Summary
تقدم هذه المخطوطة بسيطة، لكنها قوية، في طريقة المختبر لتقييم انقباض العضلات الملساء ردا على وكلاء الدوائية أو تحفيز العصب. التطبيقات الرئيسية هي فحص المخدرات والأنسجة علم وظائف الأعضاء فهم، والصيدلة، وعلم الأمراض.
Abstract
وصفنا طريقة في المختبر لقياس المثانة انقباض العضلات الملساء، واستخدامه للتحقيق في الخصائص الفسيولوجية والدوائية من العضلات الملساء وكذلك التغيرات الناجمة عن الأمراض. وهذه الطريقة توفر المعلومات الهامة لفهم وظيفة المثانة في حين التغلب على الصعوبات المنهجية الرئيسية التي تعترض في التجارب المجراة، مثل التلاعب الجراحية والدوائية التي تؤثر على الاستقرار والبقاء للاستعدادات، واستخدام الأنسجة البشرية، و / أو استخدام المواد الكيميائية باهظة الثمن. كما يوفر وسيلة لتحقيق خصائص كل مكون المثانة (أي العضلات الملساء، الغشاء المخاطي، والأعصاب) في ظروف صحية ومرضية.
تتم إزالة المثانة البولية من حيوان تخدير، وضعت في حل كريبس ومقطعة إلى شرائح. توضع شرائح في غرفة مليئة حل كريبس الدافئ. ويرد أحد طرفيه إلى التوتر السطحي متساوي القياسن محول لقياس قوة الانكماش، ويرد الطرف الآخر إلى قضيب ثابت. يتم تحفيز الأنسجة بإضافة مركبات مباشرة إلى الحمام أو عن طريق الأقطاب الكهربائية التحفيز المجال التي تنشط الأعصاب، مشابهة لاثار تقلصات المثانة في الجسم الحي. نحن لشرح استخدام هذا الأسلوب لتقييم عفوية انقباض العضلات الملساء خلال التنمية وبعد إصابة الحبل الشوكي التجريبية، وطبيعة العصبي (أجهزة الإرسال ومستقبلات المعنية)، العوامل التي تدخل في تعديل نشاط العضلات الملساء، ودور المكونات الفردية المثانة، والأنواع والاختلاف الجهاز ردا على وكلاء الدوائية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدامها للتحقيق في مسارات الخلايا المشاركة في الانكماش و / أو الاسترخاء في العضلات الملساء، والعلاقات هيكل النشاط المخدرات وتقييم الافراج الارسال.
وقد استخدم في المختبر السلس طريقة انقباض العضلات على نطاق واسع FOص أكثر من 50 عاما، وقدمت البيانات التي ساهمت بشكل كبير في فهمنا وظيفة المثانة وكذلك لتطوير المستحضرات الصيدلانية من المركبات المستخدمة حاليا سريريا لإدارة المثانة.
Introduction
يرتاح العضلات الملساء للسماح المثانة تخزين البول، والعقود للحصول القضاء البول. وبوساطة من الاسترخاء الجوهرية خصائص العضلات الملساء والافراج منشط بافراز (NE) من الأعصاب متعاطفة، والذي ينشط مستقبلات بيتا الأدرينالية (β 3 AR في الإنسان) في النافصة. ويتحقق عن طريق تثبيط يفرغ مدخلات متعاطف وتفعيل الأعصاب الحركية التي تطلق أدن تشافيز / ATP للتعاقد المثانة العضلات الملساء 1. العديد من الحالات المرضية، بما في ذلك الدماغ و / أو إصابة الحبل الشوكي والأمراض العصبية، مرض السكري، وانسداد مخرج المثانة أو التهاب المثانة الخلالي، يمكن أن يغير بشكل عميق وظيفة المثانة، مع تأثير شديد على نوعية حياة المريض 2. هذه الظروف تغير انقباض العضلات الملساء التي تؤثر على واحد أو أكثر من مكونات المثانة: العضلات الملساء، وارد أو أعصاب صادرة و / أوالغشاء المخاطي.
عدة في الجسم الحي وطرق المختبر لدراسة وظيفة المثانة وضعت. في الجسم الحي، قياس المثانة هو القياس الأساسي من وظيفة المثانة. وإن كان هذا هو إعداد سليمة تسمح جمع المعلومات تحت بالقرب من الظروف الفسيولوجية، هناك عدد من الظروف التي يفضل استخدام شرائط العضلات الملساء. وتشمل هذه الحالات عندما الجراحية و / أو التلاعب الدوائية شأنه أن يؤثر على بقاء واستقرار إعداد في الجسم الحي، أو عندما تتطلب الدراسات استخدام الأنسجة البشرية أو المواد الكيميائية باهظة الثمن. هذه الطريقة تسهل أيضا دراسة آثار المخدرات والعمر وعلم الأمراض في كل مكون من المثانة، أي العضلات الملساء، الغشاء المخاطي، وارد والأعصاب صادرة.
وقد استخدمت شرائط المثانة على مر السنين العديد من المجموعات للإجابة على عدد من الأسئلة العلمية. كانت تستخدم لإيفاالتغييرات luate في النشاط العفوي عضلي الناجمة عن الأمراض. ويعتقد أن هذا النشاط إلى المساهمة في الاستعجال والتردد أعراض فرط نشاط المثانة (OAB)، وبالتالي فهي هدف للمخدرات التي يجري تطويرها لOAB 3-9. استخدمت شرائط المثانة أيضا للتحقيق في العوامل المنشأ العضلي والعصبية التي تعدل نبرة العضلات الملساء بهدف اكتشاف القنوات الأيونية و / أو مستقبلات و / أو المسارات داخل الخلايا التي يمكن أن تكون مستهدفة للحث إما الاسترخاء أو تقلص العضلات الملساء 3،10- 13. وقد ركزت دراسات أخرى على طبيعة العصبي، بما في ذلك أجهزة الإرسال ومستقبلات المعنية والتغيرات الناجمة عن أمراض 14،15. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام أسلوب المقارنات بين الأنسجة من مختلف الأنواع 16- 18، بين الأجهزة 19-21، وتقييم العلاقات المخدرات هيكل النشاط 22-24. وقد استخدم امتدادا لهذا الأسلوب لقياس آثافةالبريد تأثير المخدرات على الإفراج الارسال من أعصاب صادرة 25. وعلاوة على ذلك، مجموعة متنوعة من الأنسجة (المثانة ومجرى البول والجهاز الهضمي، GI) تحصد من الحيوانات أو البشر (من العمليات الجراحية أو الأنسجة المانحة الجهاز وافق لأبحاث) ومن مجموعة متنوعة من النماذج الحيوانية بما في ذلك إصابات الحبل الشوكي (النخاع الشوكي)، منفذ المثانة العرقلة (BOO)، أو التهاب المثانة الخلالي (IC) يمكن التحقيق باستخدام هذه التقنية.
نحن في هذه الورقة توضيح استخدام هذه الطريقة مع البروتوكولات التجريبية اللازمة، لمعالجة العديد من المسائل العلمية المذكورة أعلاه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات الموضحة هنا من قبل لجنة IACUC في جامعة بيتسبرغ.
1. حلول
- إعداد الحل كريبس بحسب وصفه. تكوين في ملي: 118 كلوريد الصوديوم، بوكل 4.7، 1.9 CaCl 2، MgSO 4 1.2، NaHCO 3 24.9، KH 2 PO 4 1.2، سكر العنب 11.7.
- تهوية كريبس مع 95٪ O 2، 5٪ CO 2 ووضعه في حمام الماء 37 درجة مئوية ليتم استخدامها في كافة مراحل التجربة. ضع جانبا ~ 200 مل من محلول كريبس الهوائية في درجة حرارة الغرفة لاستخدامها في تشريح الأنسجة.
- قياس الرقم الهيدروجيني (~ 7.4) والأسمولية (~ 300 الميلي أسمول) من الخلوية كريبس.
2. التجريبية مجموعة المتابعة (تخطيطي الشكل 1A)
- ملء الغازي (95٪ O 2، 5٪ CO 2) غرف مع 10 مل كريبس.
- بدء ضخ المياه المنتشرة لتسخين الدوائر إلى 37 درجة مئوية؛ تشغيل المعدات اللازمة: مكبر للصوت (ق)، مشجعا (ق) وتسجيل البرامج.
- معايرة محولات مع 1 غرام من الوزن.
3. الأنسجة (الشكل 1B)
إزالة المثانة من شخص بالغ السذاجة أنثى سبراج داولي الفئران (200-250 غرام؛ ~ 10-12 أسابيع من العمر) باتباع الخطوات التالية:
- إعداد منطقة تشريح والأدوات اللازمة: ماكينة حلاقة كهربائية، مع ملقط الأسنان، شفرة مشرط، مقص تشريح، microscissors، وهما ملقط تشريح (الكتاب تفضل دومون ملقط 3 #)، ومقاطع الأنسجة (أو خياطة الحرير)، طبق تشريح Sylgard المغلفة مع كريبس و دبابيس تشريح الأنسجة.
