Summary
İzole pankreas acininin in vivo morfolojisi ve etkinliğini muhafaza ve izleme ve salgılanmasını işlenmesi için güçlü yollar sunuyoruz. Bu çalışma acininin fare pankreasında izole edilebilir ve bunların salgı kapasiteleri ne değerlendirilebilir gösterilmiştir.
Abstract
Pankreas asiner hücreler üretmek ve sindirim enzimleri salgılar. Bu hücreler ortak bir lümen oluşturur ve hisseleri bir küme olarak organize edilmektedir. Bu çalışma, bu hücrelerin izole edilmiş salgılama kapasitesi asini kültürü ile değerlendirilebilmektedir gösterilmiştir. Dokunulmamış ekzokrin pankreas birçok özelliklerini muhafaza izole acininin, manipüle ve tüm hayvanda daha kolay kontrol edilebilir, çünkü kurulum avantajlıdır. Ex vivo kültür asini in vivo doğayı temsil edecek şekilde pankreas asini şekilde tecrit önemli bir gerekliliktir. Protokol fare pankreas sağlam asinüsü izole etmek için nasıl gösterir. Daha sonra, pankreas salgısını değerlendirmek için iki yardımcı yöntem sunulmaktadır. Pankreas salgılarının doğrudan görüntüleme bir alt-hücresel çözünürlükte salgılanması karakterizasyonu sağlar ise amilaz salgılanması deneyi, küresel bir tedbir olarak hizmet vermektedir. Toplu olarak, bu teknikler presented burada ekzokrin salgısını incelemek için deneyler geniş bir yelpazede sağlar.
Introduction
Ekzokrin pankreas, memeli pankreas kütlesinin çoğunu oluşturur ve sindirim enzimleri 1 üretimi ve salgılanması için adanmış. Ekzokrin pankreas, acinus, fonksiyonel birim ortak bir lümen oluşturur ve hisse epitel hücrelerinin bir küme. Hormonal veya nöronal uyarım üzerine, enzim ile dolu keseler bununla birlikte apikal hücre yüzeyine taşınan sigorta ve lümen içine 1-3 içeriğini çıkarmak. Salgılanan enzimler daha sonra besin, besin parçalanmasını katalize ince bağırsağa kanalların bir birleştirme grubu tarafından drene edilir.
Bu video tüm pankreas izole edilir ve kendi salgılama kapasitesi ne kadar nasıl tespit edilebilir sağlam acininin gösterir. Bu kurulumu kullanılarak, pankreas salgı uyarılmasını takip yayımlanan amilaz nispi miktarının ölçülmesi ile ölçülür. Seçenek olarak ise, farklı salgılama kullanılmasıyla canlı görüntülenebilirsensörleri ve boyalar.
Sağlam pankreas birçok özelliklerini muhafaza izole acininin, manipüle edilen ve hayvanın tamamı 4-6 daha kolay kontrol edilebilir yana pankreas asinüs ex vivo olarak ayar avantajlıdır. Bu kurulum aslında 1970 sonlarında geliştirilen ve bu tükrük ve meme bezlerinin 3-7 gibi çeşitli ekzokrin dokuların çalışma için genişletilmiş beri oldu. Özellikle, bu polarize epitel kompleks hücresel kuruluşlara en az bir girişim ile salgılanmasının çalışma sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: hayvan denekleri Prosedürleri Weizmann Bilim Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Numune Hazırlama
- Pankreas asinüs izolasyonu
- Başlamadan önce taze Krebs-Ringer bikarbonat HEPES (KRBH) ortam 300 ml hazırlayın. 140 mM NaCI, 4.7 mM KCI, 1.16 karıştırın mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 11 mM glikoz, 10 mM HEPES. Büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) ve 0.1 mg / ml soya fasulyesi tripsin inhibitörü (STI) (yeniden süspansiyon ortamı) ekleyin. Orta kollagenazının (~ 0.75 mg / ml) (sindirim ortamı) ile takviye edilmiş 10 ml yeniden süspansiyon - 5 hazırlayın.
