Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Bladder Smooth Muscle Strip Kontraktilitet som en metod för att utvärdera Lower Urinary Tract farmakologi

Published: August 18, 2014 doi: 10.3791/51807
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,2
1Department of Medicine, Renal division, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Department of Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Detta manuskript presenteras en enkel men kraftfull, in vitro-metod för utvärdering av glatt muskulatur kontraktilitet som svar på farmakologiska medel eller nervstimulering. Huvudsakliga användningsområden är drogscreening och förståelse vävnads fysiologi, farmakologi och patologi.

Abstract

Vi beskriver en in vitro-metod för att mäta blåsans glatta muskulatur kontraktilitet, och dess användning för att undersöka fysiologiska och farmakologiska egenskaperna hos den glatta muskulaturen samt förändringar inducerade av patologi. Denna metod ger viktig information för att förstå blåsfunktion samtidigt undvika större metodologiska svårigheterna med in vivo-experiment, såsom kirurgiska och farmakologiska manipulationer som påverkar stabiliteten och överlevnaden av preparaten, användning av mänsklig vävnad, och / eller användningen av dyra kemikalier. Det ger också ett sätt att undersöka egenskaperna för varje blåskomponent (dvs. glatt muskulatur, slemhinna, nerver) hos friska och patologiska tillstånd.

Den urinblåsan avlägsnas från en sövd djur, placerades i Krebs lösning och skars i remsor. Remsorna placeras i en kammare fylld med varm Krebs lösning. Den ena änden är fäst till en isometrisk tensidn omvandlare för att mäta sammandragning kraft, är den andra änden fäst till en fast stång. Tissue stimuleras genom att direkt lägga föreningar till badet eller från elektriska fält stimuleringselektroder som aktiverar nerver, liknande utlösande blåskontraktioner in vivo. Vi visar att användningen av denna metod för att utvärdera spontan glatt muskulatur kontraktilitet under utveckling och efter en experimentell ryggmärgsskada, vilken typ av neurotransmission (sändare och receptorer inblandade), faktorer som modulering av glatt muskulatur aktivitet, vilken roll enskilda blåskomponenter, och arter och skillnader organ som svar på farmakologiska medel. Dessutom kan den användas för att undersöka intracellulära signalvägar involverade i kontraktion och / eller avslappning av den glatta muskulaturen, drog struktur-aktivitetssamband och utvärdering av transmittorfrisättning.

Den in vitro-glatt muskel kontraktilitet metod har använts i stor omfattning for över 50 år och har lämnat uppgifter som kraftigt bidragit till vår förståelse av blåsfunktion samt läkemedelsutveckling av föreningar som för närvarande används kliniskt för blåsledningen.

Introduction

Blåsan glatta muskulaturen slappnar tillåta urin lagring och kontrakt för att framkalla eliminering urin. Avkoppling förmedlas av inneboende glatta muskelegenskaper och tonic frisättning av noradrenalin (NE) från de sympatiska nerver som aktiverar beta-adrenerga receptorer (β 3 pa i människa) i detrusor. Tömning sker genom att hämma sympatiska ingång och aktivera parasympatiska nerver som frigör ACh / ATP att ingå avtal blåsan glatt muskulatur 1. Många sjukdomstillstånd, inklusive hjärna och / eller ryggmärgsskada, neurodegenerativa sjukdomar, diabetes, urinblåsan utlopp obstruktion eller interstitiell cystit, kan i grunden förändra blåsfunktion, med allvarliga konsekvenser för patientens livskvalitet 2. Dessa förhållanden ändrar kontraktilitet i glatt muskulatur genom att påverka en eller flera komponenter i urinblåsan: den glatta muskulaturen, afferenta eller efferenta nerver och / ellerslemhinnan.

Flera in vivo och in vitro-metoder för att studera blåsfunktionen har utvecklats. In vivo är cystometri den primära mätningen av blåsfunktionen. Även om detta är en intakt beredning som möjliggör insamling av information enligt nära fysiologiska förhållanden, det finns ett antal omständigheter där användningen av glatt muskulatur remsor är att föredra. Dessa innefattar situationer då kirurgisk och / eller farmakologiska manipulationer skulle påverka överlevnad och preparatets stabilitet in vivo, eller när studierna kräver användning av mänskliga vävnader eller dyra kemikalier. Metoden underlättar också en undersökning av effekterna av droger, ålder och patologi på varje komponent i blåsan, dvs glatt muskulatur, slemhinna, afferenta och efferenta nerver.

Bladder remsor har använts under årens lopp av många grupper för att besvara ett antal vetenskapliga frågor. De användes för att evaluate förändringar i myogenic spontan aktivitet inducerad av patologi. Denna aktivitet tros bidra till ärendets brådskande karaktär och frekvens symtom på överaktiv blåsa (OAB), och är därför ett mål för läkemedel som utvecklas för OAB 3-9. Bladder remsor användes också för att undersöka myogena och neuronala faktorer som modulerar slät muskeltonus i syfte att upptäcka jonkanaler och / eller receptorer och / eller intracellulära signalvägar som kan riktade för att inducera antingen avkoppling eller sammandragning av glatt muskulatur 3,10- 13. Andra studier har fokuserat på den typ av neurotransmission, inklusive sändare och receptorer är inblandade och förändringar inducerade av patologi 14,15. Dessutom har metoden använts för jämförelser mellan vävnader från olika arter 16- 18, mellan organ 19-21 och utvärdering av läkemedels struktur-aktivitetssamband 22-24. En utvidgning av denna metod har använts för att MEASURe effekten av droger på transmittorfrisättning från efferenta nerver 25. Dessutom en mängd olika vävnader (urinblåsa, urinrör, mag-tarmkanalen, GI) skördas från djur eller människor (från operationer eller organdonatorvävnad godkända för forskning) och från en mängd olika djurmodeller, inklusive ryggmärgsskada (SCI), urinblåsan utlopp obstruktion (BOO) eller interstitiell cystit (IC) kan undersökas med hjälp av denna teknik.

I denna uppsats belyser vi användning av denna metod tillsammans med nödvändiga experimentella protokoll, ta upp flera vetenskapliga frågor som nämns ovan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla förfaranden som beskrivs här är godkända av IACUC kommittén vid University of Pittsburgh.

1. Lösningar

  1. Bered Krebs lösning enligt receptet. Sammansättning i mM: NaCl 118, KCl 4,7, CaCl2 1,9, MgSO 4 1.2, NaHCO 3 24,9, KH 2 PO 4 1.2, dextros 11.7.
  2. Lufta Krebs med 95% O2, 5% CO2 och placera den i ett 37 ° C vattenbad för att användas under hela experimentet. Placera undan ~ 200 ml luftad Krebs lösning vid rumstemperatur för att användas för vävnads dissekering.
  3. Mät pH (~ 7,4) och osmolaritet (~ 300 mOsm) i luftad Krebs.

2 Experimentell Set-up (Schematisk figur 1 A)

  1. Fyll luftad (95% O2, 5% CO 2) kammare med 10 ml Krebs.
  2. Starta cirkulationsvattenpumpen att upphetta kamrarna till 37 ° C; slå på nödvändig utrustning: förstärkare (s), stimulator (s) och inspelning programvara.
  3. Kalibrera givare med en 1 g vikt.