- تخدير الحيوانات مع استنشاق الأيزوفلورين (4٪ في O 2) في غرفة الاستقراء. استخدام مرهم البيطرية على العينين لمنع جفاف بينما تحت التخدير. باستمرار رصد مستوى التخدير من خلال مراقبة معدل التنفس، والاستجابة للمؤثرات الخارجية، وفقدان أطرافهم الخلفية سحب المنعكس.
- عندما يتم تخدير الحيوان حلق في أسفل البطنالجرمية. فضح أجهزة الحوض عن طريق شق البطن خط الوسط. التعرف على المثانة ومجرى البول. إزالة المثانة عن طريق قطع عند عنق المثانة قريبة من مجرى البول القريبة. وضع الأنسجة فورا في طبق المغلفة Sylgard مليئة حل كريبس الهوائية.
- إذا لزم الأمر، وإزالة النسيج إضافية في هذا الوقت: مجرى البول، قطعة من الجهاز الهضمي (GI) الجهاز و / أو البروستاتا، الخ
- التضحية الحيوانية باستخدام طرق IACUC الموافقة (على سبيل المثال، جرعة زائدة من مخدر أو CO 2 اختناق يليها طريقة الثانوي).
- إدراج دبابيس تشريح الأنسجة من خلال قبة المثانة والعنق، والحالب، لاستقرار الأنسجة لمزيد من تشريح. لا تمتد الأنسجة. إزالة الدهون، والنسيج الضام، الاحليل الداني، والحالب إذا كان موجودا.
- فتح المثانة من القاعدة إلى قبة لإنشاء ورقة مسطحة، المصلية الجانب أسفل / الجانب اللمعية يصل (الشكل 1B). وضع دبابيس تشريح في كل ركن من الأنسجة. إزالة المثانة دومه والأنسجة الرقبة.
- إذا كان الغرض من التجربة هو تحديد مساهمة المخاطية (الظهارة البولية والصفيحة المخصوصة - انظر الرسم البياني الشكل 1C) إلى تقلص العضلات على نحو سلس، مقارنة خصائص شرائط النافصة مع وبدون الغشاء المخاطي المرفقة. لهذا، قبل قطع الأنسجة في الشرائط، وإزالة بعناية الطبقة المخاطية باستخدام مقص القزحية الربيع وملقط غرامة تحت المجهر تشريح. في نهاية التجربة، وتحديد شرائح للH & E تلطيخ لتأكيد الإزالة الكاملة من الغشاء المخاطي. لاحظ أن هذا الإجراء هو أسهل في الماوس المثانة في المثانة من الفئران.
- قطع النسيج طوليا من القاعدة إلى قبة إلى شرائح من ~ 2 × 8 مم (الشكل 1B). ربطة عنق أو إرفاق مقطع الأنسجة لطرفي كل شريط.
وعادة ما يمكن أن تقطع إحدى المثانة الفئران إلى 4 شرائح ولكن عدد من الشرائط يمكن أن تزيد أو تنقص تبعا لحجم الحيوان / المثانة: ملاحظة. - نقل شرائط للEXPERغرف imental. إرفاق واحدة من نهاية كل قطاع لمحول القوة، الذي يقيس تقلص الأنسجة، والآخر إلى ثابت قضيب الزجاج / المعادن.
ملاحظة: غرف الأنسجة تختلف في الحجم (0.2 مل إلى 20 مل أو أكبر). غرف نموذجية لقربة القوارض هي 5-20 مل، والتي توفر ارتفاع كاف للشرائط ليكون المغمورة تماما في الحل. بعض الغرف تأتي مع المدمج في أقطاب التحفيز، والبعض الآخر لا. ينبغي توخي الحذر لضمان أن كافة الاتصالات من الأقطاب الكهربائية هي في حالة جيدة، وإلا التحفيز مجال كهربائي ليست مضمونة. - تطبيق كمية محددة من القوة لكل قطاع التي تمتد بلطف الأنسجة حتى يصل التوتر الأساسي 1 جم (10 مليون). في البداية الأنسجة تميل إلى الاسترخاء التي يتم تسجيلها وانخفاض في التوتر الأساسي. الأنسجة غسل تقريبا كل 15 دقيقة باستخدام الهوائية الدافئة كريبس وضبط التوتر الأساسي إلى 1 غرام بعد كل غسل. تسمح الأنسجة لكي تتوازن ل~ 1-2 ساعة أو حتى التوتر الأساسي هو مستقر (أي لا مزيد من الاسترخاء الأنسجة).
- يتم التوصل إلى اختبار قابلية الأنسجة بإضافة بوكل (80 ملم) مباشرة إلى الحمام ل~ 5 دقائق، أو حتى استجابة الهضبة. ويمكن أيضا الردود على تركيزات عالية من بوكل أن يتكرر خلال التجربة أو في نهاية التجربة وتستخدم لتطبيع الردود على أدوية أخرى أو بين شرائح (انظر التطبيع تحت قسم تحليل البيانات).
- الأنسجة غسل عدة مرات (3-5x) مع كريبس الهوائية الدافئة للسماح للأنسجة بالعودة إلى ظروف ما قبل المعالجة.
4. تحفيز البروتوكولات
- للتحقيق في الآثار علم الأمراض على نشاط عضلي عفوية أو العضلات الملساء، استخدم شرائط العضلات الملساء من نماذج حيوانية مختلفة مثل اصابات النخاع الشوكي، BOO، أو حديثي الولادة. الشكل 2 يوضح استخدام هذا الأسلوب لتحقيق تغييرات في المثانة النشاط العفوي خلال تطوير و بعد اصابات النخاع الشوكي. بالإضافة إلى ذلك، وكلاء الدوائية يمكن استخدامها لتعديل ليرة سوريةالنشاط ontaneous. يوضح الشكل (3) تأثير جهري قناة KCNQ، flupirtine وXE991، على النشاط العفوي ونبرة العضلات الملساء.
- لتنشيط العضلات الدوائية بناء منحنيات استجابة سلسة تركيز بإضافة مركبات من الحلول الأسهم المركزة مباشرة إلى الحمام في فترات زمنية محددة. استخدام المخدرات والسيارة في شرائط متوازية لحساب السيارة والوقت الآثار.
- جعل الحلول الأسهم من المركبات المطلوبة في اختبار 1000X تركيز العمل النهائي. لكرباكول (لجنة التنسيق)، ومستقبلات المسكارينية ناهض، وإعداد الأسهم التالية: 10 -5 M، 3 × 10 -5 M، 10 -4 M، 3 × 10 -4 M، 10 -3 M، 3 × 10 -3 M 10 -2 م. تركيزات النهائي في الحمام هي 10 -8 M إلى 10 -5 M (أرقام 4C، D). لneuromedin B (NMB)، والنوع الفرعي 1 بومبيزين مستقبلات ناهض، وإعداد الأسهم التالية: 10 -8 M، 10 -7M، 10 -6 M، 10 -5 M، 10 -4 M، 10 -3 M وتركيزات النهائية في الحمام هي 10 -11 M إلى 10 -6 م. ومن المتوقع أن تزيد انقباض الأنسجة كلا من لجنة التنسيق وNMB.
- لحمام الأنسجة 10 مل، إضافة 10 ميكرولتر من كل محلول المخزون جنة التنسيق حالما تصل إلى استجابة هضبة (الشكل 4C، D). في شرائط متوازية إضافة كميات متساوية من السيارة (الماء). وبالمثل، إضافة 10 ميكرولتر من كل حل neuromedin الأسهم B ~ كل 5 دقائق.
ملاحظة: لاحظ تأثير مثير للNMB وCCH على العضلات الملساء في شرائط من نوع مختلف في الشكل 4. - التحقيق في خصائص ارتخاء العضلات الملساء في الأنسجة ما قبل التعاقد مع وكيل مثير، عادة لجنة التنسيق أو بوكل.
- لمنع استجابة ناهض، يمهد للمعالجة الأنسجة لمدة 10-20 دقيقة مع خصم للسماح اختراق الأنسجة، قبل ناهض التحفيز.
- لSTIM العصبيةulation من العضلات الملساء، وتسمى أيضا تحفيز الحقل الكهربائي (EFS) اتبع الخطوات من 1 حتي 3،13 والاستمرار كما هو موضح أدناه. والمقصود EFS لتنشيط الأعصاب انتقائي مقابل العضلات الملساء. المعلمات لتحفيز يجب اختيارها بعناية لتجنب تحفيز العضلات الملساء المباشر.
- إنشاء المعلمات التحفيز: نوع من التحفيز (البقول واحدة أو القطارات)، والمدة (مدة النبضة ومدة القطار)، وتواتر وشدة، كما هو موضح في الخطوات التالية ويتضح في أرقام 5A، B.
- لتحفيز نبض واحد، تعيين مدة النبضة، فاصل بين التحفيز وعدد من المحفزات المطلوبة. المعلمات المعتادة مدة التحفيز هي واحدة من البقول ،05-0،3 مدة ميللي ثانية تسليمها على فترات المطلوب (الشكل 5A). اتبع الخطوة 4.3.1.4 لكثافة التحفيز.
