Summary
वृषण माउस कोशिकाओं के लिए एक अभिकर्मक तकनीक शुक्राणुजनन की अद्वितीय प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के रूप में इस अनुच्छेद विवो में microinjection और माउस वृषण की electroporation वर्णन करता है. प्रस्तुत प्रोटोकॉल electroporation द्वारा गिलास केशिका तैयारी, अपवाही वाहिनी के माध्यम से microinjection, और अभिकर्मक के कदम शामिल है.
Abstract
यह वीडियो और लेख योगदान microinjection और vivo में माउस वृषण की electroporation के लिए एक व्यापक विवरण देता है. वृषण माउस कोशिकाओं के लिए यह विशेष रूप से अभिकर्मक तकनीक शुक्राणुजनन में अद्वितीय प्रक्रियाओं के अध्ययन की अनुमति देता है.
निम्नलिखित प्रोटोकॉल प्लाज्मिड निर्माणों साथ वृषण माउस कोशिकाओं के अभिकर्मक पर केंद्रित है. विशेष रूप से, हम लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (DsRed2) व्यक्त हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) और भी pDsRed2-N1 वेक्टर बढ़ाया व्यक्त जो रिपोर्टर वेक्टर pEGFP-C1, इस्तेमाल किया. दोनों इनकोडिंग रिपोर्टर जीन मानव cytomegalovirus तत्काल जल्दी प्रमोटर (सीएमवी) के नियंत्रण में थे.
माउस वृषण में जीन स्थानांतरण प्रदर्शन के लिए, संवाददाता प्लाज्मिड निर्माणों में रहने वाले चूहों के वृषण में इंजेक्ट किया जाता है. कि अंत करने के लिए, एक anaesthetized जानवर के वृषण संपर्क में है और microinjection की साइट तैयार किया जाता है. की हमारी पसंदीदा जगहइंजेक्शन वृषण और अधिवृषण के बीच शुक्राणुओं की संरचनात्मक परिवहन मार्ग के रूप में अंत में जुड़ा हुआ जाल वृषण साथ, अपवाही वाहिनी है. इस तरह, microinjection के बाद बीजदार नलिकाओं के भरने उत्कृष्ट कारण दाग डीएनए समाधान का उपयोग करने में कामयाब रहे और नियंत्रित किया जाता है. अपनी रंगीन छोटी नली संरचना से वृषण की पर्याप्त भरने देखने के बाद, अंग electroporated है. यह वृषण कोशिकाओं में डीएनए समाधान के हस्तांतरण के लिए सक्षम बनाता है. ऊष्मायन के 3 दिन बाद, वृषण निकाल दिया जाता है और अभिकर्मक सफलता illustrating, हरी या लाल प्रतिदीप्ति के लिए खुर्दबीन के नीचे की जांच की.
आम तौर पर, इस प्रोटोकॉल DNA- या RNA- पहुंचाने के लिए नियोजित किया जा सकता क्रम में रहने वाले माउस वृषण में constructs (अधिक) व्यक्त या विवो जीन समारोह विश्लेषण में सुविधा जीन नीचे दस्तक. इसके अलावा, यह संवाददाता निर्माणों या ख्यात जीन नियमों के अध्ययन के लिए उपयुक्त हैइतिहास तत्वों. इस प्रकार, electroporation तकनीक का मुख्य लाभ वैकल्पिक तकनीकों की तुलना में आवश्यक कम प्रयास के साथ ही मध्यम तकनीकी उपकरण और कौशल के साथ संयोजन में तेजी से प्रदर्शन कर रहे हैं.
Introduction
स्तनधारी शुक्राणुजनन परिपक्व अगुणित शुक्राणु में विकसित करने के क्रम में क्रमिक पिंजरे का बँटवारा, अर्धसूत्रीविभाजन और भेदभाव के दौर से गुजर स्वयं renewing स्टेम कोशिकाओं के एक परिष्कृत प्रक्रिया माना जाता है. इन morphological परिवर्तन विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं द्वारा करवाया जाता है और गहन प्रयासों के बावजूद, यह सेल संस्कृति 1,2 में इन प्रक्रियाओं की नकल करने के लिए अभी असंभव है. इसलिए, अब तक शुक्राणुजनन पर अनुसंधान में vivo मॉडल के रूप में रहने वाले जीवों पर निर्भर करता है. सामान्य में, जीन समारोह पढ़ाई आमतौर पर ट्रांसजेनिक जानवरों पर आधारित हैं. हालांकि, सृजन और पशु मॉडल के इस तरह बनाए रखने के लिए समय लेने वाली है, लागत गहन और काफी विस्तृत है. यह सृजन और पीढ़ियों पर transgene बनाए रखने के लिए आवश्यक लंबे प्रजनन प्रक्रिया को जिम्मेदार ठहराया है. साथ ही, ट्रांसजेनिक या पीटा दृष्टिकोण से पूरे जीव की आनुवंशिक हेरफेर जी को लक्ष्य बनाते समय शारीरिक विकलांगता के कारण होने की संभावना हैजैसे कई क्षेत्रों में आवश्यक कार्यों, वृषण बाहर या प्रणालीबद्ध साथ Enes.
