Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Sinir Devresi Temelini Bellek Oluşumunda Diseksiyon için Yenidoğan Sıçanlarda bir Lateralize Koku Öğrenme Modeli

Published: August 18, 2014 doi: 10.3791/51808
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1
1Division of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, Memorial University, 2Division of Medical Sciences, University of Victoria
* These authors contributed equally

Introduction

Olfaction başarıyla gezinmek veya kendi ortamında hayatta kalmak için mümkün olmaz onsuz kemirgenlerde primer duyu yöntemidir. Bu 1 beslemek için annelerini bulmak için koku alma duyusunu kullanmak için, ilk doğum sonrası hafta boyunca görmeniz ne duymak ne yenidoğan yavrular, için özellikle önemlidir. Sonuç olarak, yenidoğan sıçan yavrular basit deneysel manipülasyonlar ile kokuları tercih klimalı edilebilir. Uyaranların çeşitli iç içe geçme çevre 2,3, süt emzirme 4-6, okşayarak ve dokunma uyarısına 7 de dahil olmak üzere yeni yenidoğanlarda kokulara koşullandırılmış tepkileri (Koşullu uyarı, TH), indükleme koşulsuz uyarıcı (UCS) olarak kullanılmaktadır 12, kuyruk tutam 13, anne tükürük 13, hafif bir ayak şok 14-18, ve intrakranial beyin stimülasyonu 19. Bu çalışmada köklü bir erken koku tercihi paradigma istihdam edildiği bu durumda nane bir koku, bennane, 24 saat sonra 10,11,20 için bir tercih üretilmesi amacıyla dokunma uyarısına birlikte s. Bu kokular hafızası esas olarak koku ampuller (OB) 21-23 ve ön piriform korteks (APC), 24,25 de dahil olmak üzere, sağlam koku devresi bağlıdır.

Erken koku tercihi öğrenme Deneysel araştırmalar derinleşti ve bir memeli hafıza moleküler ve fizyolojik temellerinin anlayışımızı genişlettik. Bu memeli model, bellek mekanizmaları okuyan birçok avantajı vardır. İlk olarak, UCS sinyalinin nöral kaynakları tespit edilmiştir. Yukarıda belirtildiği gibi, çeşitli uyarıcılar sırayla 22,27,28 öğrenmeyi desteklemek hücresel ve fizyolojik etkilere neden OB ve aPC'ye birden adrenoreseptörler aktive odağı coeruleus norepinefrin salınımını 26 uyarırlar. İkincisi, bellek destek mekanizmaları iyi tanımlanmış laminer sinir yapıları yer almaktadır.yenidoğan sıçanlarda koku devrenin basitlik sinaptik plastisite ile ilgili karmaşık süreçleri ortaya çıkarmak için birlikte ideal bir çerçeve ile araştırmacılar sağlar. Diğer yapılar 29 arasında OB ve ipsilateral lateral koku yolu (LOT) ile piriform korteks (PC) dönüş projesi çerçevesinde bu mitral / sorguçlu hücrelerin mitral / tüylü hücreler üzerine koku epiteli projede koku alma duyu nöronları (OSN). OSN OB 30,31 sinapsların ve LOT aPC'ye içinde 24,25 sinapsların sinaptik öğrenme destekleyen değişiklikler ve bellek için kritik loci olarak tespit edilmiştir. Üçüncü olarak, sıçanlarda erken yaşta, koku girişler kolayca lateralize edilebilir. Her aPC'ye bu kez beyaz cevher tam post-natal gün 12 (PD12) 32'de oluşturulan ön komissura'da aracılığıyla ikili koku bilgilere erişimi vardır. PD 12 önce, koku girişli tek tıkanıklığı naris 24,25,31,33,34 <aracılığıyla OB ve aPC'nin ipisilateral izole edilebilir/ Sup>. Tek naris tıkanıklığı açık naris gelen koku hafıza oluşumuna olanak ve 12 33 pd önce tıkalı naris aynı bellek önler. Koku hafızası hem OB ve aPC'ye dahil ipsilateral hemisferde izole edilir. Bu nedenle, her sıçan yavru öğrenme ve fizyolojisini destekleyen için kendi kontrol edilebilir.