- لتحفيز القطار، وتعيين المدة الفاصلة القطار والقطار أمور. و3-10 ثانية سلمت القيم النموذجية للأنسجة المثانة لا يقل عن 1 مفي ما عدا (الشكل 5B). في حال حدوث التعب الأنسجة (أي EFS تقلصات تنخفض خلال فترة الرقابة)، وزيادة الفترة الفاصلة بين القطار.
- إنشاء تواتر المحفزات القطار (عدد النبضات في قطار - الشكل 5B). تشغيل منحنى استجابة التردد تتراوح 0،5 حتي 50 هرتز. ترددات نموذجية لالمثانة هي 10-20 هرتز، والتي تعطي تقلصات متكررة ومستقرة بوساطة ATP وأدن تشافيز. مراقبة استجابات تعتمد تردد لتحفيز EFS في شرائط الماوس المثانة في الشكل 5 يظهر كيف يمكن استخدام هذه الطريقة لتقييم مساهمة الكوليني وآليات purinergic إلى العصبي.
- إنشاء شدة التحفيز: زيادة منهجية كثافة (جهد) من التحفيز حتى اتساع انكماش تصل إلى الهضبة (في حال استخدام قطارات تبقي ثابت التردد).
- تعيين شدة التحفيز اعتمادا علىتهدف التجربة. إذا كان الهدف هو زيادة تقلصات-أثار العصبي، ثم استخدم كثافة submaximal ان هذه السعة من الانكماش هي ~ 50٪ من انكماش القصوى. إذا كان الهدف هو تقليل تقلصات-أثار العصبي، ثم تعيين كثافة إلى ~ 80٪ من السعة القصوى لتجنب التعب الأنسجة.
- مرة واحدة يتم وضع المعلمات التحفيز (مدة وتواتر وشدة)، تسمح ~ 20-30 دقيقة لEFS- أثار تقلصات لتحقيق الاستقرار قبل الاختبار المخدرات.
ملاحظة: للتحقق من الانتقائية في EFS لنقل العصبي، كتلة الإرسال العصبي مع حاصرات قنوات الصوديوم، سم الأسماك الرباعية الأسنان (TTX، 0.5-1 ميكرومتر). تنفيذ هذه الخطوة في بداية التجربة، كما TTX يغسل من السهل نسبيا. وبالإضافة إلى ذلك، نفذ هذا في نهاية التجربة (راجع الخطوة 4.3.5. أدناه). - إعداد الحلول الأسهم في 1،000x تركيزات العمل النهائية ل: ألفا، بيتا الميثيلين ATP (ABMA، مستقبلات المنشط purinergicوdesensitizer) 10 -2 M، الأتروبين (أ مستقبلات المسكارينية) 10 -3 M (الشكل 5C). نلاحظ أمثلة أخرى في الشكل 6. و5HT4 مستقبلات ناهض، سيسابريد (3 × 10 -6 M، 10 -6 M، 3 × 10 -5 M، M 10 -5، 3 × 10 -4 M، 10 -4 M، 3 × 10 -3 M، 10 -3 M)، ويزيد من انقباض الأنسجة وSB-203186 (3 × 10 -3 M)، وهو 5HT4 مستقبلات، عكس آثار سيسابريد ل.
- لاختبار آثار ABMA والأتروبين على EFS (الشكل 5C)، نفذ اثنان السيطرة منحنيات استجابة التردد. إضافة 10 ميكرولتر من 10 -2 M ABMA إلى الحمام لتركيز النهائي من 10 ميكرومتر. وهذا التعاقد الأنسجة بسبب التحفيز المباشر للمستقبلات purinergic في العضلات الملساء. بعد عودة ردا على خط الأساس، كرر منحنيات استجابة التردد. إضافة 10 ميكرولتر من 10 -3 M الأتروبين لويركز النهائيايون من 1 ميكرومتر. ~ بعد 10 دقيقة (اللازمة لالأتروبين لمنع مستقبلات المسكارينية)، كرر منحنيات استجابة التردد. في شرائط متوازية إضافة 10 ميكرولتر من السيارة، والمياه، في كل خطوة.
ملاحظة: للحصول على أمثلة أخرى في الشكل 6، إضافة 10 ميكرولتر من كل محلول المخزون سيسابريد على فترات محددة الوقت (~ كل 15 دقيقة، انظر المناقشة)، تليها 10 ميكرولتر من SB-203186 حل الأسهم مباشرة إلى الحمام ورصد تأثيرها على EFS الناجم عن الانكماش. في شرائط متوازية إضافة 10 ميكرولتر من السيارة، DMSO. رصد آثار سيسابريد، ناهض مستقبلات 5HT4، على تقلصات EFS أثار في المثانة والأنسجة البشرية الدقاق في الشكل 6. بالإضافة إلى ذلك، يلاحظ تأثير DMSO، وسيلة لسيسابريد، على EFS-أثار تقلصات في المثانة والأنسجة البشرية الدقاق . - في نهاية البروتوكول EFS التحقق من الانتقائية EFS من خلال منع انتقال العصبي مع حاصرات قنوات الصوديوم، سم الأسماك الرباعية الأسنان (TTX، 0.5-1 و# 181، M). إذا TTX تقلصات المقاومة لا تزال موجودة، فمن المستحسن لضبط مدة وشدة التحفيز في التجارب اللاحقة.
- إنشاء المعلمات التحفيز: نوع من التحفيز (البقول واحدة أو القطارات)، والمدة (مدة النبضة ومدة القطار)، وتواتر وشدة، كما هو موضح في الخطوات التالية ويتضح في أرقام 5A، B.
- لتحديد آثار المخدرات على مواقع ما قبل أو ما بعد متشابك (الشكل 7A) اتبع الخطوات من 1 إلى 4.3.2. إنشاء استجابات استنساخه لكرباكول وEFS، ثم يضاف اكس المخدرات
- في نهاية التجربة، قم بفك أو فك الشرائط، وصمة عار لهم بلطف على قطعة من المناديل الورقية لإزالة السوائل الزائدة وقياس الوزن كل قطاع باستخدام التوازن. أيضا قياس طول الأنسجة باستخدام الفرجار لتحديد مساحة المقطع العرضي. وتستخدم هذه المعلومات لتطبيع البيانات (انظر القسم 5.4).
تحليل البيانات 5.
تحليل البيانات باستخدام برنامج الكافي (على سبيل المثال، Windaq، LabChart).
- عن النشاط العفوي، حدد نافذة لا تقل عن 30 ثانية قبل و في ذروة الاستجابة المخدرات التي يسببها لي وASURE اتساع وتيرة النشاط عضلي (الشكل 3).
- استخدام تحليل سريع لتحديد تحويل فورييه طيف الترددات المساهمة في مقلص الردود وإذا كانت هناك اختلافات بين أجزاء مختلفة من المثانة (على سبيل المثال، مقابل قبة الرقبة) أو مع التنمية، علم الأمراض، والأدوية 8.
- للآثار على العضلات الملساء تحديد نافذة من 10-30 ثانية على الأقل قبل وفي ذروة الاستجابة المخدرات التي يسببها وقياس السعة من الانكماش.
- للآثار على تقلصات أثار العصبي، قياس السعة والمدة والمساحة تحت منحنى تقلصات (3 على الأقل) قبل وفي ذروة الاستجابة المخدرات التي يسببها.