3 Tissue (Figur 1B)

Ta blåsan från en vuxen naiv Sprague Dawley (200-250 g, ~ 10-12 veckor gamla) så här:

  1. Förbered dissektion området och nödvändiga instrument: elektriska rakapparater, tång med tänder, skalpellblad, dissekera sax, microscissors, två dissekera pincett (författare föredrar Dumont pincett # 3), vävnads clips (eller silkessutur), en Sylgard belagd dissektion skålen med Krebs och vävnad dissektion stift.
  2. Bedöva djuret med isofluran inandning (4% O2) i induktionskammare. Använd veterinär salva på ögonen för att förhindra torrhet under narkos. Kontinuerligt övervaka nivån av anestesi genom att observera andningsfrekvens, respons på yttre stimuli, och förlust av bakre lem återkalla reflex.
  3. När djuret bedövas rakning nedre delen av buken enrea. Exponera bäckenorganen via en mittlinje buksnitt. Identifiera blåsan och urinröret. Avlägsna blåsan genom att skära vid blåshalsen nära proximala urinröret. Placera vävnad omedelbart i Sylgard belagd skål fylld med luftad Krebs lösning.
  4. Om det behövs, ta bort extra vävnad vid denna tid: urinröret, bitar av gastrointestinala (GI) tarmkanalen och / eller prostata, etc.
  5. Offra djuret med hjälp IACUC godkända metoder (t.ex. bedövningsmedel överdos eller CO2 kvävning följt av en sekundär metod).
  6. Sätt vävnads dissekera stift genom blåsans övre, nacke och urinledare, för att stabilisera vävnaden för vidare dissektion. Dra inte i vävnaden. Avlägsna fett, bindväv, proximal urinrör och urinledare om sådana finns.
  7. Öppna blåsan från basen till kupolen för att skapa ett plant ark, serosa sidan nedåt / luminala sidan uppåt (Figur 1B). Placera dissekera stift i varje hörn av vävnaden. Avlägsna blåsan Dome och halsvävnad.
  8. Om syftet med försöket är att fastställa bidrag slemhinnan (urothelium och lamina propria - se diagram Figur 1C) till glattmuskelkontraktion, jämföra egenskaperna hos detrusor remsor med och utan slemhinnan bifogas. För detta, innan du skär vävnaden i remsor, försiktigt bort slemhinneskiktet hjälp av iris våren sax och fin pincett under en dissekera mikroskop. Vid slutet av experimentet, fixera remsorna för H & E-färgning för att bekräfta fullständigt avlägsnande av slemhinna. Observera att förfarandet är enklare i mus blåsan än i råttblåsa.
  9. Skär vävnaden längden från basen till kupolen i strimlor av ~ 2 x 8 mm (Figur 1B). Knyt eller bifoga en vävnads klipp till båda ändarna av varje remsa.
    OBS: En råtta urinblåsan kan vanligtvis skuren i fyra remsor men antalet remsor kan öka eller minska beroende på djuret / blåsstorlek.
  10. Överför remsorna till experimental kamrarna. Fäst ena änden av varje remsa till en kraftomvandlare, som mäter vävnadssammandragning, och den andra till en fast glas / metallstav.
    OBS: Vävnadskammare varierar i storlek (0,2 ml till 20 ml eller större). Typiska kammare för gnagare blåsor är 5-20 ml, som ger tillräcklig höjd för remsorna att vara helt nedsänkt i lösningen. Vissa avdelningar kommer med inbyggd stimuleringselektroder, andra inte. Försiktighet bör vidtas för att se till att alla anslutningar av elektroderna är i gott skick, annars elfältstimulering är inte tillförlitlig.
  11. Applicera en definierad mängd kraft till varje remsa genom att försiktigt sträcka vävnaden tills baslinjen spänningen når 1 g (~ 10 mN). Initialt vävnaden tenderar att slappna av vilket redovisas som en minskning av baslinje spänning. Tvätta vävnad ungefär var 15 min med hjälp av varma luftad Krebs och justera baslinjen spänningen till 1 g efter varje tvätt. Låt vävnad till jämvikt under ~ 1-2 timmar eller tills baslinjen spänningen är stabil (dvs ingen ytterligare vävnads avslappning).
  12. Test vävnadsviabilitet genom tillsats KCl (80 mM) direkt till badet för ~ 5 minuter, eller tills en platå svar uppnås. Svar på höga koncentrationer av KCl kan också upprepas under experimentet eller i slutet av experimentet och används för att normalisera svar på andra droger eller mellan remsor (se normalisering i dataanalys avsnitt).
  13. Tvätta vävnads flera gånger (3-5x) med den varma luftad Krebs att låta vävnaden för att återgå till förbehandling förhållanden.

