Summary
Isoliert Pankreasazini behalten ihre in-vivo-Morphologie und Aktivität und bieten leistungsfähige Möglichkeiten zur Überwachung und Manipulation Sekretion. Diese Arbeit zeigt, wie Acini von der Bauchspeicheldrüse der Maus isoliert werden, und wie die sekretorischen Fähigkeiten beurteilt werden kann.
Abstract
Azinuszellen des Pankreas produzieren und sezernieren Verdauungsenzyme. Diese Zellen werden als Cluster, die eine gemeinsame Lumen bildet und Aktien organisiert. Diese Arbeit zeigt, wie die sekretorische Fähigkeit dieser Zellen durch Kultur von isolierten Acini bewertet. Das Setup ist vorteilhaft, da isolierte Azini, die viele Eigenschaften des intakten exokrinen Pankreas behalten können manipuliert und leichter überwacht als in der gesamten Tier werden. Die richtige Isolierung von Pankreasazini ist eine wesentliche Voraussetzung, so dass der Ex-vivo-Kultur wird die in-vivo Natur der Acini darstellen. Das Protokoll zeigt, wie intakt Acini von der Maus Bauchspeicheldrüse zu isolieren. Anschließend werden zwei komplementäre Verfahren zur Bewertung Pankreassekretion dargestellt. Die Amylase-Sekretion Assay dient als globales Maß, während die direkte Abbildung von Pankreas-Sekretion ermöglicht die Charakterisierung der Sekretion bei einer subzellulärer Auflösung. Gemeinsam presen die TechnikenTed hier ermöglichen ein breites Spektrum von Experimenten zur exokrinen Sekretion studieren.
Introduction
Exokrinen Pankreas bildet den größten Teil der Masse des Säugerpankreas und arbeitet an der Produktion und Sekretion von Verdauungsenzymen 1. Die Funktionseinheit des exokrinen Pankreas, Azinus, ist ein Cluster von Epithelzellen, die ein gemeinsames Lumen bildet und Anteile. Auf hormonelle oder neuronale Stimulation werden Vesikel mit Enzymen gefüllt, um der apikalen Zelloberfläche transportiert mit ihm, Sicherung und vertreiben ihre Inhalte in das Lumen 1-3. Die sekretierten Enzyme werden dann durch einen Koaleszenz-Satzes von Kanälen in den Dünndarm, wo sie den Abbau von Lebensmitteln in Nährstoffe katalysieren abgelassen.
Dieses Video zeigt, wie intakt Azini werden von der ganzen Bauchspeicheldrüse isoliert und wie ihre sekretorischen Kapazität beurteilt werden kann. Mit diesem Setup wird Pankreas-Sekretion durch Messung der relativen Menge an Amylase, die nach Stimulation veröffentlicht wurde quantifiziert. Alternativ kann die Sekretion Live durch die Verwendung von verschiedenen abzubildendenSensoren und Farbstoffe.
Die Ex-vivo-Setup Pankreasazini ist vorteilhaft, da isolierte Azini, die viele Eigenschaften der intakten Bauchspeicheldrüse behalten, manipuliert und leichter überwacht als in der gesamten Tier 4-6 werden. Dieser Aufbau wurde ursprünglich in den späten 1970er Jahren entwickelt und da bei der Untersuchung der verschiedenen exokrinen Gewebe ausgedehnt wie der Speichel und Brustdrüsen 3-7. Bemerkenswerterweise ermöglicht es die Untersuchung der Sekretion mit minimaler Störung der komplexen Zellverbände dieser polarisierten Epithelien.
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Protocol
HINWEIS: Verfahren mit tierischen Patienten wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) am Weizmann Institute of Science genehmigt worden.
1. Probenvorbereitung
- Isolierung von Pankreasazini
- Bereiten Sie 300 ml frischem Krebs-Ringer-Bicarbonat HEPES (KRBH) Medium vor dem Start. Mischen 140 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,16 mM MgCl 2, 1 mM CaCl 2, 11 mM Glucose, 10 mM HEPES. Hinzufügen Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1 mg / ml Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor (STI) (Resuspensionsmedium). Bereiten 5 - 10 ml Resuspensionsmedium mit Kollagenase (~ 0,75 mg / ml) (Digestionsmedium) ergänzt.
- Oxygenieren die KRB Medium für ~ 30 min. Fügen BSA nach Sauerstoffblasenbildung zu verhindern. Bringen Aufwirbelung und Verdauung Medien bis 37 ° C. HINWEIS: Sauerstoffanreicherung des Mediums reduziert Zellmortalität und verbessert Reaktionsfähigkeit auf die Sekretion. Die Wirkung der Oxygenierung mindestens 6 h deutlich.
HINWEIS: Um Verunreinigungen zu vermeiden, Autoklaven werden die Dissektion Werkzeuge und die für KRBH Medium vor Gebrauch verwendete Wasser. Filtern KRBH Medium durch ein 0,2 um-Filter. Vor der Entfernung der Bauchspeicheldrüse die Dissektion Werkzeuge mit 70% Ethanol spülen und durchzuführen Dissektion auf eine saubere Bank. Durchführung von Virusinfektionen in einem Level 3 Bio-Sicherheitsschrank. Fügen Antibiotika auf den O / N Kulturmedium (siehe Abschnitt 4).
- Schnitt weit die Bauchhaut und Unterhaut. Identifizieren Sie die Leber, Magen, Darm, Bauchspeicheldrüse und Milz (Abbildung 1). HINWEIS: In den folgenden Schritten, behandeln die Pankreasgewebe vorsichtig und vermeiden Sie übermäßigen mechanischen force auto-Verdauung des Gewebes und Zelltod verhindert.
- Durch die Verwendung von zwei stumpfen Pinzette, ziehen Sie den Dünndarm. Beginnen an den Dünndarm proximalen Ende, nahe dem Ausgang aus dem Magen. Trenne die Bauchspeicheldrüse aus dem Darm und bewahren Sie sie in der Körperhöhle. Nach Erreichen des Dickdarms, bemerken eine rosa / weiß Bindegewebe. Nicht zu verwechseln mit der Bauchspeicheldrüse.
- Zu löschen, so viel Pankreasgewebe wie möglich, ohne das Sammeln Fett oder Bindegewebe. Entfernen Sie die Bauchspeicheldrüse durch Lösen aus der Milz und Magen und Schneiden der Bauchblutgefäße darunter (Abbildung 1A-C).
HINWEIS: Da die Ausbeute an Pankreasazini von einem einzigen Tier hoch ist, kann man von Sammeln aller Pankreasgewebe um das Sammeln anderer Gewebe zu verhindern, zu unterlassen.
- Spülen Sie die Bauchspeicheldrüse ein paar Mal in Resuspensionsmedium auf 37 ° C erhitzt und entfernen übrigen Teile des nicht-Pankreas-Gewebe. Tauchen Sie in die Bauchspeicheldrüse ~ 5 ml vorgewärmten Verdauung Medium in einem 20 ml Szintillationsfläschchen. Hackfleisch in der Bauchspeicheldrüse an Stücke von 1-3 mm. Legen Sie sie in einem beheizten Wasserbad (optimal unter Rühren von ~ 100 rpm). , Um die Verdauung zu beschleunigen, Pipette der verdauten Gewebe auf und ab, wenn alle paar Minuten.
HINWEIS: Die Dauer Collagenaseverdau hängt hauptsächlich von der Kollagenase-Konzentration und der Menge der mechanischen Kraft auf das Gewebe aufgebracht. Verwendung von 0,75 mg / ml Collagenase für ungefähr 15 min und Pipettieren der Gewebe mit einer 5 ml Polystyrolpipette mit einer 2 mm Düse alle 3 - 5 Minuten, was zu Acini 10-30 Zellen. Nach der Verdauung, wird die Suspension trübe, die sichtbare Gewebestücke. Seit Collagenasen Effizienz variiert zwischen verschiedenen Handelstypen und viele, bestimmen den Zeitpunkt der Verdauung empirisch. - Waschen und Filtrieren
- Übertragen Sie das verdaut Gewebe in einem 50-ml-Tube und beenden digestion durch Zugabe von 45 ml Medium resuspendiert. Filtern der Suspension durch ein grobes (~ 1 mm) Metallnetz in ein frisches Röhrchen. Zentrifugieren des Durchflusses bei 100 × g für 3 min.
- Überstand verwerfen und suspendiert die Bauchspeicheldrüse verdaut in 50 ml Resuspensionsmedium. Filtern der Suspension durch ein 70 oder 100 um Nylonnetz. Zentrifuge vor.
- Um schwimmende, beschädigte Acini zu entfernen, den Überstand verwerfen und resuspendieren Pankreasgewebe in 3-5 ml Resuspensionsmedium. Es wird 1 ml der Pankreas-Acini in 15 ml konischen Röhrchen mit 7 ml Resuspensionsmedium gefüllt. Lassen Sie die Acini für 2 beigelegt - 3 min. Sammeln Sie die Acini, die am Boden der Röhre mit einer 1 ml Pipette angesiedelt haben, und wiederholen Sie diesen Schritt 2 - 3 mal.
- Sehen Sie sich die Pankreasazini unter einem Lichtmikroskop oder sezieren, um ihren Zustand zu prüfen. In Abbildung 2, beobachten die Reinheit der Isolation und der Schäden auf die Zellen Duri zugefügtng Isolation. Verwenden Sie diese Acini sofort oder Kultur für bis zu 20 Stunden.
2. Amylase Sekretion Assay
HINWEIS: Die Amylase-Sekretion Assay dient als globales Maß für die sekretorische Kapazität von Pankreasazini. Dies wird durch Sammeln des Mediums, in dem das Pankreas-Acini wurden inkubiert, und die Bestimmung der Amylaseaktivität des Mediums, in der Regel unter Verwendung eines kommerziellen Kits erreicht.
- Bestimmen der Anzahl von experimentellen Bedingungen untersucht werden (zB nicht-stimulierten versus stimuliert). Verwenden Sie mindestens drei Wiederholungen für jede Bedingung. Außerdem fügen Sie eine Reihe von Wiederholungen, um die Gesamtzell Amylase-Gehalt ('Total' Probe) und einen Satz für die Amylase-Aktivität des Mediums ("Null"-Probe) zu bestimmen. Label eine Multi-Well-Platte, in der der Assay durchgeführt werden, und zwei Sätze von Mikroröhrchen für jede der Wiederholungen verwendet werden.
HINWEIS: 12 oder 24-Well-Plattes kann zur Überwachung 1 und 0,5 ml acinar Suspensionen, bzw. werden. - Zweimal waschen Sie die Acini in 30 ml KRBH Resuspensionsmedium und Inkubation sie in Resuspensionsmedium für 30 min bei 37 ° C. Um die Multi-Well-Platte fügen Sie ein 10 ul Tropfen secretagogue die angemessene endgültige Konzentration zu erreichen.
- Pankreasazini reagieren auf eine Steigung von secretagogue in einem zweiphasigen Weise. Die Konzentrationen optimale Sekretion Werte von 50 bis 100 pM von Cholecystokinin (CCK) und 1 uM Carbachol (3A) 5.
- Waschen und resuspendieren Acini in Resuspensionsmedium. Stellen Sie sicher, dass die Acini sind homogen in der Suspension und aliquoten gleiche Mengen von Suspension in die Multi-Well-Platte und in die 'total'-markierten Mikroröhrchen verteilt. Inkubiere die Platte für 30 min bei 37 ° C aufweist. (Vorzugsweise in einem Wasserbad unter leichtem Schütteln (~ 50 min)).
HINWEIS: Die genaue Zahl der Acini zwischen experimen variierents sollte aber ähnlich in Wiederholungen innerhalb der einzelnen Experiment. So ist präzise Aliquotierung der Acini Suspension entscheidend für den Vergleich zwischen den verschiedenen Wiederholungen und Bedingungen. - Während der Inkubation produzieren die "Gesamt" und "Null"-Proben. Zentrifugieren Sie die "Gesamt" Mikroröhrchen für ein paar Sekunden bei 5.000 × g und entfernen 50 ul aus dem Überstand in 'zero'-markierten Mikroröhrchen und legen Sie sie bei 4 ° C. Lyse der Acini in den "Gesamt"-Proben durch Zugabe von Triton X-100 zu den Mikroröhrchen, um eine endgültige Konzentration von 1% zu erreichen. Mischen Sie den Mikroröhrchen kräftig.
HINWEIS: Aliquote "Insgesamt" repliziert ähnlich wie bei den Wiederholungen des Experiments. Lyse der Azini, führt zur Freisetzung des gesamten Amylase-Gehalt. Alternativ erfassen die Acini zu jedem Zustand und Lyse am Ende des Experiments, um den zellulären Gehalt an jede Wiederholung zu bestimmen. - Sammeln Sie die meisten der acinar Suspension inin der ersten Reihe von den pre-markierten Mikroröhrchen. Zentrifugieren der Mikroröhren für einige Sekunden bei 5000 × g auf. Den Überstand in den zweiten Satz der vorge markierten Mikroröhrchen.
- Assay des Überstands für die Amylase-Aktivität mit einem handelsüblichen Kit. Berechnen Sie den Prozentsatz der Amylase sezerniert.
Hinweis: Es ist entscheidend, die Amylase-Aktivität in seinem linearen Bereich zu lesen. Präsentieren der Prozentsatz der Amylase als Prozentsatz der Amylase von der anfänglichen Gesamtgehalt freigesetzt sezerniert. Subtrahieren Sie die Hintergrundebene Amylase des Mediums aus jeder dreifacher Ausfertigung und teilen sie durch die ebenfalls normierten Anfangsgesamtgehalt.
3. Live-Imaging von Pankreas-Sekretion
Sekretion aus Pankreasazini kann direkt durch Live-Bildgebung überwacht werden. Mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen und Sensoren ermöglicht die Live-Darstellung die Charakterisierung der Sekretion bei einer subzellulärer Auflösung.
- Frisch herstellen Sauerstoff angereichert Resuspensionsmedium wie ichSchritt n 1.1 und bringen es auf 37 ° C. Stellen Sie das Mikroskop, und wenn mit einem Temperaturregler ausgestattet, passen sie auf 37 ° C.
- Waschen Sie die Azinuszellen in 30 ml Resuspensionsmedium und legen Sie sie in einem Glas oder Kunststoffrutsche. Hinweis: Wenn lipophile Farbstoffe verwendet werden, um Label für Plasmamembran mit lipophilen Farbstoffen markiert, färben die Acini für nicht mehr als 5 min auf die Kennzeichnung von internen Membranen, die durch Endozytose zu verhindern. Während der Arbeit, übernehmen die Acini vorsichtig und vermeiden Pipettieren.
- Einmal am Mikroskop ist die Bild Acini, deren Morphologie klar, und Bildgebung von Acini die basolaterale Bläschen oder intrazelluläre Vakuolen Display zu vermeiden. Hinzufügen Sekretagogum tropfenweise oder mit Hilfe einer Perfusionskammer, entweder während oder unmittelbar vor dem Beginn der Bilderzeugung.
Hinweis: Ein hoher Vergrößerung Objektive mit hoher numerischer Aperturen (zB × 63 / 1,4 × 100 oder / 1.4) wird empfohlen, subzellulärer Strukturen zu beobachten.
4. O / N Kultur Pankreasazini (Alternate Zellkulturtechnik)
HINWEIS: O / N Kultivierung wird oft für Adeno-Virus-Infektion eingesetzt. 16 h vor der Untersuchung - Infektion wird bei 10 6 bis 10 7 pfu / ml für 9 durchgeführt.
- Kultur Pankreasazini für bis zu 20 Stunden. Aus einer einzigen Pankreas in 25 ml Kulturmedium (DMEM resuspendiert erhalten Acini mit fötalem Kälberserum (FCS) (5%), Natrium-Pyruvat (1%), Antibiotika (1%), L-Glutamin (0,5%), BSA ergänzt (10 mg / ml) und STI-(0,2 mg / ml), und geteilt zu fünf 10cm-Platten. infizieren die Acini mit Virus in einer Ebene 3 Bio-Sicherheitsschrank.
- Inkubiert Pankreasazini bei 37 ° C in einer 5% CO 2 befeuchtete Luft. Ermöglichen Acini in sauerstoffhaltigen Resuspensionsmedium 30 min zu erholen, bevor nachfolgende Untersuchung 3,8.
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Representative Results
Pankreasazini, die ordnungsgemäß isoliert wurden zeigen eine stereotypische Morphologie bei Durchlicht betrachtet. Ihre basolateralen Domänen sollten rund und frei von Blasen erscheinen. Die apikale Domäne wird von Hunderten von sekretorischen Vesikeln umgeben und erscheint dunkler in der Farbe (Abbildung 2a, b). Die Kerne sind basal an die Bläschenbereich. Zelltrümmer und Komponenten des Pankreasgangsystems und des endokrinen Pankreas, die in frühen Stadien der Acini Isolation (2C, D) festgestellt werden kann, sollte außerhalb des endgültigen Azinuszellen Suspension (2A, B). Unsachgemäße Isolierung kann bei der Erzeugung von basolateralen Bläschen und Bruch von Zellen, die Entladung ihr Verdauungsenzymen in das Medium (2E, F) führen.
Amylase-Freisetzung aus Pankreasazini zeigt eine zweiphasige Kurve, wenn gegen die Konzentration der Sekretagogen (3A) aufgetragen. Whne Stimulation über 5% des Anfangsgehalts wird während 30 min Inkubation freigesetzt. Nach Stimulation wird diese Zahl bis zu 5-fache erhöht. Acini, die kultiviert O / N waren, zeigen ein niedrigeres Verhältnis der stimulierten gegen basale Amylasefreisetzung im Vergleich zu frisch isolierten Acini. Wichtig ist, kultiviert, die Acini durch Adeno-Viren infiziert waren, zeigen eine hohe basale Amylase-Sekretion und ein sensibilisiertes stimulierte Sekretion (3B, C). Es ist daher entscheidend, um die Kontrolle Acini mit einer ähnlichen Dosis von Kontrollvirus zu infizieren.
Live-Darstellung von Acini sollten klare Identifizierung der basolateralen und apikalen Domänen von Azinuszellen ermöglichen. Lipophile Farbstoffe Instrumental zur Unterscheidung zwischen dem schmalen Bereich und der apikalen und basolateralen lateralen Aspekte der Zellen (Abbildung 4). Unter physiologischen Stimulation wird die Sekretion ausschließlich auf der apikalen Oberfläche 1,9 gerichtet. Verwendung des F-Actin-Sonde LifeAct-GFPErmöglicht Live Visualisierung von sekretorischen Vesikeln, da Pankreas Zymogen Vesikel Aktin Beschichtung unterzogen werden kurz vor der Exozytose (Abbildung 4).
Abbildung 1. Lokalisation der Bauchspeicheldrüse und benachbarten Organen. (AC) Die Bauchspeicheldrüse und benachbarte Organe nach dem Einschnitt der Bauchhaut und der Unterschicht (A), vor und nach der Trennung von Pankreasnachbarorgane, (B) und (C) sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen diese Zahl.
Abbildung 2. Isolierung von Pankreasazini. (A) und (B) Pankreasazini isoliert richtig ein stereotypes Morphologie anzuzeigen; ihre basolateralen Domains rund und frei von Blasen erscheinen, während ihre apikale Domäne von Hunderten von sekretorischen Vesikeln umgeben und erscheint dunkler in der Farbe (Pfeil). (C) und (D) Zelltrümmer und Komponenten s des Pankreasgangsystem nachgewiesen werden können in frühen Stadien der Acini Isolierung (Pfeil zeigt auf eine exokrine Kanal). (E) und (F) Falsche Isolation führt zur Erzeugung von Bläschen basolateralen (E, Pfeil), und ein Bruch von Zellen, die ihre Entladung Verdauungsenzyme in dem Medium ( F, Pfeil). Maßstabsbalken repräsentieren 100 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 
Abbildung 3. Messung der Amylase-Freisetzung aus isolierten Acini. (A) Amylase-Freisetzung aus Pankreasazini zeigt eine zweiphasige Kurve, wenn gegen die Konzentration eines secretagogue aufgetragen. Acini wurden isoliert und für 30 min vor Stimulation mit den angegebenen Konzentrationen von Cholecystokinin (CCK) wiederherzustellen. Die Ergebnisse stellen den Mittelwert und SEM von drei unabhängigen Experimenten. (B), die Acini kultiviert O / N, zeigen ein geringeres Verhältnis der stimulierten gegen basale Amylasefreisetzung im Vergleich zu frisch isolierten Acini waren. Kultiviert Acini, die durch Adeno-Viren infiziert waren, zeigen eine hohe basale Amylase-Sekretion und eine sensibilisierte stimuliert Sekretion. (C) Nicht-Sauerstoffanreicherung Kulturbedingungen, um übermäßige di führenscharge von Amylase, die Masken der stimulierende Effekt der secretagogue.
Abbildung 4. Live-Bildgebung des Pankreas-Sekretion. Live-stimulierten Azinuszellen, ausdrücken LifeAct-GFP (LA, grün, grau) und mit dem lipophilen Farbstoff FM4-64 (rot) gefärbt. Verwendung der Sonde ermöglicht LifeAct Live-Visualisierung der einzelnen Fusionsereignisse von Aktin-Vesikel (Pfeile). Die Zellen wurden O / N mit Adenovirus-LifeAct-GFP (Ad-LifeAct-GFP) infiziert, gebeizt und stimuliert kurz mit 100 pM CCK vor Beginn der Bildgebung. Maßstab repräsentiert 5 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Neben der Ex-vivo-Kultur, alternative Setups für das Studium der exokrinen Sekretion gehören Intravitalmikroskopie und die Messung von Flüssigkeiten aus dem Pankreasgang. Intravitalmikroskopie wurde gezeigt, dass in der Maus Speicheldrüsen 10 gut bedienen. Dieses Verfahren kann die Sekretion in Echtzeit in dem intakten Tier aufnehmen, wird aber in der Auflösung und durch die Einrichtung zum Manipulieren des exokrinen Gewebe beschränkt. Beurteilung Sekretion durch Sammeln von Flüssigkeiten aus dem Pankreasgang wurde an narkotisierten Ratten 11 erreicht. Da Kanülierung des Pankreasganges ist extrem schwierig, dieses Verfahren wird selten verwendet.
Verglichen mit diesen Einstellungen ist der Ex-vivo-Kultur von Pankreasazini einfache, schnelle und ermöglicht zugängliche Mittel zur Überwachung und Manipulation der Zellen, ohne sich mit der Organisation des intakten Gewebes 4,5. Dennoch hat dieses Setup seine Mängel. Bauchspeicheldrüsen-Azinuszellen sind zart in der Natur und sehr empfindlich auf Veränderungen der Kulturbedingungen. Da die Zellen mit proteolytischen Enzymen beladen, sie sind anfällig für die Lyse und Zelltod. Infolgedessen ist diese Kultur von kurzer Dauer und in der Regel nicht mehr als 20 Stunden dauern.
Es ist immer gut zu erkennen und Probleme zu beheben, wie sie entstehen. Die wichtigsten methodischen Schritt ist intakt Pankreasazini ohne signifikante Anzeichen von Zellschäden und Mortalität zu isolieren. Solche Zeichen sind leicht erkennbar und umfassen übermäßigen Zelltrümmer und Acini mit basolateralen Bläschen oder intrazelluläre Vakuolen. In der Amylase-Sekretion Assay wird Zellschäden auf einen niedrigen angeregt / nicht-stimulierten Sekretion Verhältnis führen. Um solche Schäden zu vermeiden, ist es empfehlenswert, um das Gewebe schonend zu behandeln, fügen BSA und STI auf das Medium, und es mit Sauerstoff anzureichern. Beispielsweise und ohne Sauerstoffzufuhr, übermäßiger Entladung der Zelle von Amylase Masken die stimulierende Wirkung des Sekretagogum (Abbildung3C). Doch wegen der Zerbrechlichkeit der exokrinen Gewebe, einige Gewebeschaden fast unvermeidlich - solche Präparate sollte verworfen werden.
2 Tage - für die Amylase-Sekretion-Assay, der Überstand, der die sekretierten Amylase enthält, aber frei ist von Zellen, bei 4 ° C für 1 gehalten werden. Dieser Überstand ist dann mit einem kommerziellen Kit getestet werden. Vielen verfügbaren Kits basieren auf einer Spaltung einer künstlichen Amylase Substrat und die anschließende Freisetzung eines Chromophors. So, höhere Konzentrationen führen Amylase zu einer schnelleren Änderung in der Farbe der Lösung. Da das sekretierte Amylase wird letztendlich alle Chromophor von dem Substrat, ist es wesentlich, die Reaktion über die Zeit verfolgen, und nur die während der linearen Phase gesammelten Daten.
Live-Darstellung von Pankreasazini kann eine frustrierende Erfahrung für den Forscher sein. Einige Zellpräparate, vor allem die von infizierten Acini, möglicherweise nicht geeignet für Live seinBildgebung aufgrund beeinträchtigt Morphologie der Acini oder unzureichende Höhe der Fluoreszenzsensoren. Auch in geeigneten Zubereitungen kann es einige Zeit dauern, geeignete Proben zu finden. So Bildgebung erhebliche Zeit in Anspruch. LifeAct-GFP, ein F-Actin-Sonde, ist bemerkenswert, 12. Dieses Tool erlaubt es uns, die Dynamik des F-Aktin während Pankreas-Sekretion für bis zu 16 Stunden nach der Infektion zu folgen, auf einem Niveau von Auflösung, die nicht in festen acinar Proben erreicht werden konnte. Zusätzlich Einsatz der Sonde aktiviert LifeAct Verfolgung von Einzel Exozytose Ereignisse, wie Bauchspeicheldrüsen Zymogen Vesikel Aktin-Beschichtung unterziehen kurz vor Exozytose 3,13.
Kollektiv, wenn gemeistert, die hier beschriebenen Techniken bieten die Forscher bedeutet, Pankreas-Sekretion zu bewerten und durch Baum sie neue Teilnehmer in diesem mehrstufigen Prozess zu identifizieren. Zusätzlich im Hinblick auf die strukturellen und funktionellen Ähnlichkeiten zwischen den Pankreas und anderen Organen exokrinen,Diese Techniken können auch auf andere exokrinen Gewebe und 3 angewendet werden.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der US-Israel-BSF finanziert, um BS und EDSBS ist ein Inhaber des Hilda und Cecil Lewis Professur in Molekulargenetik.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ICR mice | Harlan | Any strain will do | |
| HBSS | Sigma Aldrich | H8264 | Can substitude for KRB |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | Fraction V |
| Trypsin inhibitor | Sigma Aldrich | T9003 | |
| Collagenase XI | Sigma Aldrich | C0130 | |
| Nylon mesh | BD Falcon | 352360 | 70-100µm |
| Amylase infinity reagent | Thermo | TR25421 | |
| CCK | Sigma Aldrich | C2175 | |
| FM4-64 | Lifetechnologies | F34653 | Diluted to 16µM |
| 20mL scintillation vial | Sigma Aldrich | Z190527 | |
| DeltaVision system | Applied Precision | Consisting of an inverted microscope IX71 equipped with 60x/1.4 or 100x/1.3 objectives (Olympus) | |
| Zeiss 510 or 710 confocal microscope | Zeiss | 60x/1.4 or 100x/1.4 objectives | |
| Ultra Microplate reader | BioTek | ELx808 |
References
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