ملاحظة: من الضروري قياس كل من السعة والمساحة تحت المنحنى من تقلصات يسببها EFS لمكونات purinergic والكوليني لها حركية مختلفة. المكون purinergic سريع وعابر (ATP ينشط purinergiج ionotropic قنوات مثل P2X1 التي تسمح تدفق سريع للكالسيوم، ثم أنها توعي)، مما يسهم أكثر إلى الاستجابة ذروة السعة وأقل إلى المنطقة تحت المنحنى. المكون الكوليني أبطأ وتستمر (أدن تشافيز ينشط مستقبلات المسكارينية metabotropic، والتي تتطلب المزيد من الوقت لتنشيط مسارات الخلايا التي تنشط في النهاية القنوات الأيونية أن يزيل الاستقطاب العضلات الملساء للحث على انكماش). وبالتالي، يتم التقاط المكون المسكارينية أفضل من خلال قياس المساحة تحت المنحنى. - تطبيع البيانات لتكون قادرة على مقارنة النتائج عبر شرائط والعلاجات الدوائية. لا ينبغي أن تتأثر المعلمة الذي تم اختياره لتطبيع من قبل مركبات الاختبار، الحالة المرضية المدروسة أو التصميم التجريبي. ومن بين هذه المعايير، الوزن استخدام الشريط، مساحة المقطع العرضي، والاستجابات بوكل (الشكل 4B)،٪ من الاستجابة القصوى (الشكل 7B) أو٪ من الاستجابة القصوى إلى وكيل مقلص آخر(على سبيل المثال، لجنة التنسيق) أو وكلاء الاسترخاء (على سبيل المثال، بابافيرين).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عفوية نشاط عضلي
عضلي النشاط العفوي هو سمة العضلات الملساء الهامة التي يخضع لتغيرات مع التنمية ما بعد الولادة 6-9 وعلم الأمراض (مثل اصابات النخاع الشوكي، BOO) 3-5. لأنه يعتقد هذا النشاط إلى المساهمة في أعراض فرط نشاط المثانة (OAB) 2، وتقييم المستقبلات، مسارات داخل الخلايا وكلاء الدوائية التي تعدل فيه، هو من مصلحة كبيرة لتطوير علاجات فعالة لOAB وغيرها من الاختلالات العضلات الملساء. الطريقة المعروضة هنا يمكن بسهولة أن تحقق هذه الأسئلة الشكل 2 يوضح أنماط مختلفة من النشاط العفوي عضلي خلال التنمية في حديثي الولادة (ط)، الأحداث (ب) الكبار (ج) والحبل الشوكي إصابة الفئران. (SCI؛ الرابع). شرائط من الفئران حديثي الولادة تظهر السعة الكبيرة، والانقباضات الإيقاعية التردد المنخفض (الشكل 2Ai)، في حين أن شرائح من الفئران الكبارق المعرض السعة الصغيرة، وارتفاع وتيرة النشاط (الشكل 2Aii، الثالث). بعد اصابات النخاع الشوكي نمط حديثي الولادة إعادة يظهر (الشكل 2Aiv). بالإضافة إلى استخدام شرائط من النماذج الحيوانية، ومختلف وكلاء الدوائية يمكن أن تستخدم للحث على تقلصات عفوية في شرائط من الحيوانات ساذجة، بهدف فهم الآليات الكامنة وراء تقلصات عفوية. أمثلة من وكلاء الدوائية مناسبة تشمل منبهات مستقبلات المسكارينية (كرباكول، لجنة التنسيق).، والمركبات التي تزيد من مستويات أدن تشافيز (مثل مثبطات الأستيل كولين استريز)، وتركيزات منخفضة من بوكل (على سبيل المثال، 20 ملم) أو عقاقير تجريبية أخرى أرقام 3A-B، توضح التشكيل من النشاط العفوي من قبل وكلاء الدوائية التي تعمل على قنوات KCNQ تقع على العضلات الملساء. وفتحت قناة KCNQ، flupirtine، يقلل من اتساع وتيرة النشاط العفوي بطريقة تعتمد على التركيز (الشكل 3Ai-III)، في حين أنKCNQ حاصرات قنوات، XE991، يقلل من السعة لكنه يزيد من وتيرة النشاط العفوي (الشكل 3Bi-III).
العضلات الملساء
العضلات الملساء وانقباض الخصائص هي عوامل مهمة لوظيفة المناسبة من المثانة أثناء التخزين ويفرغ. يمكن هذا الأسلوب الشاشة بسهولة آثار كلاء الدوائية على العضلات الملساء شخصيات 3Aiv و3Biv تبين أن flupirtine يقلل هجة القاعدية، بما يتفق مع استرخاء العضلات الملساء، في حين أن الزيادات XE991 العضلات الملساء الشكل 4 يوضح زيادة تركيز تعتمد في العضلات الملساء من خلال تفعيل مستقبلات بومبيزين مع neuromedin B (NMB، الشكل 4A، B) أو مستقبلات المسكارينية مع كرباكول (لجنة التنسيق، أرقام 4C، D). وعلاوة على ذلك، مسارات داخل الخلايا تتوسط هذه الاستجابات العضلات الملساء يمكن التحقيق شالغناء جهري محددة (لا تظهر البيانات).
الردود بوساطة العصبي والتحوير من النقل العصبي
ويتحقق المثانة انكماش قبل الافراج عن أدن تشافيز / ATP من الأعصاب صادرة السمبتاوي. تختلف مساهمة أنظمة المسكارينية وpurinergic إلى تقلص المثانة بين الأنواع والحالات المرضية، مع زيادة السائدة في purinergic مساهمة في أمراض مثل التهاب المثانة الخلالي، منفذ عرقلة جزئية، وفرط نشاط المثانة 26. يبين الشكل 5C استخدام هذا الأسلوب لتحديد مساهمة مكونات المسكارينية وpurinergic إلى المثانة العصبي في شرائط من الماوس. تم تقييم مساهمة المكون الكوليني باستخدام مستقبلات المسكارينية، الأتروبين. تم تقييم مساهمة منظومة purinergic استخدام المنشط مستقبلات purinergic وdesensitizer، ألفا، بيتا الميثيلالشم ATP (ABMA). بالإضافة إلى ذلك، تم تقييم مساهمة تردد تعتمد كل عنصر من خلال تغيير وتيرة التحفيز من الأقل إلى الترددات العالية (2-50 هرتز).
قوة انقباض المثانة تلعب دورا هاما في يفرغ بكفاءة. باستخدام هذه الطريقة، ومستقبلات التي تعدل مسارات انتقال العصبي يمكن التحقيق كأهداف المخدرات ليفرغ الخلل. يتم التعبير عن مستقبلات 5HT4 قبل junctionally في الخلايا العصبية الحركية وتفعيلها يزيد من مستويات 27 أدن تشافيز الشكل 6 يوضح تأثير مثير للمستقبلات ناهض 5HT4، سيسابريد، في المثانة والدقاق شرائط الإنسان.
يمكن استخدام البروتوكولات التجريبية المختلفة لتحديد موقع عمل مركب الاختبار. الرسم البياني في الشكل 7A يوضح بروتوكول يستخدم لتقييم ما قبل مقابل المواقع بعد صلي. إذا X المخدرات يقلل (أو زيادة) استجابة EFS ولكن ليس له يالحظر على الاستجابة لجنة التنسيق، الموقع الأكثر احتمالا للعمل هو ما قبل وصلي. إذا المخدرات X يغير كلا EFS لجنة التنسيق وردا على ذلك، فإنه قد يعمل على مستقبلات تقع بعد junctionally أو كليهما قبل وبعد junctionally.
دور كل مكون: العضلات الملساء، الغشاء المخاطي، والخلايا العصبية
الحالات المرضية المختلفة قد تؤثر على مختلف عناصر المثانة. على سبيل المثال التهاب المثانة الخلالي (IC) يؤثر في المقام الأول على الظهارة البولية، في حين OAB قد يؤدي إلى انقباض العضلات الملساء غيرت. أيضا، يمكن التعبير عن مستقبلات مختلفة في كل مكون المثانة، وبالتالي يمكن أن تستهدف على وجه التحديد في أمراض معينة. بدلا من الأساليب في الجسم الحي، التي تقيس تأثير الصافي لجميع مكونات المثانة، وهذه الطريقة في المختبر يسمح التحقيق في مكونات معينة باستخدام مزيج من الإجراءات الجراحية والدوائية. لاختبار تقلص العضلات الملساء / الاسترخاء في غياب العصبيةانتقال، TTX (0.5-1 ميكرومتر) يمكن أن تضاف إلى الحمام. في الشكل 4، تم اختبارها وNMB جنة التنسيق في وجود TTX. لاختبار مساهمة المخاطية (الظهارة البولية والصفيحة المخصوصة) إلى انقباض العضلات الملساء، تتم مقارنة شرائح مع وبدون الطبقة المخاطية. يبين الشكل 7B أن الاستجابات لجنة التنسيق يتم تخفيض في وجود الغشاء المخاطي في خنزير 28. أبلغ عن نتائج مماثلة في شرائط المثانة الإنسان 29. لاختبار دور الألياف العصبية، ويمكن اتخاذ عدة نهج. واحد هو لتنشيط أو تثبيط الألياف محددة باستخدام وكلاء الدوائية. على سبيل المثال، كبخاخات تنشط مجموعة سكانية محددة من الأعصاب وارد وتسبب الأنواع التي تعتمد تقلص العضلات الملساء أو الاسترخاء 17،18. غوانيثيدين يمنع إطلاق سراح بافراز من الألياف العصبية الودية، وبالتالي القضاء على مساهمة هذه الألياف. وثمة نهج آخر هو توعي / القضاء على الألياف محددة في الجسم الحيقبل التجربة. على سبيل المثال، العلاج الشامل للحيوان مع تبلد كشافات كشافات وارد الأعصاب الحساسة. مكونات المثانة الأخرى التي يمكن دراستها في هذا الإعداد هي خلايا الخلالية أو تقاطعات الفجوة من خلال تفعيل أو منعها مع وكلاء محدد.
