Summary
Descrevemos aqui um método eficaz para o isolamento, identificação e purificação de células epiteliais do timo do rato (TEC). O protocolo pode ser utilizada para estudos da função do timo para o desenvolvimento normal das células T, disfunção do timo, e a reconstituição de células T.
Abstract
O timo é um órgão vital para o desenvolvimento de linfócitos T. De células do estroma do timo, as células epiteliais do timo (TEC) são particularmente crucial em vários estágios de desenvolvimento de células T: compromisso de células T, de seleção positiva e negativa de seleção. No entanto, a função de TEC no timo permanece incompletamente compreendida. No artigo, nós fornecemos um método para isolar subconjuntos TEC de timo fresco rato usando uma combinação de ruptura mecânica e digestão enzimática. O método permite que as células do estroma de timo e de timócitos de ser eficientemente libertado a partir de células de células e ligações célula-matriz extracelular e para formar uma suspensão de célula única. Utilizando as células isoladas, multiparamétrica de citometria de fluxo pode ser aplicado para a identificação e caracterização de TEC e células dendríticas. Porque TEC são uma população rara de células no timo, que também descrevem uma forma eficaz para enriquecer e purificar a TEC, esgotando os timócitos, o tipo de célula mais abundante no timo. Folloala o enriquecimento, a selecção de células de tempo pode ser reduzida de forma que a perda de viabilidade das células pode ser minimizada durante a purificação de TEC. As células purificadas são adequados para diversas análises a jusante como o Real Time-PCR, Western blot e perfil de expressão gênica. O protocolo irá promover a investigação da função do TCE e, assim como o desenvolvimento de reconstituição in vitro de células T.
Introduction
No início do desenvolvimento das células T, de medula óssea hematopoiéticas derivadas de células progenitoras pluripotentes são recrutados para o córtex do timo, submetido a compromisso de linhagem T e tornar-se precursores de células T 1. No córtex, precursoras de células T CD4 e CD8 duplo negativos (DN) timócitos expandir e diferenciar em imaturo CD4 e CD8 duplo positivo (DP) timócitos, formando uma grande piscina de progenitores com receptores de células T altamente variável 1. Apenas um seleto subconjunto MHC-restrito de células DP vai se tornar único positivos (SP) timócitos CD4 ou CD8, migram para a medula do timo, e se diferenciar em células T maduras funcionalmente competentes, um evento que é chamado de seleção como positiva 2 6. Em contraste, os clones de timócitos auto-reactivos sofrem de selecção negativa e são removidos por meio de apoptose, convertidas em células T reguladoras para a auto-tolerância, ou desviado para linfócitos intra-epiteliais para fins que ainda não são claras 3,7-10.
No timo, as células do estroma de timo formar um microambiente único fornecimento de sinais para esses vários destinos de desenvolvimento de células T 5,11,12. As células do estroma de timo são compostas por células epiteliais tímicas (TEC) - incluindo TEC corticais (CTECs TEC) e medulares (mTECs), células dendríticas, macrófagos, fibroblastos, células endoteliais, pericitos derivados da crista neural e outras células mesenquimais 13-15. Entre estes, TEC são cruciais nas várias fases de desenvolvimento das células T 1,2,16,17. No entanto, a falta de uma forma robusta para isolar TEC tem dificultado uma compreensão abrangente de suas funções 16. Em particular, CTECs, que formam uma rede tridimensional circundante progenitores no córtex, são essenciais para a seleção positiva 13,18,19 por razões que ainda não estão claras. Estudos anteriores forneceram pistas sobre a heterogeneidade eo papel da TEC, principalmente contando com ferramentas morfológicas e histológicas 13 12,20. A forma robusta e reproduzível para isolar TEC é fundamental para alcançar a caracterização imparcial de subconjuntos do TCE, avaliação quantitativa e qualitativa das funções do TCE, e esclarecimento de mecanismos como CTECs apoiar seleção positiva.
Devido à raridade da TEC no timo e as interações apertadas formam no órgão intacto, o isolamento da TEC tem sido um desafio. O protocolo aqui descrito é baseado em descobertas anteriores, atualmente reagentes disponíveis, técnicas e conhecimento da estrutura do timo e composição estromal. Há quase duas décadas, vários procedimentos foram relatados desagregar tecidos timo 21-27, em que diferentes enzimas foram utilizadas durante a digestão, incluindo tripsina, colagenase e Dispase. Gray et al. comparação dessas enzimas em sua precedure 28, e relataram uma melhoria da method com a digestão de várias etapas de coquetéis enzimáticos 29 que se tornaram amplamente utilizados 20,30. No entanto, este método envolve um tempo de preparação longos e complexos processos de digestão e resulta em última variável o número de células e as proporções de TEC ainda na mesma coorte de murino 29,30. Vários anos atrás, Liberase enzima grau de investigação, contendo altamente purificado colagenase e protease neutra começou a ser utilizado na dissociação tecido do timo 30. Aqui, nós descrevemos um protocolo baseado em digestão Liberase, com processos de separação mecânica optimizadas, que produz um elevado número de TEC viáveis a partir de tecidos do timo do rato. .
Para enriquecer células estromais dissociados, estudos anteriores têm usado gradientes de densidade ou separação magnética talão 21,29. No entanto, ambos os métodos de causar grave perda de determinadas populações de células do estroma de timo, especialmente a população de CTECs 29. Eliminação citotóxica e técnicas de panning
A suspensão de células do timo isolado descrito na Seção 3 pode ser aplicado diretamente para análise por citometria de fluxo para a identificação e caracterização dos subconjuntos TEC e células dendríticas. A Seção 4 descreve uma forma simples e útil para identificar subconjuntos TEC utilizando fluxo multiparâmetro citômetro. Para experiências que procuram obter CTECs purificadas ou mTECs, TEC enriquecimento e células de triagem procedimentos podem ser encontradas na Seção 5 e 6.
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Protocol
Neste estudo, os adultos - foram usados (6 8 semanas) do sexo feminino C57BL / 6. Ratos foram adquiridos no Instituto Nacional do Câncer e mantidos sob condições específicas livres de patógenos. A Universidade do Comitê de Cuidados e Uso de Animais Institucional Minnesota (IACUC) aprovou toda a experimentação animal.
1 Preparação de Instrumentos e amortecedores
- Preparar a solução de enzima (meio RPMI 1640 com 0.05% [w / v] de Liberase TH e 100 U / ml de DNase I), tampão rico em albumina (1X PBS, [Ca 2 + / Mg 2 + livre], com 0,5% de soro de bovino albumina e 2 mM de ácido etilenodiamino tetra-acético [EDTA]), de tampão de FACS (PBS 1X [Ca 2 + / Mg 2 + livre] contendo soro de bovino fetal a 1% [FBS] e 0,02% de NaN 3), separação por FACS tampão (PBS 1X [Ca 2 + / Mg 2 + livre] contendo 2% de FBS), e meio RP10 (RPMI-1640 fornecido com 10% de FBS).
- Prepare 10 placas panning. Preparar a solução de revestimento de 40 ml (0,01 mg / ml de Laveia anti-IgG de rato em 0,1 M de tampão de NaHCO3), e adicionar 4 ml de solução de revestimento em cada 100 x 15 mm placa, redemoinho e incubar a 4 ° CO / N. Escorrer solução de anticorpo e lavar a placa com 5 ml de PBS 1x por 2 vezes, agite vigorosamente entre lavagens. Armazenar as placas preparadas a 4 ° C.
2 Colheita de Thymus Tissue
- Eutanásia rato numa câmara de CO 2. Coloque o animal em suas costas em uma esteira dissecação, fixar os pés no tapete e molhar a pele por aspersão com etanol 70%.