4 stimuleringsprotokoll

  1. För att undersöka effekterna av patologi på spontan myogenic aktivitet eller slät muskeltonus, använd glatta muskelremsor från olika djurmodeller såsom SCI, BOO, eller nyfödda. Figur 2 illustrerar användningen av denna metod för att undersöka förändringar i blås spontan aktivitet under utveckling och efter SCI. Dessutom kan farmakologiska medel användas för att modulera spontaneous aktivitet. Figur 3 illustrerar effekten av KCNQ kanalmodulatorer, flupirtin och XE991, om spontan aktivitet och slät muskeltonus.
  2. För farmakologiska glatta muskelstimulering konstruera koncentrationsresponskurvor genom att lägga till föreningar från koncentrerade stamlösningar direkt till badet vid bestämda tidsintervall. Använd läkemedlet och fordon i parallella remsor till svars för fordons och tidseffekter.
    1. Gör stamlösningar av önskade testföreningar vid 1000x sista arbetskoncentration. För karbakol (CCh), en muskarin-receptoragonist, förbereda följande bestånd: 10 -5 M, 3 x 10 -5 M, 10 -4 M, 3 x 10 -4 M, 10 -3 M, 3 x 10 -3 M , 10 -2 M. Slutliga koncentrationer i badet är 10 -8 Mkr till 10 -5 Mkr (figur 4C, D). För neuromedin B (NMB), ett bombesin receptorsubtypen 1 agonist, förbereda följande bestånd: 10 -8 M, 10 -7M, 10 -6 M, 10 -5 M, 10 -4 M, 10 -3 M och slutkoncentrationer i badet är 10 -11 M till 10 -6 M. Både CCh och NMB förväntas öka vävnads kontraktilitet.
    2. Till en 10 ml vävnadsbad, lägg 10 | il av varje CCh stamlösning så snart svar når en platå (Figur 4C, D). I parallella remsor lägga lika mycket av fordonet (vatten). På samma sätt lägga till 10 l av varje neuromedin B stamlösning varje ~ 5 min.
      OBS: Observera den excitatoriska effekten av NMB och CCh på glatt muskeltonus i remsor från olika arter i Figur 4.
    3. Undersök relaxa egenskaperna hos musklerna i förväg avtalade vävnaden med en retande medel, vanligen CCh eller KCl.
    4. För att blockera en agonistsvar, förbehandla vävnaden för 10-20 min med antagonisten för att tillåta vävnadspenetration, före agoniststimulering.
  3. För neurala stimlering av den glatta muskulaturen, även kallad elektrisk fältstimulering (EFS) Följ steg 1 till 3,13 och fortsätt enligt nedan. EFS är att selektivt aktivera nerver kontra glatt muskulatur. Parametrar för stimulering bör väljas med omsorg för att undvika direkt smidig muskelstimulering.
    1. Upprätta stimuleringsparametrar: typ av stimulus (enstaka pulser eller tåg), varaktighet (pulslängd och tåg duration), frekvens och intensitet, som beskrivs i stegen nedan och illustreras i figur 5A, B.
      1. För enstaka puls stimulering, inställda pulslängd, inter-stimulus intervall och antal stimuli önskade. Vanliga stimulering varaktighet parametrarna är enstaka pulser med 0,05-0,3 ms varaktighet levereras med önskade intervall (Figur 5A). Följ steg 4.3.1.4 för stimulusintensitet.
      2. För tåg stimulering, ställa tåget varaktighet och inter tåg intervall. Typiska värden för blåsvävnad är 3-10 sek levererat minst 1 mi varandra (figur 5B). Om vävnads trötthet uppträder (dvs. EFS-sammandragningar minskar under kontrollperioden), öka inter tåget intervallet.
      3. Upprätta frekvensen av tåg stimuli (antal pulser i ett tåg - Figur 5B). Kör en kurva frekvensomfång som sträcker sig från 0,5 till 50 Hz. Typiska frekvenser för blåsan är 10-20 Hz, vilket ger reproducerbara och stabila sammandragningar förmedlade av ATP och ACh. Observera frekvensberoende svar på EFS stimulering i mus blåsremsor i Figur 5 som visar hur denna metod kan användas för att bedöma bidrag kolinerga och purinerga mekanismer för neurotransmission.
      4. Upprätta intensiteten för stimulus: systematiskt öka intensiteten (spänning) av stimulus tills amplituden av kontraktionen nått en platå (vid användning av tåg hålla frekvensen konstant).
      5. Ställ intensiteten för stimulus beroende påsikta på experimentet. Om syftet är att öka Neurally-framkallade sammandragningar, sedan använda submaximal intensitet så att amplituden för kontraktion är ~ 50% av maximal kontraktion. Om syftet är att minska Neurally-framkallade sammandragningar, sedan in intensiteten till ~ 80% av maximal amplitud för att undvika vävnads trötthet.
    2. När stimuleringsparametrar (duration, frekvens och intensitet) är etablerade, tillåta ~ 20-30 min för EFS- framkallade kontraktioner stabiliseras före drogtestning.
      OBS: För att verifiera selektivitet EFS för neural transmission, block neural transmission med Na +-blockerare, tetrodotoxin (TTX, 0,5-1 M). Utför detta steg i början av experimentet, som TTX tvättar bort relativt lätt. Dessutom utför detta i slutet av experimentet (se steg 4.3.5. Nedan).
    3. Bered stamlösningar vid 1,000x de sista arbetskoncentrationerna för: alfa, beta-metylen ATP (ABMA, en purinergisk receptor aktivatoroch desensibiliseringsanordningen) 10 -2 M, atropin (ett muskarinreceptorantagonist) 10 -3 Mkr (figur 5C). Beakta andra exempel i Figur 6. Den 5HT4-receptoragonist, cisaprid (3 x 10 -6 M, 10 -6 M, 3 x 10 -5 M, 10 -5 M, 3 x 10 -4 M, 10 -4 M, 3 x 10 -3 M, 10 -3 M), ökar vävnads kontraktilitet och SB-203.186 (3 x 10 -3 M), en 5HT4-receptorantagonist, vänder cisaprid effekter.
    4. För att testa effekten av ABMA och atropin på EFS (figur 5C), utför två kontrollfrekvens responskurvor. Lägg 10 pl av 10 -2 M ABMA till badet för en slutlig koncentration av 10 | iM. Det drar ihop vävnaden på grund av direkt stimulering av purinerga receptorer i den glatta muskulaturen. Efter svars återgår till baslinjen, upprepa frekvensresponskurvor. Tillsätt 10 l av 10 -3 M atropin för en slutlig Koncentratjon av en iM. Efter ~ 10 min (som behövs för atropin att blockera muskarinreceptorer), återkommande frekvensresponskurvor. I parallella remsor lägga till 10 l av fordonet, vatten, vid varje steg.
      OBS: För andra exempel i figur 6, tillsätt 10 ìl av varje cisaprid stamlösning vid definierade tidsintervall (~ var 15 min, se diskussion), följt av 10 pl SB-203.186 stamlösning direkt till badet och övervaka deras effekt på EFS-framkallad kontraktion. I parallella remsor lägga till 10 l av fordonet, DMSO. Beakta effekterna av cisaprid, en 5HT4-receptoragonist, på EFS-framkallade sammandragningar i humana blås och ileum vävnader i Figur 6. Dessutom observera effekten av DMSO, fordonet för cisaprid, på EFS-framkallade sammandragningar i mänsklig blåsa och ileum vävnader .
    5. I slutet av EFS-protokollet verifiera selektivitet EFS genom att blockera nerv transmission med Na +-blockerare, tetrodotoxin (TTX; 0,5-1 &# 181; M). Om TTX resistenta sammandragningar är fortfarande närvarande, rekommenderas att justera längden och intensiteten av stimulans i efterföljande experiment.
  4. För att bedöma effekterna av droger på pre eller post-synaptiska platser (figur 7A) Följ steg 1 till 4.3.2. Upprätta reproducerbara svar på karbachol och EFS, lägg sedan till läkemedels X.
  5. Vid slutet av försöket, lossa eller knyta upp banden, blot dem försiktigt på en bit silkespapper för att eliminera extra vätska och mäta varje remsa vikt med hjälp av en balans. Mäta även tissuelängden med en passare för att bestämma tvärsnittsarea. Denna information används för normalisering av data (se avsnitt 5.4).

5. Data Analysis

Analysera data med hjälp av lämplig programvara (t.ex. Windaq, LabChart).

  1. För spontan aktivitet, väljer ett fönster på minst 30 sek före och på toppen av läkemedlet framkallad respons och migASURE amplitud och frekvens myogenic aktivitet (Figur 3).
    1. Använd snabb Fourier transformation analys för att bestämma frekvensspektrum som bidrar till kontraktila svaren och om det finns skillnader mellan olika delar av urinblåsan (t.ex. kupol kontra halsen) eller med utveckling, patologi, och droger 8.
  2. För effekter på glatt muskulatur tonen väljer ett fönster på minst 10-30 sekunder före och på toppen av läkemedlet framkallad respons och mäta amplitud kontraktion.
  3. För effekter på neuralt framkallade sammandragningar mäter amplitud, varaktighet och området under kurvan för sammandragningar (minst 3) före och på toppen av läkemedelsinducerad svar.
    OBS: Det är nödvändigt att mäta både amplituden och området under kurvan för EFS-inducerade sammandragningar eftersom purinerga och kolinerga komponenter har olika kinetik. Den Purinergic komponenten är snabb och övergående (ATP aktiverar purinergic jonotropa kanaler såsom P2X1 som tillåter snabb tillströmning av kalcium, då de okänsliga), vilket bidrar mer till toppen amplitudsvaret och mindre till området under kurvan. Den kolinerga komponenten är långsammare och ihållande (ACh aktiverar metabotropa muskarinreceptorer, som kräver mer tid för att aktivera intracellulära signalvägar som slutligen aktiverar jonkanaler som depolarize den glatta muskulaturen att framkalla en kontraktion). Således är muskarin komponenten fångas bättre genom att mäta arean under kurvan.
  4. Normalisera data för att kunna jämföra resultat över remsor och farmakologisk behandling. Parametern som valts för normalisering bör inte påverkas av testföreningarna, patologiskt tillstånd studerat eller experimentell design. Bland dessa parametrar, användning remsa vikt, tvärsnittsarea, KCl-svar (figur 4B),% av det maximala svaret (Figur 7B) eller% av det maximala svaret till en annan sammandragande medel(T.ex. CCh) eller avslappnande medel (t.ex. papaverin).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Spontan Myogenic Aktivitet