Bu çalışmada, lateralize ilk koku tercih öğrenme protokol verilmektedir. Bu yöntem, böylece gerekli hayvan sayısını ve genel varyasyonu de azaltarak, intra-hayvan kontrolü 24,25,31 sağlayarak koku öğrenmenin temelini nöral mekanizmaları çalışmak için güçlü bir araç olarak hizmet vermektedir. Tıkanıklığı naris gres ya da burun tıkacın uygulanan ve en az stres veya hayvana zarar çıkarılabilir olması ile tersine çevrilebilir. Burada öncelikle, erken koku tercihi eğitim ve test prosedürleri ayrıntılı bir nos tek naris tıkanıklığı kullanarak lateralizan protokolü odaklanarak, tarif edilmektedire fiş. Sonra sonuçlar koku girişini izole ve lateralizan koku belleği üreten tek tıkanıklığı naris etkinliğini göstermek için sunulmaktadır. Son olarak, hem öğrenim hem de destek bellek ifade oluşturmak koku sistemi fizyolojik değişiklikleri incelemek için bu lateralizan öğrenme modelini kullanarak potansiyelleri tartışılmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Her iki cinsiyette Sprague Dawley sıçan (Charles River) yavrular kullanılır. Litters (doğum PD0 olmak) PD1'in 12 on itlaf edilir. Baraj gıda ve suya ad libitum giriş ile, 12 saat aydınlık / karanlık döngüsünde tutulur. Deneysel prosedürler Memorial Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Burun Tak İnşaatı

NOT:. Bu prosedür adapte Cummings ve ark modifiye edildi (1997) 35.

  1. Kazandırılacak polietilen-20 tüp ve 3-0 ipek sütür konu.
  2. Yaklaşık olarak 0.8 mm olan polietilen boru 20 küçük bir parça kesin.
  3. Iplik boru bölümünün her iki yanı üzerinde olduğu bir şekilde hazırlanan boru içinden Konu ipek dikiş ipliği.
  4. Tıpanın dış ipliğin bir ucunda, ipliğin bir düğüm.
  5. Iplik düğüm üzerinde aşağı tüp bölümünü çekin. Düğüm boru içine başvurusunda gerekir.
  6. Ipliğin yaklaşık 2 mm hortumunun bir ucundan dışarı çıkıntı yapan şekilde, ipliğin her iki ucuna da trimerler (Şekil 1A bakınız).

Eğitim öncesi 2. Naris Tıkanıklığı

  1. Düzenli yatak ile kaplı güvenli bir çanak baraj ve yerden yavru çıkarın.
  2. Naris üzerine, lokal anestezik jöle,% 2 lidokain kurulamak için bir pamuk uçlu uygulamayı kullanmak tıkanacak.
  3. Yavru ~ 3 dakika boyunca çanak dinlenmeye bırakın.
  4. Baskın olmayan elle yavaşça ama güvenli yavru tutun.
  5. Dominant eli kullanarak, burun fiş almak ve iplik çıkıntı değil hangi ucu etrafında aynı lokal anestezik jel hafifçe sürün. Bu fiş ekleme ile ilgili herhangi bir minör ağrıları için hem bir anestezik olarak hareket edecek ve naris içinde bir yağlayıcı olarak hareket edecektir. NOT: Xylocaine etkisi birkaç dakika içinde başlar ve 20-30 dakika sürer. Xylocaine jöle uygulamadan sonra fiş yerleştirilmesi için genel göstermek iyi tolerans yavrular (myayilan mücadele ve seslendirme).
  6. Yavaşça sıkıca yavru tutan ve Fişin tamamen takıldığını ve sadece 2 mm diş naris çıkıntı kadar yavaş yavaş çok nazik itişlerle fişi çevirerek burun fişini takın (Şekil 1B bakınız). Bu işlem sırasında ya da herhangi bir kanama naris olmalıdır. Burun fiş yerleştirilmesi sırasında kanama ile yavrular hariç ve barajlar iade edilir
  7. Hayvan tıpa alıştırmak amacıyla 5 dakika için bu çanak dinlenmeye bırakın.
  8. Alışma çanak yavru çıkarın ve klima paradigmayı 24 başlar.

Şekil 1
Bir burun fiş Şekil 1. İnşaat. A) Şemalar bir burun fişi yapma aşamalarını gösteren. Bir iş parçacığı polietilen boru ile çekilir; Bir düğüm yapılan ve pul edilirBunu engellemek için, borunun ortasına içine bırakılır; iki ucu) boru. b üzerinden bir ucunda 2 mm'lik bir tortu ile ön ve bir naris bir burun fişi ile bir sıçan lateral bir görünüşünü kesilir.

3. Kokulu Yatak Hazırlama

  1. Yeni eldiven giyen ve koku bulaşmayı önlemek bir plastik torba içine woodchip yatak 500 ml yerleştirmek için bir davlumbaz.
  2. 0.3 ml nane özü hazırlamak için bir şırınga kullanın ve plastik torba içinde yatak üzerinde bu sprey.
  3. , Çanta kapalı kravat şiddetle çanta sallayın ve yatak 5 dakika boyunca torbaya dinlenmeye bırakın.
  4. Kullanmadan önce, 5 dakika boyunca bir çeker ocak içinde ortaya çıkarılan bir net, sığ, akrilik eğitim kutusu (20 x 20 x 5 cm 3, Şekil 2A) olarak kokulu yatak yerleştirin. Yatak hazırlandıktan sonra, bu eldiven atmak ve bu eldivenler hayvanlarla temas etmesine izin vermeyin.
  5. Özdeş bir şeffaf plastik kutu içinde kokusuz yatak yerleştirin, ve eno kokulu yatak veya kullanılan eldiven ile temas etmediğinden emin olun.

