Summary
単離された膵臓腺房はそれらのインビボの形態および活性を保持し、監視し、分泌を操作するための強力な方法を提供します。この作品は、腺房、マウスの膵臓から単離することができ、それらの分泌能力がどのように評価することができる方法を示しています。
Abstract
膵臓腺房細胞が生産し、消化酵素を分泌する。これらの細胞は、関節腔を形成し、株式のクラスタで構成されています。この作品は、これらの細胞の分泌能力が孤立した腺房の文化によって評価することができる方法を示しています。無傷の外分泌膵臓の多くの特性を保持して孤立した腺房は、操作し、全動物におけるよりも容易に監視することができるため、セットアップが有利である。膵臓腺房の適切な分離は、ex vivo培養は腺房のin vivo性質を表現するように、重要な要件です。プロトコルは、マウスの膵臓から無傷の腺房を分離する方法を示します。続いて、膵臓の分泌を評価するための2つの相補的な方法が提示される。膵臓分泌の直接画像化は、サブセルラー解像度で分泌の特徴付けを可能にしながら、アミラーゼ分泌アッセイは、世界的な尺度として役立つ。総称して、技術はPRESENテッドは、ここで外分泌を研究するための実験の広いスペクトルを可能にする。
Introduction
外分泌膵臓は、哺乳動物の膵臓の質量の大部分を構成し、消化酵素1の産生および分泌に捧げられています。外分泌膵臓、腺房の機能ユニットは、関節腔を形成し、株式上皮細胞のクラスタである。ホルモンまたは神経刺激を受けると、酵素で満たされた小胞は、頂端細胞表面に輸送され、それと融合し、内腔1-3にその内容を追放。分泌された酵素は、それらが栄養素に食物の分解を触媒する小腸内へのダクトの合体セットによって排出される。
このビデオでは、全体の膵臓から単離され、それらの分泌能力がどのように評価することができる方法を無傷で腺房を示しています。このセットアップを使用して、膵臓の分泌が刺激後に放出されたアミラーゼの相対量を測定することによって定量される。あるいは、分泌は異なるの使用によって、ライブ画像化することができるセンサーや染料。
無傷の膵臓の多くの特性を保持して孤立した腺房は、操作し、全動物4-6よりも容易に監視することができるので、膵臓腺房のex vivoセットアップが有利で ある。このセットアップは、もともと1970年代後半に開発され、そのような唾液や乳腺3-7のようないくつかの外分泌組織の研究のために拡張されているためであった。注目すべきことに、これらの偏光の上皮の複雑な細胞組織への最小限の干渉分泌の研究を可能にする。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注：動物を対象とする手順は、科学のワイツマン研究所の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されている。
1試料の調製
- 膵臓腺房の単離
- 開始する前に、新鮮なクレブス - リンガー重炭酸HEPES（KRBH）培地の300ミリリットルを用意してください。 140mMのNaCl、4.7のKClを、ミックス1.16のMgCl 2、1mMのCaCl 2、11mMのグルコース、10mMのHEPES。ウシ血清アルブミン（BSA）および0.1 mg / mlのダイズトリプシンインヒビター（STI）（再懸濁媒体）を加える。コラゲナーゼ（〜0.75 mg / ml）を（消化培地）を補充した再懸濁培地10ml - 5を準備します。
- 〜30分間、KRB培地に酸素。泡立ちを防ぐために、酸素化した後、BSAを追加します。 37℃に再懸濁し、消化媒体を持参してください。注：メディアを酸素化すると、細胞の死亡率を減少させ、分泌促進物質に対する応答性を向上させます。酸素化の効果は、少なくとも6時間、明らかである。
NOTE：汚染を避けるために、切開ツールおよび使用前にKRBH培地に使用する水をオートクレーブ。 0.2μmのフィルターを介してKRBH培地をフィルタリングします。膵臓の切除に先立ち、70％エタノールで解剖ツールをすすぎ、クリーンベンチ上で解剖を実施しています。レベル3のバイオ安全キャビネット内のウイルス感染を行ってください。 O / N培養培地に抗生物質を追加します（セクション4を参照してください）。
- 切開広く腹部皮膚と皮下層。肝臓、胃、腸、膵臓および脾臓（ 図1）を特定。注：以下の手順では、静かに膵臓組織を処理し、過度の機械FORCが適用されることを避けるため電子組織および細胞死の自己消化を防止する。
- 2つの平滑鉗子を使用することにより、小腸を引き出します。胃からの出口の近くに、小腸近位端で開始します。腸から膵臓を分離し、体腔内にそれを保持している。一度大腸に到達し、ピンク/ホワイトの結合組織に気づく。膵臓と混同しないようにしてください。
- 脂肪または結合組織を収集せずに、できるだけ多くの膵臓組織をクリアします。 （ 図1A-C）脾臓、胃からそれを取り外し、その下に腹部血管を切断することにより、膵臓を削除します。
注：単一の動物から膵臓腺房の収率が高いので、一方が他方の組織を収集しないようにするために、すべての膵臓組織を収集控えることができる。
- 膵臓の37℃に加熱し、再懸濁培地中で数回すすぎ、非膵臓の残りの部分を削除組織。 20ミリリットルのシンチレーションバイアルに予熱した消化培地の〜5ミリリットル中に膵臓を浸し。 1〜3ミリメートルの部分に膵臓をみじん切りに。 （最適〜100rpmで攪拌下で）加熱された水浴中に置きます。消化を促進するために、消化された組織の上下に一回数分毎にピペット。
NOTE：コラゲナーゼ消化の持続時間は、主にコラゲナーゼ濃度にし、組織に適用される機械力の量に依存する。 30個の細胞 - 10の腺房、その結果、5分 - 約15分間、0.75 mg / mlのコラゲナーゼの使用と2ミリメートルと5ミリリットルポリスチレンピペットを用いて組織をピペットでは、すべての3オリフィス。消化後、懸濁液は、組織の可視部分を含む濁って見える。コラゲナーゼ効率が異なる市販タイプやロット間で変化するので、経験的に消化のタイミングを決定する。 - 洗濯とフィルタリング
- 50ミリリットルチューブに消化された組織を移し、DIGを終了再懸濁培地45mlのを追加することによってestion。新しいチューブに粗い（〜1mm）の金属メッシュを通して懸濁液をろ過。遠心分離し、フロースルー100×gで3分間。
- 上澄みを捨て、再懸濁培地50ml中で消化膵臓を再懸濁した。 70または100μmのナイロンメッシュを通して懸濁液をろ過。前と遠心する。
- 再懸濁培地5ml - 、フローティング、損傷した腺房を削除する上清を破棄し、3に膵臓組織を再懸濁するために。再懸濁培地7mlので満たされた15ミリリットルコニカルチューブに膵臓腺房1mlの部分を適用します。 3分 - 腺房は2のために解決できるようにします。 1ミリリットルピペットでチューブの底に沈殿した腺房を収集し、このステップを繰り返して、2 - 3回。
- 彼らの状態をテストするために、光または解剖顕微鏡下で膵臓腺房を表示します。 図2では、対応時間は限ら細胞に与えた隔離の純度及び損害賠償を観察ngの分離。これらの直後に腺房や文化には、最大20時間使用してください。
2アミラーゼ分泌アッセイ
注：アミラーゼ分泌アッセイは、膵臓腺房の分泌能のグローバル尺度として役立つ。これは、通常、市販のキットを用いて、膵臓腺房をインキュベートしている培地を収集し、培地のアミラーゼ活性を測定することによって達成される。
- （ 例えば非刺激対刺激）検査される実験条件の数を決定します。各条件について少なくとも3回の反復を使用してください。また、全細胞アミラーゼ含量（ '合計'サンプル）と中のアミラーゼ活性のためのセット（「ゼロ」のサンプル）を決定するためにレプリケートのセットを追加。マルチウェルアッセイが実施されたプレート、および複製物のそれぞれについて、マイクロチューブの二組の標識が使用される。
注：12または24ウェルプレートsは、それぞれ、腺房懸濁液の1 0.5mlのを監視するために使用することができる。 - KRBH再懸濁培地30mlで二回腺房を洗浄し、37℃で30分間再懸濁培地中でインキュベートする。マルチウェルプレートに適切な最終濃度に達するように分泌10μlの滴を加える。
- 膵臓腺房は二相性様式で分泌の傾きに反応する。コレシストキニン（CCK）およびカルバコールの1μM（ 図3A）の100pMの5 -最適な分泌値を持つ濃度は50である。
- 洗って再懸濁培地中で腺房を懸濁します。腺房はマルチウェルプレートにと 'total'で標識されたマイクロチューブにサスペンションのサスペンションや分量等量で均一に分布していることを確認します。 37℃で30分間、プレートをインキュベートする。 （好ましくは、穏やかな攪拌（〜50回転）の下で水浴中）。