इसके अलावा, कुछ क्षणिक अभिकर्मक तरीकों कुछ महत्वपूर्ण नुकसान के साथ जुड़े रहे हैं. Lipofection 3 और microparticle बमबारी 4 ऊतकों को नुकसान पहुंचा सकता है और पर्याप्त अभिकर्मक दक्षता के लिए एक निश्चित सेल गहराई तक ही सीमित हैं, जबकि उदाहरण के लिए, वायरस की मध्यस्थता जीन स्थानांतरण के विशिष्ट कमियां, immunoreactions और अतिरिक्त सुरक्षा नियमों के संभावित उकसावे हैं.
इसके विपरीत, क्षणिक अभिकर्मक की एक आम रास्ता के रूप में electroporation (ईपी), विवो अभिकर्मक और लगातार vivo में जीन विश्लेषण में सक्षम बनाने के लिए एक आशाजनक तकनीक का गठन करने के लिए लगता है. सामान्य में, ईपी nanoseconds के भीतर फलस्वरूप मध्यस्थता pores के साथ स्थानीय transmembrane वोल्टेज पर निर्भर करता है कि एक गतिशील घटना के रूप में जाना जाता है. इन खामियों को दूर मिसे के लिए बनाए रखा जा सकता है, पर्याप्त टीओ डीएनए, आरएनए या छोटे अणुओं 5 तक पहुंच प्रदान करें. लागू वोल्टेज बहुत अधिक है, जब ईपी का आमतौर पर क्षणिक चरित्र के कारण गर्मी उत्पादन और सेल 5 के फलस्वरूप अपरिवर्तनीय क्षति के साथ भी व्यापक permeabilization के शामिल होने के लिए counteracted है.
यहाँ, हम electroporation vivo में वृषण जीन विशेषताओं को स्पष्ट करने के क्रम में आनुवंशिक वृषण परिवर्तन के लिए उपयोग किया जा रहा करने में सक्षम है जो एक प्रभावी और किफायती अभिकर्मक प्रणाली है कि दिखा. यह लेख अपवाही वाहिनी और माउस वृषण के बाद electroporation के माध्यम प्लाज्मिड तैयारी, microinjection पते. यह प्रक्रिया शुक्राणुजनन की प्रक्रियाओं की जांच करने के क्रम में vivo में माउस वृषण की बीजदार नलिकाओं में तेजी का विशिष्ट और कुशल अभिकर्मक प्राप्त करने के लिए विकल्प के साधन हो सकता है.
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Protocol
सभी प्रदर्शन पशु प्रयोगों स्थानीय आचार समिति (Landesamt फर Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei, Mecklenburg-Vorpommern, जर्मनी) द्वारा अनुमोदित किया गया है.
1 प्लाज्मिड तैयारी
- प्लाज्मिड तैयारी के लिए, प्लाज्मिड शुद्धि किट (सामग्री तालिका देखें) या जानवर की प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं से बचा जा सकता है, ताकि endotoxin हटाने बफर के साथ इसी तरह के तरीकों का उपयोग करें. पुस्तिका के निर्देशों का पालन करें. प्लाज्मिड समाधान को कमजोर करने DDH 2 हे रोजगार.
- अधिकतम गति (20,000 XG) में डीएनए समाधान कताई से मलबे को हटा दें. फिर सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा.
- एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (सामग्री देखें) के साथ प्लाज्मिड एकाग्रता का निर्धारण.
- 1-3 ग्राम (डीएनए) / μl को DDH 2 ओ के साथ प्लाज्मिड एकाग्रता समायोजित करें. नोट: उच्च सांद्रता एक बहुत चिपचिपा इंजेक्शन समाधान के कारण हो सकता है, जबकि कम सांद्रता, अभिकर्मक दक्षता कम हो जाएगा. इसके अलावा,अभिकर्मक दक्षता प्लाज्मिड के आकार पर निर्भर करता है और व्यक्तिगत रूप से परीक्षण किया जाना है.
- इंजेक्शन से पहले, के साथ एक समाधान मिश्रण तैयार 5 μl पीबीएस (10x) और 5 μl फास्ट ग्रीन (0.5%) के साथ मिलकर उदाहरण 40 μl प्लाज्मिड के लिए. फास्ट ग्रीन इंजेक्शन प्रक्रिया पर नज़र रखने के लिए आवश्यक है. अधिमानतः, पतली दीवार पीसीआर ट्यूब या Parafilm का उपयोग करें. नोट: वृषण का आकार के आधार पर, 20-50 μl की एक मात्रा प्रत्येक वृषण लिए आवश्यक हो जाएगा.
Microinjection पिपेट की 2. तैयारी
- Microinjection pipettes की तैयारी के लिए borosilicate केशिकाओं (सामग्री तालिका देखें) का प्रयोग करें.
- एक खड़ी केश खींचने के साथ कांच केशिकाओं खींचो (सामग्री तालिका देखें).
- धीरे बैंडिंग द्वारा संदंश के साथ केशिका टिप तोड़ो. टिप आमतौर पर 50-80 माइक्रोन व्यास में और के बारे में 1 सेमी लंबा है. इन ऊतक घुसना करने के लिए पर्याप्त कठोर नहीं हैं बहुत लंबे हैं कि सुझावों बचने की कोशिश करें.
- पिछले, शा मेंएक micropipette beveler (सामग्री तालिका देखें) का उपयोग कर 45 डिग्री कोण के लिए एक 30 डिग्री में टिप rpen.
- इंजेक्शन समाधान मिश्रण के साथ microinjection पिपेट लोड (प्लाज्मिड तैयारी देखें). एक छोटे से सिरिंज के साथ कांच केशिका के पीछे में समाधान को लागू करें. नोट: चालकता को कम करने के साथ ही संभवतः ऊतकों को नुकसान का कारण होगा इसलिए अन्यथा इन प्लाज्मिड समाधान के साथ बीजदार नलिकाओं में इंजेक्ट किया जाएगा, लोड हो रहा है, जबकि हवाई बुलबुले से बचने के लिए प्रयास करें.
3 संज्ञाहरण और सर्जरी
- बाँझ (यानी, सिरिंज, सुई, सर्जिकल उपकरणों, आदि) सामग्री का उपयोग करके सड़न रोकनेवाला शर्तों के तहत कार्रवाई करते हैं. इस जानवर के संक्रमण को कम करने और अच्छा जीवित रहने की दरों को सुनिश्चित करेगा.
- 6-8 सप्ताह के इस दौर में electroporation के लिए पुरुष चूहों का प्रयोग करें.
- Postsurgical एनाल्जेसिक उपचार को प्रारंभ करने के लिए, दर्दनाशक दवाओं के साथ माउस सर्जरी से पहले दिन पर पानी पीने गयी प्रदान करते हैं. यह गधाबहुत संभव postsurgical hypodipsia (कम पानी का सेवन) के मामले में एक रिक्तिपूर्व analgesia ures. यह अंत करने के लिए, उदाहरण के लिए एक बाल चिकित्सा इबुप्रोफेन निलंबन (20 मिलीग्राम / एमएल) के साथ पीने के पानी का पर्दाफाश. औषधीय पीने का पानी भी एक दिन और समान एकाग्रता में सुधार की दो पर आपूर्ति की जानी चाहिए. इस C57BL / 6J आयु वर्ग के 8 सप्ताह के लिए 25 ग्राम के 5 मिलीलीटर / डी पीने के पानी और शरीर के वजन के लिए मान्य 7.5 मिलीग्राम / किलो की एक दैनिक खुराक, इसका मतलब है. यह एनाल्जेसिक आहार एक मौलिक दर्द से राहत और उच्च कल्याण 26 के साथ साथ त्वरित वसूली की गारंटी देता है.
- (सामग्री तालिका देखें): 1 के अनुपात सर्जरी के दिन पर काम कर समाधान संज्ञाहरण तैयार करने के लिए, एक 1 में 10% Ketamin और 2% Xylazin मिश्रण.
- संवेदनाहारी समाधान subcutaneously की 0.25 मिलीग्राम / 100 मिलीग्राम शरीर के वजन को लागू करने, पशु anesthetize करने के लिए (Ketamin = 0.125 ग्राम / किलो, Xylazin = 0.025 ग्राम / किग्रा). चूहों के अंग क्षति और चोट को रोकने के क्रम में श्रोणि और अंग के बीच एक इंजेक्शन साइट का उपयोग करें. आमतौर पर, 10 मिनट की जरूरत हैजब तक माउस गहरा anesthetized है.
- संज्ञाहरण के दौरान सूखापन को रोकने के लिए पशु चिकित्सक मरहम के साथ माउस आँखों को कवर किया.
- प्रतिक्रिया की कुल कमी से ध्यान देने योग्य है, जो गहरी संवेदनाहारी गिरफ्तारी, टेस्ट. इसके लिए सिर्फ जानवर के पैर के अंगूठे चुटकी.
- सर्जरी शुरू करने के लिए, एक इलेक्ट्रिक शेवर या इसी तरह के साथ पेट में बालों को हटाने और sterilium या इसी तरह के आपरेशन क्षेत्र कीटाणुरहित.
- सीधे पेट क्षेत्र के केंद्र में preputial ग्रंथियों के ऊपर एक उदर चीरा. उस जगह पर, पहले दूर त्वचा खींचने के लिए और के बारे में 8-14 मिमी की एक छोटी आड़ा त्वचीय कटौती का संचालन. फिर, पेट की मांसपेशियों परत के साथ जारी है.
नोट: पशु को नुकसान को कम करने के लिए संभव के रूप में घाव के रूप में छोटा होना चाहिए. - संलग्न वृषण बेनकाब और बस चीरा साइट (2A चित्रा) के पास एक पूर्व तैयार निविड़ अंधकार प्रयोज्य कागज टांगना पर जगह ध्यान से पेट की चर्बी पैड ऊपर खींचो.
- एफ के लिए दूरबीन का उपयोगइंजेक्शन लक्ष्य के रूप में अपवाही वाहिनी इंडस्ट्रीज़. वाहिनी अपवाही वृषण और अधिवृषण के बीच ठीक पोत जंक्शन के रूप में पहचान की है. यह प्रमुख वृषण धमनी के निकट स्थित है. वाहिनी धमनी को 45 डिग्री के कोण पर लगभग चलाता है और जाहिरा निस्सार epididymidis में प्रवेश करती है. नोट: माउस की उम्र पर निर्भर करता है, वाहिनी आमतौर पर वसा ऊतकों में दफन है.
- इस वसा ऊतकों की अपवाही वाहिनी खाली करने के लिए ठीक संदंश का प्रयोग करें. उसके बाद, परिवेश आई बिना वाहिनी का स्पष्ट दृश्यता सुनिश्चित करने के लिए एक बाँझ कागज पट्टी पर जारी वाहिनी जगह है.
4 Microinjection और डीएनए आवेदन
- Micromanipulator / इंजेक्टर इकाई को प्लाज्मिड समाधान के साथ भरी हुई है जो microinjection पिपेट, कनेक्ट करें.
- टिप जाल वृषण (चित्रा 2B) की ओर इशारा करते हुए के साथ अपवाही वाहिनी को microinjection सुई समानांतर रखें.
- ठीक चिमटी का प्रयोग करें औरmicroinjection पिपेट पर डक्ट पट्टी. इस पर खींच जबकि केशिका वाहिनी के समानांतर रखा है कि सुनिश्चित करें.
नोट: यह प्रक्रिया micromanipulator के साथ सुई ले जाकर पोत मर्मज्ञ से अधिक सुविधाजनक है. - वृषण की ओर ध्यान से सुई सीधे और यह Tunica धवल (चित्रा -2) के नीचे सीधे जाल वृषण प्रवेश के रूप में बस बंद करो.
नोट: जाल वृषण overreaching के मामले में प्लाज्मिड समाधान बीचवाला अंतरिक्ष में रिसाव जाएगा. यह आमतौर पर बीजदार नलिकाओं transfecting की विफलता की ओर जाता है. - गड़बड़ी: 100 एचपीए, तिवारी: 0.2 सेकंड, और पीसी: 0 इंच (चित्रा 2 डी) प्लाज्मिड समाधान के इंजेक्शन के लिए निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ microinjector का उपयोग.
- हरे रंग की मदद से स्थिति को भरने वृषण देख कर पूरे इंजेक्शन प्रक्रिया की निगरानी. वृषण केवल पी एल के साथ इसकी मात्रा का 2/3 तक भरा जाता है कि ध्यान रखनाasmid समाधान (चित्रा 2 ई).
नोट: इंजेक्शन की मात्रा अधिक हो गई है, तो वृषण ऊतक नुकसान पहुंचाया जा सकता है.
वृषण की 5 Electroporation
- , प्रभावी electroporation सक्षम पीबीएस (1x) में चिमटी से नोचना इलेक्ट्रोड सोख करने के लिए. यह पर्याप्त प्रवाहकत्त्व सुनिश्चित करता है.
- सुचारू रूप से गीला इलेक्ट्रोड (चित्रा 2 एफ) के बीच वृषण निचोड़. Electroporator के साथ विद्युत प्रतिरोध उपाय.
- वृषण लिए वर्तमान लागू करें. 50 मिसे नाड़ी समय और 950 मिसे अंतराल समय के एक निरंतर अवधि के साथ 4 अलग वृषण स्थलों पर 40 वी की आठ वर्ग दालों प्रदर्शन करना.
6 घाव बंद और बाद सर्जरी
- Electroporation के समाप्त हो गया है, वापस मूल स्थान में वृषण जगह है.
- शल्य सिवनी (सामग्री देखें) के साथ भीतरी पेशी परत सीना.
- सिवनी क्लिप्स (सामग्री तालिका देखें) को रोजगार से त्वचा को बंद करें. त्वचा बुद्धि खींचोज चिमटी. पेशी परत को बाहर करने के लिए सुनिश्चित करें. नहीं अधिक से अधिक 5 मिमी की दूरी पर क्लिप, हर जगह.
नोट: शल्य सिवनी माउस ने निगल लिया जा सकता है, सीवन क्लिप त्वचा घाव को बंद करने के लिए इष्ट हैं. - माउस एक 37 डिग्री सेल्सियस गर्म पैड पर शांत है, जो एक बाँझ खाली माउस पिंजरे में रखा बाँझ कागज तौलिए पर संज्ञाहरण से उबरने के लिए अनुमति दें. पैड एक गर्मी ढाल बनाने पिंजरे के एक आधे की वार्मिंग सुनिश्चित करना चाहिए. पशु के लिए इस वजह से पिंजरे में तापमान किस्म के व्यक्ति, सबसे अधिक आरामदायक क्षेत्र के लिए खोज करने के लिए संभव बनाता है. इसके अलावा, तनाव आगे कम किया जा सकता है, ताकि बाँझ कागज तौलिया के एक पत्र के साथ माउस को कवर किया. नोट: माउस के शरीर सतह शरीर द्रव्यमान के संबंध में अपूर्व उच्च चूंकि बड़े जानवरों की तुलना में,, थर्मल समर्थन कृन्तकों के सफल वसूली के लिए विशेष महत्व का है.
- संचालित पशु पूरी तरह जागा है, जब मैं हस्तांतरणएक पूरी तरह से सुसज्जित नए माउस पिंजरे में आगे वसूली के लिए टी. अपने पुराने पिंजरे में या चूहों के एक समूह को वापस जानवर मत डालो. पिंजरे घाव संक्रमण को रोकने के लिए संभव के रूप में साफ और बाँझ है कि सुनिश्चित करें. पूरी वसूली प्रक्रिया की निगरानी. यह पूरी तरह से ठीक है और सामान्य रूप से व्यवहार करने के लिए प्रकट होता है जब तक वापस जानवरों की देखभाल की सुविधा के लिए माउस स्थानांतरित करने के लिए, रुको.
नोट: अतिरिक्त प्रति और शल्य चिकित्सा के बाद रणनीतियों Pritchett-Corning के.आर. एट अल 6 से चर्चा कर रहे हैं.
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Representative Results
यह प्रयोग किया जाता है के रूप में vivo में माउस वृषण के microinjection और electroporation प्रदर्शन प्रोटोकॉल के अनुसार के लिए प्रयोगात्मक सेटिंग यह औद्योगिक रूप से निर्मित micropipettes प्राप्त करने के लिए संभव है. हालांकि चित्रा 1 में सचित्र है, हम (चित्रा 1 ए खींच कर अपने स्वयं के pipettes उत्पन्न करने के लिए पसंद किया इतना है कि) और beveling (चित्रा 1 बी) कांच केशिकाओं वे हमारी जरूरतों फिट. microinjection और electroporation के लिए उपकरण चित्रा 1C में सचित्र है. अभिकर्मक दक्षता के कारणों के लिए, यह एक वर्ग लहर electroporator का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है.
2 दिखाता अपवाही वाहिनी की तैयारी पर विशेष ध्यान देने के साथ माउस सर्जरी की महत्वपूर्ण कदम चित्रा. Figur (वृषण सामने आ रहा है इस संदर्भ (2A चित्रा) और अपवाही नली में दूरबीन अवलोकन द्वारा की पहचान की है और वसा ऊतकों से रिहाई 2 बी). बाद में, अपवाही वाहिनी (आंकड़े -2 सी ई) एक microinjection पिपेट साथ हवा निकाल दी है और प्लाज्मिड समाधान किया जाता है. अंत में, लोड वृषण दो इलेक्ट्रोड के बीच निचोड़ा और लागू वर्ग तरंग दालों (चित्रा 2 एफ) द्वारा ट्रांसफ़ेक्ट है.
इस में vivo अभिकर्मक दृष्टिकोण विभिन्न रिपोर्टर जीन एन्कोडिंग अलग plasmids के उपयोग की अनुमति देता है. यहाँ हम बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) और लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (DsRed2) की transactivation सक्रिय करने के भी pDsRed2-N1 (चित्रा -3 सी) वेक्टर व्यक्त जो रिपोर्टर वेक्टर pEGFP-C1 (चित्रा 3 ए) का उपयोग किया था. हमारे मामले में, दोनों रिपोर्टर जीन मानव cytomegalovirus तत्काल जल्दी प्रमोटर (सीएमवी) के नियंत्रण में थे.
अभिकर्मक सफलता का मूल्यांकन करने के लिए, microinjected और electroporated वृषण 3 दिन पूरी प्रक्रिया के बाद काटा गया और fluores तहत मनायाcence माइक्रोस्कोपी (चित्रा 3). विस्तृत जांच के लिए, वृषण, कटा हुआ (5 माइक्रोन) के साथ ही नीले रंग का नाभिक में जिसके परिणामस्वरूप के लिए प्रो-3 के साथ counterstained आयल में एम्बेडेड, formaldehyde-तय किया गया. आखिरकार, वर्गों प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच की गई. संभव अभिकर्मक परिणामों के दो उदाहरण चित्रा 4 में देखा जा सकता है. रिपोर्टर जीन EGFP की अभिव्यक्ति हरी प्रतिदीप्ति ने संकेत दिया है, DsRed2 के transactivation लाल उत्सर्जन द्वारा नामित है.
