Summary
고립 된 췌장 선포 세포는 생체 형태와 활동을 유지하고 모니터링 및 분비를 조작하기위한 강력한 방법을 제공합니다. 이 작업은 샘 꽈리가 마우스의 췌장으로부터 단리 할 수 있고, 자신의 분비 능력이 어떻게 평가 될 수 있는지 보여준다.
Abstract
췌장 선포 세포 생산 및 소화 효소를 분비한다. 이 세포는 공동 루멘을 형성하고 주 클러스터로 구성됩니다. 이 작품은 이러한 세포의 분비 능력이 고립 꽈리의 문화에 의해 평가 될 수있는 방법을 보여줍니다. 그대로 외분비 췌장의 여러 특성을 유지 절연 꽈리는, 조작 및 전체 동물에서보다 더 용이하게 모니터링 할 수 있기 때문에 설치가 유리하다. 생체 문화가 꽈리의 생체 내 특성을 대표 할 수 있도록 췌장 선포 세포의 적절한 분리가 핵심 요구 사항이다. 이 프로토콜은 마우스의 췌장에서 그대로 선포 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다. 그 후, 췌장 분비를 평가하는 두 개의 보완적인 방법이 제공됩니다. 췌장 분비 직접 이미징 서브 해상도 분비 세포의 특성화를 허용하면서 아밀라아제 분비 분석은, 글로벌 계수로서 기능한다. 종합적으로, 기술은 presen와여기 테드의 외분비 분비를 연구하기 위해 실험의 폭 넓은 스펙트럼을 할 수 있습니다.
Introduction
외분비 췌장은 포유 동물의 췌장의 질량의 대부분을 구성하고, 소화 효소 하나의 생산 및 분비에 전념하고 있습니다. 외분비 췌장, acinus의 기능 유닛은 공동 루멘을 형성하고, 주 상피 세포의 클러스터이다. 호르몬 또는 신경 자극되면, 효소로 가득 소포가 그것으로, 혀끝의 세포 표면에 퓨즈를 수송하고 루멘 1-3로 콘텐츠를 추방. 분비 된 효소는 그 때 영양소로 음식의 분해를 촉진 소장에 관의 유착 세트에 의해 배출된다.
이 동영상은 전체 췌장에서 고립되고, 자신의 분비 능력이 어떻게 평가 될 수있는 방법을 그대로 꽈리 보여줍니다. 이 설정을 사용하여, 췌장 분비를 자극 다음 출시 된 아밀라아제의 상대적인 양을 측정하여 정량화한다. 대안 적으로, 서로 다른 분비를 이용하여 묘화 될 수있는 라이브센서 및 염료.
본래 췌장의 여러 특성을 유지하는 절연 꽈리는, 조작 및 전체 동물 4-6에서보다 더 용이하게 모니터링 할 수 있기 때문에 췌장 선포 세포의 생체 외 설치가 유리하다. 이 설정은 원래 1970 년대 후반에 개발 및 타액 및 유선 3-7로 여러 외분비 조직의 연구를 위해 확장 된 이후였다. 특히, 이러한 편광 상피 세포의 복잡한 세포 조직에 최소한의 간섭 분비의 연구를 할 수 있습니다.
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Protocol
주 : 동물 대상으로 한 절차는 과학의 와이즈만 연구소의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1 샘플 준비
- 췌장 선포 세포의 분리
- 시작하기 전에 신선한 크렙스 - 링거 중탄산 HEPES (KRBH) 매체의 300 ML를 준비합니다. 140 밀리미터의 NaCl, 4.7 밀리미터의 KCl을 혼합 1.16 mM의 MgCl2를, 1 mM의 염화칼슘이, 11 mM의 포도당, 10 mM의 HEPES. 소 혈청 알부민 (BSA) 및 0.1 ㎎ / ㎖ 대두 트립신 억제제 (STI) (재 부유 매체)를 추가한다. 매체 콜라게나 제 (~ 0.75 ㎎ / ㎖) (소화 매체)와 보충 재 부유 10 ㎖ - 5를 준비합니다.
- ~ 30 분 KRB 매체에 산소. 버블 링을 방지하기 위해 산소 후 BSA를 추가합니다. 37 ° C에서 재 부상 및 소화 매체를 가져와. 주 : 매체를 산소로하는 세포 사망률을 감소시키고 분비에 대한 응답 성을 향상시킨다. 산소의 효과는 최소한 6 시간 동안 명백하다.
참고 : 오염을 방지 절개 도구 및 사용 전에 KRBH 매체에 사용되는 물을 고압 증기 멸균하기 위하여. 0.2 μm의 필터를 통해 KRBH 매체를 필터링합니다. 이전에는 췌장 절제술로 70 % 에탄올로 해부 도구를 헹구고 깨끗한 벤치에 절개를 실시하고 있습니다. 레벨 3 생물 안전 캐비닛의 바이러스 감염을 수행하십시오. O / N 배양 배지에 항생제를 추가 (4 절 참조).
- 절개 널리 복부 피부와 피하 층을 포함한다. 간, 위, 대장, 췌장, 비장 (그림 1) 확인합니다. 참고 : 다음 단계에서 조심스럽게 췌장 조직을 처리하고 과도한 기계적 그렇게해야을 적용하지 않도록전자 조직 및 세포 죽음의 자동 소화를 방지합니다.
- 이 무딘 집게를 사용하여 소장을 잡아 당깁니다. 위장으로부터 출구 근처 소장 근위 단부에서 시작. 소장에서 췌장을 분리하고 체강 내에서 유지됩니다. 일단 대장에 도달, 핑크 / 화이트 결합 조직을 알 수 있습니다. 췌장와 혼동하지 마십시오.
- 지방이나 결합 조직을 수집하지 않고 가능한 한 많은 췌장 조직을 취소합니다. 비장과 위장에서 그것을 분리 및 복부 혈관 그 아래 (그림 1A-C)를 절단하여 췌장을 제거합니다.
NOTE : 단일 동물 췌장 선포 세포에서의 수율이 높기 때문에, 하나가 다른 조직을 수집하는 것을 방지하기 위해 모든 췌장 조직 수집을 삼가 할 수있다.
- 췌장 37 ° C로 가열 재 부상 매체에 몇 번 헹구고 비 췌장의 나머지 부분을 제거조직. 20 ml의 신틸레이션 바이알에 예열 된 소화 매체 ~ 5 ㎖ 중의 췌장 담가. 1-3밀리미터의 조각 췌장을 말하다. (최적 ~ 100 rpm으로 교반하면서) 가열 된 물을 욕조에 넣습니다. 소화를 촉진하기 위해, 소화 조직 상하마다 몇 분 피펫.
NOTE : 콜라게나 제 소화 기간은 주로 콜라게나 제 농도 및 조직에 적용되는 기계적 힘의 크기에 의존한다. 30 셀 - (10)의 선포 세포의 결과로 5 분 - 약 15 분 동안 825 ㎎ / ㎖ 콜라게나 제의 사용 및 2mm와 5 ㎖의 폴리스티렌 피펫 조직을 피펫 팅은 매 3 오리피스. 소화 후, 현탁액을 조직 보이는 조각을 포함 혼탁이 나타납니다. 콜라게나 효율 다른 상업적 유형과 많은 사이에서 변화하므로, 경험적으로 소화의시기를 결정한다. - 세척 및 필터링
- 50 ML 튜브로 소화 조직을 전송하고 발굴을 종료재 부유 배지 45 ㎖에 첨가하여 estion. 거친 통해 서스펜션 필터 (~ 1mm) 금속은 새로운 튜브에 메쉬. 3 분 동안 흐름을 통해 100 × g에서 원심 분리기.
- 뜨는을 취소하고 재 부유 매체의 50 ㎖에 소화 췌장을 재현 탁. 70 또는 100 μm의 나일론 메쉬를 통해 현탁액을 필터링합니다. 이전과 원심 분리기.
- 재 부상 매체의 5 ML -, 부동, 손상 선포 세포를 제거 상층 액을 제거하고 3 췌장 조직을 재현 탁하기 위해. 재 부상 매체의 7 ML 가득 15 ML 원뿔 튜브에 췌장 선포 세포의 1 ml의 일부를 적용합니다. 3 분 - 꽈리 2 정착하도록 허용합니다. 1 ml의 피펫 튜브 바닥에 침전 한 선포 세포를 수집하고,이 단계 2를 반복 - 3 회.
- 자신의 상태를 테스트하기 위해 조명이나 해부 현미경으로 췌장 선포 세포를 볼 수 있습니다. 그림 2에서 두리 세포에 가해 분리의 순도와 손해 배상을 관찰NG 격리. 최대 20 시간 동안이 즉시 선포 세포 나 문화를 사용합니다.
2 아밀라아제 분비 분석
참고 : 아밀라아제 분비 분석은 췌장 선포 세포의 분비 능력에 대한 전역 조치로서 역할을한다. 이것은 보통 상업용 키트를 사용하여, 췌장 선포 세포가 배양 된 배지를 수집하고, 매체의 아밀라아제 활성을 결정함으로써 달성된다.
- 실험 조건의 수를 결정하기 위해 검사한다 (예를 들어 비 - 자극 된 대는 자극). 각 조건에 대해 최소한 세 복제물을 사용합니다. 또한, 매체 (영점 샘플)의 아밀라아제 활성에 대한 전체 셀룰러 아밀라아제 함량 ( '전체'샘플)과 집합 결정에 복제 세트를 추가한다. 멀티 웰의 분석이 수행 될 것이다 플레이트 및 복제물 각 모세관의 두 세트를 사용하는 라벨된다.
참고 : 12 또는 24 웰 플레이트S는 각각 선포 현탁액의 0.5 ml의 1을 모니터링하는데 사용될 수있다. - KRBH의 재 부상 매체의 30 ㎖에 두 번 선포 세포를 세척하고 37 ° C에서 30 분 동안 재 부상 매체에서 그들을 품어. 멀티 웰 플레이트에 적절한 최종 농도에 도달하는 분비 촉진제의 10μL 방울을 추가한다.
- 췌장 선포 세포는 이중 phasic 방식으로 분비의 기울기에 반응한다. 콜레시스토키닌 (CCK)와 카르 바콜의 1μM (그림 3A)의 100 오후 5시 - 최적의 분비 값이 농도는 50입니다.
- 씻고 재 부상 매체에서 꽈리를 재현 탁. 꽈리가 멀티 웰 플레이트로하고 'total' 표지 마이크로 튜브로 현탁액의 서스펜션과 나누어 동일한 양으로 균일하게 분산되어 있는지 확인합니다. 37 ° C에서 30 분 동안 접시를 품어. (바람직하게는 온화한 교반하면서 수조 (에 ~ 50 RPM)).
참고 : 꽈리의 정확한 수는 experimen에 따라 다를 수 있습니다TS는 각 실험 내에서 반복 실험에서와 유사해야하지만. 따라서, 꽈리 현탁액의 정확한 aliquoting 다른 복제하고 조건 사이의 비교 중요합니다. - 배양하는 동안, '총'과 '제로'샘플을 생산하고 있습니다. 원심 분리기는 '총'5000 × g에서 몇 초 동안 마이크로 튜브 및 'zero' 표지 마이크로 튜브에 상층 액 50 μl를 제거하고 4 ° C에서 배치합니다. 를 Lyse는 모세관에 트리톤 X-100을 첨가함으로써 '전체'샘플 꽈리 1 %의 최종 농도에 도달한다. 적극적으로 마이크로 튜브를 흔든다.
NOTE : '전체'이 실험의 반복 실험과 유사한 복제 Aliquote. 선포 세포를 용균, 총 아밀라아제 콘텐츠의 릴리스로 연결됩니다. 대안 적으로, 각각의 세포 복제에 콘텐츠를 결정하기 위해, 실험의 끝에, 각 조건에서 꽈리를 Lyse 수집. - 선포 서스펜션 난의 대부분을 수집미리 라벨링 모세관의 제 n을 세트. 5,000 × g에서 몇 초 동안 마이크로 튜브를 원심 분리기. 미리 라벨링 모세관의 두번째 세트로 뜨는을 전송합니다.
- 상용 키트와 함께 아밀라제 활동에 대한 상층 액을 분석. 분비 된 아밀라아제의 비율을 계산합니다.
주 : 선형 범위에서 아밀라아제 활성을 읽을 중요합니다. 초기 전체 내용에서 발표 아밀라아제의 비율로 분비되는 아밀라아제의 비율을 제시한다. 각 중으로부터 매체의 배경 아밀라아제 레벨 빼기와 마찬가지로 초기 정규화 된 총 함량으로 나눈다.
췌장 분비의 3 라이브 영상
췌장 선포 세포에서 분비 라이브 영상에 의해 직접 모니터링 할 수 있습니다. 다양한 형광 염료와 센서를 사용하여 라이브 영상은 세포 이하 해상도에서 분비의 특성을 수 있습니다.
- 갓 산소 재 부상 매체로 준비 전n은 1.1 단계로 37 ºC에 가져다. 현미경을 설정하고 온도 조절 장치를 장착하는 경우, 37 ºC로 조정.
- 재 부상 매체의 30 ㎖에 선포 세포를 씻고 유리 또는 플라스틱 슬라이드에 배치합니다. 주 : 친 유성 염료, 지용성 염료로 표지 원형질막 레이블 엔도 사이토 시스에 의해 막 내부 라벨을 방지하게는 5 분 이상 선포 세포를 염색하기 위해 사용되어야하는 경우. 작업 전반에 걸쳐 조심스럽게 선포 세포를 처리하고 과도한 피펫을 피하십시오.
- 현미경에서 일단 그 형태 이미지 꽈리는 명확하고, 기저 기흉 또는 세포 내 액포를 표시 선포 세포의 이미징을 피하십시오. 현명 동안 또는 직전에 영상의 시작에 하나, 관류 챔버를 사용하여 분비 드롭을 추가합니다.
참고 : 높은 숫자 조리개와 높은 배율 렌즈 (예 : × 63 / 1.4 또는 100 / 1.4 ×) 세포 내 구조를 관찰하는 것이 좋습니다.
4. O / 췌장 선포 세포의 N 문화 (대체 세포 배양 기술)
참고 : O / N 배양 자주 아데노 바이러스 감염에 사용됩니다. 검사 전 16 시간 - 감염 9 10 6 -10 7 PFU / ㎖에서 수행된다.
- 최대 20 시간 동안 문화 췌장 선포 세포. 25 ml의 배지 (DMEM에서 단일 췌장으로부터 얻어지는 현탁 선포 세포는 우태 혈청 (FCS) (5 %), 나트륨 피루 베이트 (1 %), 항생제 (1 %), L-글루타민 (0.5 %), BSA로 보충 (10 ㎎ / ㎖) 및 STI (0.2 ㎎ / ㎖), 5 10cm 플레이트에 나누었다. 레벨 3 바이오 안전 캐비넷에 바이러스를 감염 꽈리.
- 5 % CO 2의 가습 된 공기를 37 ℃에서 췌장 선포 세포를 배양 하였다. 꽈리 후속 시험 3,8하기 전에 30 분 동안 산소 재 부상 매체에 복구 할 수 있습니다.
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Representative Results
전송 된 빛에 의해 볼 때 제대로 분리 한 췌장 선포 세포는에 박힌 형태를 표시합니다. 이들의 기저 도메인은 라운드 기흉의 결여 나타납니다. 혀끝의 도메인이 분비 소포의 수백에 의해 둘러싸여 있으며, 색상 (그림 2A, B)에서 어두운 나타납니다. 핵 기공을 갖는 영역으로 기저에 위치하고 있습니다. 세포 파편 및 췌장 유관 시스템 및 선포 세포 분리 (도 2C, D)의 초기 단계에서 검출 될 수 내분비 췌장의 구성 요소는 최종 선포 현탁액 결석한다 (도 2A, B). 부적절한 분리는 소화가 매체 (그림 2E, F)로 효소 방전 기저 기흉과 세포의 파손의 발생의 원인이 될 수 있습니다.
분비 촉진제의 농도 (그림 3A)이 역모를 꾸몄다 때 췌장 선포 세포에서 아밀라제의 방출은 이중 phasic 곡선을 보여줍니다. W초기 콘텐츠의 5 %에 대한 ithout 자극은 배양 30 분 동안 해제됩니다. 자극에 따라,이 수는 5 배까지로 상승. 갓 고립 선포 세포에 비해 배양 O / N이었다 꽈리는 기초 아밀라아제 릴리스 대 자극의 낮은 비율을 표시합니다. 중요한 것은, 아데노 바이러스에 의해 감염된 배양 꽈리은 높은 기저 아밀라아제 분비를 표시하고 감응 분비 (그림 3B, C)를 자극. 그것은 제어 바이러스의 유사한 복용량 제어 선포 세포를 감염하는 것이 중요합니다.
꽈리의 라이브 영상 선방 세포의 기저 및 치근단 도메인의 명확한 식별을 허용해야합니다. 지용성 염료가 좁은 혀끝 도메인과 세포의 기저 외측 측면 및 양태 (도 4)을 구별하는 수단이 될 수있다. 생리적 인 자극에서 분비 선 단면 1,9 독점적 관한 것이다. F-액틴 프로브 Lifeact-GFP의 사용췌장 효소 원의 소포가 직전에 세포 외 유출 (그림 4) 액틴 코팅을 받아야하기 때문에, 분비 소포의 실시간 시각화 할 수 있습니다.
췌장과 인접 장기의 그림 1 현지화. (AC) 복부 피부와 피하 층 (A)의 절개 후 췌장 및 인접 기관 이전과 췌장 주변 장기에서 분리, (B)와 (C) 한 후, 각각. 여기를 클릭하십시오이의 더 큰 버전을 볼 수 이 그림.
췌장 선포 세포의 2 절연 그림. (A) 및 (B)는 췌장 꽈리 적절히 상동증 형태를 표시 격리; 자신의 혀끝의 도메인이 분비 소포의 수백에 의해 둘러싸여 있으며, 색상 (화살표)에서 어두운 표시하는 동안 자신의 기저 도메인은., 라운드 및 기흉없는 상태 표시 (C) 및 췌장 유관 시스템 (D) 세포 파편 및 구성 요소의 검출 할 수 (E). 선포 세포 분리의 초기 단계 (외분비 덕트에 화살표가)에서와 (F) 자신의 소화가 중간에 효소 방전 기저 기흉 (E, 화살표), 그리고 세포의 파손의 생성에 부적절한 분리 결과 ( F, 화살표). 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 
분비 촉진제의 농도에 대하여 플롯 할 때 절연 선포 세포에서 아밀라제 릴리스의 그림 3 측정. 췌장 선포 세포에서 (A) 아밀라아제 자료는 이중 phasic 곡선을 보여줍니다. 꽈리는 고립되었고 콜레시스토키닌 (CCK)의 표시 농도 자극하기 전에 30 분 동안 복구 할 수있었습니다. 결과 갓 절연 꽈리에 비해 배양은 O / N은, 기저 대 아밀라제 방출 자극의 낮은 비율을 표시했다 평균 3 개의 독립적 인 실험의 SEM. (B) 꽈리를 나타낸다. 아데노 바이러스에 의해 감염된 배양 꽈리은 높은 기저 아밀라아제 분비 감응 자극 분비를 표시합니다. (C) 배양 조건이 과도한 디로 이어질 비 산소를아밀라아제 분비의 마스크 자극 효과 scharge.
그림 4 췌장 분비의 라이브 영상입니다. (LA, 그린, 그레이)과 친 유성 염료 FM4-64 (적색)로 염색 Lifeact-GFP를 표현, 선포 세포를 자극 살고있다. Lifeact 프로브의 사용은 액틴 코팅 소포 (화살표)의 하나의 융합 이벤트의 실시간 시각화 할 수 있습니다. 세포, O / N 아데노 바이러스 Lifeact-GFP (광고 Lifeact-GFP)에 감염 염색 및 이미징의 개시 전에 100 오후 CCK와 잠시 자극했다. 스케일 바는 5 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
생체 문화 외에, 외분비 분비의 연구를위한 대안 설정은 췌관에서 유체의 intravital 현미경 및 측정을 포함한다. 의 intravital 현미경은 타액이 10 땀샘 마우스에서 잘 작동 것으로 나타났다. 이 방법은 그대로 동물에서 실시간으로 분비를 기록 할 수 있지만, 그것의 해상도와 외분비 조직을 조작하기위한 수단에 의해 제한된다. 췌관에서 유체를 수집하여 분비를 평가는 마취 된 쥐 11을 달성했다. 췌관의 삽관은 극히 곤란하기 때문에,이 방법은 거의 사용되지 않는다.
이러한 설정에 비해 췌장 선포 세포의 생체 외 배양을, 간단하고 신속 그대로 4,5 조직의 조직을 방해하지 않고, 모니터링 및 세포를 조작하기위한 액세스 수단을 허용한다. 그럼에도 불구하고,이 설정은 단점이 있습니다. 췌장선방 세포는 자연 속에서 섬세하고 배양 조건의 변화에 매우 민감하다. 세포의 단백질 분해 효소로로드되기 때문에, 이들은 용해 및 세포 사멸되기 쉽다. 결과적으로,이 문화를 통해 20 시간 지속하지 않습니다 일반적으로 수명이 짧고.
그것은가 발생할 때이를 식별하고 문제를 해결하는 것이 최선입니다. 중요한 방법 론적 단계는 세포 손상과 사망률의 중요한 징후없이 그대로 췌장 선포 세포를 분리하는 것입니다. 이러한 징후가 명백하고, 기저 기흉 또는 세포 내 공포와 과도한 세포 파편과 꽈리를 포함한다. 아밀라아제 분비 분석에서 세포 손상은 / 비 자극 분비 비율 자극 낮은으로 이어질 것입니다. 이러한 손상을 방지하기 위하여, 부드럽게 조직을 처리 배지에 BSA 및 STI를 추가하고, 산소를 풍부하게하기 위해 추천된다. 예를 들어, 산소없이, 아밀라아제 마스크 분비의 자극 효과를 과도하게 세포 방전 (그림3C). 그러나 때문에 외분비 조직의 취약성에, 일부 조직의 손상이 거의 불가피 - 이러한 준비는 폐기되어야한다.
2 일 - 아밀라아제 분비 분석의 경우, 분비 된 아밀라아제를 포함하지만, 세포에서 무료 상층 액을, 1 사 ° C로 유지 될 수있다. 이 상층 액을 다음 상용 키트에 의해 정량한다. 많은 가능한 키트 인공 아밀라아제 기판의 절단과 발색단의 후속 릴리스에 의존한다. 따라서,보다 높은 농도는 아밀라제 용액의 색 변화로 이어질 빠르게. 아밀라아제 분비 결국 기판으로부터 모든 발색단을 해제하기 때문에, 시간에 걸쳐 반응을 수행하고, 단지 선형 단계에서 수집 된 데이터를 사용하는 것이 필수적이다.
췌장 선포 세포의 라이브 영상은 연구자에 대한 좌절 경험이 될 수 있습니다. 감염된 꽈리 특히 일부 세포 제제는 라이브 적합하지 않을 수 있습니다때문에 꽈리의 손상 형태 또는 형광 센서의 불충분 한 수준으로 영상. 심지어 적절한 준비, 그것은 적절한 표본을 찾을 시간이 걸릴 수 있습니다. 따라서 이미지는 상당한 시간이 필요할 수 있습니다. Lifeact-GFP, F-액틴 프로브는, 주목할만한 12이다. 이 도구는 고정 선포 샘플에 도달 할 수없는 해상도의 수준으로, 감염 후 최대 16 시간 동안 췌장 분비 동안 F-액틴의 역학을 따르도록 우리를 허용했다. 또한, 췌장 발효균 소체로서 단일 세포 외 유출 이벤트 Lifeact 프로브 활성화 트래킹, 사용 직전에 세포 외 유출 3,13 액틴 코팅을 겪는다.
마스터시 통칭, 여기에 설명 된 기술은 연구자가 췌장 분비를 평가하는 수단을 제공하며, 하네스는이 다단계 공정에서 신규 참가자를 식별. 또한, 외분비 췌장 및 다른 기관과의 구조적 및 기능적 유사성의 관점에서,이러한 기술은 다른 외분비 조직뿐만 아니라 3에 적용될 수있다.
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Acknowledgments
이 작품은 BS하기 위해 미국 - 이스라엘 BSF로부터의 보조금에 의해 자금을 지원하고 EDSBS는 분자 유전학의 힐과 세실 루이스 교수의 의자 현직있다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ICR mice | Harlan | Any strain will do | |
| HBSS | Sigma Aldrich | H8264 | Can substitude for KRB |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | Fraction V |
| Trypsin inhibitor | Sigma Aldrich | T9003 | |
| Collagenase XI | Sigma Aldrich | C0130 | |
| Nylon mesh | BD Falcon | 352360 | 70-100µm |
| Amylase infinity reagent | Thermo | TR25421 | |
| CCK | Sigma Aldrich | C2175 | |
| FM4-64 | Lifetechnologies | F34653 | Diluted to 16µM |
| 20mL scintillation vial | Sigma Aldrich | Z190527 | |
| DeltaVision system | Applied Precision | Consisting of an inverted microscope IX71 equipped with 60x/1.4 or 100x/1.3 objectives (Olympus) | |
| Zeiss 510 or 710 confocal microscope | Zeiss | 60x/1.4 or 100x/1.4 objectives | |
| Ultra Microplate reader | BioTek | ELx808 |
References
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