Summary
Testis fare hücreleri için bir transfeksiyon tekniği Spermatogenezisin benzersiz süreçleri incelemek için bu makalede, in vivo mikroenjeksiyon ve fare testis Elektroporasvon açıklar. Sunulan protokol, elektroporasyon ile cam kılcal hazırlanması götürücü kanalı yoluyla mikro-enjeksiyon, ve transfeksiyon adımlar içerir.
Abstract
Bu video ve makale katkı mikroenjeksiyon ve in vivo fare testis elektroporasyon kapsamlı bir açıklamasını verir. Testis fare hücreleri için bu özel teknik transfeksiyon spermatogenez benzersiz süreçlerin çalışma sağlar.
Aşağıdaki protokol, plazmid yapıları ile fare testis hücrelerin transfeksiyonu odaklanmaktadır. Özellikle, kırmızı flöresanlı proteinin (DsRed2) ifade yeşil flüoresan protein (EGFP) ve ayrıca pDsRed2-N1 vektör geliştirilmiş ifade eden raportör vektör pEGFP-C1, ikinci. Her iki raportör genler kodlanan insan sitomegalovirüs hemen erken promoteri (CMV) kontrolü altındaydı.
Fare testislerinde gen transferini gerçekleştirmek için, raportör plasmid yapıları, canlı farelerde testis enjekte edilir. Bu amaçla, bir hayvan anestetize testis maruz kalmakta ve mikroenjeksiyon site hazırlanır. Bizim tercih yerienjeksiyon testis ve epididim arasında spermlerin anatomik taşıma rotası olarak sonuçta bağlı rete testis ile, efferent kanal olduğunu. Bu şekilde, mikro enjeksiyon sonrası seminifer tüp doldurma sayesinde mükemmel lekeli DNA çözeltilerinin kullanılması ile idare ve kontrol edilir. Onun renkli tübül yapısı ile testisin yeterli dolgu gözlemledikten sonra, organ elektropore edilmiştir. Bu testis hücrelere DNA solüsyonu aktarılmasını sağlar. Inkübasyon 3 gün sonra, testis çıkarılır ve transfeksiyon başarı gösteren, yeşil ve kırmızı floresans mikroskobu altında incelendi.
Genellikle, bu protokol DNA- ya RNA- teslim için kullanılabilir için canlı fare testisi içine inşa (over) ifade veya in vivo gen fonksiyon analizinde kolaylaştırılması, genleri yıkmak. Ayrıca, raportör gen ya da putatif düzenlenmesinden çalışmak için uygundurTory elemanları. Böylece, elektroporasyon tekniğinin ana avantajları, alternatif tekniklerle karşılaştırıldığında Gerekli düşük çaba yanı sıra ılımlı teknik ekipman ve becerileri ile birlikte hızlı performans vardır.
Introduction
Memeli spermatogenez olgun haploid sperm içine geliştirmek amacıyla art arda mitoz, mayoz ve farklılaşma geçiren kendini yenileyen kök hücrelerin karmaşık bir süreç olarak kabul edilir. Bu morfolojik değişiklikler, farklı hücre tipleri tarafından orkestra ve derin girişimlerine rağmen, hücre kültürü 1,2 bu süreçleri taklit hala imkansız. Dolayısıyla, bugüne kadar spermatogenez üzerine araştırmalar in vivo model olarak yaşayan organizmalar dayanır. Genel olarak, gen fonksiyonu çalışmalar, genellikle transgenik hayvanlarda dayanmaktadır. Bununla birlikte, üretme ve hayvan modellerinde bu tür sürdürülmesi zaman alıcı ve maliyet-yoğun ve oldukça karmaşıktır. Bu üreten ve nesiller boyunca transgen korumak için gerekli uzun yetiştirme süreci atfedilir. Buna ek olarak, transgenik ya da nakavt yaklaşım bütün organizmanın genetik manipülasyon g hedeflerken fizyolojik bozulmalara neden eğilimliÖrneğin birden fazla bölgelerde, temel işlevleri, testis dışında veya sistemik ile enes.
Bundan başka, bazı geçiş transfeksiyon yöntemleri bazı önemli dezavantajlar ile ilişkilidir. Lipofeksiyon 3 ve mikro-parçacık bombardımanı 4 dokuya zarar verebilir ve yeterli transfeksiyon verimi açısından belirli bir hücre derinliği ile sınırlıdır, oysa Örneğin, virüs aracılı gen transferi tipik dezavantajları, immün reaksiyonlar ve ilave güvenlik düzenlemelerinin olası provokasyon bulunmaktadır.