4. Koku Klima Paradigma (Şekil 2A resmi görmek)

Yavrular PH 6, ya da birden çok deneme seansları (günde bir seans, PD 3-6) üzerinde, ya tek bir klima oturumu tabi.

  1. Kokulu yatak üzerinde habitüe yavru yerleştirin. Koku kontrolü sadece (O / S -) için yavrular, daha sonra 4,5 adıma atlayın, 10 dakika boyunca yatak üzerinde bu yavrular bırakın. Deneysel koku + inme (O / S +) yavrular, bu bölümde aşağıdaki adımlarla devam ediyor.
  2. İnme 30 saniye boyunca yavru küçük bir fırça kullanarak. Öncelikle yavru arka bölgenin çevresinde hızlı dairesel hareketlerle kullanın.
  3. Yavru 30 saniye boyunca dinlenmeye bırakın.
  4. Tekrar 4.2 ve 10 dakika olmak üzere toplam 4,3 (okşayarak + koku yani 10 eşleşmeleri) adım.
  5. , Klima kutusundan yavru çıkarın burun fişini çıkarın ve baraj yavru dönmek.
<p class = "jove_title"> 5. Lateralize Koku Tercih Test (Şekil 2B resmi görmek)

Test, son antrenman sonra çeşitli zaman noktalarında (örneğin, 24 ya da 48 saat) oluşur. Test 2 cm nötr bölge ile ayrılmış iki eğitim kasası (eğitim kutu 3,4 tarif edilmiştir), üst üste yerleştirilir, paslanmaz çelik bir test bölmesinin (30 x 20 x 18 cm3) içinde gerçekleştirilir. Diğer kutusu temiz, kokusuz yatak içerir iken bir eğitim kutu nane kokulu yataklar içerir. Test bölmesinin tabanı daha sonra plastik örgü çıkarılabilir bir levha (Şekil 2B) ile kaplanmış olan bir metal ızgara vardır.

  1. Bir nane ve Bölüm 3 başına bir kokusuz yatak hazırlayın ve 2 cm aralıklarla test odasının, ters taraflarında altında her bir kutu yerleştirin. Test odasının metal ızgaralı zemin üzerine plastik örgü yerleştirin.
  2. Baraj yavru çıkarın ve naris üzerinde kokusuz silikon gres bir firma dab koyunBu eğitim sırasında tıkanmaktadır. Yeniden başvuruda gerektiği gibi ilk test boyunca gres. NOT: eğitim ve test sırasında Rastgele naris tıkanıklığı önyargı önlemek için kabul edilebilir.
  3. Test bölmesinin nötr bölgedeki yavru yerleştirin.
  4. Yavru odasının iki tarafın üzerinden geçirdim ne kadar süre kayıt, yavru 1 dakika odasını keşfetmek için izin (yani nane veya tarafsız kokulu yatak üzerinde).
  5. Yavru bir kapalı plastik tutma odasının 1 dakika dinlenmeye bırakın.
  6. Tekrar 10 dakika toplam 5,2 ve 5,3 adım (5 ile kalan denemeleri ile ayrılan 5 testi denemeleri) yönünde tercihlerini kontrol etmek amacıyla oda içindeki yavru bir başlangıç ​​yönlenmesini anahtarlama.
  7. Testin hemen ardından, naris gelen yağı silin.
  8. Bölüm 2'deki gibi ters naris, bir polietilen noseplug yerleştirin ve hayvan 10 dakika boyunca dinlenmeye bırakın.
  9. Olarak bir kez daha test yavru 5.3 -5.6, kapağı çıkarıp, baraja yavru dönmek. Çıkarın ve% 95 etanol ile test odasının plastik örgü temizlemek ve sıvı buharlaşmasına izin verin. Sonraki yavru test etmeden önce geri örgü yerleştirin.
    NOT: test sırasında ilk naris oklüzyon silikon gres uygulanması, kanama ve burun fiş ekleme ile ilişkili stres şansını engeller.

Şekil 2
Şekil 2. Erken koku tercihi eğitim ve test. Paradigma okşayarak + koku kullanarak A) Erken koku tercih çalışması. B) bir tarafta nane yatak ile iki seçenek koku tercihini test, karşı tarafta yatak kokusuz kontrol eder. 2 cm nötr bölge arasına yerleştirilir.

6. Tek Naris Oklüzyonu Etkinliğinin Test

nt "> Bu deney, tek naris tıkanma koku alma sisteminin lateralizan aktivasyonuna neden olup olmadığını belirlemek için yapılır.