Spontan myogena aktivitet är en viktig glatt muskulatur egenskap som genomgår förändringar med postnatal utveckling 6-9 och patologi (t.ex. SCI, BOO) 3-5. Eftersom denna verksamhet anses bidra till symtom på överaktiv blåsa (OAB) 2, är av stort intresse för att utveckla effektiva behandlingar för OAB och andra glatta muskel dysfunktioner en utvärdering av receptorer, intracellulära signalvägar och farmakologiska medel som modulerar det. Den metod som presenteras här kan enkelt undersöka dessa frågor Figur 2 visar olika mönster av myogenic spontan aktivitet under utveckling i neonatal (i), juvenil (ii) vuxen (iii) och ryggmärgsskador råttor. (SCI, iv). Strips från neonatala råttor uppvisar stor amplitud, låg frekvens rytmiska sammandragningar (Figur 2AI), medan remsor från vuxen råttas uppvisar liten amplitud, hög frekvens aktivitet (Figur 2Aii, iii). Efter SCI neonatal mönstret återuppstår (Figur 2Aiv). Förutom att använda remsor från djurmodeller kan olika farmakologiska medel användas för att inducera spontana kontraktioner i remsor från naiva djur, i syfte att förstå de mekanismer som ligger bakom de spontana sammandragningar. Exempel på lämpliga farmakologiska medel inkluderar muskarina agonister (karbakol; CCh)., Föreningar som ökar ACh nivåer (t.ex. acetylkolinesteras-hämmare), låga koncentrationer av KCl (t.ex. 20 mM) eller andra experimentella droger Figurerna 3A-B, illustrerar module av spontan aktivitet av farmakologiska medel som verkar på KCNQ-kanalerna är belägna på den glatta muskeln. Den KCNQ kanalöppnare, flupirtin minskar amplituden och frekvensen av spontan aktivitet på ett koncentrationsberoende sätt (Figur 3AI-iii), medanKCNQ kanalblockerare, XE991 minskar amplituden men ökar frekvensen av spontan aktivitet (Figur 3BI-iii).

Slät muskeltonus

Smidig muskeltonus och kontraktilitet egenskaper är viktiga faktorer för korrekt funktion av urinblåsan under lagring och tömning. Denna metod kan lätt screena effekterna av farmakologiska medel på slät muskeltonus. Figurer 3Aiv och 3Biv visar att flupirtin minskar basal ton, i linje med glattmuskelrelaxation, medan XE991 ökar slät muskeltonus. Figur 4 visar koncentrationsberoende ökningar i slät muskeltonus genom aktivering av bombesin-receptorer med neuromedin B (NMB, fig 4A, B) eller muskarinreceptorer med karbakol (CCH; figurerna 4C, D). Dessutom kan intracellulära signalvägar som förmedlar dessa glatta muskelsvar utredas usjunger specifika modulatorer (data visas ej).

Neurally-medierade svar och Modulation of Neurotransmission

Bladder kontraktion uppnås genom frisättning av ACh / ATP från parasympatiska efferenta nerver. Bidraget från muskarina och purinerga system till urinblåsan kontraktion varierar mellan arter och patologiska tillstånd, med övervägande ökning Purinergic bidrag patologier såsom interstitiell cystit, delvis utlopp obstruktion, och överaktiv blåsa 26. Figur 5C visar användningen av denna metod för att bestämma bidrag muskarina och purinerga komponenter för att neurotransmission i blåsremsor från musen. Bidraget från det kolinerga komponenten bedömdes med hjälp av muskarinreceptorantagonist, atropin. Bidraget från Purinergic systemet bedömdes med hjälp av purinergisk receptoraktiva och desensibiliseringsanordningen, alfa, beta-metylene ATP (ABMA). Dessutom bedömdes den frekvensberoende bidrag av varje komponent genom att variera stimuleringsfrekvensen från låga till höga frekvenser (2-50 Hz).

Styrkan i blåssammandragning spelar en betydande roll i tömnings effektivt. Med denna metod kan receptorer och vägar som modulerar neural transmission undersökas som läkemedelsmål för tömning dysfunktioner. De 5HT4-receptorer uttrycks i förväg junctionally i parasympatiska neuron och deras aktivering ökar ACh-nivåer 27. Figur 6 illustrerar den excitatoriska verkan av 5HT4-receptoragonist, cisaprid, i humana urinblåsan och ileum remsor.

Olika experimentella protokoll kan användas för att bestämma platsen för verkan av en testförening. Diagram i Figur 7A illustrerar ett protokoll som används för att bedöma pre vs post junctionala webbplatser. Om läkemedels X minskar (eller ökar) EFS svar men har ingen effekt på CCh svar, är den mest sannolika platsen för verkan för-Junktional. Om läkemedels X förändrar både EFS och CCh svar, då det kan verka på receptorer belägna post junctionally eller både före och efter junctionally.

Roll Varje komponent: Smooth Muscle, Mucosa och neuronal

Olika sjukdomstillstånd kan påverka olika delar av urinblåsan. Till exempel interstitiell cystit (IC) påverkar främst urothelium, medan OAB kan leda till förändrad glatt muskulatur kontraktilitet. Dessutom kan olika receptorer uttryckas i varje blåsa komponent och därmed kunde vara specifikt inriktade på ett visst patologi. Till skillnad från in vivo-metoder, som mäter en nettoeffekt av alla blåskomponenter, ger detta in vitro-metod för utredning av speciella komponenter med hjälp av en kombination av kirurgiska och farmakologiska förfaranden. För att testa glattmuskelkontraktion / relaxation i frånvaro av neuronaltransmission, TTX (0,5-1 M) kan läggas till badet. I figur 4, var NMB och CCh testas i närvaro av TTX. För att testa bidrag slemhinnan (urothelium och lamina propria) till glatt muskulatur kontraktilitet, är remsor med och utan slemhinneskiktet jämförs. Figur 7B visar att svaren på CCh reduceras i närvaro av slemhinnan i gris 28. Liknande resultat rapporterades i mänskliga blåsremsor 29. För att testa rollen av nervtrådar, kan flera tillvägagångssätt tas. En är att aktivera eller hämma specifika fibrer med hjälp av farmakologiska medel. Exempelvis aktiverar capsaicin en specifik population av afferenta nerver och orsakar arter beroende glattmuskelkontraktion eller avslappning 17,18. Guanetidin hämmar frisättningen av noradrenalin från sympatiska fibrer, vilket eliminerar bidraget av dessa fibrer. Ett annat tillvägagångssätt är att okänsliga / eliminera specifika fibrer in vivoföre experimentet. Exempelvis systemisk behandling av djuret med kapsaicin desensitizes capsaicin känsliga afferenta nerver. Övriga blås komponenter som kan studeras i denna beredning är interstitiella celler eller kanalförbindelser genom att aktivera eller blockera dem med specifika medel.

Sort Skillnader

Medan de flesta läkemedelsutveckling är avsedd för behandling av mänskliga sjukdomar, är grundforskning främst utförs i djurvävnad. Sort skillnader föreligger i ett antal receptorer. Exempelvis 5HT4-receptoragonister öka neuralt framkallade sammandragningar i den mänskliga blåsan men inte hos råtta blåsan 19,30, EFS-inducerade sammandragningar nästan uteslutande atropin känsliga i mänskligt och gammaldags monkey detrusor från stabila blåsor 31 men blir delvis atropin beständiga i mänsklig detrusor från patienter med instabil blåsförhållanden (t.ex. neurogen, obstructed blåsor) 15,32,33, framkallar capsaicin en excitatoriska svar på råtta och människa blåsband, inget svar på svinblåsremsor och hämmande respons i marsvin blåsremsor 17,18. Figur 4 visar att bombesin receptoragonister har excitatoriska effekter på råttblåsa och inga effekter på mus och gris blåsremsor 16. Denna information är kritisk för val av lämplig djurmodell för att studera en specifik receptor.

Jämförelse av känslighet över organ

Läkemedel avsedda för behandling av blåsrubbningar kan också påverka glatt muskel från andra organ, såsom mag-tarmkanalen, urinröret, gallblåsan, etc. Denna metod medger bestämning av selektivitet orgel och känslighet för ett farmakologiskt medel genom att jämföra olika vävnader sida vid sida. Såsom illustreras i figur 6, den 5HT4-receptoragonist, cisaprid, har skiljaent effekt och potens i mänsklig blåsan vs ileum vävnad.