الاختلافات الأنواع
في حين يقصد معظم تطوير الأدوية لعلاج الاضطرابات البشرية، يتم تنفيذ البحوث الأساسية في المقام الأول في الأنسجة الحيوانية. توجد الاختلافات بين الأنواع في عدد من المستقبلات. على سبيل المثال، منبهات مستقبلات 5HT4 تعزيز تقلصات أثار العصبي في الإنسان المثانة ولكن ليس في المثانة الفئران 19،30، EFS الناجم عن تقلصات وتقريبا بشكل حصري حساسة-الأتروبين في النافصة الإنسان وقرد العالم القديم من قربة مستقرة 31 ولكن أصبح جزئيا في النافصة الإنسان مقاومة للالأتروبين من المرضى الذين يعانون من حالات المثانة غير المستقرة (مثل العصبية، obstructeقربة د) 15،32،33، كشافات يثير استجابة مثير في الفئران والإنسان المثانة الشرائط، أي رد في شرائط المثانة الخنازير واستجابة المثبطة في خنزير غينيا شرائط المثانة 17،18 الشكل 4 يبين أن بومبيزين منبهات مستقبلات لها آثار مثير على المثانة الفئران وليس له آثار على الماوس والمثانة خنزير شرائط 16. هذه المعلومات حاسمة لاختيار نموذج حيواني المناسب لدراسة مستقبلات محددة.
مقارنة الحساسية عبر أجهزة
العقاقير المخصصة لعلاج اضطرابات المثانة قد تؤثر أيضا على العضلات الملساء من الأجهزة الأخرى، مثل الجهاز الهضمي، مجرى البول والمرارة وغير ذلك وهذا الأسلوب يسمح تقدير الانتقائية وحساسية الجهاز إلى وكيل الدوائية بمقارنة الأنسجة المختلفة جنبا إلى جنب. كما هو موضح في الشكل (6)، و5HT4 مستقبلات ناهض، سيسابريد، وقد تختلففعالية الأنف والحنجرة والمثانة فعالية في الأنسجة البشرية مقابل الدقاق.
الرقم 1. التجريبية مجموعة المتابعة وإعداد شريط المثانة. A) تخطيطي للالتجريبية مجموعة المتابعة. والمغمورة شرائط المثانة في غرف الأنسجة مليئة حل كريبس الهوائية أبقى في 37 ° C عن طريق ضخ المياه المنتشرة. يتم إرفاق واحدة من نهاية الشريط إلى قوة محول متساوي القياس لقياس انقباض الأنسجة، وأخرى لقضيب ثابت. توصيل محول القوة لمكبر للصوت وجهاز الكمبيوتر لتسجيل البيانات. يتم وضع أقطاب التحفيز حقل كهربائي متصلة مشجعا في غرفة واستخدامها لإثارة تقلصات المثانة بوساطة العصبي. B) إعداد شرائح الأنسجة. ويعلق أسفل المثانة في طبق ويتم تنفيذ الإجراءات التالية: # 1 العمودية قطع عشرنصف بطني ough المثانة من مجرى البول إلى قبة لفتح المثانة إلى ورقة مسطحة. # 2 تخفيضات الأفقية إزالة القبة وقاعدة المثانة / الاحليل الداني. # 3 تخفيضات العمودية تقسيم منتصف المثانة إلى شرائح متساوية (4 شرائط من المثانة الفئران) C) رسم تخطيطي للمكونات الشريط: العضلات الملساء والغشاء المخاطي، سواء التي تحتوي على وارد (الازرق) وناقل (الأخضر) الأعصاب. يتكون الغشاء المخاطي للالظهارة البولية والصفيحة المخصوصة. الصفيحة المخصوصة يحتوي على الأوعية الدموية [1]، وخلايا الخلالية [2]، والعضلية المخاطية [3]. خط منقط المسمى # 2B يشير إلى الإجراء لإزالة طبقة الغشاء المخاطي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 2. عضلي النشاط العفوي خلال التنمية وبعدعلم الأمراض. أ) أمثلة على النشاط العفوي في حديثي الولادة (ط)، الأحداث (ب)، والكبار سليمة الشوكي (ج) والحبل الشوكي المصاب (SCI) الكبار (د) شرائط المثانة الفئران. تم استخدام الفئران اصابات النخاع الشوكي في 4 أسابيع بعد الجراحة. B، C) ملخص السعة (B)، وتردد (C) من تقلصات عفوية في المجموعات الأربع التحقيق. (مستنسخة بإذن من وضع ارتيم DE، كولمان كرة القدم، دوتري SL، Bupp E، CL إدواردز، دي حبوب WC Neurourol Urodyn نوفمبر 2011، 30 (8):. 1666-74.) الرجاء الضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3. تعديل من النشاط العفوي عضلي والعضلات الملساء. أ) تأثير فتحت قناة KCNQ، flupirtine، على النشاط العفوي ونبرة أساسية في البالغين شرائط المثانة الفئران. وأضاف (ط) Flupirtine في زيادة تركيزات (التراكمية) في الأوقات المشار إليها بواسطة الأسهم. التوسعات تحت التتبع عرض 4 دقائق من النشاط خلال قطاع الرقابة وبعد تطبيق 10 ميكرومتر و 50 ميكرومتر flupirtine. (الثاني إلى الرابع) ملخص آثار flupirtine (7 شرائط من 4 الفئران) على السعة (ب) وتردد (ج) من النشاط العفوي ونبرة أساسية (د)، كما أعربت نسبة التغيير من سيطرة القيم (ما قبل المخدرات) ، والتي تم تعيينها إلى 100٪. ب) تأثير حاصرات قنوات KCNQ، XE991، على النشاط العفوي ونبرة أساسية في البالغين شرائط المثانة الفئران. وأضاف (ط) XE991 في زيادة تركيزات (التراكمية) في الأوقات المشار إليها بواسطة الأسهم. التوسعات تحت التتبع تظهر 2 دقيقة من النشاط خلال قطاع الرقابة وبعد تطبيق 10 ميكرومتر و 50 ميكرومتر XE991. (الثاني إلى الرابع) ملخص آثار XE991 (9 شرائح من الفئران 4) علىالسعة (ب) وتردد (ج) من النشاط العفوي ونبرة أساسية (د)، كما أعربت نسبة التغيير من التحكم (ما قبل المخدرات) القيم التي تم تعيينها إلى 100٪. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم .
الرقم 4. أنواع الخلافات. أ) تركيز تعتمد تقلصات العضلات الملساء ردا على ناهض مستقبلات بومبيزين، neuromedin B (NMB)، في شرائط المثانة الفئران. B) ملخص آثار NMB على تقلص العضلات الملساء في المثانة شرائح الفئران. البيانات هي تطبيع لبوكل (80 ملم) استجابة. C، D) غياب الردود على NMB في الماوس (C) والخنازير (D) شرائط المثانة. كرباكول (لجنة التنسيق) يثير تركيز قوي يعتمد يخدعtractions في كل من الفأر والخنزير شرائط، مشيرا إلى أن الشرائط يمكن أن تستجيب للمؤثرات. كان TTX (0.5 ميكرومتر) الحالي في الحمام في جميع الشرائط. (مستنسخة بإذن من كولمان كرة القدم، ماكينا D، ويلز GI، ثور KB نيوروببتيد أكتوبر 2013 و 47 (5):. 305-13) يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. التحفيز المجال الكهربي. A) تخطيطي واحدة من المعلمات التحفيز النبض. الاختصارات: د = مدة النبض، ط = شدة النبض، والمعهد الدولي للصحافة = أمور نبض الفاصلة B) تخطيطي من المعلمات التحفيز القطار. الاختصارات: مدة TD = القطار، ط = شدة النبض، ITI = فاصل القطار أمور. معارض أقحم عدد النبضات في قطار والفاصل betwالتابعين لهم، والتي جنبا إلى جنب مع مدة القطار تحديد وتيرة التحفيز القطار. C) مساهمة مكونات purinegic والكوليني إلى أثار العصبي، تقلصات المثانة. EFS-FR تمثل ترددات التحفيز، 2، 5، 10، 20، 50 هرتز. تم اختبار ثلاثة محفزات تسليم كل 90 ثانية لكل تردد وتكرر كل سلسلة تردد مرتين في السيطرة ومرتين بعد إضافة كل مجمع. ألفا، بيتا الميثيلين ATP، اختصار ABMA (قطاع 1)، كانت تستخدم لتوعي مستقبلات purinergic والأتروبين (2 شريط) كانت تستخدم لمنع مستقبلات المسكارينية. قطاع 3 شغل منصب السيطرة وعولج مع السيارة والماء. السهام تشير إلى الوقت عندما أضيف كل مجمع إلى كل قطاع. لاحظ أن تقلصات EFS أثار تنخفض بشدة ABMA والأتروبين، في حين لا تتأثر السيارة. وأضيف TTX في نهاية التجربة بينما تم تسليم EFS في 20 هرتز. لاحظ أن تقلصات المتبقية التي لوحظت في السيطرةالشريط 3 ألغيت من قبل TTX، مما يدل على طبيعة العصبية (أي التي بدأها الإفراج الارسال من الأعصاب جماعية). # يشير استجابات العضلات الملساء لABMA في غياب EFS. الحانات هي مقياس 5 دقائق لمحور س و 2 ز لمحور ذ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 6. التحوير من تقلصات المثانة أثار العصبي. A، B) أمثلة على تعزيز تقلصات أثار العصبي من قبل ناهض مستقبلات 5HT4، سيسابريد في المثانة الإنسان (A) وشرائح الدقاق (B). وأضيف سيسابريد (سجلات سوداء) أو DMSO (سجلات الرمادية) بطريقة تعتمد على التركيز في الأوقات المشار إليها بواسطة الأسهم. أشرطة سوداء أدناه السجلات في كل لوحةتمثل EFS، الذي يتألف من 10 قطارات ثانية ألقاها في 20 هرتز كل 120 ثانية. الحانات المقياس العمودي هي 1 غرام لجميع الأمثلة. كان تركيز TTX 0.5 ميكرومتر. CF) ملخص المنطقة تحت المنحنى (AUC) من تقلصات EFS أثار ردا على سيسابريد (أشرطة سوداء) أو DMSO (القضبان الرمادية) في شرائط المثانة (C، D) وشرائح الدقاق (E ، F). في CF، SB تقف على SB-203186، وهو ما يمثل ملخصا للبيانات التي تم الحصول عليها بعد إضافة للخصم 5HT4 المستقبلة. يتم تعيين الخطوط المنقطة إلى 100٪ وتمثل السيطرة. (مستنسخة بإذن من كولمان كرة القدم، كوريهارا R، L يي، ويلز GI، ماكينا DG، Burgard EC، ثور KB Auton Neurosci يونيو 2013، 176 (1-2):. 