- Fazer uma incisão na linha média através da pele, a partir de cima da abertura da uretra para cima para o maxilar inferior com uma tesoura e alargar a incisão para baixo para os joelhos em ambos os lados. A incisão se parece com uma cabeça para baixo "Y". Retire a pele solta de volta nas laterais, e fixá-lo para o tapete dissecção.
- Perfurar o diafragma do xifóide, cortar as costelas de cada lado até cerca da clavícula, em seguida, levante os reforços comfórceps e fixá-lo para o tapete dissecção. O timo é apenas abaixo das costelas, e se parece com dois lobos brancos finos que recobrem o coração (Figura 1). Tecido conjuntivo Disconnect torno do timo, retire com cuidado e retire a par de lobos do timo com uma pinça serrilhada curvas. Lóbulos timo lugar em uma placa de 6 poços contendo 5 ml de meio RPMI-1640.
3 Preparação de Células do estroma tímico
- Aparar qualquer tecido adiposo e conjuntivo circundante e transferir os lóbulos timo para um novo poço da placa de 6 poços contendo 5 ml de solução de enzima recentemente preparar. Fazer pequenas incisões nos lóbulos do timo com uma tesoura fina, e incubar a placa a 37 ° C durante 20 min.
- Pipeta suavemente digerir o tecido do timo e para baixo 2-3 vezes usando 5 ml de pipeta para dissociação de tecidos. Recolher a fracção de sobrenadante num tubo de 50 ml contendo 10 ml de tampão frio rico em albumina para neutralizar as enzimas. Mantenha o tubo de coleta no gelo. Adicionar 2,5solução de enzima ml para o tecido restante e incubar a placa a 37 ° C durante 15 min.
- Realizar a agitação mecânica suave com uma seringa de 3 ml e agulha de 18 G para quebrar agregados. Piscina sobrenadante para o tubo de coleta. Adicionar solução de 2,5 ml de enzima no tecido remanescente e incubar a placa a 37 ° C durante 15 min.
- Repetir a agitação mecânica suave com uma seringa de 3 ml e uma agulha G 25, e incuba-se a placa adicional 5 - 10 min.
- Após a digestão completa, piscina do sobrenadante para o tubo de coleta. Centrifugar o tubo de recolha a 400 xg, 4 ° C durante 8 minutos para recolher as células. Aspirar o líquido e suspender as células peletizadas em 10 ml de tampão ricos em albumina e filtrar a amostra através de malha de 100 milímetros. Contagem de células utilizando um hemocitómetro. Em seguida, realizar a análise de citometria de fluxo (Seção 4) ou TEC enriquecimento (Seção 5).
4 Identificação de TEC por Citometria de Fluxo
5. Enriquecimento da TEC garimpando
- Girar as células do timo (preparados na Seção 3) a 400 xg, 4 ° C por 5 min. Aspirar o líquido e suspender as células peletizadas em tampão FACS triagem a uma concentração de 2 x 10 8 culas por ml em 15 ml ou um tubo de 50 ml. Adicionar anticorpos anti-CD90.2 (Clone 30-H12) (ou anti-CD45), a uma concentração final de 2,5 ug / ml de suspensão de células e incubar as células suavemente num misturador rotativo a 4 ° C durante 30 min. A seguir à incubação, lava-se com uma 5 - volume de meio RP10 10x e centrifugar o tubo a 400 xg, 4 ° C durante 5 min.
- Aspirar o líquido e voltar a suspender as células aglomeradas emMeio RP10 a uma concentração de 1 x 10 7 por ml. Adicionar 5 ml de suspensão de células para cada placa revestida panning (preparada no Passo 1.3), redemoinho e incubar durante 30 min à temperatura ambiente. Agite vigorosamente; transferir o sobrenadante para um tubo cónico. Lavar a placa duas vezes com o meio RP10 e reunir os sobrenadantes dentro do tubo de coleta.
- Centrifuga-se o tubo de recolha a 400 xg, 4 ° C durante 5 min. Aspirar o líquido e voltar a suspender as células aglomeradas em cinco ml de meio RP10. Adicionar a suspensão de células para uma nova placa de deslizamento, agite e incube durante 30 min à temperatura ambiente. Coletar as células lavar o prato e reuni-los em um tubo cônico. Uma vez que são enriquecidas TEC, rodar para baixo as células a 400 xg, 4 ° C durante 5 min e suspender as células em 5 ml de tampão de FACS triagem.
6. Purificação da TEC por separação de células
- Contagem de células utilizando um hemocitómetro e preparar a suspensão de células a uma concentração de 4 x 10 7 células em tampão de SCAF triagem. Adicionar anticorpos described na Secção 4.4 em solução de células e incubar as células suavemente num misturador rotativo a 4 ° C durante 30 min. Após a coloração, lavar e suspender as células a uma concentração de 10 x 10 6 culas por mL de tampão de FACS triagem.
- Ordenar subconjuntos TEC através de um bocal de 100 pM utilizando separação de células activadas por fluorescência. Célula classificados são recolhidos em 30% (v / v) de FBS em meio RPMI-1640). Uma vez que separação de células é feito, centrifugar células a 400 xg, 4 ° C por 5 min e se preparar para análise a jusante.
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Representative Results
Usando este protocolo, um órgão timo foi removido a partir de um rato adulto (Secção 2) e uma suspensão de células do timo, foi preparado como descrito no ponto 3 a suspensão de células obtida consistiu de timócitos, células de estroma derivadas de hematopoiéticas e células estromais não hematopoiéticas. CD45 é um marcador de pan-hematopoiético expressos em ambos os timócitos e células do estroma hematopoiético, tais como macrófagos e células dendríticas. Em contraste, os TEC não são de origem hematopoiética e não expressam CD45 15. Coloração celular e análise por citometria de fluxo foram realizados conforme descrito na Seção 4.
Dois tipos de subconjuntos do TCE, CTECs e mTECs, originários de um bi-TEC potente precursor comum 15. Ambos CTECs mTECs e expressar a molécula EpCAM na sua superfície 28. Assim TEC pode ser fechado de acordo com a EpCAM-positiva e CD45-negativo, por citometria de fluxo (Figura 2A). CTECs mTECs e podem ser distinguidos por dois reagentes: a Ly51anticorpo que reconhece glutamil aminopeptidase expresso por CTEC, e a lectina de Ulex europaeus aglutinina-1 (UEA-1) 28 que se liga a MTEC (Figura 2B). Ambos mTECs e CTECs expressar moléculas MHC de classe II na sua superfície (Figura 2C e 2D). mTECs pode ser classificada em MTEC para baixo e MTEC alta, dependendo do nível de moléculas MHC II (Figura 2D). O número médio de TCE por timo é de cerca de 9 x 10 5. Em comparações directas, que recuperados cerca de 8 vezes mais TEC usando este protocolo baseado Liberase enzima em comparação com um protocolo multi-passo com colagenase / dispase 29 (Figura 3).
A fim de diminuir o tempo de triagem e de aumentar a viabilidade das células estromais recuperados, foi desenvolvido um método de filtração para esgotar timócitos porque a suspensão de células do timo composto por mais de 95% timócitos. As células foram incubadas com umti-CD90 e anticorpo capturado por meio de placas pré-revestidas. Em comparação com os que, em todo células do timo preparadas (pré-enriquecida), a proporção de TEC aumentou de menos do que 0,5% e mais de 15% nas células pós-enriquecida (Figura 4A e 4B). Posicionar com anti-CD45 também podem ser utilizados se, por exemplo, não é necessário para recuperar as células dendríticas assim. Neste caso, TEC enriquecimento aumenta para cerca de 80% (dados não mostrados). Após o enriquecimento de células do estroma garimpando, as proporções de subconjuntos do TCE não foram alteradas (Figura 4C e 4D), sugerindo que um subconjunto ou o outro não está perdido seletivamente durante o deslocamento. Em comparação com a amostra de pré-enriquecimento, a taxa de recuperação de TEC era cerca de 85% (Figura 4E).
Figura 1 O timo do rato durang dissecção. O timo está localizado acima do coração do tórax anterior superior. Depois de cortar e levantar as costelas, os dois lobos brancos do timo estão expostos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 Identificação de CTECs MTEC e com a análise de dados de citometria de fluxo. Amostras de células do timo manchado foram analisadas por citometria de fluxo. FACS perfis representativos são mostrados. Os números indicam a porcentagem de cada população. (A) de células vivas, um portão de eventos CD45 negativo e EpCAM-positivos representa células do TCE. (B) No portão do TCE, duas populações são separadas por nível de Ly51 e UEA- 1. CTECs têm altaexpressão er de Ly51; mTECs têm maior nível de UEA-1. moléculas (C) MHC II são altamente expressos em CTECs. (D) mTECs consiste em sub-populações de baixa altura e MHC II MHC II, que são referidos separadamente como MTEC alta e MTEC baixo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A Figura 3 um protocolo baseado no Liberase permitido rendimentos mais elevados a partir de células do timo de usar um protocolo / dispase multi-passo com colagenase. Células do timo foram preparadas utilizando um multi-passo com colagenase protocolo publicado anteriormente / ou dispase este protocolo baseado Liberase. Os dois grupos de amostras foram analisadas por citometria de fluxo. (A) </ Profiles strong> FACS representativos são mostrados. Os números indicam as percentagens de células TEC em cada grupo. (B) os números de células totais de TCE por timo do rato são apresentados no gráfico de barras. As barras de erro indicam o desvio padrão (n> 3). Uma de duas caudas, teste T foi realizada utilizando software Prism. P <0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 Enriquecimento da TEC pelo método de panning. Perfis FACS de células do estroma tímico pré e pós-enriquecido são mostrados. Células do timo preparadas foram coradas com anticorpo anti-CD90. Timócitos CD90-positivo compor mais de 95% de células do timo. Durante o processo de enriquecimento do TCE, timócitos são Captured e empobrecido no prato deslizamento pré-revestido, portanto TEC são enriquecidas no sobrenadante. (A) e (B), TEC portões são mostrados. Os números mostram a proporção de TEC entre células vivas na população total de (pré-enriquecimento) começando ou após o enriquecimento (Pós-enriquecimento). (C) e (D), as células no interior e CTECs MTEC portões são mostrados. Os números de exibir as percentagens de CTECs e MTEC TEC nas populações de cada grupo. Números (E) e de células de CTECs mTECs por timo do rato são indicados no gráfico. Os dados são representativos de 5 experiências. "Pre" significa amostra pré-enriquecimento; "Post" significa amostra pós-enriquecimento; pequenas linhas horizontais indicam a média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
No protocolo, os passos críticos são a preparação de células do estroma do timo (ponto 3) e o enriquecimento da TEC (Seção 4). É altamente recomendável que a solução enzimática fresca é preparada de cada vez e que o tecido é tratado o mais rapidamente possível. Para timos reunidas, optimizar o volume da solução de enzimas é necessária, dependendo do número de timos. Se qualquer resíduo de tecido é deixado após o processamento, a adição de mais solução enzimática e extensão do tempo de incubação poderia aumentar a produção de células. Durante enriquecimento da TEC, completando cobrança do sobrenadante e repetir a lavagem da placa descrito na Seção 5.3 vai diminuir a perda de células.
Em 1980, Wekerle et al. relatada pela primeira vez um tipo de TEC - "células do timo de enfermagem" (ETN) 33, que são grandes células epiteliais corticais que envolvem completamente muitas células linfóides viáveis dentro de vesículas intracelulares. Em 1982, Kyewski e Kaplan descreveu vários cond isolamentoitions que influenciam o rendimento das empresas transnacionais 34. Recentemente, Takahama e colegas revisitou o isolamento e as características das empresas transnacionais. Eles identificaram tais células com base na coloração preferencial para CD45 apenas após permeabilização da membrana 35. Eles também descreveu "quebrado" TNC na sua preparação, que consistia em um CTEC e múltiplas timócitos encadernados. Tal quebrado TNC foram positivas para CD45 extracelular e para o marcador β5t CTECs e constituem 70% do total de CTECs na sua preparação. Na verdade, também observamos uma população de células semelhantes, que foi elevada de CD45 + e EpCAM Ly51 + no nosso suspensão de células do timo preparadas, embora composta por menos de 40% do total de CTECs com o nosso procedimento de isolamento. Estes quebrado TNC são removidos protocolos TEC enriquecimento, como o nosso, que utilizam esgotamento tanto com CD90 ou CD45. Assim, um desafio futuro será a minimizar a perda desta população.
Comparadopara o procedimento de digestão de multi-passo 29 existente, o protocolo de Liberase digestão permite que um rendimento significativamente mais elevado de células da TEC (Figura 3). Outros grupos também relataram seus novos métodos para o isolamento de células do estroma tímico, modificando o método de cinza 30,36, apesar de rendimento celular não aumentou significativamente. Recentemente, Chidgey e colegas relataram independentemente um protocolo TEC utilizando digestão Liberase e eles também obteve liberação efetiva da TEC 37. No entanto, o primeiro passo de libertação de timócitos de seu protocolo tem o potencial para eliminar cerca de 1,6 x 10 4 a partir de cada um timo TEC 29, a maioria dos quais são CTECs. Devido ao gradiente de densidade de enriquecimento de causar a perda de células do estroma menores, uma depleção de CD45-microbead baseada em AutoMACS é popularmente utilizado para o enriquecimento do TEC antes da FACS purificação 29,36,37. Em comparação com o enriquecimento baseado no AutoMACS usando depleção de CD45-micropérola protocolos 29, osgarimpando enriquecimento obtido taxas de recuperação mais elevados de TEC. Em geral, o protocolo aqui apresentado agrega um número de vantagens anteriormente relatados. Subconjuntos TEC purificados com este protocolo (Seção 6) têm sido utilizados com sucesso para posterior análise, como o Real Time-PCR e Western blot 12.
Este protocolo é também adequada para o isolamento e estudo de outras células do estroma de timo, tal como as células dendríticas. Acreditamos que o isolamento robusto de células do estroma do timo, particularmente TEC, vai acelerar a compreensão de como funciona o timo para o desenvolvimento de células T e alcançar in vitro T constituição celular. Além disso, a caracterização dessas células tem grande valor prático para a comunidade médica, uma vez que um problema comum com a recuperação a partir de terapêuticas (tais como aqueles utilizados na transplantação e no tratamento de cancro) é pobre a reconstituição de células epiteliais no timo levando a imunodeficiência.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health Grant R01 AI088209 (para KAH). Agradecemos também a Universidade de Minnesota Citometria de Fluxo de recursos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse EpCAM | eBioscience | XX-5791-YY* | Clone G8.8 |
| Anti-mouse MHC II | eBioscience | XX-5321-YY* | Clone M5/114.15.2 |
| Anti-mouse Ly51 | eBioscience | XX-5891-YY* | Clone 6C3 |
| UEA-1 | Vector Laboratory | FL-1061 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSRFortessa | |
| Flow cell sorter | BD Biosciences | FACSAria | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| Flow cytometry analysis software | TreeStar - Flowjo | FlowJo v7/9 | |
| *XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size. |
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