Figur 1
Figur 1 Försöksuppställning och blåslist förberedelser. A) Schematisk bild av den försöksuppställningen. Bladder remsor nedsänkt i vävnadskammare fyllda med luftad Krebs lösning hålls vid 37 ° C via ett cirkulerande vatten pump. En ände av remsan är fäst till en isometrisk kraftomvandlare för att mäta vävnads kontraktilitet, den andra till en fast stav. Den kraftomvandlare är ansluten till en förstärkare och dator för datainspelning. Elektrisk fältstimulering elektroder anslutna till en stimulator placeras i kammaren och användas för att frammana neuralt förmedlade blåskontraktioner. B) Framställning av vävnadsremsor. Blåsan är låst i en skål och följande procedurer utförs: # 1 vertikala snitt though ventrala delen av urinblåsan från urinröret till kupolen för att öppna blåsan i en platt ark. # 2 horisontella nedskärningar tar bort kupolen och basen av urinblåsan / proximala urinröret. . # 3 vertikala snitt som delar mitten blåsan i lika remsor (4 remsor från en råttblåsa) C) Schematisk bild av banddetaljer: glatt muskulatur och slemhinnor, som båda innehåller afferenta (blå) och efferenta (grön) nerver. Mucosa består av urotelet och lamina propria. Lamina propria innehåller blodkärl [1], interstitiella celler [2], och muscularis slemhinnor [3]. Prickad linje märkt # 2b anger förfarandet för att ta bort slemhinna skikt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2 Myogenic spontan aktivitet under utveckling och efterpatologi. A) Exempel på spontan aktivitet i neonatal (i), juvenil (ii), spinal intakt vuxen (iii) och ryggmärgen skadade (SCI) vuxen (iv) råttblåsremsor. NKI råtta användes vid fyra veckor efter operationen. B, C) ​​Sammanfattning av amplitud (B) och frekvens (C) av spontana kontraktioner i de fyra undersökta grupperna. (Återgivet med tillstånd från Artim DE, Kullmann FA, Daugherty SL, Bupp E, Edwards CL, de Groat WC Neurourol Urodyn 2011 Nov; 30 (8):.. 1666-1674.) Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3
Figur 3 Modulering av myogenic spontan aktivitet och slät muskeltonus. A) Effekten av KCNQ kanalöppnare, flupirtine, på spontan aktivitet och baslinjen ton i vuxen råtta blåsremsor. (I) Flupirtin sattes i ökande koncentrationer (kumulativ) vid de tider som anges med pilar. De utvidgningar under spår show 4 min av band aktivitet under kontroll och efter applicering av 10 ^ M och 50 ^ M flupirtin. (Ii-iv) Sammanställning av effekter av flupirtin (7 remsor från 4 råttor) på amplituden (ii) och frekvens (iii) för spontan aktivitet och utgångssignalen (iv), uttryckt som% förändring från kontroll (pre-läkemedel) värden , som satt till 100%. B) Effekten av KCNQ kanalblockerare, XE991, på spontan aktivitet och utgångssignalen hos vuxna råttblåsremsor. (I) XE991 sattes i ökande koncentrationer (kumulativ) vid de tider som anges med pilar. De utvidgningar under kurvan visar 2 min av band aktivitet under kontroll och efter applicering av 10 ^ M och 50 ^ M XE991. (Ii-iv) Sammanfattning av effekter av XE991 (9 remsor från 4 råttor) påamplitud (ii) och frekvens (iii) för spontan aktivitet och utgångssignalen (iv), uttryckt som% förändring från kontroll (pre-läkemedel) värden som fastställdes till 100%. Klicka här för att se en större version av denna siffra .

Figur 4
Figur B 4. Arter skillnader. A) koncentrationsberoende glatta muskelsammandragningar som svar på bombesin receptoragonist, neuromedin B (NMB), i råttblåsremsor.) Sammanfattning av effekter av NMB på glattmuskelkontraktion i råttblåsremsor. Data är normaliserade till KCl (80 mM) svar. C, D) Avsaknad av svar på NMB i musen (C) och gris (D) blåsremsor. Karbakol (CCh) framkallar starkt koncentrationsberoende contractions i både mus och gris remsor, vilket indikerar att remsorna kan reagera på stimuli. TTX (0,5 M) var närvarande i badet i alla band. (Återgivet med tillstånd från Kullmann FA, McKenna D, Wells GI, Thor KB Neuropeptides 2013 Oct; 47 (5):.. 305-13) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5
Figur 5 Elektrisk fältstimulering. A) Schematisk bild av enstaka pulsstimuleringsparametrar. Förkortningar: d = varaktighet puls, i = intensitet av puls, IPI = interpulsintervall B) Schematisk av tåg stimuleringsparametrar.. Förkortningar: td = tåg varaktighet, i = intensitet puls, = iti inter tåg intervall. Inset visar antalet pulser i ett tåg och intervallet between dem, som tillsammans med tåg duration bestämmer hur ofta tåget stimulering. C)   Bidrag purinegic och kolinerga komponenter neuralt-framkallade blåsan. EFS-FR representerar stimuleringsfrekvenser, 2, 5, 10, 20, 50 Hz. Tre stimuli levereras varje 90 sek testades för varje frekvens och varje frekvensserie upprepades två gånger under kontroll och två gånger efter att ha lagt varje förening. Alfa, beta-metylen-ATP, förkortat ABMA (remsa 1), användes för att desensibilisera purinerga receptorer och atropin (remsa 2) användes för att blockera muskarinreceptorer. Strip 3 fungerade som kontroll och behandlades med fordonet, vatten. Pilar indikerar tiden då varje förening tillsattes till varje remsa. Observera att EFS-framkallade sammandragningar är starkt reduceras med ABMA och atropin, utan att påverkas av fordonet. TTX sattes i slutet av försöket, medan EFS levererades vid 20 Hz. Observera att återstående sammandragningar observerats i kontrollenremsa 3 avskaffades av TTX, vilket visar deras neurala karaktär (dvs. initierat av transmittorfrisättning från intramural nerver). # Indikerar glatt muskulatur svar på ABMA i frånvaro av EFS. Skala barer är 5 min för x-axeln och 2 g för y-axeln. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6
Figur 6 Modulering av neuralt framkallade blåskontraktioner. A, B) Exempel på en förbättring av de neuralt framkallade sammandragningar av 5HT4-receptoragonist, cisaprid i humanurinblåsan (A) och ileum remsor (B). Cisaprid (svarta register) eller DMSO (grå skivor) tillsattes i ett koncentrationsberoende sätt vid de tidpunkter som anges med pilar. Svarta fält under posterna i varje panelrepresenterar EFS, som bestod av 10 sek tåg som levereras vid 20 Hz var 120 sek. Vertikala skala barer är 1 g för alla exempel. TTX koncentrationen var 0,5 M. CF) Sammanfattning av arean under kurvan (AUC) för EFS-framkallade kontraktioner som svar på cisaprid (svarta staplar) eller DMSO (grå staplar) i blåsremsor (C, D) och ileum lister (E , F). I CF, SB står för SB-203.186, vilket motsvarar en sammanställning av data som erhållits efter tillsats av 5HT4-receptorantagonist. Prickade linjer är satta till 100% och representerar kontrollen. (Återgivet med tillstånd från Kullmann FA, Kurihara R, Ye L, Wells GI, GD McKenna, Burgard EG, Thor KB Auton Neurosci 2013 Jun; 176 (1-2):... 70-7) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7
Figur 7. webbplatser handlings av droger och betydelsen av olika komponenter i urinblåsan. A) Schematisk bild av protokoll för att identifiera platsen för verkan av ett läkemedel. Remsor stimuleras med ESF och karbakol (CCh). I Jag drog X reducerar EFS svar men inte den CCh respons, vilket indikerar en förut junktional ningsställe. I ii, förändrar drog X båda svaren, vilket indikerar en åtgärd på post-junctionala eller både före och efter junctionala receptorer. B) Inverkan av slemhinnan på glatt muskulatur kontraktion. Effekter av karbakol är sämre i remsor med slemhinnan närvarande (intakt) jämfört med remsor med slemhinnan bort (blottlagda). (B återges med tillstånd från Hawthorn MH, Chapple CR, Kuk M, Chess-Williams R. Br J Pharmacol 2000 Feb; 129 (3):. 416-9). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denna uppsats beskrev vi en enkel in vitro glatt muskulatur kontraktilitet metod som kan användas för att ta itu med ett antal viktiga vetenskapliga frågor som rör urinblåsan fysiologi och patologi, samt medhjälp upptäckten av nya läkemedel för behandling av urinblåsan dysfunktioner. Vi har illustrerat att använda denna metod för att bedöma utvecklings, patologiska och farmakologiska egenskaper blåsan glatt muskulatur kontraktilitet (figurer 2-4), neurotransmission modulation (Siffror 5-7A), arter skillnader (Figur 4), skillnader organ (Figur 6) och relevans specifika blåskomponenter (t.ex. slemhinna, figur 7B). Ytterligare program som inte visas här inkluderar utvärdering av intracellulära signalvägar som använder farmakologiska medel 3,10,11, struktur-aktivitetssamband av olika droger 22-24 eller utvärdering / kvantifiering av sändar releÅse efter neural stimulering 25.

Medan blåsfunktion slutligen kan bedömas in vivo, detta in vitro-metod övervinner många situationer som är problematiska i vivo. Dessa omfattar situationer där kirurgiska och farmakologiska manipulationer skulle minska lönsamheten och / eller överlevnad av organet eller djuret, användning av mänsklig vävnad, behovet av att identifiera och karaktärisera svar från specifika komponenter (t.ex. glatt muskulatur vs epitel vs nerver ) eller användningen av dyra kemikalier. Förfarandet medger systematisk undersökning av effekterna av olika farmakologiska medel samt patologi på kontraktila aktiviteten i den glatta muskulaturen och i ett väl kontrollerat sätt och miljö.

Metoden ger en uppsjö av information; dock bör man vid tolkning och extrapolera dessa uppgifter. Detta är en in vitro-metod för en reducerad beredning, disansluten från sin normala miljö och neural styrning. De experimentella förhållanden är inte fysiologiska, alltså datan kanske inte helt återspeglar in vivo fysiologiska situationer. Exempelvis kan metoden inte hänsyn till förändringar i blodflödet, hormoner, humorala substanser, yttre mekaniska krafter, eller yttre neural styrning. Tissue är akut decentraliserad, alltså skada och ischemi relaterade reaktioner måste utvärderas och beaktas. Patologiska förändringar i hjärnan eller ryggmärgen kan inte testas med denna metod, om de inte redan har ändrat afferenta, glatt muskulatur, slemhinna eller intramural nervfunktion (dvs cellulär plasticitet). Elektrisk fältstimulering (EFS) möjliggör utvärdering av neuralt medierade svar. Däremot retar det urskillningslöst alla nerver i remsan (t.ex. sympatiska, parasympatiska, afferenter), till skillnad från in vivo-situation där urineringsreflexen aktiverar endast särskilt pathways. Ett sätt att övervinna denna situation är att kombinera EFS med specifika antagonister som selektivt blockerar olika vägar. Exempelvis skulle guanetidin användas för att blockera norepinefrin frisättning när man studerar sammandragningsegenskaper, eller atropin kan användas för att blockera muskarinreceptorer att förhindra blåssammandragningar vid studier relaxationsegenskaper. Slutligen är viabilitet av vävnaden begränsad till ett visst antal timmar. I allmänhet är de flesta komponenterna i blåsvävnad är livsdugliga och stabila (dvs svara på EFS utan försämrade svar) under en period av 6-8h eller längre. Dock kan andra vävnader vara känsligare (t.ex. varar ileum ~ 6 timmar eller mindre, författarens personliga erfarenheter).

Även om metoden är tekniskt möjligt och med god reproducerbarhet, det finns flera viktiga åtgärder som krävs för att säkerställa dess framgång. För det första bör förberedelse vävnad utföras noggrant för att säkerställa lönsamheten genom att göra nödvändiga förändringartill dissekering förfarandet (undvik att sträcka vävnaden samtidigt förbereda remsorna) och / eller media om det behövs för olika typer eller arter vävnads. Ett annat viktigt steg är att sätta upp neuronala stimuleringsparametrar, så att taket effekter undviks. Såsom beskrivits i metodavsnittet, beror detta på typen av mekanismen för verkan av testföreningen experiment utfört och förväntat. Till exempel, för att testa effekterna av cisaprid, en 5HT4-receptoragonist, om blåsremsor (figur 6), vi ställa in amplituden av EFS-framkallade kontraktionen till ~ 50% av den maximala. Detta baserades på den kända verkningsmekanismen för 5HT4-receptoragonister, nämligen förstärker ACh-frisättning från pre-Junktional parasympatiska nerver 27, vilket i sin tur förväntas öka EFS-framkallade sammandragningar. Stimulering av muskler kontra nerver bör testas med hjälp av TTX, som hämmar nerv överföring och därmed borde hämma EFS-framkallade sammandragningar. Tillräckliga kontroller för fordon och time måste utföras under drogtestning till hänsyn till försämring av vävnaden med tiden och för eventuella effekter av fordonet. Till exempel är många läkemedel löst i DMSO eller etanol. Våra data (Figur 6) visar att DMSO (0,1% och högre) kan öka neuralt framkallade sammandragningar, en effekt som måste subtraheras från effekten av testläkemedlet. Likaså etanol (upp till 1%) minskar de spontana glatta muskelsammandragningar, men har ingen effekt på Neurally-framkallade kontraktioner 34,35. Om du använder genmanipulerade djur eller kirurgiska modeller (t ex ryggmärgsskada eller efter ooforektomi), bör kontrollerna omfatta vävnad från den bakgrund musstammen eller skenopererade djur. Dessutom är vissa vävnader, såsom mänskliga, mus och marsvin blåsor innehåller intramural ganglierna. När du arbetar med dessa vävnader, måste protokoll urval och tolkning av data ta hänsyn till effekter av läkemedel eller EFS på intramural neurons som ytterligare stimulerar den glatta muskulaturen.

Utforma det experimentella protokollet, att välja rätt parametrar (EFS, för drog stimulering) och koncentrationer som skall testas är avgörande för att säkerställa meningsfulla uppgifter. Även parametrar bör justeras för enskilda vävnader och droger, allmänna principer / riktlinjer som beskrivs nedan är tillämpliga. Kumulativa koncentrations-responskurvorna är önskvärda, men detta är inte möjligt för alla föreningar. Läkemedel som riktar receptorer som okänsliga, såsom purineric jonotropa receptorer (P2X), eller läkemedel som metaboliseras snabbt i vävnaden (exempel ACh), kan inte testas på ett tillförlitligt sätt med hjälp av kumulativa koncentrationsresponskurvor i samma vävnad. I dessa fall är enskilda koncentrationer testas i olika grupper av vävnad. För att utvärdera hyposensibilisering, rekommenderas att jämföra storleken på som förvärvas vid ett enskilt högsta koncentrationen som uppnås vid slutet av en kumulativ koncentrationsvarskurva.