  1. Bölüm 2'de tarif edildiği gibi 6 veya PH 7 yavruların tek taraflı naris oklüzyonlarını gerçekleştirin.
  2. ~ 5 dk alışma sonra, bir kapalı plastik kapta yavru koyun ve 10 dakika boyunca doku bir parça batırılmış 30 ul saf nane yağı maruz kalmaktadır.
  3. Hemen nane kokusu maruz kaldıktan sonra, periton boşluğu içine (ip) dozunda genel anestezik olarak hidrat (400 mg / kg) ya da pentobarbitolün (150 mg / kg) ile yavru enjekte edilir.
  4. Tam (baştan kuyruğa veya ayak tutam yanıt vermedikleri) anestezi sonra, transkardiyal 0.1 M fosfat tampon çözeltisi, PBS içinde çözüldü paraformaldehid (% 4, ardından ~ 1 dakika boyunca tuzlu su (% 0.9) içinde buz soğukluğunda çözümlerle yavru, serpmek ).
  5. Daha sonra, trans, paraformaldehid perfüzyon 10 dakika sonra beyin toplamak ve 4 ° C'de bir gece paraformaldehid koyunEk bir 24 saat boyunca, bir sakaroz çözeltisi (PBS içinde% 20) ile beyin fer.
  6. Bir kriostat ile 30 mikron kalınlığında koronal beyin dilimleri kesin. OB ve PC dilimleri toplayın ve pCREB antikor 21,25,30 standart immünhistokimya boyama izledi jelatin kaplı slaytlar, üzerine monte.

7. Tek Naris Oklüzyonu reversibilite testi

Bloke edici etkisi burun tıkacın çıkarılmasının ardından 24 saat sonra geri olup bu deney testleri.

  1. Bölüm 2'de tarif edildiği gibi 6 veya PH 7 yavruların tek taraflı naris oklüzyonlarını gerçekleştirin.
  2. (Eğitim sırasında tıkanıklığı naris süresine eşdeğer - 5 dk alışma + 10 dk eğitim) 15 dakika sonra, burun kapağı çıkarıp, baraja yavru dönmek.
  3. 6.2 de tarif edildiği gibi 24 saat sonra, 10 dakika süre ile kapalı bir plastik kap içine nane kokusuna maruz yavru.
  4. Mezhep aynı adımları izleyin6,3-6,6 iyonlar bulunmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Burada koku girişini izole ve bir yarımkürede öğrenme tıkanıklığı naris etkinliğini ve bu yöntemin reverzibilitesini göstermek için daha önce kurulmuş sonuçlarının 24 bazı gözden.

Erken koku tercihi eğitim sırasında tek naris tıkanıklık lateralizan koku hafızasına 24 yol açar. Bellek korunmuş naris (Şekil 3) ile sınırlıdır. Yavrular eğitimi sırasında olduğu gibi tıkanır aynı naris ile koku tercihi için test edildiğinde, klimalı koku (örneğin, nane) için tercih gösteriyor. Yavrular tıkandı ters naris ile test edildiğinde, klimalı koku için hiçbir tercih gösteriyor. Birlikte, bu sonuçlar bir koku tercihi bellek yalnızca oluşturulmuş ve ilişkisel klima okşayarak + koku uygulanan bağışladı naris ile ifade edilir düşündürmektedir.

Şekil 3, Şekil 3. Tek naris tıkanıklığı lateralizan koku öğrenmeyi uyarmaktadır. Davranış protokolü üst panelinde gösterilir. Koku + (O / S +) okşayarak veya koku sadece (O / S -) eğitim sırasında tıkanmaktadır tek naris hayvanlar, ters naris tıkalı ile aynı naris sonra tıkandı ilk koku tercihi testi uygulandı. Alt komisyon iki seçim koku testinde farklı gruplar arasında nane kokulu yatak üzerinde harcanan zamanın yüzdesini gösterir. * P <0.05. Hata çubukları, ortalama ± SEM. Fontaine ve ark çoğaltılmıştır., J. Izni ile Neuroscience (2013).

Koku maruz (Şekil 4) 24 sırasında koku alma sisteminin lateralizan aktivasyonu lateralizan koku eğitimi sonuçları. Tek naris tıkanıklığı OB aktivasyonunu ve ipsilateral hemisfer pahalı ne bir PC önlerkoku maruz kalma ng. Bu CREB'ye OB fosfatlanmasını ve PC izlenmesi ile gösterilmiştir. Immünohistokimya kullanılarak, Şekil 4'de gösterildiği gibi, fosforile CREB (pCREB) karşı korunmuş hemisfer ile karşılaştırıldığında, nane kokusu maruz kaldıktan sonra, tıkanmış hemisferde önemli ölçüde daha düşüktür. Nissl boyama (Şekil 4A) OB mitral hücre katmanı benzer hücre gövdeleri göstermektedir ve her iki yarı kürelerinin PC'nin piramidal hücre tabakası. Bununla birlikte, tıkalı pCREB naris (Şekil 4B) kadar yarı küre ipsilateral her iki hücre tabakalarının önemli ölçüde daha düşüktür.