注：腺房の正確な数はexperimen間で異なる場合がありますtsは、各実験内での複製に類似していなければならない。このように、腺房懸濁液の正確な分注が異なるの反復や条件の間で比較するために重要です。 - インキュベーションの間、「合計」と「ゼロ」のサンプルを生成します。遠心分離機は、「合計」5,000×gで数秒間マイクロチューブとは「zero'で標識されたマイクロチューブに上清から50μlのを削除し、4℃で配置します。溶解は、マイクロチューブにトリトンX-100を添加することにより「合計」サンプル中の腺房は、1％の最終濃度に到達する。精力的にマイクロチューブをボルテックスする。
注：「合計」は実験の反復実験と同様に複製等分。腺房を溶解し、総アミラーゼ含量の放出を導く。あるいは、各反復の細胞含量を決定するために、実験終了時の各条件と溶解で腺房を収集します。 - 腺房サスペンションiの大部分を収集予め標識マイクロチューブの最初のセットNtoの。 5,000×gで数秒間マイクロチューブを遠心。前標識されたマイクロチューブの第二セットに上清を移す。
- 市販のキットでアミラーゼ活性のために上清をアッセイ。分泌されたアミラーゼの割合を計算します。
注：それはその線形範囲でアミラーゼ活性を読むことが重要です。初期全コンテンツから放出されたアミラーゼの割合として分泌アミラーゼの割合を提示。各三連からの培地のバックグラウンドアミラーゼ値を減算し、同様に正規化された初期の含有量の合計で割ります。
膵分泌の3。ライブイメージング
膵臓腺房からの分泌は、ライブイメージングによって直接監視することができます。さまざまな蛍光色素やセンサを使用して、ライブイメージングは、細胞内の解像度で分泌の特徴付けを可能にする。
- iと新鮮に酸素化され再懸濁媒体を準備nは1.1に進み、37ºCに持ってきて。顕微鏡を設定し、温度コントローラーを装備している場合、37ºCにそれを調整します。
- 再懸濁培地30mlに腺房細胞を洗浄し、ガラスまたはプラスチックスライドに配置します。注：親油性色素、親油性色素で標識した原形質膜について標識するために使用される場合、エンドサイトーシスによって内部の膜の標識化を防止するためには5分以上房を染色する。仕事を通して、優しく腺房を処理し、過剰なピペッティングを避ける。
- 一度、その形態は明らかであり、側底ブレブまたは細胞内の液胞を表示腺房の画像化を避けるため、顕微鏡、画像腺房で。賢明な中または直前に撮影の開始にいずれか、灌流チャンバーを使用することにより分泌低下を追加します。
注：高い数値の開口を有する高倍率レンズ（ 例：×63 / 1.4または100 / 1.4×）は、細胞内構造を観察することをお勧めします。
4。膵臓腺房のO / N培養（代替細胞培養技術）
注：O / N培養は、しばしば、アデノウイルス感染のために使用される。検査前16時間-感染は、9、10 6〜10 7 PFU / mlで実施される。
- 最大20時間、培養膵臓腺房。 25ミリリットルの培地（DMEM、単一の膵臓から得られる再懸濁腺房は、ウシ胎児血清（FCS）（5％）、ピルビン酸ナトリウム（1％）、抗生物質（1％）、L-グルタミン（0.5％）、BSAを補充した（10 mg / ml）をとSTI（0.2 mg / ml）を、5 10センチメートルプレートに分けた。レベル3のバイオ安全キャビネット内でウイルスと腺房に感染。
- 5％CO 2の加湿空気中で37°Cでの膵臓腺房インキュベートした。腺房は、その後の検査の3,8の前に30分間酸素化再懸濁培地中で回復することを許可します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
、透過光で見ると適切に分離された膵臓腺房はステレオタイプの形態を表示する。彼らの基底外側ドメインは、ラウンドとブレブの欠い表示されます。頂端ドメインは、分泌小胞の数百人に囲まれており、色（ 図2A、B）中の暗く表示されます。核は水疱性の領域に基礎を置かれている。細胞残屑および膵管系及び腺房の分離（ 図2C、D）の初期段階で検出することができる内分泌膵臓の成分は、最終的な腺房懸濁液から不在であるべきである（ 図2A、B）。不適切な隔離は彼らの消化培地（ 図2E、F）に酵素放電側底ブレブ、セルの破損が発生する恐れがあります。
分泌促進物質の濃度（ 図3A）に対してプロットしたときに、膵臓腺房からのアミラーゼ放出は、二相性曲線を示す。 W刺激ithout初期含有量の約5％が30分間のインキュベーションの間に放出される。刺激の後、この数は5倍までによって上昇する。新たに単離した腺房と比較した場合、培養された、O / Nであった腺房は、基底アミラーゼ放出対刺激されたのより低い比率を表示します。重要なことは、アデノウイルスに感染させ、培養された腺房は高い基礎アミラーゼ分泌を表示し、感作分泌（ 図3B、C）を刺激した。これは、対照ウイルスの同様の用量でコントロール腺房に感染することが重要である。
腺房のライブイメージングは腺房細胞の基底外側および頂端ドメインの明確な識別を可能にするはずである。親油性色素は、狭い頂端ドメインと細胞の側方および側底側面（ 図4）とを区別するための尽力することができます。生理的刺激下では、分泌は、頂端面1,9に排他的に向けられている。 F-アクチンプローブLifeact-GFPの使用膵臓チモーゲン小胞は直前エキソサイトーシス（ 図4）アクチンコーティングを受けることから、分泌小胞のライブ可視化を可能にする。
膵臓および隣接器官の図1の局在。それぞれ（AC）膵臓および隣接臓器腹部の皮膚を切開した後および皮下層（A）、隣接器官からの膵臓の分離前と後、（B）および（C）、。 の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図。
膵臓腺房の2の分離図。 （A）及び（B）膵臓腺房が正しく常形態を示し、単離された;その頂端ドメインは、分泌小胞の数百人に囲まれており、色（矢印）での暗く見える。（C）および膵管系の（D）の細胞片と成分sを検出することができている間に、それらの基底外側ドメインは、ラウンドとブレブの欠い現れる初期の腺房分離の段（外分泌ダクトに矢印点）。（E）と（F）側底小疱（E、矢印）の生成、および細胞の破壊における不適切な単離結果、放電それらの消化酵素媒体への（でF、矢印）。スケールバーは、100μmを表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 
膵臓腺房から単離した腺房からのアミラーゼ放出の図3。測定。（A）アミラーゼ放出分泌の濃度に対してプロットした場合、二相性曲線を示す。腺房を単離し、コレシストキニン（CCK）の示された濃度での刺激の前に30分間回復させ。結果は、新たに単離した腺房と比較した場合、基底アミラーゼ放出対刺激されたのより低い比率を表示し、3つの独立した実験。（B）腺房培養し、O / Nであったの平均値と標準誤差を表す。アデノウイルスに感染させた培養腺房は高い基礎アミラーゼ分泌を表示し、感作分泌を刺激した（C）非酸素供給培養条件は、過度のジにつながるアミラーゼ、分泌のマスク刺激効果のscharge。
図4の膵臓分泌のライブイメージングは。（LA、緑、灰色）および親油性色素FM4-64（赤）で染色Lifeact-GFPを発現する、腺房細胞を刺激したライブ。 Lifeactプローブの使用は、アクチンリン被覆小胞（矢印）の単一の融合イベントのライブの可視化を可能にします。細胞は、O / NアデノウイルスLifeact-GFP（AD-Lifeact-GFP）を感染させ染色し、イメージングの開始前には100pMのCCKと簡単に刺激した。スケールバーは5μmで表しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ex vivoでの文化だけでなく、外分泌の研究のための代替セットアップは膵管からの流体の生体顕微鏡や測定が含まれる。生体顕微鏡は、マウス唾液腺10で良好に動作することが示された。この方法は、無傷の動物において、リアルタイムでの分泌を記録することができますが、その解像度と外分泌組織を操作するための手段によってのみ制限される。膵管から流体を収集することにより分泌を評価するには麻酔したラット11で達成された。膵管のカニューレ挿入が非常に困難であるので、この方法はほとんど使用されない。
これらのセットアップと比較して、膵臓腺房のex vivo文化は急速な、シンプルで、無傷組織4,5の組織化を妨害することなく、細胞をモニターし、操作するためのアクセス可能な手段を可能にする。それにもかかわらず、このセットアップは、その欠点を持っています。膵臓の腺房細胞は、本質的に繊細で、培養条件の変化に非常に敏感である。細胞をタンパク質分解酵素でロードされるので、それらは溶解および細胞死を起こしやすい。結果として、この文化は短命であり、通常20時間にわたって持続しない。
それは、彼らが発生するなどの問題を特定し、トラブルシューティングするために常に最善です。キー方法論的ステップは、細胞の損傷および死亡の重大な兆候なしに無傷の膵臓腺房を単離することである。このような兆候が容易に明らかであり、側底ブレブまたは細胞内の液胞と過剰な細胞の破片や腺房が含まれています。アミラーゼ分泌アッセイでは、細胞の損傷は、低刺激/未刺激分泌率につながる。このような損傷を防止するためには、穏やかに組織を処理培地にBSAおよびSTIを追加し、酸素とそれを豊かにすることが推奨される。例えばアミラーゼマスク、酸素なしで、過剰な細胞放電分泌の刺激効果（ 図3C）。しかし、外分泌組織の脆弱性に起因する、いくつかの組織の損傷はほとんど避けられない - そのような製剤は、廃棄されるべきである。
2日 - アミラーゼ分泌アッセイのために、分泌されたアミラーゼを含むが細胞を含まない上清を、1〜4℃に保つことができる。この上清は、その後市販のキットによりアッセイされるべきである。多くの入手可能なキットは、人工アミラーゼ基質の切断および発色団の今後のリリースに依存している。したがって、より高いアミラーゼ濃度は、溶液の色がより速い変化につながる。分泌されたアミラーゼは、最終的に基板からすべての発色団を放出するので、時間をかけて反応を追跡し、線形位相の間に収集されたデータのみを使用することが不可欠である。
膵臓腺房のライブイメージングは、研究者のためにイライラする経験をすることができます。感染した腺房の特にいくつかの細胞調製物は、生には適していないによる腺房の妥協形態学または蛍光センサの不十分なレベルにイメージング。でも、適切な製剤には、適切な標本を検索する時間がかかる場合があります。このように画像化はかなりの時間が必要な場合があります。 Lifeact-GFP、F-アクチンプローブは、注目すべき12である。このツールは、固定された腺房サンプルで達成することができなかった解像度のレベルで、感染後最大16時間、膵臓分泌の間に、F-アクチンのダイナミクスに従うことができた。膵臓チモーゲン小胞は直前エキソサイトーシス3,13アクチンコーティングを受けるように加えて、Lifeactプローブの使用は、単一のエキソサイトーシス事象の追跡を可能にした。
マスタリング時に一括して、ここに記載される技術は、研究者は、膵臓分泌を評価する手段を提供し、ハーネスによって、この多段階プロセスにおける新規参加者を識別する。さらに、膵臓および他の外分泌器官の間の構造的および機能的な類似性の観点から、これらの技術は、3などの他の外分泌組織に適用することができる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
この作品は、米国·イスラエルのBSFからBSとEDSBSに助成金によって賄われていた分子遺伝学におけるヒルダとセシル·ルイス教授の椅子の責務であると信ずる。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ICR mice | Harlan | Any strain will do | |
| HBSS | Sigma Aldrich | H8264 | Can substitude for KRB |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | Fraction V |
| Trypsin inhibitor | Sigma Aldrich | T9003 | |
| Collagenase XI | Sigma Aldrich | C0130 | |
| Nylon mesh | BD Falcon | 352360 | 70-100µm |
| Amylase infinity reagent | Thermo | TR25421 | |
| CCK | Sigma Aldrich | C2175 | |
| FM4-64 | Lifetechnologies | F34653 | Diluted to 16µM |
| 20mL scintillation vial | Sigma Aldrich | Z190527 | |
| DeltaVision system | Applied Precision | Consisting of an inverted microscope IX71 equipped with 60x/1.4 or 100x/1.3 objectives (Olympus) | |
| Zeiss 510 or 710 confocal microscope | Zeiss | 60x/1.4 or 100x/1.4 objectives | |
| Ultra Microplate reader | BioTek | ELx808 |
References
- Williams, J. A. Regulation of pancreatic acinar cell function. Current Opinion in Gastroenterology. 22, 498-504 (2006).
- Schnekenburger, J., et al. The role of kinesin, dynein and microtubules in pancreatic secretion. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 66, 2525-2537 (2009).
- Geron, E., Schejter, E. D., Shilo, B. Z. Directing exocrine secretory vesicles to the apical membrane by actin cables generated by the formin mDia1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 10652-10657 (2013).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 3028-3032 (1972).
- Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini. The American journal of physiology. 235, 517-524 (1978).
- Jerdeva, G. V., et al. Actin and non-muscle myosin II facilitate apical exocytosis of tear proteins in rabbit lacrimal acinar epithelial cells. Journal of Cell Science. 118, 4797-4812 (2005).
- Menozzi, D., Jensen, R. T., Gardner, J. D. Dispersed pancreatic acinar cells and pancreatic acini. Methods in Enzymology. , 192-271 (1990).
- Bi, Y., Williams, J. A. A role for Rho and Rac in secretagogue-induced amylase release by pancreatic acini. Am J Physiol Cell Physiol. 289, C22-C32 (2005).
- Palade, G.
- Masedunskas, A., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 13552-13557 (2011).
- Petersen, H., Grossman, M. I. Pancreatic exocrine secretion in anesthetized and conscious rats. The American Journal of Physiology. 233, E530-E536 (1977).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5, 605-607 (2008).
- Porat-Shliom, N., Milberg, O., Masedunskas, A., Weigert, R. Multiple roles for the actin cytoskeleton during regulated exocytosis. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 70, 2099-2121 (2013).