För exakt montering av uppgifterna från koncentrationsresponskurvor, är det önskvärt att testa halvloggkoncentrationer (t.ex. CCH i Figur 6). Men log koncentrationer (t.ex. NMB i figur 4A) är acceptabelt när vävnadsviabilitet kan begränsas eller andra begränsningar kan vara på plats.

För att välja ett koncentrationsområde för en ny förening, i preliminära försök, är det lämpligt att överväga bindningsaffiniteten av föreningen och testa två makt 10 över och under denna koncentration. I efterföljande experiment, är det protokoll som raffineras för att bestämma en startpunkt där ingen effekt av läkemedlet observeras och en slutpunkt där antingen svaret är maximal eller den testade koncentrationen inte längre är specifik för det avsedda målet.

Tidsintervallet för applicering av ett läkemedel bör väljas med hänsyn tagen till flera faktorer: a) Dags för enläkemedel för att ha en effekt. Generellt läkemedel riktade mot membranreceptorer har en relativt snabb respons (sekunder till minuter), medan läkemedel mot intracellulära mål (t.ex. forskolin och andra enzymhämmare 36, botulinumtoxin 37) kräver ytterligare inkubationstid (30 min - 3 timmar). Dessutom kan vävnadstjocklek spela en roll. b) Varaktighet och verkningsmekanismen för läkemedel. För de fall då läkemedelseffekten når en platå som är ihållande, såsom NMB i figur 4A och cisaprid i Figur 6, tidsintervall på 5-15 min mellan drogapplikationer är tillräckliga för att samla in tillräckligt med data. Detta är inte möjligt med läkemedel som har en mycket kortare verkningstid eller annan verkningsmekanism (ATP, CCh). Till exempel effekten av CCh i figur 4C eller 4D, når en platå snabbt men vävnaden spänningen tenderar att återvända till baslinjen. I detta fall är tidsintervallen behöva justeras enligtly, vanligtvis sätta nästa koncentration när det första svaret når ett maximum.

Dataanalys, särskilt normalisering av data för att möjliggöra jämförelser mellan remsorna är ett mycket viktigt steg. Olika studier använder olika parametrar för normalisering, inklusive remsor vikten 38, band tvärsnittsarea 39, KCl svar 12% av maximal respons 28 eller% av det maximala svaret på en annan sammandragande medel (t.ex. CCh 38). Normaliserings parametern bör väljas beroende på ändamålet med experimentet, så att parametern inte påverkas av testföreningar, patologi eller experimentell design. Till exempel normalisering till KCI svar eliminerar vikt och andra dimensioner av remsorna, och därmed kan användas för att jämföra svaren i vävnader där patologiskt tillstånd kan öka vikten på banden (t.ex. ökar diabetesblåsmassan). Dessutom regensvaret på KCl påverkas inte av att avlägsna slemhinnan / urothelium 29, vilket skulle kunna användas i försök som utvärderar olika komponenter i urinblåsan (t.ex. slemhinna kontra musklerna).

Sammanfattningsvis ger denna kontraktilitet metod ett snabbt, enkelt och mycket kraftfullt förhållningssätt för att bedöma urinblåsan (och andra organ) fysiologi och farmakologi. När det används på rätt sätt, det ger möjlighet att manipulera vävnad i en reducerad och väl kontrollerad miljö. I studien av urinblåsfunktion, denna metod bidrog upptäckten och testning av föreningar som för närvarande används för OAB hantering, såsom antimuskarina medel och nyutvecklade β 3 AR-agonister.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av NIH R37 DK54824 och R01 DK57284 bidrag till LB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Tissue Bath System with Reservoir Radnoti, LLC 159920 isolated tissue baths
Warm water recirculator pump Kent Scientific Corporation  TPZ-749 to keep tissue baths to 37 °C
Computer
Data Acquisiton System DataQ Instruments DI-710-UH To view, record and analyze data
Transbridge Transducer Amplifier World Precision Instruments SYS-TBM4M Transducer amplifier
Grass stimulator Grass Technologies Model S88 Stimulator
Anesthesia System Kent Scientific Corporation  ACV-1205S To anesthetesize the animal
Anesthetizing Box Harvard Apparatus 500116 To anesthetesize the animal
Anesthesia Masks Kent Scientific Corporation  AC-09508 To anesthetesize the animal
Materials and Surgical Instruments
Sylgard Dow Corning Corp 184 SIL ELAST KIT To pin, dissect, & cut tissue
Petri Dish Corning 3160-152 To dissect/cut tissue
Insect Pins ENTOMORAVIA Austerlitz Insect Pins Size 5 To pin tissue
Bench Pad VWR International 56617-014 Absorbent bench underpads
Rat surgical Kit Kent Scientific Corporation  INSRATKIT To remove and dissect tissue
2 Dumont #3 Forceps Kent Scientific Corporation  INS500064 To remove and dissect tissue
Tissue Forceps Kent Scientific Corporation  INS500092 To remove and dissect tissue
Scalpel Kent Scientific Corporation  INS500236 To remove and dissect tissue
Scalpel blade Kent Scientific Corporation  INS500239 To remove and dissect tissue
Professional Clipper  Braintree Scientific, Inc. CLP-223 45 To remove fur
Suture Thread Fine Science Tools 18020-50 Tie tissue
Tissue Clips Radnoti, LLC 158802 Attach tissue to rod/transducer
1 g weight  Mettler Toledo 11119525 For transducer calibration
Chemicals
Krebs Solution:
Sodium chloride
Potassium chloride
Monobasic potassium phosphate
Magnesium sulfate
Dextrose
Sodium bicarbonate
Calcium chloride
Magnesium chloride		  
Sigma
Fisher
Fisher
Fisher
Fisher
Sigma
EMD
Baker		  
S7653
P217-500
P285-3
M65-500
D16-500
S5761
CX0130-2
2444		 To prepare Krebs solution
Isoflurane Henry Schein 029405 To anesthetesize the animal
 Oxygen tank Matheson Tri Gas ox251 To use with anesthesia system
Carbogen Tank (95% Oxygen; 5% Carbon Dioxide)  Matheson Tri Gas Moxn00hn36D To aerate Krebs solutions

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. The neural control of micturition. Nat Rev Neurosci. 9, 453-466 (2008).
  2. Andersson, K. E. Detrusor myocyte activity and afferent signaling. Neurourol Urodyn. 29, 97-106 (2010).
  3. Artim, D. E., et al. Developmental and spinal cord injury-induced changes in nitric oxide-mediated inhibition in rat urinary bladder. Neurourology and urodynamics. 30, 1666-1674 (2011).
  4. Kita, M., et al. Effects of bladder outlet obstruction on properties of Ca2+-activated K+ channels in rat bladder. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 298, 1310-1319 (2010).
  5. Barendrecht, M. M., et al. The effect of bladder outlet obstruction on alpha1- and beta-adrenoceptor expression and function. Neurourol Urodyn. 28, 349-355 (2009).
  6. Maggi, C. A., Santicioli, P., Meli, A. Postnatal development of myogenic contractile activity and excitatory innervation of rat urinary bladder. The American journal of physiology. 247, 972-978 (1984).
  7. Ng, Y. K., de Groat, W. C., Wu, H. Y. Smooth muscle and neural mechanisms contributing to the downregulation of neonatal rat spontaneous bladder contractions during postnatal development. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 292, 2100-2112 (2007).
  8. Szell, E. A., Somogyi, G. T., de Groat, W. C., Szigeti, G. P. Developmental changes in spontaneous smooth muscle activity in the neonatal rat urinary bladder. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 285, 809-816 (2003).
  9. Szigeti, G. P., Somogyi, G. T., Csernoch, L., Szell, E. A. Age-dependence of the spontaneous activity of the rat urinary bladder. J Muscle Res Cell Motil. 26, 23-29 (2005).
  10. Frazier, E. P., Braverman, A. S., Peters, S. L., Michel, M. C., Ruggieri, M. R. Does phospholipase C mediate muscarinic receptor-induced rat urinary bladder contraction. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 322, 998-1002 (2007).
  11. Xin, W., Soder, R. P., Cheng, Q., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Selective inhibition of phosphodiesterase 1 relaxes urinary bladder smooth muscle: role for ryanodine receptor-mediated BK channel activation. American journal of physiology. Cell physiology. 303, 1079-1089 (2012).
  12. Frazier, E. P., Peters, S. L., Braverman, A. S., Ruggieri, M. R., Michel, M. C. Signal transduction underlying the control of urinary bladder smooth muscle tone by muscarinic receptors and beta-adrenoceptors. Naunyn-Schmiedeberg's archives of pharmacology. 377, 449-462 (2008).
  13. Svalo, J., et al. The novel beta3-adrenoceptor agonist mirabegron reduces carbachol-induced contractile activity in detrusor tissue from patients with bladder outflow obstruction with or without detrusor overactivity. European journal of pharmacology. 699, 101-105 (2013).
  14. Yokota, T., Yamaguchi, O. Changes in cholinergic and purinergic neurotransmission in pathologic bladder of chronic spinal rabbit. J Urol. 156, 1862-1866 (1996).
  15. Bayliss, M., Wu, C., Newgreen, D., Mundy, A. R., Fry, C. H. A quantitative study of atropine-resistant contractile responses in human detrusor smooth muscle, from stable, unstable and obstructed bladders. J Urol. 162, 1833-1839 (1999).
  16. Kullmann, F. A., McKenna, D., Wells, G. I., Thor, K. B. Functional bombesin receptors in urinary tract of rats and human but not of pigs and mice, an in vitro study. Neuropeptides. 47, 305-313 (2013).
  17. Sadananda, P., Kao, F. C., Liu, L., Mansfield, K. J., Burcher, E. Acid and stretch, but not capsaicin, are effective stimuli for ATP release in the porcine bladder mucosa: Are ASIC and TRPV1 receptors involved. European journal of pharmacology. 683, 252-259 (2012).
  18. Maggi, C. A., et al. Species-related variations in the effects of capsaicin on urinary bladder functions: relation to bladder content of substance P-like immunoreactivity. Naunyn-Schmiedeberg's archives of pharmacology. 336, 546-555 (1987).
  19. Kullmann, F. A., et al. Effects of the 5-HT4 receptor agonist, cisapride, on neuronally evoked responses in human bladder, urethra, and ileum. Autonomic neuroscience : basic & clinical. 176, 70-77 (2013).
  20. Warner, F. J., Miller, R. C., Burcher, E. Human tachykinin NK2 receptor: a comparative study of the colon and urinary bladder. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30, 632-639 (2003).
  21. Zoubek, J., Somogyi, G. T., De Groat, W. C. A comparison of inhibitory effects of neuropeptide Y on rat urinary bladder, urethra, and vas deferens. The American journal of physiology. 265, 537-543 (1993).
  22. Warner, F. J., Miller, R. C., Burcher, E. Structure-activity relationship of neurokinin A(4-10) at the human tachykinin NK(2) receptor: the effect of amino acid substitutions on receptor affinity and function. Biochem Pharmacol. 63, 2181-2186 (2002).
  23. Warner, F. J., Mack, P., Comis, A., Miller, R. C., Burcher, E. Structure-activity relationships of neurokinin A (4-10) at the human tachykinin NK(2) receptor: the role of natural residues and their chirality. Biochem Pharmacol. 61, 55-60 (2001).
  24. Dion, S., et al. Structure-activity study of neurokinins: antagonists for the neurokinin-2 receptor. Pharmacology. 41, 184-194 (1990).
  25. Somogyi, G. T., Zernova, G. V., Yoshiyama, M., Yamamoto, T., de Groat, W. C. Frequency dependence of muscarinic facilitation of transmitter release in urinary bladder strips from neurally intact or chronic spinal cord transected rats. British journal of pharmacology. 125, 241-246 (1998).
  26. Andersson, K. E., Wein, A. J. Pharmacology of the lower urinary tract: basis for current and future treatments of urinary incontinence. Pharmacological reviews. 56, 581-631 (2004).
  27. D’Agostino, G., Condino, A. M., Gallinari, P., Franceschetti, G. P., Tonini, M. Characterization of prejunctional serotonin receptors modulating [3H]acetylcholine release in the human detrusor. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 316, 129-135 (2006).
  28. Hawthorn, M. H., Chapple, C. R., Cock, M., Chess-Williams, R. Urothelium-derived inhibitory factor(s) influences on detrusor muscle contractility in vitro. British journal of pharmacology. 129, 416-419 (2000).
  29. Chaiyaprasithi, B., Mang, C. F., Kilbinger, H., Hohenfellner, M. Inhibition of human detrusor contraction by a urothelium derived factor. J Urol. 170, 1897-1900 (2003).
  30. Testa, R., et al. Effect of different 5-hydroxytryptamine receptor subtype antagonists on the micturition reflex in rats. BJU international. 87, 256-264 (2001).
  31. Craggs, M. D., Rushton, D. N., Stephenson, J. D. A putative non-cholinergic mechanism in urinary bladders of New but not Old World primates. J Urol. 136, 1348-1350 (1986).
  32. Fry, C. H., Bayliss, M., Young, J. S., Hussain, M. Influence of age and bladder dysfunction on the contractile properties of isolated human detrusor smooth muscle. BJU international. 108, 91-96 (2011).
  33. Kennedy, C., Tasker, P. N., Gallacher, G., Westfall, T. D. Identification of atropine- and P2X1 receptor antagonist-resistant, neurogenic contractions of the urinary bladder. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 845-851 (2007).
  34. Levin, R. M., Danek, M., Whitbeck, C., Haugaard, N. Effect of ethanol on the response of the rat urinary bladder to in vitro ischemia: protective effect of alpha-lipoic acid. Molecular and cellular biochemistry. 271, 133-138 (2005).
  35. Malysz, J., Afeli, S. A., Provence, A., Petkov, G. V. Ethanol-mediated relaxation of guinea pig urinary bladder smooth muscle: Involvement of BK and L-type Ca2+ channels. American journal of physiology. Cell physiology. 306, 45-58 (2013).
  36. Longhurst, P. A., Briscoe, J. A., Rosenberg, D. J., Leggett, R. E. The role of cyclic nucleotides in guinea-pig bladder contractility. British journal of pharmacology. 121, 1665-1672 (1997).
  37. Takahashi, R., Yunoki, T., Naito, S., Yoshimura, N. Differential effects of botulinum neurotoxin A on bladder contractile responses to activation of efferent nerves, smooth muscles and afferent nerves in rats. J Urol. 188, 1993-1999 (2012).
  38. Sadananda, P., Chess-Williams, R., Burcher, E. Contractile properties of the pig bladder mucosa in response to neurokinin A: a role for myofibroblasts. British journal of pharmacology. 153, 1465-1473 (2008).
  39. Liu, G., Daneshgari, F. Alterations in neurogenically mediated contractile responses of urinary bladder in rats with diabetes. American journal of physiology. Renal physiology. 288, 1220-1226 (2005).

Tags

Medicin Krebs artskillnader, Glatt muskulatur kontraktilitet neural stimulering
Bladder Smooth Muscle Strip Kontraktilitet som en metod för att utvärdera Lower Urinary Tract farmakologi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kullmann, F. A., Daugherty, S. L.,… More

Kullmann, F. A., Daugherty, S. L., de Groat, W. C., Birder, L. A. Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology. J. Vis. Exp. (90), e51807, doi:10.3791/51807 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter