活化的MAPK和PI3K信号在TRP - / -星形胶质细胞导致了原位移植模型系统30形成的GBM的。因此，对在体外鼠星形胶质变换T，R和P突变的影响通过与体内肿瘤发生在原位移植相关的集落形成测定法确定。
如需要肿瘤细胞，注射原位转化，nGEM细胞向同系小鼠的大脑中植入手术全系车型将引起急性创伤反应，称为反应性胶质增生。在此响应，神经细胞，包括星形细胞，少突胶质细胞祖细胞（NG2 +）神经胶质细胞，小胶质细胞和，prolifer吃了并获得更原始的分化状态，主要是为了应对分泌的蛋白质，如音速刺猬52,53。然而，反应性神经胶质增生的响应于刺伤人增殖期是比较短的，通常为53一周。之前我们已经表明，注射TRP的- / -在这段时间内星形胶质细胞诱导效率肿瘤，产生低级别星形细胞瘤经常发展为高级别星形细胞瘤，包括大紫荆勋章。相比之下，注射T或总磷- / -星形胶质细胞很少发展成低级别星形细胞瘤在1-3周后，注射这些肿瘤没有发展到高级别星形细胞瘤30。另外，注射的表型的野生型星形胶质细胞和NSC单独不能引起肿瘤形成（数据未显示）。我们发现，TRP - / -异体移植生长成倍增加2-3周后喷射，在此期间的增殖期反应的时间帧IVE胶质已经结束（ 图5和图7）。考虑到在注射后转化，nGEM细胞向同基因小鼠的大脑肿瘤发生潜力的微环境的影响，特别是在反应性神经胶质增生的增生期，建议进行的表型WT大鼠星形胶质细胞或调查的unrecombined新颖组合时NSC控制注射剂，两侧装接loxP的致癌等位基因。我们也建议在第一个月后喷射期间监测两个表型WT和转化的（重组）细胞每隔一周的肿瘤发生的效率，正如我们前面所描述的30。
或者通过注射的细胞或同种异体移植物宿主本身的遗传操作中，nGEM星形细胞模型系统，可以用来模拟星形细胞瘤发病机制的许多方面，包括肿瘤 - 基质的相互作用。作为一个例子，我们设计TRP - / -皮质astrocyTES以表达萤光素酶在体内 （ 图7）限定的肿瘤生长动力学。或者，nGEM细胞可以被遗传修饰以表达荧光蛋白和原位注入的GEM用荧光标记的神经元或血管系统的大脑来定义的肿瘤细胞和正常脑细胞54之间的相互作用。大脑区域或发育年龄对gliomagenesis微环境的影响可以通过原位注射nGEM细胞在不同位置或不同年龄的小鼠来确定。虽然短肿瘤潜伏期和生存是有益的临床前药物测试，快速的肿瘤发展可能并不理想模型星形细胞瘤发病机制的一些方面，包括恶性进展，侵袭和瘤气孔相互作用。 nGEM同种异体移植物宿主的存活可通过改变细胞注射的数量和系统地监测肿瘤的外显率和延迟3可以容易地操纵0。
星形细胞瘤的基因组复杂且表现出广泛的内部和跨肿瘤的异质性5-7,55,56。这种异质性的潜在来源包括体细胞突变，引发肿瘤发生，在恶性进展的进化过程中获得的突变，并且其中这些突变发生在细胞的发育潜能。大规模测序项目已发现了许多星形细胞瘤相关的基因突变及其共生7的模式。这些研究都依赖于生物信息学算法，以识别经常发生突变，并提名突变，很可能致癌， 即得。 “司机突变”的启动肿瘤或开车恶性进展。然而，许多这些突变，而其潜在的细胞类型特异性的致癌性，一直没有系统地研究了模型系统。我们建议nGEM车型ütilizing皮质星形胶质细胞和NSC如这里描述的，以及可以被纯化并在培养中生长的其它神经细胞类型中，提供一种通用的系统来执行这样的调查。的充分性和必要性，通过大规模的测序计划确定新的候选基因突变改造就可以使用传统的遗传GAIN-和丧失功能的方法与具体nGEM细胞类型窝藏共同合作，产生突变的核心GBM途径来系统地研究了这有条件的创业板存在5。我们进一步建议，nGEM的面板窝藏在多个神经细胞类型的基因突变的不同组合将在模拟人脑星形细胞瘤的基因组异质性是有用的。此外，nGEM星形细胞瘤模型星形胶质细胞和NSC从创业板的条件推导可以提供临床前药物开发听话的模型，因为最初的体外试验均单和联合疗法可在这些细胞进行直接的免疫能力，同系小鼠体内药物测试更加高效。此外，免疫调节和基质靶向疗法，可在nGEM星形细胞瘤模型的免疫能力，同基因移植主机进行测试。因此，nGEM星形细胞瘤模型转化的大鼠星形胶质细胞和NSC是一个有价值的模型系统，以确定在特定细胞类型中的致癌基因突变的组合的功能性后果，可能是在临床前药物测试是有用的。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Invitrogen | 11995065 | DMEM can also be purchased from other suppliers including GIBCOSigma and Cellgro |
| Fetal Bovine Serum, Regular | Cellgro | 35-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-395 | |
| Cartilage Thumb Forceps, Curved | Fisher Scientific | 1631 | |
| Miltex 17-301 Style 1 Jeweler Style Forceps, Fine, 4 | Miltex | 17-301 | |
| Ethanol (200 proof) | Decon Labs | 2710 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid | Invitrogen | 14175-095 | |
| TrypLE Express (1x), Phenol Red | Invitrogen | 12605-010 | Other trypsin solutions are also suitable for cortical astrocyte havest and culture |
| Culture Dish, 60 x 15 mm | Thomas Scientific | 9380H77 | |
| 15 ml Tubes | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml Tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Adenovirus stock | Gene Transfer Vector Core, U. Iowa | Ad5CMVCre | Store in 5 µl aliquots at -80 °C. Hazardous. Use Bsl2 safety precautions |
| Sodium sulfate (Na2SO4) | Sigma-Aldrich | 238597 | |
| Potassium sulfate (K2SO4) | Sigma-Aldrich | 221325 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| HEPES potassium salt | Sigma-Aldrich | H0527 | |
| D-(+)- Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Papain | Worthington | LS003127 | |
| L-Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
| Syringe filter (0.22 µm pore size) | Millipore | SLGP033NS | |
| Neurocult proliferation kit, mouse | Stemcell Technologies | 5702 | This kit contains the NeuroCult NSC Basal Medium and NeuroCult NSC supplement needed for NSC culture |
| 0.2% Heparin solution | Stemcell Technologies | 7980 | |
| EGF | Invitrogen | PMG8041 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0261 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (10x) | Invitrogen | 14185-052 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| E-64 | Sigma-Aldrich | E3132 | Make 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C |
| 6-well Plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Cell strainer (40 µm pore size) | Corning | 352340 | |
| Stem cell dissociation solution | Stemcell Technologies | 5707 | Alternatively, use gentle enzyme solutions such as Accutase |
| Methyl cellulose 15 cP | Sigma-Aldrich | M7027 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Media 2x | Millipore | SLM-202-B | For making 5% methyl cellulose solution |
| 1.7 ml Snap Cap Microcentrifuge Tube | Corning | 3620 | |
| Hamilton syringe, 250 µl LT no needle | Fisher Scientific | 14-815-92 | |
| PB600-1 Antigen Dispenser | Hamilton | 83700 | |
| Disposable 18 G needles | Fisher Scientific | NC9015638 | |
| 27 ga 1/2" luer tip needle | Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Betadine | Fisher Scientific | NC9386574 | |
| Puralube Opthalmic Ointment | Fisher Scientific | NC9689910 | |
| Model 900 Stereotaxic frame | Kopf Instruments | ||
| VETBOND | Fisher Scientific | NC9259532 | Tissue adhesive |
| Lidocaine | ShopMedVet | RXLIDO-EPI | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3580 | |
| Anti-Sox2 | Millipore | AB5603 | |
| Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako | Z0334 | |
| IVIS Kinetic | PerkinElmer | For in vivo imaging | |
| D-Luciferin - K+ Salt Bioluminescent Substrate | PerkinElmer | 122796 | For in vivo bioluminescence imaging |
| EdU Imaging Kit | Invitrogen | C10340 | |
| MSCV Luciferase PGK-hygro | Addgene | 18782 |
References
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