Şekil 4
Şekil koku pozlama sırasında koku alma sisteminin lateralizan aktivasyonu 4. Tek naris tıkanıklığı sonuçları. Koku ampul) Nissl boyama(OB) ve ön piriformis'in korteks (aPC). B) tek bir naris tıkalı yavru nane maruz takip tıkalı ve bağışladı hemisferlerde PCREB ifadeler. Oklar aPC OB ve piramidal hücre tabakasmm mitral hücre tabakasını göstermektedir. Ölçek bar, 500 mikron. Fontaine ve arkadaşları çoğaltılamaz. Izni ile J.Neurosci (2013).

Tek bir çalışma (15-20 dk) tıkanıklığı naris etkisi geçici ve geri dönüşümlü, ve 24, test sırasında kokulara koku algılama değiştirilmiş ve indirgenmiş nöronal aktivasyonuna yol bozabilecek uzun süreli nöronal hasara neden olmaz. Pozlama kokulara karşı OB ve PC pCREB boyama (Şekil 5), OB mitral hücrelerinde pCREB ifadeler ve PC piramidal hücreleri tarafından endeksli olarak, tıkalı ve bağışladı hemisfer arasında karşılaştırılabilir çıkarılmasını takiben 24 saat burun fiş - tercihi test kokulara aynı zaman noktasıErken koku tercih eğitim sonrasında gerçekleştirilir.

Şekil 5,
Şekil 5 geri tıkanıklığı naris sonra sinir hücresi reaktivitesinin değerlendirilmesi. OB PCREB boyanması ve aPC, bir yavru bir burun tıkacın çıkarılmasının ardından 24 saat. Oklar aPC OB ve piramidal hücre tabakasmm mitral hücre tabakasını göstermektedir. MCL, mitral hücre tabakası. PCL, piramidal hücre tabakasıdır. Ölçek barlar, daha düşük büyütme için 500 mikron ve daha yüksek büyütme için 100 mikron.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritik bir zaman penceresi içinde sıçan yavrularında lateralizan koku, öğrenme ve bellek modeli ilk Hall ve arkadaşları tarafından kurulmuştur. Çalışmaların 33,34,36 bir dizi, onlar bir koku tercih bellek sıçan yavrularının PH 6 az bir naris için koku + süt eşleşmeleri tarafından lateralize olabileceğini gösterdi. Tercih bellek aynı naris eğitim ve test sırasında açık olduğunda sağlam, ancak tıkalı naris bloke edilmemiş ve kontrol edilmiş olduğu zaman gözlemlenmemiştir. Artık oldu böylece Ancak, ön koku korteks, anterior commissural bağlantıları işlevsel 32 olmak PH 12, en, eğitimsiz naris yalnız ön komissürün 6. Lezyon lateralizan hafızasını geri PH edinilen koku tercihi ifadesini destekleyecek eğitimsiz naris 33 erişilebilir. Bu lateralizan öğrenme modeli başarıyla paradigma 24,25,31 okşayarak + bir koku ile çoğaltılmış edilmiştir. Koku + tek naris OCC ile eğitim okşayarakPD ile ham hayal PH bir lateralizan belleğe 6 açar 7 31. PD 3-6 tekrarlayan tek naris tıkanıklıklar en az 48 saat 24 süren uzun bir lateralizan bellek açar.

Bireysel hayvanlarda "bölünmüş beyin" in lateralizan koku öğrenme protokol sonuçları. Bu model davranış ve destekleyen biyo-fizyolojik değişiklikleri incelemek için büyük avantajlara sahiptir. Örneğin, yeterince arası hayvan tasarımları sapmaları azaltır bir denek içi modelini kullanarak davranışsal çıktılarını karşılaştırarak. Bu erken yaşta yavrular kendi faaliyet ve yanıt oldukça değişir. Intra-hayvan kontrolü performans ve yanıt verme doğasında bireysel değişkenlik yanı sıra moleküler ve fizyolojik değişimlerin değerlendirilmesi biyolojide içsel farklılıkları ortadan kaldırır. Ayrıca, lateralize öğrenme bu güçlü bebek modeli bize bir fırsat bireysel fizyoloji bireysel bellek performansı ilişkilendirmek ve inci değerlendirmek için ödünçfarklı sürelerde 24,25,31 anıları e temelleri. Aynı hayvanların içinde iki yarımküresinde fizyolojisini karşılaştırarak ex vivo deneyler ile birlikte bu lateralizan öğrenme modelini kullanarak, Son zamanlarda erken koku öğrenme gibi OB 31 hem de sinaps arttı AMPA reseptörü tepkiler olarak sinaptik plastisite uyardığını göstermiştir edilmiş ve aPC 24,25. Koku ağda gelişmiş bir çıkış 24 temsilleri içine erken koku öğrenme aşağıdaki Geliştirilmiş sinaptik iletim çevirir.

Gelecekteki çalışmalar bu lateralizan öğrenme modelini kullanarak koku bellek moleküler temellerini keşfetmek gerekir. Bu kazanç fonksiyon-zarar-fonksiyon-proteinler ve özel ilgi genlerin etkileri bakarak Korelasyonel proteinlerin bakıyor çalışmaları ve aşağıdaki öğrenmeyi aktif genleri ve nedensel çalışmaları içerir. Bir başka heyecan verici ve önemli olasılık edebilmek t olmaktırO davranış bellek mukavemetine fizyolojik ve moleküler değişikliklere ilgilidir. Her yavru için, ilk olarak, açık ve tıkalı burun için tercih bellek ölçü elde etmek mümkündür. Gelen eğitimli ve eğitimsiz korteks üzerinde takip eden ex vivo deneyler bağlaşık fizyolojik değişimler sağlayacaktır. Bu mümkün, ancak, kendini test tercihi sırasında bu koku yeniden pozlama sinaptik gücü değiştirecek, ya da diğer beyin bölgeleri hafıza ifade önemli katkı sağlamaktadır. Bizim Mevcut çalışmalarda, fizyoloji ve davranış ayrı kuşaklar üzerindeki yürütülmektedir. Bu ilgi çok parametrelerini etkileyen davranış testi ile ilgili endişeleri ortadan kaldırır.

Burun fişi kullanarak bir ihtar fiş takma ve çıkarma ile ilişkili potansiyel sinir doku hasarı olduğunu. Bu nedenle, herhangi bir potansiyel bakım uzun vadeli EF önlemek için tutulmalıdır sokulması esnasında kanama ile burun fiş ve yavrular sokulması alınmıştır olmalıdırenflamasyon gibi kanama ile ilgili malzeme hatası. Uzun süreli tıkanıklık (saat, günler ile aylar) naris veya koku epitel sürekli ablasyon bu etkilerden bazıları uzun süreli bağlı olsa da, uzun süreli koku bırakma, sinir hasarı ve OB indirgenmiş nöronal aktivite ve PC 37-41 yol açar naris tıkanıklığı 39,40 tamamen geri dönüşümlüdür. Akut tıkanıklığı naris sonra doku bütünlüğü (~ 15 dakika) pCREB immünohistokimya boyanması ile doğrulanmış olup, gösterilmiş olan bir aktivite bağımlı nöronal belirteç, 5 günlük tıkanıklığı naris 39 aşağıdaki yetişkin farelerde PC azalır. tıkalı naris ipsilateral OB ve PC pCREB seviyeleri tıkanıklığı naris sırasında sıçan yavrularında koku throughput başarılı lateralizasyonunu onaylayan, nane kokusu pozlama sırasında önemli ölçüde daha az idi. Bununla birlikte, koku tercihini test sırasında burun tıpanın çıkartılması, bunu takip eden 24 saat, pCREB katlarında karşılaştırılabilirn iki yarım küresi, akut tıkanıklık etkisini düşündüren 24 tam tersine çevrilebilir. Bu nedenle, önceden tıkanık naris ile test nane tercih eksikliği bellek yetersizliği nedeniyle, ancak bir değişiklik veya test sırasında doku hasarı ile ilişkili koku algı eksikliği nedeniyle değil. Ayrıca, kontrol elektrofizyolojik kayıtları O / S - hayvanlar (okşayarak olmadan koku pozlama sırasında tıkalı bir naris) ile kalsiyum görüntüleme görülen aktive piramidal hücrelerin hiç fEPSPs farklılıkları veya sayısını gösterdi - ayrıca teyit piriform korteks hiçbir işlevsel değişiklik yoktur nedeniyle bu kısa vadeli geri dönüşümlü naris tıkanıklıklarında 24,25 için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polythylene 20 tubing Intramedic 427406 Non-radiopaque, Non-toxic
3-0 Silk suture thread Syneture Sofsilk Non-absorbent
Silicone grease Warner Instrument 64-0378 Odorless
2% Xylocaine gel AstraZeneca Prod. No 061 Lidocaine hydrochloride jelly, purchased at local pharmacy
Paint brush Dynasty 206R Similar size/other brands work too
Peppermint extract Sigma-Aldrich W284807 Other brands should be okay too
Training box Custom-made N/A Acrylic box (20 x 20 x 5 cm3), see Figure 2A. Parameters and material for the box are not critical and can be modified. Material used should be odorless and does not absorb odors
Testing chamber Custom-made N/A Stainless steel (30 x 20 x 18 cm3), see Figure 2B. Parameters and material for the chamber are not critical and can be modified. For example, an acrylic chamber instead of a stainless steel one can be used
pCREB antibody Cell Signaling 9198 Ser 133 (87G3) Rabbit mAb
Chloral hydrate Sigma-Aldrich C8383 N/A
Paraformaldehype Sigma-Aldrich P6148 N/A
Sucrose Sigma-Aldrich S9378 N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gregory, E. H., Pfaff, D. W. Development of olfactory-guided behavior in infant rats. Physiol Behav. 6, 573-576 (1971).
  2. Alberts, J. R., May, B. Nonnutritive, thermotactile induction of filial huddling in rat pups. Dev Psychobiol. 17, 161-181 (1984).
  3. Galef, B. G., Kaner, H. C. Establishment and maintenance of preference for natural and artificial olfactory stimuli in juvenile rats. J Comp Physiol Psychol. 94, 588-595 (1980).
  4. Johanson, I. B., Hall, W. G. Appetitive learning in 1-day-old rat pups. Science. 205, 419-421 (1979).
  5. Johanson, I. B., Hall, W. G. Appetitive conditioning in neonatal rats: conditioned orientation to a novel odor. Dev Psychobiol. 15, 379-397 (1982).
  6. Johanson, I. B., Teicher, M. H. Classical conditioning of an odor preference in 3-day-old rats. Behav Neural Biol. 29, 132-136 (1980).
  7. McLean, J. H., Darby-King, A., Sullivan, R. M., King, S. R. Serotonergic influence on olfactory learning in the neonate rat. Behav Neural Biol. 60, 152-162 (1993).
  8. Moore, C. L., Power, K. L. Variation in maternal care and individual differences in play, exploration, and grooming of juvenile Norway rat offspring. Dev Psychobiol. 25, 165-182 (1992).
  9. Pedersen, P. E., Williams, C. L., Blass, E. M. Activation and odor conditioning of suckling behavior in 3-day-old albino rats. J Exp Psychol Anim Behav Process. 8, 329-341 (1982).
  10. Sullivan, R. M., Hall, W. G. Reinforcers in infancy: classical conditioning using stroking or intra-oral infusions of milk as UCS. Dev Psychobiol. 21, 215-223 (1988).
  11. Sullivan, R. M., Leon, M. Early olfactory learning induces an enhanced olfactory bulb response in young rats. Brain Res. 392, 278-282 (1986).
  12. Weldon, D. A., Travis, M. L., Kennedy, D. A. Posttraining D1 receptor blockade impairs odor conditioning in neonatal rats. Behav Neurosci. 105, 450-458 (1991).
  13. Sullivan, R. M., Hofer, M. A., Brake, S. C. Olfactory-guided orientation in neonatal rats is enhanced by a conditioned change in behavioral state. Dev Psychobiol. 19, 615-623 (1986).
  14. Camp, L. L., Rudy, J. W. Changes in the categorization of appetitive and aversive events during postnatal development of the rat. Dev Psychobiol. 21, 25-42 (1988).
  15. Moriceau, S., Wilson, D. A., Levine, S., Sullivan, R. M. Dual circuitry for odor-shock conditioning during infancy: corticosterone switches between fear and attraction via amygdala. J Neurosci. 26, 6737-6748 (2006).
  16. Roth, T. L., Sullivan, R. M. Endogenous opioids and their role in odor preference acquisition and consolidation following odor-shock conditioning in infant rats. Dev Psychobiol. 39, 188-198 (2001).
  17. Roth, T. L., Sullivan, R. M. Consolidation and expression of a shock-induced odor preference in rat pups is facilitated by opioids. Physiol Behav. 78, 135-142 (2003).
  18. Sullivan, R. M. Developing a sense of safety: the neurobiology of neonatal attachment. Ann N Y Acad Sci. 1008, 122-131 (2003).
  19. Wilson, D. A., Sullivan, R. M. Olfactory associative conditioning in infant rats with brain stimulation as reward. I. Neurobehavioral consequences. Brain Res Dev Brain Res. 53, 215-221 (1990).
  20. Sullivan, R. M., Wilson, D. A., Leon, M. Associative Processes in Early Olfactory Preference Acquisition: Neural and Behavioral Consequences. Psychobiology. , 29-33 (1989).
  21. McLean, J. H., Harley, C. W., Darby-King, A., Yuan, Q. pCREB in the neonate rat olfactory bulb is selectively and transiently increased by odor preference-conditioned training. Learn Mem. 6, 608-618 (1999).
  22. Sullivan, R. M., Stackenwalt, G., Nasr, F., Lemon, C., Wilson, D. A. Association of an odor with activation of olfactory bulb noradrenergic beta-receptors or locus coeruleus stimulation is sufficient to produce learned approach responses to that odor in neonatal rats. Behav Neurosci. 114, 957-962 (2000).
  23. Yuan, Q., Harley, C. W., McLean, J. H. Mitral cell beta1 and 5-HT2A receptor colocalization and cAMP coregulation: a new model of norepinephrine-induced learning in the olfactory bulb. Learn Mem. 10, 5-15 (2003).
  24. Fontaine, C. J., Harley, C. W., Yuan, Q. Lateralized odor preference training in rat pups reveals an enhanced network response in anterior piriform cortex to olfactory input that parallels extended memory. J Neurosci. 33, 15126-15131 (2013).
  25. Morrison, G. L., Fontaine, C. J., Harley, C. W., Yuan, Q. A role for the anterior piriform cortex in early odor preference learning: evidence for multiple olfactory learning structures in the rat pup. J Neurophysiol. 110, 141-152 (2013).
  26. Nakamura, S., Kimura, F., Sakaguchi, T. Postnatal development of electrical activity in the locus ceruleus. J Neurophysiol. 58, 510-524 (1987).
  27. Harley, C. W., Darby-King, A., McCann, J., McLean, J. H. Beta1-adrenoceptor or alpha1-adrenoceptor activation initiates early odor preference learning in rat pups: support for the mitral cell/cAMP model of odor preference learning. Learn Mem. 13, 8-13 (2006).
  28. Shakhawat, A. M., Harley, C. W., Yuan, Q. Olfactory bulb alpha2-adrenoceptor activation promotes rat pup odor-preference learning via a cAMP-independent mechanism. Learn Mem. 19, 499-502 (2012).
  29. Isaacson, J. S. Odor representations in mammalian cortical circuits. Curr Opin Neurobiol. 20, 328-331 (2010).
  30. Lethbridge, R., Hou, Q., Harley, C. W., Yuan, Q. Olfactory bulb glomerular NMDA receptors mediate olfactory nerve potentiation and odor preference learning in the neonate rat. PLoS One. 7, e35024 (2012).
  31. Yuan, Q., Harley, C. W. What a nostril knows: olfactory nerve-evoked AMPA responses increase while NMDA responses decrease at 24-h post-training for lateralized odor preference memory in neonate rat. Learn Mem. 19, 50-53 (2012).
  32. Schwob, J. E., Price, J. L. The development of axonal connections in the central olfactory system of rats. J Comp Neurol. 223, 177-202 (1984).
  33. Kucharski, D., Hall, W. G. New routes to early memories. Science. 238, 786-788 (1987).
  34. Kucharski, D., Johanson, I. B., Hall, W. G. Unilateral olfactory conditioning in 6-day-old rat pups. Behav Neural Biol. 46, 472-490 (1986).
  35. Cummings, D. M., Henning, H. E., Brunjes, P. C. Olfactory bulb recovery after early sensory deprivation. J Neurosci. 17, 7433-7440 (1997).
  36. Kucharski, D., Hall, W. G. Developmental change in the access to olfactory memories. Behav Neurosci. 102, 340-348 (1988).
  37. Brunjes, P. C. Unilateral odor deprivation: time course of changes in laminar volume. Brain Res Bull. 14, 233-237 (1985).
  38. Kass, M. D., Pottackal, J., Turkel, D. J., McGann, J. P. Changes in the neural representation of odorants after olfactory deprivation in the adult mouse olfactory bulb. Chem Senses. 38, 77-89 (2013).
  39. Kim, H. H., Puche, A. C., Margolis, F. L. Odorant deprivation reversibly modulates transsynaptic changes in the NR2B-mediated CREB pathway in mouse piriform cortex. J Neurosci. 26, 9548-9559 (2006).
  40. Korol, D. L., Brunjes, P. C. Rapid changes in 2-deoxyglucose uptake and amino acid incorporation following unilateral odor deprivation: a laminar analysis. Brain Res Dev Brain Res. 52, 75-84 (1990).
  41. Leung, C. H., Wilson, D. A. Trans-neuronal regulation of cortical apoptosis in the adult rat olfactory system. Brain Res. 984, 182-188 (2003).

Tags

Nörobilim Sayı 90 lateralize koku öğrenme sıçan hafıza burun fiş koku ampul piriform korteks fosforile CREB
Sinir Devresi Temelini Bellek Oluşumunda Diseksiyon için Yenidoğan Sıçanlarda bir Lateralize Koku Öğrenme Modeli
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fontaine, C. J., Mukherjee, B.,… More

Fontaine, C. J., Mukherjee, B., Morrison, G. L., Yuan, Q. A Lateralized Odor Learning Model in Neonatal Rats for Dissecting Neural Circuitry Underpinning Memory Formation. J. Vis. Exp. (90), e51808, doi:10.3791/51808 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter