Summary
在这里，我们描述了用于分离，鉴定和小鼠胸腺上皮细胞（TECs的）的纯化的有效方法。该协议可以用于胸腺功能的正常T细胞发育，胸腺机能障碍，和T细胞重建研究。
Abstract
胸腺是T细胞发展的重要器官。胸腺基质细胞，胸腺上皮细胞器（TEC）是在T细胞发育的多个阶段尤为关键：T细胞的承诺，正选择和负选择。然而，肾小管上皮在胸腺的功能尚未完全了解。在这篇文章中，我们提供了一种方法来隔离新鲜的小鼠胸腺采用机械破碎和酶消化相结合的TEC的子集。该方法允许胸腺基质细胞和胸腺细胞被有效地从细胞 - 细胞和细胞 - 细胞外基质的连接释放以形成单细胞悬浮液。使用分离的细胞，多参数流式细胞术可以应用于识别的TECs和树突状细胞和表征。由于TECs的是一种罕见的细胞群体在胸腺中，我们还描述了以丰富和消耗的胸腺细胞在胸腺中最丰富的细胞类型纯化的TECs的有效途径。 Follo翼的富集，细胞分选时可以减少这样的细胞生存力的丧失可以的TECs的纯化过程中被最小化。纯化细胞是适用于各种下游分析如实时PCR，Western blot和基因表达谱。该协议将促进TEC的功能的研究和以及体外 T细胞重建的发展。
Introduction
早在T细胞发育，骨髓造血干细胞衍生的多潜能祖细胞被募集到胸腺的皮质，经受承诺T系和成为T细胞的前体1。在皮层，T细胞前体的CD4和CD8双阴性（DN）胸腺扩大和分化为不成熟的CD4和CD8双阳性（DP）的胸腺细胞，祖细胞形成具有高度可变的T细胞受体1的大型游泳池。仅DP细胞的选择MHC限制的子集将成为CD4或CD8单一阳性（SP）的胸腺细胞，迁移至胸腺髓质，并分化为功能性主管成熟的T细胞，这被称为正选择2的事件6。与此相反，自身反应性胸腺细胞克隆进行阴性选择，并通过细胞凋亡被删除，转换为调节性T细胞的自身耐受，或改行上皮内淋巴细胞的目的是尚不清楚-3,7-10。
在胸腺，胸腺基质细胞形成了独特的微环境提供这些不同的T细胞发育命运5,11,12信号。胸腺基质细胞组成的胸腺上皮细胞（的TECs） -包括皮层的TECs（cTECs）和延髓的TECs（mTECs），树突细胞，巨噬细胞，成纤维细胞，内皮细胞，神经脊衍生的周细胞等间充质细胞13-15。在这些中，的TECs是在T细胞发育1,2,16,17的各阶段的关键。然而，缺乏一个可靠的方法来隔离的TEC阻碍了它们的功能16一个全面的了解。特别是，cTECs，形成了周围的皮质祖细胞的三维网络，是必不可少的阳性选择13,18,19，其原因尚不清楚。早期的研究提供线索的TEC的异质性和作用，主要依靠形态学和组织学的工具13 12,20解决。一个强大的和可重复的方式来隔离的TEC是根本实现TEC的子集，对TEC的功能，定量和定性评估，并澄清机制，公正的鉴定cTECs如何支持正选择。
由于肾小管上皮在胸腺的稀有和紧张的互动，他们在完整的器官形成，肾小管上皮的分离一直是具有挑战性的。这里所描述的协议是基于先前的发现，目前可获得的试剂，技术和胸腺结构和基质组合物的知识。大约20年前，有几个程序被上报分解胸腺组织21-27，在不同的酶在消化过程中使用，包括胰蛋白酶，胶原酶和分散酶。 Gray 等人 。相比于他们的precedure 28的酶，并报告改进的甲基OD与酶鸡尾酒29，成为一个多步骤的消化广泛应用于20,30。然而，这种方法涉及到一个长的准备时间和复杂的消化步骤和结果变量最终细胞数和的TECs的比例，即使在同一小鼠队列29,30。几年前，LIBERASE研究级酶，含有高度纯化的胶原酶和中性蛋白酶启动在胸腺组织离解30中使用。在这里，我们描述了一个LIBERASE消化为基础的协议，具有优化的机械分离过程，能产生大量的可行的TEC的小鼠胸腺组织。 。
为丰富分离的间质细胞，以前的研究中使用任何浓度梯度或磁珠分离21,29。然而，两种方法都导致严重的损失胸腺基质细胞，cTECs 29的特别是某些人口的人口。细胞毒性消除和平移技术
第3节中所描述的分离的胸腺细胞悬浮液可直接应用到流式细胞仪分析鉴定TEC的子集和树突状细胞和表征。第4节介绍了一个简单而有效的方法来确定使用多参数流式细胞仪TEC的子集。进行实验，寻求获得纯化的cTECs或mTECs，泰格丰富和细胞分选程序，可以在第5和第6被发现。
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Protocol
在这项研究中，成人（6 - 8周）雌性C57BL / 6小鼠。小鼠是从国立癌症研究所购买和无特定病原体的条件下维持。明尼苏达机构动物护理和使用委员会大学（IACUC）批准的所有动物实验。
1，准备工具和缓冲区
- 制备的酶溶液（RPMI1640培养基用0.05％[w / v的] LIBERASE TH和DNA酶I的100单位/毫升的），白蛋白富含缓冲液（1X PBS中的[Ca 2 + / Mg 2 +的 -free]用0.5％牛血清白蛋白和2mM乙二胺四乙酸[EDTA]），FACS缓冲液（1X PBS中的[Ca 2 + / Mg 2 +的 -free]含有1％胎牛血清[FBS]和0.02％NaN 3的），FACS分选缓冲液（1X PBS有10％FBS的[Ca 2 + / Mg 2 +的 -free]含有2％FBS）中，并RP10培养基（RPMI-1640培养基中提供）。
- 准备10淘洗板。制备40毫升涂层溶液（0.01毫克/毫升ģ燕麦抗大鼠IgG的0.1M的NaHCO 3缓冲液），并加入4毫升涂布液到每100×15毫米板，漩涡和孵育在4℃CO / N。倒掉抗体溶液冲洗，用5毫升的1X的PBS中的2倍，板，旋流大力冲洗之间。存储板准备在4℃。
胸腺组织2丰收
- 安乐死鼠标在CO 2室。把动物在其上的夹层垫回，PIN脚在垫子上，并用70％乙醇喷洒湿了的皮草。
- 作中线切开穿过皮肤，从尿道口上方直线上升到下颚用剪刀开始和向下延伸的切口，以两侧的膝盖。切口看起来像一个倒置的“Y”。拉扯皮肤松弛背部的两侧，并将其引脚连接到夹层垫。
- 从剑突刺穿隔膜，切断两侧的肋高达约锁骨上，然后向上抬起与肋镊子，针到夹层垫。胸腺只是肋骨下，看起来像两条细细的白瓣覆盖心脏（ 图1）。断开结缔组织包围胸腺，轻轻一拉，取下一对胸腺叶与弧形锯齿钳。地方胸腺裂片入含有5ml RPMI-1640 6孔板。
3，准备胸腺基质细胞
- 修剪任何周围脂肪和结缔组织和胸腺瓣转移到含有5毫升新制备的酶溶液中的6孔板的一个新井。作小切口在胸腺裂片细剪刀，孵育该板在37℃下进行20分钟。
- 轻轻吸取消化胸腺组织上下2 - 3用5毫升吸管进行组织分离时间。收集在50ml管中含有10毫升冷的白蛋白富缓冲器中和酶的上清液部分。保持在冰上的收集管。添加2.5毫升酶溶液的剩余组织孵育该板在37℃下进行15分钟。
- 用3毫升注射器和18G的针头打散聚集进行轻柔的机械搅拌。池上清液到收集管中。添加2.5毫升酶溶液的剩余组织孵育该板在37℃下进行15分钟。
- 温柔的重复机械搅拌了3毫升注射器及地下25针，孵化盘增加5 - 10分钟。
- 完全消化后，凝聚上清液进入收集管中。离心机在400 XG，4℃，8分钟，收集细胞的收集管。吸出的液体和悬浮沉淀的细胞在10ml白蛋白富含缓冲和过滤到100毫米筛网的样品。计数使用血球细胞。然后进行流式细胞术分析（第4节），或富集的TEC（第5章）。
4，肾小管上皮鉴定通过流式细胞仪
5，丰富的TECs通过平移
- 降速的胸腺细胞（在第3节中制备），在400 XG，4℃5分钟。吸出的液体和悬浮沉淀的细胞在FACS分选缓冲液以每毫升2×10 8个细胞在15ml或50ml锥形管中的浓度。添加抗CD90.2抗体（克隆30-H12）（或抗CD45），在细胞悬浮液中的2.5微克/毫升的最终浓度，并轻轻孵育细胞在旋转混合器中，在4℃下进行30分钟。以下的温育，洗涤用5 - 10倍体积RP10培养基并离心管中在400 XG，4℃5分钟。
- 吸液和悬浮沉淀细胞以1×10 7每毫升浓度RP10媒体。加入5 ml的细胞悬液，以每涂覆淘洗板中（在步骤1.3中制备的），涡旋并温育30分钟，在室温。大力漩涡;上清转移至锥形管。冲洗该板用RP10培养基两次，集中上清液进入收集管中。
- 离心收集管中，在400 XG，4℃5分钟。吸液重悬细胞沉淀在5毫升RP10媒介。添加细胞悬浮液到一个新的淘洗板中，漩涡及温育30分钟，在室温。收集细胞冲洗板，集中成一个锥形管。一旦肾小管上皮富集，降速细胞在400 XG，4℃，5分钟，细胞悬浮在5毫升流式细胞仪分选缓冲。
通过细胞分选6，净化的TECs
- 计数使用血球细胞和制备细胞悬浮液在4×10 7个细胞的FACS分选缓冲液中的浓度。添加抗体DEScribed在4.4节到细胞溶液并轻轻孵育细胞在旋转混合器中，在4℃下进行30分钟。以下染色，洗涤并悬浮细胞，以每毫升的FACS分选缓冲液10×10 6个细胞的浓度。
- 排序通过100微米的喷嘴TEC的子集，利用荧光激活细胞分选。排序细胞被收集在30％（V / V）胎牛血清的RPMI-1640）。一旦细胞分类完成后，离心细胞，在400 XG，4℃，5分钟，并用于下游分析做准备。
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Representative Results
使用该协议，胸腺器官是从成年小鼠（第2项）和胸腺细胞悬浮液中除去的制备如在第3节中概述将得到的细胞悬浮液组成的胸腺细胞，造血的基质细胞和非造血的基质细胞。 CD45是造血泛标记在两个胸腺细胞和造血的基质细胞，如巨噬细胞和树突状细胞中表达。相比之下，肾小管上皮是造血起源不是不表达CD45 15。细胞染色和流式细胞仪分析，进行与在第4节中概述。
有两种类型的TEC子集，cTECs和mTECs，从一个共同的双有力的TEC前体15起源。既cTECs和mTECs表达其表面上28上的EpCAM的分子。这样的TECs可以根据EpCAM的阳性和CD45阴性的通过流式细胞术（ 图2A）被选通。 cTECs和mTECs可以区分由两种试剂：在Ly51抗体，该抗体识别由CTEC表示谷氨酰肽酶和外源凝集素荆豆凝集素-1（UEA-1）28，其结合到MTEC（ 图2B）。既mTECs和cTECs表达MHC II类分子在其表面上（ 图2C和2D）。 mTECs可进一步分为以MTEC 低和MTEC 高取决于MHC II类分子（ 图2D）的水平。每胸腺TEC的平均数目是约9×10 5，在直接比较中，我们回收的大约8倍以上的TECs使用本LIBERASE酶基础的协议相比，用胶原酶多步协议/分散酶29（ 图3）。
为了减少分拣时间和增加回收的基质细胞的活力，我们开发了一种平移方法耗尽胸腺因为胸腺细胞悬浮液包含95％以上的胸腺细胞。细胞与一TI-CD90抗体和预涂板抓获。相比，在整个制备的胸腺细胞（预富集）的TECs的比例由小于0.5％提高到15％以上的交富集的细胞（ 图4A和4B）。用抗CD45的平移也可以，如果使用例如，一个不需要恢复的树突状细胞。在这种情况下，TEC浓缩增加至约80％（数据未示出）。后基质细胞的富集通过平移，TEC的亚群的比例没有变化（ 图4C和4D），这表明一个子或其他不选择性地平移过程中丢失。相比于预富集样品，的TECs的回收率为85％左右（ 图4E）。
图1小鼠胸腺durin克清扫。胸腺位于上方的前上胸部的心脏。切割和起重肋骨后，胸腺的两个白色的凸起暴露。 请点击这里查看该图的放大版本。
图2 CTEC和MTEC鉴定与流式细胞术数据的分析。使用流式细胞术染色胸腺细胞样品进行分析。如图代表流式细胞仪配置文件。该数字表示各人口的百分比（A）活细胞中，CD45阴性和EpCAM的阳性事件门代表的TEC细胞（B）在TEC的门，两个群体被Ly51和UEA-水平分离1。 cTECs具有高Ly51的ER表达; mTECs有UEA-1的更高级别（C）的MHC II类分子被高度表达于cTECs（D）mTECs由MHC II类分子高和MHC II类分子的低亚群，它们分别被称为MTEC 高和MTEC 低的。 请点击这里查看该图的放大版本。
图3，一种LIBERASE为基础的协议允许从胸腺高细胞产量比使用一个多步骤的胶原酶/分散酶协议。使用以前发表的多步胶原酶/分散酶协议或本LIBERASE为基础的协议，制备胸腺细胞。两组样品通过流式细胞仪进行分析。（一）</显示STRONG>代表流式细胞仪配置文件。的数字表示TEC的各组细胞的百分比（B）每只小鼠胸腺TEC的总细胞数显示在条形图。误差条表示标准偏差（n> 3）。使用软件棱镜进行双尾，非配对t检验。 P <0.0001。 请点击这里查看该图的放大版本。
示图4，在淘选法富集的TECs。前后富集胸腺基质细胞的FACS曲线。准备胸腺细胞用抗CD90抗体。 CD90阳性胸腺细胞组成的胸腺细胞的95％以上。在TEC的富集过程，胸腺是captur编和贫于预涂淘洗板中，从而TECs的富集在上清液中（A）和（B）中 ，TEC门被示出。这些数字表明肾小管上皮的总活细胞开始人口（预增），或浓缩（后浓缩）后之间的比例（C）和（D），CTEC和MTEC大门内的细胞显示。数字显示CTEC和MTEC中所占的百分比在从每个组TEC的种群。cTECs（E）的细胞数目和每小鼠胸腺mTECs示于图中。数据代表5次实验。 “预”代表预浓缩样品; “邮报”表示后浓缩样品;小横线表示平均值。 请点击这里查看该图的放大版本。
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Discussion
在协议中，关键步骤是准备胸腺基质细胞（第3节）和肾小管上皮的富集（第4节）。强烈建议新鲜酶溶液，每次准备和组织，尽快治疗。对于池thymi，优化的酶溶液的体积取决于thymi的数量是必需的。如果任何组织残留物的处理之后左，加入更多的酶溶液和延长温育时间可以提高细胞产量。中富集的TECs，完成收集上清液，并重复在第5.3节中概述将降低信元丢失的板冲洗。
1980年，Wekerle 等 。首次报道了一种类型的TECs - “胸腺细胞护士”（跨国公司）33，这是大的皮质上皮细胞的胞内囊泡内完全笼罩许多可行的淋巴样细胞。 1982年，Kyewski和Kaplan所述的各种隔离CONDitions影响跨国公司34的产率。近日，高滨和他的同事重新分离和跨国公司的特点。他们发现只有在膜通透性35等细胞优惠染色CD45的基础上。他们还自己编写，其中包括一个CTEC和多种约束胸腺描述“破”跨国公司。这样的破跨国公司为阳性外CD45和对CTEC标记β5t，并在其准备由总cTECs的70％。事实上，我们也观察到类似的细胞群体，这是我们准备胸腺细胞悬液CD45 高的EpCAM +和Ly51 +，虽然我们的分离步骤包括总cTECs小于40％。这些破碎的跨国公司是由TEC浓缩的协议，像我们这样，利用枯竭与任何CD90或CD45删除。因此，未来的挑战将是如何尽量减少这部分人群的流失。
相比到现有的多步骤的消化过程如图29所示 ，LIBERASE消化协议允许的TECs的显著高细胞产量（ 图3）。其他研究小组也报告他们对胸腺基质细胞分离新方法通过修改灰度的方法，30,36，虽然电池的产量并没有显著增加。近日，Chidgey和他的同事报告了独立使用LIBERASE消化TEC的协议，他们也获得了37的TEC的有效释放。然而，他们的协议的第一胸腺细胞释放步骤具有从每个胸腺29，其中大部分是cTECs丢弃约1.6×10 4的TECs的潜力。由于浓度梯度的富集导致较小的基质细胞的丢失，一个AutoMACS系CD45-微珠耗尽普遍地进行FACS纯化29,36,37用于的TECs的富集。使用CD45-微珠枯竭协议29日 ，相比于AutoMACS为基础的浓缩淘洗富集所得的TEC高回收率。总体而言，这里介绍的协议，聚集了许多以前报道的优势。本协议（第6章）纯化TEC的子集已经被成功地用于进一步的分析，如实时PCR和Western blot分析12。
该协议也适用于分离和其它胸腺基质细胞，如树突状细胞的研究。我们相信，胸腺基质细胞，特别是肾小管上皮，稳健的隔离会加速如何胸腺功能的T细胞发育的认识，实现在体外 T细胞构成。此外，这些细胞的表征具有用于医学界很大的实用价值，因为一个共同的问题，从治疗（如那些在移植和癌症治疗中使用）的恢复是上皮细胞，导致免疫缺陷胸腺重建差。
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Disclosures
作者宣称，他们没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作是由卫生部资助R01 AI088209（到KAH）国家机构的支持。我们也感谢明尼苏达流式细胞资源的大学。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse EpCAM | eBioscience | XX-5791-YY* | Clone G8.8 |
| Anti-mouse MHC II | eBioscience | XX-5321-YY* | Clone M5/114.15.2 |
| Anti-mouse Ly51 | eBioscience | XX-5891-YY* | Clone 6C3 |
| UEA-1 | Vector Laboratory | FL-1061 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSRFortessa | |
| Flow cell sorter | BD Biosciences | FACSAria | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| Flow cytometry analysis software | TreeStar - Flowjo | FlowJo v7/9 | |
| *XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size. |
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