70-7) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فايجوري 7. مواقع العمل من المخدرات ودور مكونات مختلفة من المثانة. A) رسم تخطيطي للبروتوكول لتحديد موقع العمل من المخدرات. يتم تحفيز قطاع غزة مع كلية العلوم التربوية وكرباكول (لجنة التنسيق). في الاول X المخدرات يقلل من استجابة EFS ولكن ليس استجابة لجنة التنسيق، مما يشير إلى الموقع قبل صلي العمل. في الثاني، المخدرات X يغير كلا من الاستجابات، مما يشير إلى العمل على مستقبلات بعد صلي أو كليهما قبل وبعد صلي. B) تأثير على الغشاء المخاطي تقلص العضلات الملساء. تتناقص آثار كرباكول في قطاع غزة مع الغشاء المخاطي الحاضر (سليمة) مقارنة مع شرائط إزالة الغشاء المخاطي (الجرداء). (ويرد B بإذن من الزعرور MH، تشابل CR، الديك M، الشطرنج ويليامز R. برازيلي J Pharmacol فبراير 2000، 129 (3): 416-9). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الورقة وصفنا بسيطة في المختبر السلس طريقة انقباض العضلات التي يمكن استخدامها لمعالجة عدد من المسائل العلمية المهمة المتعلقة المثانة علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض، وكذلك تساعد على اكتشاف أدوية جديدة لعلاج اختلالات المثانة. لقد يتضح استخدام هذه الطريقة لتقييم الخصائص التنموية والمرضية والدوائية من انقباض المثانة العضلات الملساء (الشكلان 2-4)، التشكيل العصبي (أرقام 5-7A)، فإن الاختلافات بين الأنواع (الشكل 4)، والاختلافات الجهاز (الشكل 6) وأهمية مكونات المثانة محددة (على سبيل المثال، الغشاء المخاطي، الشكل 7B). وتشمل تطبيقات إضافية لا يتضح هنا تقييم مسارات داخل الخلايا باستخدام وكلاء الدوائية 3،10،11، والعلاقات هيكل النشاط من مختلف انواع المخدرات 22-24، أو تقييم / تقدير حجم RELE الارسالبورصة عمان بعد التحفيز العصبي 25.
بينما وظيفة المثانة يمكن تقييمها في نهاية المطاف في الجسم الحي، وهذه الطريقة في المختبر يتغلب على العديد من الحالات التي هي إشكالية في الجسم الحي. وتشمل هذه الحالات عندما التلاعب الجراحية والدوائية من شأنه أن يقلل جدوى و / أو بقاء الجهاز أو الحيوان، واستخدام الأنسجة البشرية، والحاجة إلى تحديد وتوصيف ردود من مكونات محددة (مثل العضلات الملساء مقابل ظهارة مقابل الأعصاب ) أو استخدام المواد الكيميائية باهظة الثمن. طريقة يسمح التحقيق المنهجي للآثار مختلف وكلاء الدوائية وكذلك علم الأمراض على النشاط مقلص من العضلات الملساء وبطريقة تسيطر عليها بشكل جيد والبيئة.
يوفر طريقة وفرة من المعلومات؛ ومع ذلك، ينبغي توخي الحذر عند تفسير واستقراء هذه المعلومات. هذا هو الأسلوب في المختبر من إعداد مخفضة، ديسمتصلة من بيئته الطبيعية والسيطرة العصبية. الظروف التجريبية ليست الفسيولوجية، وبالتالي قد لا تعكس البيانات تماما في حالات فسيولوجية الجسم الحي. على سبيل المثال، الأسلوب لا يمكن أن تشكل التغيرات في تدفق الدم والهرمونات والمواد الخلطية، القوى الميكانيكية الخارجية، أو السيطرة العصبية خارجي. واللامركزية الأنسجة تماما، وبالتالي تحتاج إلى استجابات الإصابة ونقص التروية ذات الصلة التي سيتم تقييمها وأخذها في الاعتبار. التغيرات المرضية التي تحدث في الدماغ أو الحبل الشوكي لا يمكن اختبارها باستخدام هذه الطريقة إلا إذا غيرت بالفعل وارد، العضلات الملساء، أو الغشاء المخاطي وظيفة العصب جماعية (أي اللدونة الخلوية). التحفيز الحقل الكهربائي (EFS) يسمح بتقييم الاستجابات بوساطة العصبي. ومع ذلك، فإنه يثير أعصاب جميع دون تمييز في قطاع (على سبيل المثال، متعاطفة، غير المتجانسة، afferents)، في مقابل الوضع في الجسم الحي حيث ينشط منعكس التبول pathw خاصة فقطآيس. طريقة واحدة للتغلب على هذا الوضع تتمثل في الجمع بين EFS مع الخصوم المحددة التي تمنع بشكل انتقائي مسارات مختلفة. على سبيل المثال، يمكن استخدامها غوانيثيدين لمنع إطلاق بافراز عند دراسة خصائص الانكماش، أو يمكن أن يستخدم الأتروبين لمنع مستقبلات المسكارينية لمنع تقلصات المثانة عند دراسة خصائص الاسترخاء. أخيرا، بقاء الأنسجة يقتصر على عدد معين من الساعات. بشكل عام، فإن معظم مكونات النسيج المثانة هي قابلة للحياة ومستقرة (أي الاستجابة لEFS دون تدهور ردود) على مدى فترة من 6-8h أو لفترة أطول. ومع ذلك، قد يكون أكثر حساسية الأنسجة الأخرى (على سبيل المثال، يستمر الدقاق ~ 6 ساعة أو أقل؛ تجربة المؤلف الشخصية).
على الرغم من أن هذه الطريقة مجدية تقنيا وذات استنساخ جيدة، وهناك العديد من الخطوات الحاسمة اللازمة لضمان نجاحها. أولا، يجب أن يتم تنفيذ إعداد الأنسجة بعناية لضمان جدوى من إجراء التغييرات اللازمةلإجراء تشريح (تجنب تمتد الأنسجة أثناء إعداد شرائط) و / أو وسائل الإعلام إذا لزم الأمر لأنواع الأنسجة المختلفة أو الأنواع. خطوة حاسمة أخرى هو وضع المتابعة المعلمات تحفيز الخلايا العصبية، بحيث يتم تجنب الآثار السقف. كما هو موضح في القسم طريقة، وهذا يعتمد على نوع من آلية تنفيذ التجربة والمتوقعة لعمل المجمع الاختبار. على سبيل المثال، عن آثار سيسابريد، ناهض مستقبلات 5HT4 الاختبار، على شرائط المثانة (الشكل 6)، وضعنا اتساع انكماش EFS أثار ل~ 50٪ من القصوى. واستند هذا على آلية تعرف عمل منبهات مستقبلات 5HT4، وهي تعزيز الافراج أدن تشافيز من الأعصاب الحركية قبل موصلي 27، والتي من المتوقع أن يزيد تقلصات EFS أثار في المقابل. وينبغي اختبار تحفيز العضلات مقابل الأعصاب باستخدام TTX، مما يعوق انتقال العصبية، وبالتالي يجب أن تمنع تقلصات EFS أثار. ضوابط كافية للمركبات وتيميجب إجراء الإلكترونية خلال اختبار المخدرات لحساب تدهور الأنسجة مع الوقت وعن أي آثار محتملة للسيارة. على سبيل المثال، يتم حل العديد من الأدوية في DMSO أو الايثانول. لدينا بيانات الشكل (6) تبين أن DMSO (0.1٪ وأعلى) يمكن أن تزيد من تقلصات أثار العصبي، وهو الأثر الذي يحتاج إلى أن تطرح من تأثير اختبار المخدرات. وبالمثل، والإيثانول (تصل إلى 1٪) يقلل من عفوية تقلصات العضلات الملساء ولكن ليس له تأثير على انكماش-أثار العصبي 34،35. في حالة استخدام الحيوانات المعدلة وراثيا أو نماذج الجراحية (على سبيل المثال، واصابات الحبل الشوكي أو استئصال المبيض)، وينبغي أن تتضمن الضوابط أنسجة من سلالة الماوس الخلفية المناسب أو صورية تعمل الحيوانات على التوالي. بالإضافة إلى ذلك، بعض الأنسجة، مثل الإنسان، والماوس وخنزير غينيا قربة تحتوي على العقد جماعية. عند العمل مع هذه الأنسجة، واختيار البروتوكول وتفسير البيانات يجب أن تأخذ في الاعتبار آثار المخدرات أو EFS على شمال شرق جماعيةurons التي تزيد من تحفيز العضلات الملساء.
تصميم بروتوكول تجريبي، واختيار المعلمات الصحيحة (EFS ل، لتحفيز المخدرات) وتركيزات لفحصها حاسمة لضمان بيانات ذات مغزى. في حين ينبغي تعديل المعلمات للأنسجة والمخدرات الفردية والمبادئ العامة / المبادئ التوجيهية الواردة أدناه هي المعمول بها. التراكمية منحنيات استجابة تركيز مرغوبة، ولكن هذا ليس ممكنا لجميع المركبات. المخدرات التي تستهدف المستقبلات التي توعي، مثل المستقبلات purineric ionotropic (P2X)، أو الأدوية التي يستقلبان بسرعة في الأنسجة (على سبيل المثال أدن تشافيز)، لا يمكن اختبارها بشكل موثوق باستخدام التراكمية منحنيات استجابة التركيز في الأنسجة نفسها. في هذه الحالات، يتم اختبار تركيز واحد في مجموعات مختلفة من الأنسجة. لتقييم الحساسية، فمن المستحسن لمقارنة حجم الاستجابة التي تسببها على أعلى تركيز واحد لأن يتحقق في نهاية تركيز التراكميمنحنى الاستجابة.
للتركيب دقيق للبيانات التي تم الحصول عليها من منحنيات استجابة تركيز، فمن المستحسن لاختبار نصف تركيزات سجل (على سبيل المثال لجنة التنسيق في الشكل 6). ومع ذلك، تركيزات سجل (على سبيل المثال NMB في الشكل 4A) مقبولة عندما قابلية الأنسجة قد تكون محدودة أو قد تكون القيود الأخرى في المكان.
لتحديد نطاق التركيز لمركب الرواية، في التجارب الأولية، فمن المفيد النظر في تقارب ملزمة للمجمع واختبار محطتين لتوليد الطاقة من 10 أعلاه وأدناه أن التركيز. في التجارب اللاحقة، ويتم تكرير بروتوكول لتحديد نقطة البداية حيث لوحظ أي أثر للدواء ونقطة النهاية حيث إما الاستجابة القصوى أو تركيز اختبارها لم يعد محدد للهدف المقصود.
وينبغي اختيار الفاصل الزمني لتطبيق الدواء مع الأخذ بعين الاعتبار عدة عوامل: أ) حان الوقت لالمخدرات ليكون لها تأثير. في الأدوية العامة التي تستهدف مستقبلات الغشاء لديها استجابة سريعة نسبيا (ثواني إلى دقيقة)، في حين أن العقاقير لأهداف داخل الخلايا (على سبيل المثال، مثبطات انزيم forskolin والأخرى 36، توكسين البوتولينوم 37) تتطلب فترة حضانة إضافية (30 دقيقة - 3 ساعة). بالإضافة إلى ذلك، سمك الأنسجة قد تلعب دورا في ذلك. ب) مدة وآلية عمل المخدرات. في الحالات عندما يصل تأثير المخدرات هضبة التي لحقت، مثل NMB في الشكل 4A وسيسابريد في الشكل 6، فترات زمنية من 5-15 دقيقة بين التطبيقات المخدرات كافية لجمع البيانات الكافية. هذا غير ممكن مع العقاقير ذات مدة أقصر بكثير من العمل أو آلية مختلفة للعمل (ATP، لجنة التنسيق). على سبيل المثال تأثير لجنة التنسيق في الشكل 4C أو 4D، يصل هضبة بسرعة ولكن التوتر الأنسجة يميل إلى العودة إلى خط الأساس. في هذه الحالة، تحتاج إلى فترات زمنية ليتم تعديلها وفقالاي، عادة مضيفا تركيز المقبل عندما تصل أول رد كحد أقصى.
تحليل البيانات، لا سيما تطبيع البيانات للسماح مقارنات بين شرائط هو خطوة مهمة جدا. دراسات مختلفة تستخدم معايير مختلفة للتطبيع، بما في ذلك قطاع وزن 38، الشريط عبر مساحة المقطع 39، استجابة بوكل 12٪ من الاستجابة القصوى أو 28٪ من الاستجابة القصوى إلى وكيل مقلص آخر (على سبيل المثال، لجنة التنسيق 38). وينبغي اختيار المعلمة التطبيع اعتمادا على الغرض من التجربة، مثل أن المعلمة لا تتأثر المركبات الاختبار، علم الأمراض أو التصميم التجريبي. على سبيل المثال، إلى تطبيع استجابة بوكل يلغي الوزن والأبعاد الأخرى للشرائط، وبالتالي يمكن أن تستخدم للمقارنة بين ردود في الأنسجة حيث الحالة المرضية قد يزيد من وزن شرائط (مثل مرض السكري يزيد المثانة الكتلة). بالإضافة إلى ذلك، إعادةلا يتأثر sponse بأن بوكل عن طريق إزالة الغشاء المخاطي / 29 الظهارة البولية، وبالتالي يمكن استخدامها في التجارب تقييم مكونات مختلفة من المثانة (مثل الغشاء المخاطي مقابل العضلات الملساء).
باختصار، وهذه الطريقة توفر انقباض نهج سريع وسهل وقوي جدا لتقييم المثانة (وجهاز آخر) علم وظائف الأعضاء وعلم الصيدلة. عندما تستخدم بشكل صحيح، لأنها توفر القدرة على التعامل مع الأنسجة في بيئة منخفضة وتسيطر عليها بشكل جيد. في دراسة وظيفة المثانة البولية، وهذه الطريقة مفيدة في اكتشاف واختبار المركبات المستخدمة حاليا لإدارة OAB، مثل antimuscarinics وضعت حديثا β 3 AR منبهات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.
Acknowledgments
وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة R37 R01 DK57284 DK54824 ومنح لLB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Tissue Bath System with Reservoir | Radnoti, LLC | 159920 | isolated tissue baths |
| Warm water recirculator pump | Kent Scientific Corporation | TPZ-749 | to keep tissue baths to 37 °C |
| Computer | |||
| Data Acquisiton System | DataQ Instruments | DI-710-UH | To view, record and analyze data |
| Transbridge Transducer Amplifier | World Precision Instruments | SYS-TBM4M | Transducer amplifier |
| Grass stimulator | Grass Technologies | Model S88 | Stimulator |
| Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | ACV-1205S | To anesthetesize the animal |
| Anesthetizing Box | Harvard Apparatus | 500116 | To anesthetesize the animal |
| Anesthesia Masks | Kent Scientific Corporation | AC-09508 | To anesthetesize the animal |
| Materials and Surgical Instruments | |||
| Sylgard | Dow Corning Corp | 184 SIL ELAST KIT | To pin, dissect, & cut tissue |
| Petri Dish | Corning | 3160-152 | To dissect/cut tissue |
| Insect Pins | ENTOMORAVIA Austerlitz Insect Pins | Size 5 | To pin tissue |
| Bench Pad | VWR International | 56617-014 | Absorbent bench underpads |
| Rat surgical Kit | Kent Scientific Corporation | INSRATKIT | To remove and dissect tissue |
| 2 Dumont #3 Forceps | Kent Scientific Corporation | INS500064 | To remove and dissect tissue |
| Tissue Forceps | Kent Scientific Corporation | INS500092 | To remove and dissect tissue |
| Scalpel | Kent Scientific Corporation | INS500236 | To remove and dissect tissue |
| Scalpel blade | Kent Scientific Corporation | INS500239 | To remove and dissect tissue |
| Professional Clipper | Braintree Scientific, Inc. | CLP-223 45 | To remove fur |
| Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | Tie tissue |
| Tissue Clips | Radnoti, LLC | 158802 | Attach tissue to rod/transducer |
| 1 g weight | Mettler Toledo | 11119525 | For transducer calibration |
| Chemicals | |||
| Krebs Solution: Sodium chloride Potassium chloride Monobasic potassium phosphate Magnesium sulfate Dextrose Sodium bicarbonate Calcium chloride Magnesium chloride |
Sigma Fisher Fisher Fisher Fisher Sigma EMD Baker |
S7653 P217-500 P285-3 M65-500 D16-500 S5761 CX0130-2 2444 |
To prepare Krebs solution |
| Isoflurane | Henry Schein | 029405 | To anesthetesize the animal |
| Oxygen tank | Matheson Tri Gas | ox251 | To use with anesthesia system |
| Carbogen Tank (95% Oxygen; 5% Carbon Dioxide) | Matheson Tri Gas | Moxn00hn36D | To aerate Krebs solutions |
References
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C.
- Andersson, K. E. Detrusor myocyte activity and afferent signaling. Neurourol Urodyn. 29, 97-106 (2010).
- Artim, D. E., et al. Developmental and spinal cord injury-induced changes in nitric oxide-mediated inhibition in rat urinary bladder. Neurourology and urodynamics. 30, 1666-1674 (2011).
- Kita, M., et al. Effects of bladder outlet obstruction on properties of Ca2+-activated K+ channels in rat bladder. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 298, 1310-1319 (2010).
- Barendrecht, M. M., et al. The effect of bladder outlet obstruction on alpha1- and beta-adrenoceptor expression and function. Neurourol Urodyn. 28, 349-355 (2009).
- Maggi, C. A., Santicioli, P., Meli, A. Postnatal development of myogenic contractile activity and excitatory innervation of rat urinary bladder. The American journal of physiology. 247, 972-978 (1984).
- Ng, Y. K., de Groat, W. C., Wu, H. Y. Smooth muscle and neural mechanisms contributing to the downregulation of neonatal rat spontaneous bladder contractions during postnatal development. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 292, 2100-2112 (2007).
- Szell, E. A., Somogyi, G. T., de Groat, W. C., Szigeti, G. P. Developmental changes in spontaneous smooth muscle activity in the neonatal rat urinary bladder. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 285, 809-816 (2003).
- Szigeti, G. P., Somogyi, G. T., Csernoch, L., Szell, E. A. Age-dependence of the spontaneous activity of the rat urinary bladder. J Muscle Res Cell Motil. 26, 23-29 (2005).
- Frazier, E. P., Braverman, A. S., Peters, S. L., Michel, M. C., Ruggieri, M. R. Does phospholipase C mediate muscarinic receptor-induced rat urinary bladder contraction. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 322, 998-1002 (2007).
- Xin, W., Soder, R. P., Cheng, Q., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Selective inhibition of phosphodiesterase 1 relaxes urinary bladder smooth muscle: role for ryanodine receptor-mediated BK channel activation. American journal of physiology. Cell physiology. 303, 1079-1089 (2012).
- Frazier, E. P., Peters, S. L., Braverman, A. S., Ruggieri, M. R., Michel, M. C. Signal transduction underlying the control of urinary bladder smooth muscle tone by muscarinic receptors and beta-adrenoceptors. Naunyn-Schmiedeberg's archives of pharmacology. 377, 449-462 (2008).
- Svalo, J., et al. The novel beta3-adrenoceptor agonist mirabegron reduces carbachol-induced contractile activity in detrusor tissue from patients with bladder outflow obstruction with or without detrusor overactivity. European journal of pharmacology. 699, 101-105 (2013).
- Yokota, T., Yamaguchi, O. Changes in cholinergic and purinergic neurotransmission in pathologic bladder of chronic spinal rabbit. J Urol. 156, 1862-1866 (1996).
- Bayliss, M., Wu, C., Newgreen, D., Mundy, A. R., Fry, C. H. A quantitative study of atropine-resistant contractile responses in human detrusor smooth muscle, from stable, unstable and obstructed bladders. J Urol. 162, 1833-1839 (1999).
- Kullmann, F. A., McKenna, D., Wells, G. I., Thor, K. B. Functional bombesin receptors in urinary tract of rats and human but not of pigs and mice, an in vitro study. Neuropeptides. 47, 305-313 (2013).
- Sadananda, P., Kao, F. C., Liu, L., Mansfield, K. J., Burcher, E. Acid and stretch, but not capsaicin, are effective stimuli for ATP release in the porcine bladder mucosa: Are ASIC and TRPV1 receptors involved. European journal of pharmacology. 683, 252-259 (2012).
- Maggi, C. A., et al. Species-related variations in the effects of capsaicin on urinary bladder functions: relation to bladder content of substance P-like immunoreactivity. Naunyn-Schmiedeberg's archives of pharmacology. 336, 546-555 (1987).
- Kullmann, F. A., et al. Effects of the 5-HT4 receptor agonist, cisapride, on neuronally evoked responses in human bladder, urethra, and ileum. Autonomic neuroscience : basic & clinical. 176, 70-77 (2013).
- Warner, F. J., Miller, R. C., Burcher, E. Human tachykinin NK2 receptor: a comparative study of the colon and urinary bladder. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30, 632-639 (2003).
- Zoubek, J., Somogyi, G. T., De Groat, W. C. A comparison of inhibitory effects of neuropeptide Y on rat urinary bladder, urethra, and vas deferens. The American journal of physiology. 265, 537-543 (1993).
- Warner, F. J., Miller, R. C., Burcher, E. Structure-activity relationship of neurokinin A(4-10) at the human tachykinin NK(2) receptor: the effect of amino acid substitutions on receptor affinity and function. Biochem Pharmacol. 63, 2181-2186 (2002).
- Warner, F. J., Mack, P., Comis, A., Miller, R. C., Burcher, E. Structure-activity relationships of neurokinin A (4-10) at the human tachykinin NK(2) receptor: the role of natural residues and their chirality. Biochem Pharmacol. 61, 55-60 (2001).
- Dion, S., et al. Structure-activity study of neurokinins: antagonists for the neurokinin-2 receptor. Pharmacology. 41, 184-194 (1990).
- Somogyi, G. T., Zernova, G. V., Yoshiyama, M., Yamamoto, T., de Groat, W. C. Frequency dependence of muscarinic facilitation of transmitter release in urinary bladder strips from neurally intact or chronic spinal cord transected rats. British journal of pharmacology. 125, 241-246 (1998).
- Andersson, K. E., Wein, A. J. Pharmacology of the lower urinary tract: basis for current and future treatments of urinary incontinence. Pharmacological reviews. 56, 581-631 (2004).
- D’Agostino, G., Condino, A. M., Gallinari, P., Franceschetti, G. P., Tonini, M. Characterization of prejunctional serotonin receptors modulating [3H]acetylcholine release in the human detrusor. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 316, 129-135 (2006).
- Hawthorn, M. H., Chapple, C. R., Cock, M., Chess-Williams, R. Urothelium-derived inhibitory factor(s) influences on detrusor muscle contractility in vitro. British journal of pharmacology. 129, 416-419 (2000).
- Chaiyaprasithi, B., Mang, C. F., Kilbinger, H., Hohenfellner, M. Inhibition of human detrusor contraction by a urothelium derived factor. J Urol. 170, 1897-1900 (2003).
- Testa, R., et al. Effect of different 5-hydroxytryptamine receptor subtype antagonists on the micturition reflex in rats. BJU international. 87, 256-264 (2001).
- Craggs, M. D., Rushton, D. N., Stephenson, J. D. A putative non-cholinergic mechanism in urinary bladders of New but not Old World primates. J Urol. 136, 1348-1350 (1986).
- Fry, C. H., Bayliss, M., Young, J. S., Hussain, M. Influence of age and bladder dysfunction on the contractile properties of isolated human detrusor smooth muscle. BJU international. 108, 91-96 (2011).
- Kennedy, C., Tasker, P. N., Gallacher, G., Westfall, T. D. Identification of atropine- and P2X1 receptor antagonist-resistant, neurogenic contractions of the urinary bladder. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 845-851 (2007).
- Levin, R. M., Danek, M., Whitbeck, C., Haugaard, N. Effect of ethanol on the response of the rat urinary bladder to in vitro ischemia: protective effect of alpha-lipoic acid. Molecular and cellular biochemistry. 271, 133-138 (2005).
- Malysz, J., Afeli, S. A., Provence, A., Petkov, G. V. Ethanol-mediated relaxation of guinea pig urinary bladder smooth muscle: Involvement of BK and L-type Ca2+ channels. American journal of physiology. Cell physiology. 306, 45-58 (2013).
- Longhurst, P. A., Briscoe, J. A., Rosenberg, D. J., Leggett, R. E. The role of cyclic nucleotides in guinea-pig bladder contractility. British journal of pharmacology. 121, 1665-1672 (1997).
- Takahashi, R., Yunoki, T., Naito, S., Yoshimura, N. Differential effects of botulinum neurotoxin A on bladder contractile responses to activation of efferent nerves, smooth muscles and afferent nerves in rats. J Urol. 188, 1993-1999 (2012).
- Sadananda, P., Chess-Williams, R., Burcher, E. Contractile properties of the pig bladder mucosa in response to neurokinin A: a role for myofibroblasts. British journal of pharmacology. 153, 1465-1473 (2008).
- Liu, G., Daneshgari, F. Alterations in neurogenically mediated contractile responses of urinary bladder in rats with diabetes. American journal of physiology. Renal physiology. 288, 1220-1226 (2005).