- ~ 30 dakika boyunca ortam KRB oksijenat. Köpüren önlemek için oksijenlenme sonra BSA ekleyin. 37 ° C resüspansiyon ve sindirim ortamlar getirin. NOT: orta Oksijenleyici hücre ölümlerini azaltır ve sekretagoglannın için yanıt geliştirir. Oksijenasyon etkisi en az 6 saat boyunca açıktır.
NOT: kirlenmesini önlemek diseksiyon araçları ve kullanmadan önce KRBH ortamı için kullanılan suyun otoklavlamayın için. 0.2 um'lik bir filtreden filtre ortamı KRBH. Önce pankreas çıkarılması için% 70 etanol ile diseksiyon araçları yıkayın ve temiz bir bankta diseksiyonu yürütmek. Seviye 3 biyo-güvenlik kabini viral enfeksiyonların yürütmek. O / N kültür ortamına antibiyotik ekleyin (Bölüm 4'e bakınız).
- Kesi yaygın karın deri ve deri altı tabaka. Karaciğer, mide, bağırsak, pankreas ve dalak (Şekil 1) tanımlayın. NOT: Aşağıdaki adımlarda, yavaşça pankreas dokusu işlemek ve aşırı mekanik FORC uygulamaktan kaçınıne doku ve hücre ölümüne otomatik sindirim önler.
- İki künt forseps kullanarak, ince bağırsağa çekin. Mideden çıkışına yakın, ince barsak proksimal ucunda başlar. Bağırsaktan pankreas ayırın ve vücut boşluğunun içinde yerinde tutulması. Bir kez kalın bağırsağa ulaşan, pembe / beyaz bağ dokusu fark. Pankreas ile karıştırmayın.
- Yağ veya bağ dokusu toplama olmadan mümkün olduğunca pankreas dokusu temizleyin. Dalak ve mide ayrılmakta ve karın kan damarları altındaki (Şekil 1A-C) keserek pankreas kaldırmak.
NOT: Tek bir hayvandan alınan pankreas asinüs verimi yüksek olduğu için, bir başka dokular oluşmasını önlemek için tüm pankreas dokusu toplama kaçınırsan.
- Pankreas 37 ° C'ye kadar ısıtıldı yeniden süspansiyon ortamı içinde birkaç kez yıkayın ve pankreatik olmayan kalan bölümlerini kaldırmakdokular. Bir 20 mL sintilasyon şişesine önceden ısıtılmış bir sindirim ortamının ~ 5 ml pankreas bırakın. 1-3mm parçalarına pankreas kıyma. (Optimal olarak ~ 100 rpm çalkalama ile) ısıtılmış bir su banyosu içine koyun. Sindirim hızlandırmak için, sindirilmiş doku yukarı ve aşağı bir kez her birkaç dakikada bir pipetle.
Not: kolajenaz sindirimi süresi esas olarak kolajenaz konsantrasyonu ve doku üzerinde uygulanan mekanik kuvvet miktarına bağlıdır. 30 hücre - 10 asinüs sonuçlanan 5 dak - 15 dakika boyunca, yaklaşık 0.75 mg / ml kollajenaz kullanımı ve 2 mm olan bir 5 ml'lik pipet ile polistiren doku pipetle her 3 orifis. Sindirme işlemini takiben, süspansiyon doku görülebilir parçadan oluşan bulanık görüntülenir. Kalogenazlar verimleri farklı ticari tip ve sayıda arasında değişir bu yana, ampirik sindirim zamanlamasını belirler. - Yıkama ve filtreleme
- 50 ml'lik bir tüp içine sindirilmiş doku transferi ve kazı sonayeniden süspansiyon ortamı 45 ml ilave etmek suretiyle len. Bir kaba ile süspansiyon filtre (~ 1 mm), yeni bir tüpe, metal içine örgü. 3 dakika için akış yoluyla 100 × g santrifüj.
- Süpernatant atılır ve yeniden süspansiyona alma ortamı, 50 ml dijeste pankreas yeniden süspanse edildi. 70 veya 100 mikron naylon örgü ile süspansiyon filtre. Önceki gibi santrifüj.
- Resüspansiyon ortamın 5 ml -, yüzen, hasarlı asinüsü kaldırmak süpernatantı atmak ve 3 pankreas dokusu tekrar süspansiyon için. Yeniden süspansiyon ortamı 7 ml ile doldurulmuş 15 ml konik tüp içine pankreas asinüs 1 ml kısımlar uygulanır. 3 dakika - acininin 2 yerleşmek için izin verin. 1 ml'lik bir pipet ile tüpün dibine yerleştirilmiş olan asinüsü toplamak ve bu adımı tekrar 2 - 3 defa.
- Kendi durumunu test etmek için bir ışık veya diseksiyon mikroskobu altında pankreas asinüsü gör. Şekil 2'de, İlginç tasarım hücreleri üzerinde açtığı izolasyon saflığını ve zararları gözlemlemekng izolasyon. Kadar 20 saat boyunca bu hemen asinüsü veya kültür kullanın.
2. Amilaz Salgı Testi
Not: Amilaz salgılama tahlili pankreas asinüs salgılama kapasitesi için küresel bir ölçüsü olarak hizmet vermektedir. Bu genellikle ticari bir kit kullanılarak, pankreas acininin inkübe edildiği ortamın toplanması, ve ortamın amilaz aktivitesinin belirlenmesi suretiyle elde edilir.
- Deneysel koşullar sayısının incelenecek belirlemek (örneğin, uyarılmamış genel uyarılmış). Her bir durum için en az üç suret kullanın. Buna ek olarak, ortam ("sıfır" örneği) amilaz aktivitesi için toplam hücresel amilaz içeriği (bakiyeleri örnek) ve bir kümesini belirlemek için replika kümesi ekleyin. Çok-çukurlu deney yapılacak olan plaka ve Her bir replika için mikro-tüpler iki takım etiketlemek kullanılır.
NOT: 12 ya da 24 oyuklu plaka, sırasıyla, asinar süspansiyonlar 1 ve 0.5 ml izlemek için de kullanılabilir. - KRBH yeniden süspansiyon ortamı 30 ml iki kez asinüsü yıkayın ve 37 ° C'de 30 dakika boyunca yeniden süspansiyon ortamı içine inkübe edin. Çok-çukurlu plaka için uygun nihai konsantrasyona ulaşmak için bir 10 ul salgılattırıcısı damla ekleyin.
- Pankreas acininin çift fazlı bir şekilde salgılattırıcısı gradyanı yanıt. Kolesistokinin (CCK) ve 1 uM'nin Karbakol'ün (Şekil 3A), 100 uM 5 - uygun salgılama değerleri ile konsantrasyonları 50 bulunmaktadır.
- Yıkama ortamı içinde yeniden süspansiyon ve asinüsü tekrar süspansiyon. Acininin çok kuyucuklu plaka içine ve 'total' etiketli mikrotüpler içine süspansiyonun süspansiyon ve kısım eşit miktarlarda homojen olarak dağılmış olduğundan emin olun. 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. (Tercihen yumuşak çalkalama altında bir su banyosunda (~ 50 dak içinde)).
NOT: asini tam sayısı experimen arasında değişebilirts her deneyde çoğaltır benzer olmalı ama. Bu nedenle, süspansiyonun tam acininin Alikotlama farklı tekrarlanmış ve koşullar arasında bir karşılaştırma için çok önemlidir. - İnkübasyon sırasında, "toplam" ve "sıfır" örneklerini üretmek. Santrifüj bakiyeleri 5000 x g 'de birkaç saniye mikrotüpler ve "zero' etiketli mikrotüpler içine süpernatandan 50 ul çıkarın ve 4 ° C' de koyun. Mikro-tüplerin Lyse Triton X-100 eklenmesi ile bakiyeleri örnekleri acininin% 1 bir son konsantrasyon elde etmek üzere. Kuvvetlice mikrotüpler vorteksleyin.
NOT: 'Toplam' deney çoğaltır benzer çoğaltır eşit olarak dağıtılır. Asinüsü parçalayan amilaz toplam içeriğinin açığa çıkmasına yol açar. Seçenek olarak ise, her deney hücresel içeriğini belirlemek için, deneyin sonunda, her bir durumda ve parçalanmasıyla de asinüsü toplanır. - Asiner süspansiyon i en toplayınönceden etiketlenmiş mikrotüplerde ilk kümesi Nto. 5.000 × g birkaç saniye boyunca mikrotüpler santrifüj. Önceden etiketlenmiş mikrotüpler ikinci sette içine süpernatant aktarın.
- Ticari bir kit ile amilaz aktivitesi için yüzer maddeler sınama. Salgılanan amilaz yüzdesini hesaplayın.
NOT: Bu lineer aralığında amilaz aktivitesini okumak için çok önemlidir. Ilk toplam içeriğine salınan amilaz yüzdesi olarak salgılanan amilaz yüzdesini sunulması. Her bir üç kopya medyumuyla arka plan düzeyi amilaz çıkarma ve benzer başlangıç normalize edilmiş bir toplam muhtevası bölün.
Pankreas Salgısının 3. Canlı Görüntüleme
Pankreas asinüs salgılama, canlı görüntüleme ile doğrudan izlenebilir. Çeşitli floresan boyalar ve sensörlerini kullanarak, canlı görüntüleme bir alt-hücresel çözünürlükte salgılanması karakterizasyonu sağlar.
- Taze oksijenli resüspansiyon ortamı olarak hazırlayın in 1.1 adıma ve 37 ºC getirmek. Mikroskop ayarlayın ve bir sıcaklık kontrolörü ile donatılmış ise, 37 ºC ayarlayın.
- Yeniden süspansiyon ortamı 30 ml asinar hücreleri yıkayın ve bir cam ya da plastik slayt yerleştirin. Not: lipofilik boyalar, lipofilik boyalarla işaretlenmiş plazma zarı için etiket endositoz ile iç membran etiketleme önlemek için en fazla 5 dakika boyunca asinüsü leke için kullanılacak ise. Çalışma boyunca yavaşça asinüsü işlemek ve aşırı pipetleme kaçının.
- Mikroskop kez at, kimin morfoloji görüntü acininin açıktır ve taban kabarcıklar ya da hücre içi vakuoller görüntülemek asini görüntüleme kaçının. Halinde ya da sırasında veya hemen önce görüntüleme başlamadan, ya bir perfüzyon odasına kullanılarak salgı damla ekleyin.
NOT: Yüksek sayısal delikler ile yüksek büyütme lensler (örneğin × 63 / 1.4 veya 100 / 1.4 ×) hücre içi yapıları gözlemlemek için tavsiye edilir.
4. O / Pankreas asini N Kültürü (Alternatif Hücre Kültürü Tekniği)
Not: O / N kültürlenmesi, genellikle adeno virüs enfeksiyonu için kullanılır. Tetkikten önce 16 saat - Enfeksiyon 9 10 6 -10 7 pfu / ml 'de gerçekleştirilir.
- En fazla 20 saat boyunca kültür pankreatik acininin. 25 ml kültür ortamı (DMEM tek pankreasından elde edilen yeniden süspansiyon haline acininin fetal buzağı serumu (FCS) (% 5), sodyum-piruvat (1%), antibiyotikler (% 1), L-glutamin (% 0.5), BSA ile desteklenmiş (10 mg / ml) ve STI (0.2 mg / ml) ve 10 cm plakalar beş ayrılmıştır. seviye 3 biyo-güvenlik kabininde virüs ile asinüsü Infect.
- % 5 CO2 nemlendirilmiş hava içinde 37 ° C'de pankreas asinüsü kuluçkalanmıştır. Acininin sonraki inceleme 3,8 önce 30 dakika boyunca ortam içinde yeniden süspansiyon haline oksijenli kurtarmak için izin verin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Iletilen ışık ile bakıldığında düzgün izole edilmiştir Pankreas acininin klişeleşmiş bir morfolojiye sahiptir. Onların Bazolateral etki yuvarlak ve kabarcıkların yoksun görünmelidir. Apikal etki salgı veziküllerinde yüzlerce çevrili ve renk (Şekil 2A, B) koyu görünür. Çekirdekler veziküler alanına bazal yer almaktadır. Hücre kalıntısı ve pankreatik kanal sistemi ve acininin izolasyonu (Şekil 2C, D) erken aşamalarında tespit edilebilir endokrin pankreas, bileşenleri, nihai asinar süspansiyondan mevcut olmalıdır (Şekil 2A, B). Uygun olmayan sindirim izolasyon ortamı (Şekil 2E, F) enzimleri boşaltma bazolateral kabarcıkların ve hücrelerin kırılmasının üretilmesine yol açabilir.
Salgılatıcı konsantrasyonuna (Şekil 3A) ne karşı çizilmiştir pankreas asinüs amilaz salma çift fazlı bir eğrisini göstermektedir. Wbaşlangıç içeriğinin yaklaşık% 5 ildirimde uyarım kuluçkadan 30 dakika boyunca serbest bırakılır. Uyarmayı müteakip, bu sayı 5 kata kadar arttırabilir. Taze izole edilmiş asinüs kıyaslandığında kültür O / N olan Asini bazal amilaz serbest vs uyarılan düşük bir oranını göstermek. Önemli olarak, Adeno virüsleri ile enfekte edilmiştir kültürlenmiş acininin, yüksek bazal bir amilaz salgısının duyarlı ekran ve bir salgı (Şekil 3B, C) ile uyarıldı. Bu kontrol virüsü benzer bir dozu ile kontrol asinüsü enfekte açısından kritiktir.
Asini imaj asinar hücrelerin bazolateral alanları ve uç açık tanımlarını izin vermelidir. Lipofilik boyalar dar apikal ve hücrelerin lateral yönleri ve taban üzerindeki (Şekil 4) ayırt etmek için bir araç olabilir. Fizyolojik uyarılma altında salgı apikal yüzeyinde 1,9 münhasıran yöneliktir. F-aktin probu Lifeact-GFP kullanımıPankreas zimojen kesecikler kısa bir süre önce ekzositoz (Şekil 4), aktin kaplama geçmesi beri, salgı veziküllerinde canlı görselleştirme sağlar.
Pankreas ve komşu organların Şekil 1. lokalizasyonu. (AC) karın deri ve derialtı tabakası (A) insizyon sonrası pankreas ve komşu organlar, öncesi ve pankreas komşu organların ayrılması, (B) ve (C) sonra, sırasıyla. tıklayınız daha büyük bir versiyonunu görmek için Bu rakam.
Pankreas asini 2. İzolasyon Şekil. (A) ve (B) 'Pankreas acininin uygun bir morfolojiye sahiptir stereotipik izole; apikal alan salgı vezikülleri yüzlerce çevrili ve renk (ok) koyu görünür ise kendi taban üzerindeki etki., yuvarlak ve kabarcıkların yoksun görünür (C), ve pankreatik kanal sistemi (D) Hücre kalıntısı ve parçaları temizle algılanabilir (E). acininin izolasyon erken evrelerinde (bir salgı kanalına ok puan) de ve (F) onların sindirim ortama enzimleri deşarj Bazolateral bleblerini (E ok) ve hücrelerin kırılması nesil, içinde Yanlış izolasyon sonuçları ( F ok). Ölçek çubukları 100 mikron temsil eder. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. 
Bir salgı konsantrasyonuna karşı çizilmiştir zaman izole edilmiş asinüs amilaz serbest Şekil 3. Ölçüm. Pankreas asinüs (A) amilaz salma çift fazlı bir eğrisini göstermektedir. Asini izole edildi ve Kolesistokinin (CCK) belirtilen konsantrasyonları ile harekete geçmeden önce 30 dakika eski hallerini almaları için ayrıldı. Sonuçlar yeni izole edilmiş asinüs kıyaslandığında kültür göre O / N, bazal amilaz serbest vs uyarılan düşük bir oranını göstermek olan, ortalama ve üç bağımsız deneyin SEM. (B) 'asinüs temsil eder. Adeno virüs tarafından enfekte edilmiş kültürlü acininin yüksek bazal amilaz sekresyonunu ve duyarlı teşvik salgılanmasını gösterilecek. (C) kültür koşulları aşırı di neden olmayan oxygenatingamilaz, salgı maskeleri uyarıcı etkisinin scharge.
Şekil 4. pankreas salgısı Canlı görüntüleme. (LA, yeşil, gri) ve lipofilik boya FM4-64 (kırmızı) ile boyandı Lifeact-GFP ifade, asiner hücreleri uyarılır Canlı. Lifeact probun kullanılması aktin kaplı veziküller (oklar) tek bir füzyon etkinlikleri canlı görselleştirme sağlar. Hücreler, O / N adenovirüs-Lifeact-GFP (Ad-Lifeact GFP) ile enfekte edilmiş ve boyanmış görüntüleme başlamadan önce 100 uM, CCK ile de kısa bir uyarıldı. Ölçek çubuğu 5 mikron temsil eder. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ex vivo kültür Bunun yanı sıra, ekzokrin salgılanmasının çalışma için alternatif düzenleri pankreatik kanal sıvıların İntra vital mikroskopik ve hesaplanmasıdır. Intravital mikroskopi tükürük bezleri 10 fare iyi faaliyet gösterilmiştir. Bu yöntem, hayvanda, gerçek zamanlı olarak salgılanmasını kaydedebilir, ama çözünürlük ve ekzokrin doku işlenmesi için aracı ile sınırlıdır. Pankreatik kanala sıvıları toplayarak salgılanmasının değerlendirilmesi, anestetize edilmiş sıçanlarda 11 elde edildi. Pankreatik kanal kanulasyonun son derece zor olduğundan Ancak, bu yöntem nadiren kullanılır.
Bu kurulumları ile karşılaştırıldığında, pankreas asini ex vivo kültür, hızlı, basit ve sağlam doku 4,5 organizasyonu ile müdahale etmeden, izleme ve hücrelerin işlenmesi için erişilebilir araçlar sağlar. Yine de, bu kurulum eksiklikleri vardır. Pankreasasinüs hücrelerinde doğal olarak hassas ve kültür koşullarında değişikliklere karşı çok hassastır. Hücreler, proteolitik enzimler ile bir yüklü oldukları için, liziz ve hücre ölümüne meyillidir. Bunun bir sonucu olarak, bu kültür 20 saat boyunca sürmez genellikle kısa ömürlü olup.
Bu tespit ve ortaya çıktıkları gibi sorunlarını gidermek için her zaman en iyisidir. Temel metodolojik adım hücre hasarı ve mortalite önemli belirtileri olmaksızın sağlam pankreas asinüsü izole etmektir. Bu işaretler aşikar bir hale gelecektir, ve taban kabarcıkların ya da hücre içi vakuollü aşırı hücre artıkları ve asinüsü içerir. Amilaz salgılama tahlilinde, hücre hasarı / uyarılmamış salgılama oranı uyarılan düşük bir yol açacaktır. Bu tür zararı önlemek amacıyla, hafifçe doku işlemek ortamına BSA ve STI ekleyin ve oksijen ile zenginleştirmek için tavsiye edilir. Örneğin, oksijenasyon olmadan, amilaz maskelediği salgılattırıcısı uyarıcı etkisini aşırı hücre deşarj (Şekil3C). Ancak nedeniyle ekzokrin doku kırılganlığı, bazı doku hasarı neredeyse kaçınılmazdır - Böyle preparatlar atılmalıdır.
- 2 gün amilaz salgılama tahlili için, gizlenmiş amilaz içerir fakat hücrelerin serbest yüzer madde, 1, 4 ° C 'de muhafaza edilebilir. Bu yüzer madde daha sonra, ticari bir kit ile analiz edilmelidir. Birçok mevcut kitleri yapay bir amilaz, bir alt-tabakanın bölünme ve kromofor bunu takiben de dayanmaktadır. Böylece, yüksek amilaz konsantrasyonu çözümün renkte hızlı bir değişime yol açar. Salgılanmış amilaz sonuçta alt-tabaka tüm bir kromofor yayınlayacak için, zaman içinde reaksiyonu takip ve sadece doğrusal aşamasında toplanan verileri kullanmak esastır.
Pankreas asini Canlı görüntüleme araştırmacı için sinir bozucu bir deneyim olabilir. Enfekte asini özellikle bazı hücre preparatları, gerilim için uygun olmayabilirnedeniyle asini tehlikeye morfolojisi veya floresan sensörlerin yetersiz seviyelerine görüntüleme. Hatta uygun hazırlıklarında, uygun örnekleri bulmak zaman alabilir. Böylece görüntüleme önemli bir zaman gerektirebilir. Lifeact-GFP, bir F-aktin probu, kayda değer 12'dir. Bu araç, sabit akinar örneklerde elde edilemeyen çözünürlük arasında bir seviyede, enfeksiyondan sonra 16 saat boyunca, pankreas, salgılama sırasında F-aktine dinamiklerini takip etmemizi sağladı. Ayrıca, pankreas zimojen kesecikler gibi tek ekzositoz olayları Lifeact prob etkin izleme, kullanımı kısa süre önce ekzositoz 3,13 aktin kaplama uğrarlar.
Toplu olarak, hakim, burada tarif edilen teknikler bir araştırmacı pankreas salgısını değerlendirmek için araçları sunmaktır, ve koşum takımı ile bu çok aşamalı bir süreçte yeni katılımcıları belirlemek için. Buna ek olarak, ekzokrin pankreas ve diğer organ arasındaki yapısal ve fonksiyonel benzerliklere görünümünde,Bu teknikler, diğer salgı dokular yanı sıra 3 uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma BS ABD-İsrail BSF bir hibe ile finanse edildi ve EDSBS Moleküler Genetik Hilda ve Cecil Lewis profesörlük sandalyenin bir görevidir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ICR mice | Harlan | Any strain will do | |
| HBSS | Sigma Aldrich | H8264 | Can substitude for KRB |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | Fraction V |
| Trypsin inhibitor | Sigma Aldrich | T9003 | |
| Collagenase XI | Sigma Aldrich | C0130 | |
| Nylon mesh | BD Falcon | 352360 | 70-100µm |
| Amylase infinity reagent | Thermo | TR25421 | |
| CCK | Sigma Aldrich | C2175 | |
| FM4-64 | Lifetechnologies | F34653 | Diluted to 16µM |
| 20mL scintillation vial | Sigma Aldrich | Z190527 | |
| DeltaVision system | Applied Precision | Consisting of an inverted microscope IX71 equipped with 60x/1.4 or 100x/1.3 objectives (Olympus) | |
| Zeiss 510 or 710 confocal microscope | Zeiss | 60x/1.4 or 100x/1.4 objectives | |
| Ultra Microplate reader | BioTek | ELx808 |
References
- Williams, J. A. Regulation of pancreatic acinar cell function. Current Opinion in Gastroenterology. 22, 498-504 (2006).
- Schnekenburger, J., et al. The role of kinesin, dynein and microtubules in pancreatic secretion. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 66, 2525-2537 (2009).
- Geron, E., Schejter, E. D., Shilo, B. Z. Directing exocrine secretory vesicles to the apical membrane by actin cables generated by the formin mDia1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 10652-10657 (2013).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 3028-3032 (1972).
- Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini. The American journal of physiology. 235, 517-524 (1978).
- Jerdeva, G. V., et al. Actin and non-muscle myosin II facilitate apical exocytosis of tear proteins in rabbit lacrimal acinar epithelial cells. Journal of Cell Science. 118, 4797-4812 (2005).
- Menozzi, D., Jensen, R. T., Gardner, J. D. Dispersed pancreatic acinar cells and pancreatic acini. Methods in Enzymology. , 192-271 (1990).
- Bi, Y., Williams, J. A. A role for Rho and Rac in secretagogue-induced amylase release by pancreatic acini. Am J Physiol Cell Physiol. 289, C22-C32 (2005).
- Palade, G.
- Masedunskas, A., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 13552-13557 (2011).
- Petersen, H., Grossman, M. I. Pancreatic exocrine secretion in anesthetized and conscious rats. The American Journal of Physiology. 233, E530-E536 (1977).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5, 605-607 (2008).
- Porat-Shliom, N., Milberg, O., Masedunskas, A., Weigert, R. Multiple roles for the actin cytoskeleton during regulated exocytosis. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 70, 2099-2121 (2013).