Buna karşılık, geçici nakiller başka bir ortak yolu olarak elektroporasyon (AP), in vivo nakil ve tutarlı in vivo gen analizi etkinleştirmek için umut verici bir teknik teşkil görünüyor. Genel olarak, AP nanosaniye olan sonuç olarak aracılı gözenek ile yerel zar gerilimine bağlı olarak dinamik bir olgu olarak adlandırılır. Bu boşluklar milisaniye boyunca muhafaza edilebilir, yeterli To DNA, RNA veya küçük moleküllerin 5 erişim izni. Uygulanan gerilim çok yüksek olduğunda, EP genellikle geçici karakteri nedeniyle ısı üretimi ve hücre 5 sonuçta geri dönüşümsüz hasar ile çok kapsamlı geçirgenleştirmeden indüksiyonu ile karşılaşmaktadır.
Burada, elektroporasyon in vivo gen testis özelliklerinin ortaya konması için genetik dönüşümü için uygulanan testis olma yeteneğine sahip bir etkin ve ekonomik bir transfeksiyon sistemi olduğunu göstermektedir. Bu makalede, götürücü kanal ve fare testis sonra elektroporasyon ile bir plazmid hazırlama işlemi, mikro-enjeksiyon giderir. Bu prosedür, spermatogenez işlemlerini incelemek için in vivo fare testis seminifer tüp hızlı, spesifik ve verimli transfeksiyona elde etmek için tercih edilen bir araç olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yapılan hayvan deneyleri yerel etik kurul (Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei, Mecklenburg-Vorpommern, Almanya) tarafından onaylanmıştır.
1. Plazmid Preparasyon
- Plazmid hazırlanması için, plazmid arıtma kitleri (Malzemeler tabloya bakınız) ya da hayvanın bağışıklık reaksiyonları önlenebilir ve böylece endotoksin çıkartma tampon maddesi ile benzer bir yöntem kullanınız. Kılavuzun yönergeleri izleyin. Plasmid dilüsyon için GKD 2 O kullanır.
- Maksimum hızda (20.000 xg) DNA çözüm iplik artıkları ortadan kaldırın. Daha sonra süpernatan toplamak.
- Bir spektrofotometre (materyalleri görmek) ile plazmid konsantrasyonunu belirleyin.
- 1-3 mikrogram (DNA) / ul GKD 2 O ile plazmid konsantrasyon ayarlayın. Not: Daha yüksek konsantrasyonlar çok viskoz enjeksiyon çözüm neden olabilir iken düşük konsantrasyonlar, transfeksiyon etkinliğini azaltacaktır. Bunun yanı sıra,transfeksiyon verimi plazmidin büyüklüğüne bağlıdır ve ayrı ayrı test edilmesi gerekir.
- Enjeksiyondan önce, bir çözelti, karışımı hazırlamak 5 ul PBS (10x) ve 5 ul Fast Green (% 0.5) ile birlikte, örneğin 40 ul plasmid için. Hızlı Yeşil enjeksiyon işlemi takip için gereklidir. Tercihen, ince duvarlı PCR-tüpleri veya Parafilm kullanın. Not: Testis büyüklüğüne bağlı olarak, 20-50 ul'lik bir hacim testisler için gerekli olacaktır.
Mikroenjeksiyon Pipet 2. hazırlanması
- Mikroenjeksiyon pipetler hazırlanması için borosilikat kılcal damarları (Malzemeler tabloya bakınız) kullanın.
- Dikey kılcal çektirmesi ile cam kılcal damarları çekin (Malzemeler tabloya bakınız).
- Usulca bantlama forseps ile kılcal ucunu kırmak. Ucu genellikle 50-80 mm çapında ve yaklaşık 1 cm uzunluğundadır. Bu dokuya nüfuz kadar sert değildir gibi çok uzun ipuçlarını kaçının.
- Son, sha atBir mikropipet beveler (Malzemeler tabloya bakınız) kullanılarak 45 ° açı 30 derece ucu rpen.
- Enjeksiyon solüsyon karışımı ile mikroenjeksiyon pipet yükleyin (plazmid Hazırlama bakınız). Küçük bir şırınga ile cam kılcal arkasına çözümü uygulayın. Not: iletkenliği azaltmak hem de muhtemelen doku hasarına neden olur böylece, aksi takdirde, bu çözelti ile birlikte plazmid seminifer tüp içine enjekte edilecektir, yükleme sırasında, hava kabarcıklarını önlemek için deneyin.
3. Anestezi ve Cerrahi
- Steril (yani, şırınga, iğne, cerrahi aletler, vb) malzeme kullanılarak aseptik koşullarda işlemi gerçekleştirin. Bu hayvanın enfeksiyonu azaltmak ve iyi sağkalım oranları sağlayacaktır.
- 6-8 haftalık bir yaşta elektroporasyon için erkek fareler kullanın.
- Cerrahi sonrası analjezik tedavi başlatmak için, analjezikler ile fare ameliyattan önce günde içme suyu eklendi sağlar. Bu götkuvvetle muhtemel cerrahi sonrası hypodipsia (azaltılmış su emme) durumunda önleyici bir analjezi etmiş olur. Bu amaçla, örneğin, bir çocuk, ibuprofen süspansiyonu (20 mg / ml) ile içme suyu maruz kalmaktadır. İlaçlı içme suyu da günde bir ve aynı konsantrasyonda iyileşme iki temin edilmelidir. Bu C57BL / 6J yaş 8 hafta boyunca 25 g, 5 ml / g içme suyu ve vücut ağırlığı için geçerli bir 7.5 mg / kg arasında günlük bir doz anlamına gelir. Bu analjezik rejimi temel bir ağrı ve yüksek refah 26 ile birlikte hızlandırılmış kurtarma garanti.
- (Malzemeler tabloya bakınız): 1 oranında cerrahi gününde çalışma çözeltisi anestezi hazırlanması için, 1% 10 Ketamin ve% 2 ksilazin karıştırın.
- Anestezi sıvısı deri altından 0.25 ml 100 mg / vücut ağırlığı tatbik ediniz, hayvan anestetize için (Ketamin = 0.125 g / kg, ksilazin = 0.025 g / kg). Farelerin organ hasarı ve yaralanmaları önlemek için pelvik ve ekstremite arasında bir enjeksiyon sitesini kullanın. Genellikle, 10 dakika ihtiyaç vardırkadar fare derin anestezi.
- Anestezi sırasında kuruluğunu önlemek için veteriner merhem ile fare gözleri örtün.
- Yanıt toplam eksikliği tarafından fark edilir derin anestezi tutuklama, sınayın. Bu amaçla, sadece hayvan ayak tutturulur.
- Ameliyat başlatmak için, bir elektrikli tıraş makinesi veya benzeri ile karın tüylerini ve STERILIUM veya benzeri ile çalışma alanı dezenfekte.
- Doğrudan karın bölgesinin merkezinde Sünnet bezlerinin üstünde bir ventral kesi yapmak. O yerde, ilk deplasman cilt çekin ve yaklaşık 8-14 mm'lik küçük enine deri kesim yapmak. Daha sonra, abdominal kas tabakası boyunca devam eder.
Not: hayvana zarar azaltılması için mümkün olduğunca lezyon kadar küçük olmalıdır. - Ekli testis ortaya çıkarmak ve sadece kesi yerinde (Şekil 2A) yanında bir önceki hazırlanmış su geçirmez tek kullanımlık kağıt örtü üzerine yerleştirmek için dikkatle karın yağ yastıkları yukarı çekin.
- F dürbün kullanınenjeksiyon hedef olarak götürücü kanalını ind. Duktus efferent testis ve epididimis arasındaki ince damar kavşak olarak tanımlanır. Bu önemli testis arter bitişiğinde yer almaktadır. Duktus arter 45 ° 'lik bir açıyla neredeyse çalışır ve gözle kaput epididimisdeki girer. Not: fare yaşına bağlı olarak, duktus genellikle yağ dokusunda gömüldü.
- Bu yağ dokusu efferent kanalını temizlemek için ince forseps kullanın. Daha sonra, çevre bozmadan kanalının net bir görüş sağlamak için steril kağıt şerit üzerinde serbest duktus yerleştirin.
4. Mikroenjeksiyon ve DNA Uygulaması
- Mikromanipülatör / enjektör ünitesine plazmid çözüm ile yüklenir mikroenjeksiyon pipet, bağlayın.
- Ucu rete testis (Şekil 2B) bakacak olan götürücü kanala mikroenjeksiyon iğne paralel yerleştirin.
- Ince cımbız kullanın vemikroenjeksiyon pipet kanalı üzerinde şerit. Bunu üzerine çekerken kılcal kanala paralel tutulur emin olun.
Not: Bu yordam mikromanipülatör ile iğne hareket ettirerek gemiyi nüfuz daha uygundur. - Testis doğru dikkatlice iğneyi yönlendirmek ve bu tunika albuginea (Şekil 2C) altında direkt rete testisi nüfuz olarak sadece durdurmak.
Not: retenin testis overreaching durumunda, plazmit çözelti ara boşluk içine akar. Bu genellikle seminifer tübüller transfecting yetmezliğine yol açar. - Pi: 100 hPa, ti: 0.2 sn, ve pc: 0 hPa (Şekil 2B) plazmid çözüm enjeksiyon için aşağıdaki ayarları ile mikropüskürtücüden kullanmaktadır.
- Yeşil renk yardımıyla durumunu doldurma testisi gözlemleyerek tüm enjeksiyon sürecini izlemek. Testis sadece pl ile hacmine 2/3 kadar dolu olduğunu özenasmid çözeltisi (Şekil 2E).
Not: enjeksiyon hacmi aşılırsa, testis dokusu zarar görebilir.
Testis 5. Elektroporasyon
- Etkili elektroporasyon etkinleştirmek PBS (1x) olarak cımbız elektrotlar emmek için. Bu, yeterli iletkenlik sağlar.
- Sorunsuz ıslak elektrotlar (Şekil 2F) arasındaki testis sıkmak. Elektroporatörü ile elektrik direncini ölçün.
- Testis akım uygulayın. 50 msn darbe süresi ve 950 ms aralığı sabit bir zaman süresi ile 4 farklı testis sitelerinde 40 V sekiz kare darbeleri uygulayın.
6. Yara Kapatma ve Post-cerrahi
- Elektroporasyon bittiğinde, geri özgün konumunda testis yerleştirin.
- Cerrahi sütür (materyalleri görmek) ile iç kas tabakası diker.
- Sütür klipleri (Malzemeler tabloya bakınız) kullanılarak cilt kapatın. Cildi zekâ çekinh cımbız. Kas tabakası dışlamak emin olun. En fazla 5 mm mesafede klipsleri, her bir koyun.
Not: cerrahi dikiş fare tarafından yutulabilir Çünkü, sütür klipler cilt lezyonu kapatılması için tercih edilir. - Fare 37 ° C sıcak pad üzerinde temperli steril boş fare kafes içinde yerleştirilen steril kağıt havlu üzerinde anestezi kurtarmak için izin verin. Ped, bir ısı derecesi oluşturarak kafesin yarısının ısınma sağlamalıdır. Hayvan için bu durum kafeste sıcaklık çeşitli bireysel, en rahat alanı aramak için mümkün kılar. Ek olarak, stres daha da azaltılabilir, böylece steril kağıt havlu tabakası ile fare kapsamaktadır. Not: fare vücut yüzeyi vücut kütlesi ile ilgili olarak olağanüstü yüksek olması nedeniyle daha büyük hayvanlar ile karşılaştırıldığında, termal destek kemirgen başarılı bir şekilde geri kazanılması için özel bir önem taşımaktadır.
- Işletilen hayvan tamamen uyanmış zaman, i aktarmaktam donanımlı bir yeni fare kafesine daha kurtarma için t. Eski kafes ya da bir grup farenin geri hayvan koyma. Kafes yara enfeksiyonu önlemek için mümkün olduğunca temiz ve steril olduğundan emin olun. Tüm kurtarma sürecini izlemek. Tamamen iyileşti ve normal davranmaya görünüyor kadar geri hayvan bakım tesisi için fareyi aktarmak için, bekle.
Not: Ek per- ve ameliyat sonrası stratejiler Pritchett-Coming KR ve ark 6 tarafından tartışılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kullanıldığı olarak in vivo fare testis mikro-enjeksiyon ve elektroporasyon gerçekleştirmek için protokole uygun olarak, deneysel ortamda, sınai olarak imal edilmiş mikropipetler elde etmek mümkün olsa da. Şekil 1 'de gösterilmiş olduğu için, (Şekil 1A çekerek kendi pipetler oluşturmak için tercih edilen bir böylece) ve bizote (Şekil 1B) cam kapilerleri onlar bizim ihtiyaçlarını donatılmış. Mikro enjeksiyon ve elektroporasyon için donatım Şekil 1C'de görüntülenmiştir. Transfeksiyon verimi nedenlerden ötürü, bir kare dalga elektro-kullanılması önem taşımaktadır.
2 görüntüler eferent kanalının hazırlanması özel bir odaklanma ile fare cerrahi önemli adımlar Şekil. Figür (testis maruz kalmaktadır, bu kapsamda (Şekil 2A) ve götürücü kanal binoküler gözlem ile tanımlanır ve yağ dokusundan salınane 2B). Daha sonra, götürücü kanal (Şekiller 2C-E), bir pipet ile mikroenjeksiyon delindiği ve plazmid çözeltisi tatbik edilir. Son olarak, yüklü testis iki elektrot arasına sıkışmış ve uygulamalı kare dalga darbeleri (Şekil 2F) tarafından transfekte edilir.
Bu in vivo transfeksiyon yaklaşım, çeşitli haberci genleri kodlayan farklı plazmit kullanımına izin verir. Burada gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) ve kırmızı floresan proteini (DsRed2) transaktivasyonunu sağlayan, aynı zamanda pDsRed2-N1 (Şekil 3C) vektörünü ifade raportör vektör pEGFP-C1 (Şekil 3A), ikinci. Bizim durumda, her iki raportör genler, insan sitomegalovirüs hemen erken promoteri (CMV) kontrolü altındaydı.
Transfeksiyon başarı değerlendirmek için, mikro-enjekte elektropore testis 3 gün bütün prosedür sonra hasat edildi ve Fluores altında gözlendikarşımıza çıkıyor mikroskobu (Şekil 3). Ayrıntılı inceleme için, testis, dilimlenmiş (5 mikron) yanı sıra, mavi renkli çekirdekler sonuçlanan, To-Pro-3 ile zıt parafine gömülü, formaldehit-sabit idi. Sonuç olarak, bölümler floresan mikroskobu ile incelenmiştir. Olası transfeksiyon sonuçlar iki örneği, Şekil 4'te görülebilir. Raportör gen EGFP ifade yeşil floresan ile gösterilir, DsRed2 transaktivasyon kırmızı salımı ile belirtilir.
Şekil 1. in vivo mikroenjeksiyon ve fare testis elektroporasyon için donatım. Cam kapilerler ipuçları beveler mikropipet kullanılarak bilenmiş ise mikropipet çektirmesi (A) kullanılarak oluşturulur (
Şekil 2. testis in vivo testis mikroenjeksiyon ve cerrahi müdahale öncesi de dahil olmak üzere fare elektroporasyon ilerleyen. Erişim İllüstrasyon öncesi anestezi edilmiş fare karnın açılması yoluyla verilir. Kesim sadece Sünnet bezleri üzerinde yapılır. Testisi ifşa sonra, abdominal yağ pa kurtulur DS (A). Binoküler gözlem altında, efferent kanal tespit ve yağ serbest. Iğnenin keskin uç götürücü kanalın (B) doğru işaret ederken mikroenjeksiyon pipet atrial yanında konumlandırılmıştır. Cam kılcal atrial içine yerleştirilir ve rete testis (C) içerisinde konumlandığı testisin doğru taşınır. Seminifer tübüller DNA uygulama ve dolgu prosedürü Fast Green (D) yardımı ile izlenir. Sadece testis 2/3 doku (E) zarar önlemek amacıyla doldurulur. Nihai elektroporasyon adım için, testis elektrik kare darbeleri (F) uygulamak için cımbız tipi elektrotlar arasında sıkılır. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Tüm montaj Testis 3 gün, in vivo elektroporasyon sonra flüoresans mikroskopi altında gelişmiş yeşil floresan protein, C57BL / 6 fare göstermek ifade transfekte testis -. EGFP (A) ve kırmızı flöresanlı proteindir - DsRed2 (C) her ikisi üzerine kodlanmış pEGFP- sırasıyla C1 ve pDsRed2-N1 plazmid. Her iki raportör genin ekspresyonu her yerde bulunan bir aktif CMV-yükseltici elemanın kontrolü altındadır. Hedeflenen seminifer tüp etkili transfeksiyon floresan yoğunlukları ile ortaya konmuştur. Paneller (B) ve (D) transfekte edilmemiş kontrol testis oto-floresan gösterirler. Ölçek çubuğu = 1 mm. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3 gün pEGFP-C1 plazmid. Sabit fare testis bölümler (5 mikron) transfeksivonu sonucu 3 gün pEGFP-C1 plazmid ile tek taraflı elektroporasyon sonra gösterilmektedir tek taraflı in vivo elektroporasyon sonra fare testisi 4. Bölüm. Başarıyla yeşil floresan ile gösterilen boru şekilli testis cellsare transfekte edildi. TO-PRO-3 karşıt çekirdekleri mavi emisyon (A ve B) ile tespit edilebilir. Yuvarlak yapılar seminifer tübüllerin içindeki hücrelerin organizasyonu için tipiktir. Ölçek çubuğu = 20 mikron. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Özellikle erkek infertilitesi ve kaçınılmaz spermatogenez alanında üreme biyolojisi alanında, araştırma canlı organizmalar üzerinde dayanır. Testis işlevini incelemek amacıyla, yeterli hücre kültürü / in vitro bir sistem haploid olgun sperm 1,2 diploid spermatogonyum tüm önemli morfolojik değişiklikler yansıtma kapasitesine kurulmuştur. Böylece, genetik olarak değiştirilmiş hayvanların üretimi genellikle gereklidir ve erkek üreme biyolojisi böyle değerli bir araç olarak bir olduğunu. Bu amaçla, transgenik önemli bir sayı için, nakavt ve knock-erkek fertilite anlayışlar teslim oluşturulmuştur fareler. Bununla birlikte, transgenik farelerin üretilmesi genellikle döllenmiş yumurta pronükleusuna gen yapıları enjekte edilerek yapılır. Ancak, bu teknik zaman alıcı ve uzman laboratuarlar tarafından yapılması gerekiyordu. Prosedür knock-out oluşturmak veya knock hayvanlaradaha sofistike.
Model yaşayan organizmaların gen fonksiyonu okuyan bir başka yolu geçici olarak nakil gereğidir. Ancak, viral vektörler ile ortak iletim immünojenik veya diğer spesifik reaksiyonlara neden ve özel güvenlik düzenlemeleri gerektirir olabilir. Lipofeksiyon 3 ve mikro-parçacık bombardımanı 4 yaklaşımlar, ne yazık ki, belirli bir hücre derinliğine göre sınırlanmıştır ve hatta dokusu üzerinde olumsuz etkileri tetikleyebilir.
Bununla birlikte, hedef doku üzerine uygulanmıştır elektriksel kare puls, sözde elektroporasyon vasıtasıyla, bir canlı doku, örneğin, bu tarifnamede fare testis transfekte aslında mümkündür. Dahası, bu yöntem sadece düşük maliyetler, düşük ekipman ve düzgün vasıflı laboratuvar kadrosuna gerektirir.
Sürekli gen değiştirilmiş hayvan moduna kıyasla in vivo transfeksiyon yöntemleri ile bağlantılı dikkate değer bir başka yararıls ko-transfeksiyon olasılığıdır. Transgenik ya da nakavt farenin-genelde tek bir gen yapısı taşıyan birlikte, in vivo transfeksiyon aynı hücre içinde farklı bir gen konstruktlarının kapsamlı ve aynı anda analiz sağlar. Bu durum örneğin, çeşitli haberci genlerin, kullanımı ile yapılabilir, GFP tanımının görüntülenmesi Renilla lusiferaz karşı YFP veya Gaussia-, karşı o kadar vahşi tip ve mutant gen etkileri karşılaştırmalı olarak araştırılması mümkündür.
Ayrıca, hücre tipine özel promoterlerin uygulanması ile, gen yapılarının ifadesi zarif testisi içindeki spesifik hücreler üzerine yönlendirilebilir. Örneğin, bu sadece Sertoli hücreleri veya spermatositlerde bir testis gen ifadesini izin verebilir.
Bu makalede sunulan protokol erkek üreme biyolojisi alanında iki önemli metodlarını kapsar. Birincisi enjeksiyon kılcal hazırlanması ile seminifer tübül içine mikroenjeksiyon olduğunu. Bu teknolojinique yaygın olarak alıcıya 7 transjenik hayvanlardan veya yabancı-doku naklinde 8 bağlamında ya da sap hücresi transplantasyonu / mikrop implike edilmiştir. İkinci yöntem, plazma zarı gibi plasmidler gibi şarjlı moleküllerin yönlendirilmiş bir kısmının akış geçici gözenekleri uyarılması belirli hücrelere veya dokulara daha girişini sağlamaya muktedirdir elektroporasyon transfeksiyonudur. Elektroporasyon ile makromoleküllerin Bu özel yönü sık sık rahimde 9,10 yapılabilir tek taraflı sinir hücresi transfeksiyonda veya retina 11 gelişmekte takdir edilmektedir.
Yukarıdaki ayrıntılı bir yöntem protokolü ilk önemli adımlar olarak erkek fare anestezi, karın lezyon ile testis fuar içerir götürücü kanalının hazırlanması hem de atrial içine mikroenjeksiyon. Bu eylemler oldukça zorlu olduğu gibi, şiddetle o gerçekleştirmeden önce ölmüş hayvanlar üzerinde ilk uygulama tavsiye ediliryaşayan fareler üzerinde perations. Ayrıca, talimatlar uygun testisin Elektroporasvon yapmak için nasıl enjekte ve plazmid-DNA ile seminifer tübülleri doldurmak için nasıl sağlanır.
Çünkü EP sırasında elektrik uygulama, ısı üretimi, özellikle yüksek gerilimde doku hasarı tetikleyebilir. Yüksek gerilim ile transfeksiyon verimi 12, 13, 15 bu artış, 12-14 daralma testis olumsuz etki yaratır. En uygun voltaj aralığı testis dürüstlük üzerine küçük etkileri garanti, 30-50 V arasında olması gibi görünüyor, normal sperm kalitesi 16, normal çiftleşme davranışı 17, yavru üretim yeteneği 16-20 bakım yanı sıra yeterli bir transfeksiyon etkinlik.
Transfer gen yapılarının gen ekspresyonu ile ilgili olarak yoğunluk, Yomogida ve diğ. 21 aynı zamanda belirgin şekilde azalan bir ifade sözcüğünü ortaya koymuştur3 gün dairesel plazmid-DNA ise EP uygulaması sonrasında Lineerleştirilmiş vektörlerin salgılamanın ardından Açıkçası hala Sertoli hücrelerinde yüksek biri ile 35 gün sonra ifade sürdürmektedir. Bu burada yapıldığı gibi elektroporasyon için plazmid yapıları kullanıldığında iyi sonuçlar elde edildiğini göstermektedir. Bizim yaklaşımlarında, bir nedeniyle bu süre yeterli yara iyileşmesi, hücre bütünlüğü onarımı gibi bir raportör protein EGFP ve DsRed2 istenen uygun ifade etmek için yeterli olan gözlem ile 3 gün sonra, elektroporasyon, transfeksiyon verimini incelemiştir. Bu nedenle, cerrahi müdahale ve tüm transfeksiyon prosedür takip edilerek 3 gün bir inkübasyon süresi mümkün olduğu kadar yoğun bir flüoresan sinyal güvenilir bir transfeksiyon sonucu garantilenmiş tespit edilebilir, böylece gen ifadesi de dahil olmak üzere uygun bir şekilde geri hücre fonksiyonlarını temin etmek için gerekli gibi görünmektedir. Transfeksiyon etkinliğindeki ile ilgili olarak, Yomogida ve diğ. 21 inci ortaya koymuşturE somatik Sertoli hücreleri görünüşte germ hücrelerinden daha EP-transfeksiyonundan daha duyarlı. Bu hedef ve kontrol plazmid ile testis ko-transfeksiyon, farklı bir raportör geninin kodlama her önerilir.
Sunulan elektroporasyon yaklaşım, erkek germ hücre ve doğurganlık süreçlerine atıfta olası sorunları geniş bir yelpazede uygulanabilir. Örneğin, spermatogenez-özgü genler 17,22 düzenleyici elemanlarının analiz etmek için kullanılabilir. Yöntemi de küçük müdahale RNA 23 ile kayıp fonksiyon-çalışmalar için uygundur ve kazanç fonksiyon-24 inceler. Ayrıca, araştırma grupları zaten 18,20,25 gösterildiği gibi bile transgenik yavru terapötik tedavisi ve üretimi için EP başarmak için umut verici şansı vardır.
Dolayısıyla, efferent kanal microHenry ile birlikte in vivo elektroporasyon fare testis yeni metodolojik yaklaşımını resimliplazmid yapıları njection umarım başarılı spermatogenez doğasını çözülmesi için değerli bir teknikle yükselecek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Sansar Michaelis, Alexander Sobczak ve Joachim M. Weitzel'in, Üreme Biyoloji Enstitüsü, Çiftlik Hayvanı Biyoloji Leibniz Enstitüsü (FBN), Dummerstorf Almanya'yı istihdam hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Biz testis mikroenjeksiyon öğretmek için Münster Üniversitesi Üreme Tıbbı ve Androloji Merkezi Birgit Westernstroeer teşekkür ederim. Ayrıca, biz Ursula Antkewitz ve teknik yardım için Petra reckling minnettarız. Biz bu işi (WE2458 / 10-1) desteklemek için Alman Araştırma Vakfı (DFG) teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Sigma | 1-15 PK | |
| Spectrophotometer | Nanodrop | ND-1000 | |
| Micropipette puller | Narishige | PC-10 | vertical capillary puller |
| Microinjection capillaries | Clark | GC100-10 | borosilicate standard wall |
| Micropipette beveler | Bachofer | Typ 462 | rotating disk beveler |
| Electroporator | Nepagene | CUY 21EDIT | square wave electroporator |
| Tweezer electrodes | Nepagene | CUY 650P5 | 5 mm Ø disk electrodes |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Cold light source | Zeiss | KL 1500LCD | |
| Microinjection pump | Eppendorf | Femtojet | |
| Micromanipulator | homemade | XYZ cross table | |
| Surgical instruments | FST | scissors, forceps, needle holder | |
| Fine forceps | FST | Dumont #5, #7 | efferent ducts preparation |
| Michel clip applying stapler | FST | Michel, 12029-12 | |
| Michel suture clips | FST | Michel, 12040-01 | 7.5 x 1.75 mm |
| Surgical suture | Catgut, Markneukirchen, Germany | Catgut 00 | |
| Syringe with 30 G needle | B. Braun | Omnican 40 | to load micropipette and for anesthesia |
| Plasmid isolation kit | Promega | Cat. # A2495 | plasmid Midiprep |
| Plasmid pEGFP-C1 | Clontech | Cat. #6084-1 | CMV-promoter + EGFP |
| Plasmid pDsRed2-N1 | Clontech | Cat. #6084-1 | CMV-promoter + DsRed2 |
| Fast Green dye | Sigma | F7258-25G | for dilution in ddH2O |
| 10% Ketamine | Serum Werk, Bernburg, Germany | Urotamin | mix in a rate 1:1 with xylazine |
| 2% Xylazine | Serum Werk, Bernburg, Germany | Xylazin | mix in a rate 1:1 with ketamine |
| Sterilium | Bode Chemie | Sterillium | disinfection |
| Vet ointment | S&K Pharma, GmbH | Kerato Biciron 5%, Augensalbe | opthalmic ointment to prevent eye dryness |
| To-Pro-3 iodide | Invitrogen | T3605 | |
| 10x PBS, pH 7.4 | |||
| 1.37 M NaCl | Carl Roth | 3957.1 | |
| Ibuprofen, Dolormin | Johnson & Johnson Consumer Health Care Germany | 01094902 | analgesic pediatric solution (NSAID) for postsurgery pain relief |
| 27 mM KCl | Carl Roth | 6781.1 | |
| 100 mM Na2HPO4·2H2O | Carl Roth | T106.2 | |
| 18 mM KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
References
- Reuter, K., Schlatt, S., Ehmcke, J., Wistuba, J. Fact or fiction: In vitro spermatogenesis. Spermatogenesis. 2, 245-252 (2012).
- Hunter, D., Anand-Ivell, R., Danner, S., Ivell, R.
- Zizzi, A., et al. fluorescent protein as indicator of nonviral transient transfection efficiency in endometrial and testicular biopsies. Microsc. Res. Tech. 73, 229-233 (2010).
- Williams, R. S., et al. Introduction of foreign genes into tissues of living mice by DNA-coated microprojectiles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2726-2730 (1991).
- Bockmann, R. A., de Groot, B. L., Kakorin, S., Neumann, E., Grubmuller, H., Kinetics, statistics, and energetics of lipid membrane electroporation studied by molecular dynamics simulations. Biophys. J. 95, 1837-1850 (2008).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J. Vis. Exp. (47), (2011).
- Brinster, R. L., Avarbock, M. R. Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11303-11307 (1994).
- Schlatt, S., Von, S. V., Schepers, A. G. Male germ cell transplantation: an experimental approach with a clinical perspective. Br. Med. Bull. 56, 824-836 (2000).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. (6), (2007).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J. Vis. Exp. (54), (2011).
- Blackshaw, S. In vivo electroporation of developing mouse retina. J. Vis. Exp. (52), (2011).
- Yomogida, K., Yagura, Y., Nishimune, Y. Electroporated transgene-rescued spermatogenesis in infertile mutant mice with a sertoli cell defect. Biol. Reprod. 67, 712-717 (2002).
- Ryoki, S., Park, H., Ohmori, Y., Shoji-Tanaka, A., Muramatsu, T. An integrase facilitates long-lasting foreign gene expression in vivo in mouse spermatogenic cells. J. Biosci. Bioeng. 91, 363-367 (2001).
- Umemoto, Y., et al. Gene transfer to mouse testes by electroporation and its influence on spermatogenesis. J. Androl. 26, 264-271 (2005).
- Muramatsu, T., Shibata, O., Ryoki, S., Ohmori, Y., Okumura, J. Foreign gene expression in the mouse testis by localized in vivo gene transfer. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 45-49 (1997).
- Hibbitt, O., et al. In vivo gene transfer by electroporation allows expression of a fluorescent transgene in hamster testis and epididymal sperm and has no adverse effects upon testicular integrity or sperm quality. Biol. Reprod. 74, 95-101 (2006).
- Yamazaki, Y., Yagi, T., Ozaki, T., Imoto, K. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells using green fluorescent protein as a. J. Exp. Zool. 286, 212-218 (2000).
- Dhup, S., Majumdar, S. S. Transgenesis via permanent integration of genes in repopulating spermatogonial cells in vivo. Nat. Methods. 5, 601-603 (2008).
- Huang, Z., et al. In vivo transfection of testicular germ cells and transgenesis by using the mitochondrially localized jellyfish fluorescent protein gene. FEBS Lett. 487, 248-251 (2000).
- Majumdar, S. S., et al. A method for rapid generation of transgenic animals to evaluate testis genes during sexual maturation. J. Reprod. Immunol. 83, 36-39 (2009).
- Yomogida, K., Yagura, Y., Tadokoro, Y., Nishimune, Y. Dramatic expansion of germinal stem cells by ectopically expressed human glial cell line-derived neurotrophic factor in mouse Sertoli cells. Biol. Reprod. 69, 1303-1307 (2003).
- Ike, A., et al. Transient expression analysis of the mouse ornithine decarboxylase antizyme haploid-specific promoter using in vivo electroporation. FEBS Lett. 559, 159-164 (2004).
- Gonzalez-Gonzalez, E., Lopez-Casas, P. P., Del, M. J. Gene silencing by RNAi in mouse Sertoli cells. Reprod. Biol. Endocrinol. 6, 29 (2008).
- Tang, H., Kung, A., Goldberg, E. Regulation of murine lactate dehydrogenase C (Ldhc) gene expression. Biol. Reprod. 78, 455-461 (2008).
- Yomgogida, K. Mammalian testis: a target of in vivo electroporation. Dev. Growth Differ. 50, 513-515 (2008).
- Hayes, K. E., et al. An Evaluation of Analgesic Regimens for Abdominal Surgery in Mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 6, 18-23 (2000).