चित्र 1 में विवो microinjection और माउस वृषण की electroporation के लिए उपकरण. ग्लास केशिकाओं सुझावों beveler micropipette उपयोग तेज कर रहे हैं, जबकि micropipette खींचने (ए) का उपयोग का गठन कर रहे हैं (
चित्रा 2 वृषण में विवो वृषण microinjection और पूर्व शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप सहित माउस में electroporation कार्यवाही. पहुंच के चित्रण से पहले anesthetized किया गया है जो माउस के पेट के उद्घाटन के माध्यम से दी जाती है. कटौती सिर्फ preputial ग्रंथियों के ऊपर बना है. वृषण खुलासा करने के बाद, यह पेट की चर्बी देहात से जारी है डी एस (ए). दूरबीन के अवलोकन के तहत, अपवाही वाहिनी पहचान और वसा मुक्त कर दिया है. सुई की तेज अंत अपवाही वाहिनी (बी) की ओर इशारा कर रहा है, जबकि microinjection पिपेट वाहिनी के बगल में तैनात है. गिलास केशिका वाहिनी में डाला जाता है और जाल वृषण (सी) के भीतर सीधे तैनात करने के लिए वृषण की ओर ले जाया जाता है. बीजदार नलिकाओं का डीएनए आवेदन और भरने की प्रक्रिया फास्ट ग्रीन (डी) की मदद से नजर रखी है. केवल वृषण की 2/3 ऊतक (ई) के नुकसान को रोकने के क्रम में भरा हो जाता है. अंतिम electroporation कदम के लिए, वृषण बिजली वर्ग दालों (एफ) को लागू करने के लिए चिमटी से नोचना प्रकार इलेक्ट्रोड के बीच निचोड़ा है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 3 साबुत माउंट वृषण 3 दिन में vivo electroporation के बाद प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के तहत बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन की C57BL 6 / माउस शो अभिव्यक्ति की ट्रांसफ़ेक्ट वृषण -. EGFP (ए) और लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन - DsRed2 (सी) दोनों pEGFP- पर इनकोडिंग क्रमश: सी 1 और pDsRed2-N1 प्लाज्मिड,. दोनों रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति सर्वत्र सक्रिय सीएमवी प्रमोटर तत्व के नियंत्रण में था. लक्षित बीजदार नलिकाओं के प्रभावी अभिकर्मक प्रतिदीप्ति तीव्रता द्वारा प्रदर्शन किया है. पैनलों (बी) और (डी) untransfected नियंत्रण वृषण की ऑटो प्रतिदीप्ति वर्णन. स्केल बार = 1 मिमी. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 3 दिन pEGFP-C1 प्लाज्मिड. निश्चित माउस वृषण वर्गों (5 माइक्रोन) के अभिकर्मक परिणाम 3 दिन pEGFP-C1 प्लाज्मिड साथ एकतरफा electroporation के बाद दिखाए जाते हैं के साथ एकतरफा vivo में electroporation के बाद माउस वृषण के 4 वर्गों. सफलतापूर्वक हरी प्रतिदीप्ति ने संकेत दिया वृषण ट्यूबलर cellsare ट्रांसफ़ेक्ट. में प्रो -3 counterstained नाभिक नीले उत्सर्जन (ए और बी) द्वारा detectable हैं. दौर संरचनाओं बीजदार नलिकाओं के भीतर कोशिकाओं के संगठन के लिए विशिष्ट हैं. स्केल बार = 20 माइक्रोन. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
विशेष रूप से पुरुष प्रजनन क्षमता और अनिवार्य रूप से शुक्राणुजनन के क्षेत्र में प्रजनन जीव विज्ञान के क्षेत्र में अनुसंधान रहने वाले जीवों पर निर्भर करता है. वृषण समारोह की जांच करने के लिए, कोई पर्याप्त सेल संस्कृति / इन विट्रो प्रणाली एक अगुणित परिपक्व शुक्राणु 1,2 करने के लिए एक द्विगुणित spermatogonium से सभी महत्वपूर्ण रूपात्मक बदलाव को दर्शाती में सक्षम स्थापित किया गया है. इस प्रकार, आनुवंशिक रूप से संशोधित पशुओं की पीढ़ी अक्सर आवश्यक है और पुरुष प्रजनन जीव विज्ञान में इस तरह के एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में एक है. यह अंत, ट्रांसजेनिक की काफी संख्या के लिए, आउट दस्तक और दस्तक में पुरुष प्रजनन क्षमता में अंतर्दृष्टि वितरित जो निर्मित किया गया है चूहों. फिर भी, ट्रांसजेनिक चूहों की पीढ़ी आमतौर पर निषेचित अंडे की pronucleus में जीन निर्माणों इंजेक्शन लगाने के द्वारा किया जाता है. हालांकि, इस तकनीक का समय लेने वाली है और विशेष प्रयोगशालाओं द्वारा किया जाना माना जाता है. प्रक्रिया तोड़े बाहर उत्पन्न या तोड़े में पशुओं के लिएऔर भी अधिक परिष्कृत है.
मॉडल रहने वाले जीवों के जीन समारोह का अध्ययन का एक अन्य तरीका क्षणिक अभिकर्मक से है. हालांकि, वायरल वैक्टर के साथ आम पारगमन immunogenic या अन्य unspecific प्रतिक्रियाओं का कारण और विशेष सुरक्षा नियमों की आवश्यकता हो सकती है. Lipofection 3 और microparticle बमबारी 4 दृष्टिकोण दुर्भाग्य से एक विशेष सेल गहराई को रोका जाता है और यहां तक कि ऊतक पर प्रतिकूल प्रभाव ट्रिगर हो सकता है.
फिर भी, लक्षित ऊतक पर सीधे लागू बिजली वर्ग दालों, तथाकथित electroporation के माध्यम से, यह उदाहरण के रहने वाले ऊतक,, इस के साथ साथ माउस वृषण transfect करने के लिए वास्तव में संभव है. इसके अलावा, इस पद्धति केवल कम लागत, कम उपकरण और ठीक से कुशल प्रयोगशाला व्यक्तिगत आवश्यकता है.
लगातार जीन बदल पशु मोड की तुलना में इन विवो अभिकर्मक तरीकों के साथ जुड़े एक और उल्लेखनीय लाभलोकसभा सह अभिकर्मक की संभावना है. ट्रांसजेनिक या तोड़े चूहों आमतौर पर केवल एक जीन का निर्माण ले, वहीं इन विवो अभिकर्मक एक ही कोशिका के भीतर विभिन्न जीन निर्माणों की व्यापक, एक साथ विश्लेषण में सक्षम बनाता है. यह जैसे विभिन्न रिपोर्टर जीन, के उपयोग से किया जा सकता है, GFP Renilla-luciferase बनाम YFP या Gaussia- बनाम, इतना है कि जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती जीन प्रभाव का एक तुलनात्मक जांच संभव है.
इसके अलावा, सेल प्रकार विशिष्ट प्रमोटरों के आवेदन के द्वारा, जीन निर्माणों की अभिव्यक्ति उत्कृष्ट वृषण भीतर विशिष्ट कोशिकाओं पर निर्देशित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, यह सिर्फ Sertoli कोशिकाओं या spermatocytes में एक वृषण जीन अभिव्यक्ति अनुमति दे सकता है.
इस लेख में प्रस्तुत प्रोटोकॉल पुरुष प्रजनन जीव विज्ञान के क्षेत्र में दो महत्वपूर्ण तरीकों को शामिल किया. पहले एक इंजेक्शन केशिका की तैयारी के साथ बीजदार नलिकाओं में microinjection है. इस तकनीकnique सामान्यतः प्राप्तकर्ता 7 को ट्रांसजेनिक जानवरों से या 8 xenografting के संदर्भ में या तो कोशिका प्रत्यारोपण स्टेम / रोगाणु में फंसा दिया गया है. दूसरी विधि, प्लाज्मा झिल्ली के साथ ही प्लास्मिड तरह का आरोप लगाया अणुओं के एक निर्देशित थोक प्रवाह में क्षणिक pores उत्प्रेरण कुछ कोशिकाओं या बल्कि ऊतकों में प्रवेश सुनिश्चित करने के लिए सक्षम electroporation अभिकर्मक है. Electroporation द्वारा बड़े अणुओं के इस विशेष दिशा अक्सर अक्सर utero 9,10 में किया एकतरफा तंत्रिका कोशिका अभिकर्मक में या रेटिना 11 को विकसित करने में सराहना की है.
पूर्ववर्ती विस्तृत विधि प्रोटोकॉल पहला महत्वपूर्ण कदम के रूप में पुरुष चूहों की संज्ञाहरण, पेट घाव के माध्यम से वृषण की प्रदर्शनी भी शामिल है, अपवाही वाहिनी की तैयारी के साथ ही वाहिनी में microinjection. इन कार्यों में काफी मांग कर रहे हैं, यह दृढ़ता से ओ प्रदर्शन से पहले मृत जानवरों पर पहले अभ्यास करने की सलाह दी हैरहने वाले चूहों पर perations. इसके अलावा, निर्देश उचित वृषण की electroporation संचालन करने के लिए कैसे इंजेक्षन और प्लाज्मिड डीएनए और साथ बीजदार नलिकाओं को भरने के लिए पर प्रदान की जाती हैं.
क्योंकि ईपी के दौरान बिजली के आवेदन की, गर्मी उत्पादन, विशेष रूप से उच्च वोल्टेज में ऊतकों को नुकसान ट्रिगर हो सकता है. ऊंचा वोल्टेज से अभिकर्मक दक्षता 12, 13, 15 में यह वृद्धि 12-14 सिकुड़ वृषण के प्रतिकूल प्रभाव के साथ है. सबसे अनुकूल वोल्टेज श्रेणी वृषण अखंडता पर छोटे प्रभाव गारंटी, 30-50 वी के बीच हो रहा है, एक सामान्य शुक्राणु की गुणवत्ता 16, एक सामान्य संभोग व्यवहार 17, वंश उत्पादन क्षमता 16-20 के रखरखाव के साथ ही एक पर्याप्त अभिकर्मक प्रभावकारिता.
तबादला जीन निर्माणों के संबंध में जीन अभिव्यक्ति तीव्रता, Yomogida एट अल. 21 भी एक स्पष्ट रूप से कम expr पता चला है3 दिन परिपत्र प्लाज्मिड डीएनए जबकि ईपी कार्यान्वयन के बाद linearized वैक्टर ession जाहिर है अभी भी Sertoli कोशिकाओं में उच्चतम एक साथ 35 दिनों के बाद अभिव्यक्ति बनाए. यह यहां संपन्न रूप में electroporation के लिए प्लाज्मिड निर्माणों का उपयोग करते समय सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त कर रहे हैं कि पता चलता है. हमारे दृष्टिकोण में, हम के कारण इस समय अवधि पर्याप्त घाव भरने, सेल अखंडता की मरम्मत के साथ ही रिपोर्टर प्रोटीन EGFP और DsRed2 के वांछित समुचित अभिव्यक्ति के लिए पर्याप्त है कि अवलोकन करने के लिए 3 दिन electroporation के बाद अभिकर्मक दक्षता की जांच की. इस प्रकार, शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप और पूरे अभिकर्मक प्रक्रिया के बाद 3 दिन के एक ऊष्मायन समय संभव के रूप में गहन रूप में एक प्रतिदीप्ति संकेत एक विश्वसनीय अभिकर्मक परिणाम सुनिश्चित करने का पता लगाया जा सकता है कि इतने जीन अभिव्यक्ति सहित उचित बहाल सेल कार्य की गारंटी करने के लिए आवश्यक प्रतीत हो रहा है. अभिकर्मक दक्षता के संबंध में, Yomogida एट अल. 21 वें खुलासा किया है किई दैहिक Sertoli कोशिकाओं जाहिरा तौर पर रोगाणु कोशिकाओं की तुलना में ईपी अभिकर्मक के लिए उत्तरदायी हैं. हम लक्ष्य और नियंत्रण plasmids के साथ वृषण के सह अभिकर्मक, एक अलग रिपोर्टर जीन के लिए प्रत्येक कोडिंग की सलाह देते हैं.
प्रस्तुत electroporation दृष्टिकोण पुरुष रोगाणु सेल और प्रजनन प्रक्रियाओं की चर्चा करते हुए संभावित मुद्दों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम के लिए लागू है. उदाहरण के लिए, यह शुक्राणुजनन विशिष्ट जीन 17,22 के नियामक तत्वों का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जा सकता है. विधि भी छोटे दखल शाही सेना 23 के साथ नुकसान के समारोह के अध्ययन के लिए उपयुक्त है और लाभ के समारोह 24 अध्ययन करता है. इसके अतिरिक्त, अनुसंधान समूहों को पहले से ही 18,20,25 से पता चला है के रूप में भी ट्रांसजेनिक वंश का चिकित्सीय उपचार और पीढ़ी के लिए ईपी को पूरा करने का वादा संभावना है.
इसलिए, अपवाही वाहिनी microi के साथ संयोजन के रूप में vivo electroporation में माउस वृषण के उपन्यास methodological दृष्टिकोण सचित्रप्लाज्मिड निर्माणों की njection उम्मीद है कि सफलतापूर्वक शुक्राणुजनन की प्रकृति unraveling के लिए एक मूल्यवान तकनीक को जन्म देगा.
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Disclosures
नेवला Michaelis, सिकंदर Sobczak, और जोकिम एम WEITZEL,, प्रजनन जीवविज्ञान संस्थान, कृषि पशु जीवविज्ञान के लिए लाइबनिट्स संस्थान (FBN), Dummerstorf पर जर्मनी में कार्यरत वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा.
Acknowledgments
हम वृषण microinjection पढ़ाने के लिए म्युएन्स्टर विश्वविद्यालय में प्रजनन चिकित्सा और Andrology की केंद्र की Birgit Westernstroeer धन्यवाद. इसके अलावा, हम उर्सुला Antkewitz और तकनीकी सहायता के लिए पेट्रा Reckling के लिए आभारी हैं. हम इस काम (WE2458 / 10-1) का समर्थन करने के लिए जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (DFG) धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Sigma | 1-15 PK | |
| Spectrophotometer | Nanodrop | ND-1000 | |
| Micropipette puller | Narishige | PC-10 | vertical capillary puller |
| Microinjection capillaries | Clark | GC100-10 | borosilicate standard wall |
| Micropipette beveler | Bachofer | Typ 462 | rotating disk beveler |
| Electroporator | Nepagene | CUY 21EDIT | square wave electroporator |
| Tweezer electrodes | Nepagene | CUY 650P5 | 5 mm Ø disk electrodes |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Cold light source | Zeiss | KL 1500LCD | |
| Microinjection pump | Eppendorf | Femtojet | |
| Micromanipulator | homemade | XYZ cross table | |
| Surgical instruments | FST | scissors, forceps, needle holder | |
| Fine forceps | FST | Dumont #5, #7 | efferent ducts preparation |
| Michel clip applying stapler | FST | Michel, 12029-12 | |
| Michel suture clips | FST | Michel, 12040-01 | 7.5 x 1.75 mm |
| Surgical suture | Catgut, Markneukirchen, Germany | Catgut 00 | |
| Syringe with 30 G needle | B. Braun | Omnican 40 | to load micropipette and for anesthesia |
| Plasmid isolation kit | Promega | Cat. # A2495 | plasmid Midiprep |
| Plasmid pEGFP-C1 | Clontech | Cat. #6084-1 | CMV-promoter + EGFP |
| Plasmid pDsRed2-N1 | Clontech | Cat. #6084-1 | CMV-promoter + DsRed2 |
| Fast Green dye | Sigma | F7258-25G | for dilution in ddH2O |
| 10% Ketamine | Serum Werk, Bernburg, Germany | Urotamin | mix in a rate 1:1 with xylazine |
| 2% Xylazine | Serum Werk, Bernburg, Germany | Xylazin | mix in a rate 1:1 with ketamine |
| Sterilium | Bode Chemie | Sterillium | disinfection |
| Vet ointment | S&K Pharma, GmbH | Kerato Biciron 5%, Augensalbe | opthalmic ointment to prevent eye dryness |
| To-Pro-3 iodide | Invitrogen | T3605 | |
| 10x PBS, pH 7.4 | |||
| 1.37 M NaCl | Carl Roth | 3957.1 | |
| Ibuprofen, Dolormin | Johnson & Johnson Consumer Health Care Germany | 01094902 | analgesic pediatric solution (NSAID) for postsurgery pain relief |
| 27 mM KCl | Carl Roth | 6781.1 | |
| 100 mM Na2HPO4·2H2O | Carl Roth | T106.2 | |
| 18 mM KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
References
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