Introduction
O olfato é a modalidade sensorial primário em roedores, sem o que não seria capaz de navegar ou sobreviver em seu ambiente com sucesso. É especialmente importante para os filhotes recém-nascidos, que nem podem ver, nem ouvir, durante a primeira semana pós-natal, para usar o olfato para localizar a sua mãe para alimentar 1. Como resultado, os filhotes de ratos recém-nascidos pode ser condicionado a preferir odores com manipulações experimentais simples. Uma variedade de estímulos têm sido usados como estímulo incondicionado (UCS) para induzir respostas condicionadas a novos odores (estímulo condicionado, CS) em recém-nascidos, incluindo o ambiente de nidificação 2,3, sugando leite 4-6, acariciando ou estimulação tátil 7 12, 13 de aperto da cauda, saliva materna 13, 14-18 leve choque nas patas, intracraniana e a estimulação do cérebro 19. O presente estudo emprega um odor precoce preferência paradigma bem estabelecido, em que o odor, neste caso, de hortelã-pimenta, is combinados com a estimulação táctil de modo a produzir uma preferência para hortelã-pimenta 24 horas mais tarde 10,11,20. Estas memórias odores são dependentes de circuitos olfativa intacta, incluindo principalmente o bulbo olfatório (OB) 21-23 eo córtex piriforme anterior (APC) 24,25.
Investigações experimentais do início do aprendizado preferência odor aprofundaram e ampliaram nossa compreensão das bases moleculares e fisiológicos de uma memória dos mamíferos. Este modelo de mamíferos tem várias vantagens em estudar mecanismos de memória. Em primeiro lugar, as fontes neurais do sinal UCS foram identificados. Vários estímulos, como mencionado acima estimular lócus coeruleus liberação de noradrenalina 26, que por sua vez ativa vários receptores adrenérgicos na OB e APC, causando efeitos celulares e fisiológicos que sustentam o aprendizado 22,27,28. Em segundo lugar, os mecanismos de memória de apoio ter lugar em estruturas neurais laminares bem definidas. Asimplicidade do circuito olfativo em ratos recém-nascidos fornece aos pesquisadores do quadro ideal com o qual a desvendar os intrincados processos relacionados com a plasticidade sináptica. Neurônios olfativos sensoriais (OSN) no projeto epitélio olfativo Onto mitral / células tufados no OB e estes mitral / células tufados, por sua vez projeto ipsi para córtex piriforme (PC) via lateral trato olfatório (LOT), entre outras estruturas 29. Ambas as sinapses OSN no OB 30,31 ea LOT sinapses 24,25 na APC foram identificados como loci crítico para mudanças sinápticas que apoiar a aprendizagem ea memória. Em terceiro lugar, em uma idade precoce em ratos, insumos olfativos podem ser facilmente lateralizada. Cada A APC tem acesso à informação odor bilateral através da comissura anterior uma vez que esta substância branca está completamente formado no pós-natal dia 12 (PD12) 32. Antes PD 12, entrada de odor pode ser isolado para ipisilateral OB e APC através único oclusão naris 24,25,31,33,34 </ Sup>. Oclusão naris Único permite a formação de memória odor do naris aberto, e impede a mesma memória das narinas ocluídas anteriores para PD 12 33. Memória Odor é isolado para o hemisfério ipsilateral incluindo tanto OB e APC. Portanto, cada filhote de rato pode ser seu próprio controle para o aprendizado e subjacente a fisiologia.
No presente estudo, o odor cedo protocolo aprendizagem preferência lateralizada é introduzido. Este método serve como uma ferramenta poderosa para o estudo dos mecanismos neurais subjacentes aprendizagem odor, proporcionando um controlo intra-animais 24,25,31, reduzindo assim tanto o número de animais necessários e a variação geral. Oclusão naris é reversível em que o bujão de gordura ou nariz pode ser aplicado e removido com o stress ou dano para o animal mínimo. Aqui, em primeiro lugar, os procedimentos detalhados de treinamento preferência odor cedo e testes são descritos, com foco no protocolo lateralizado usando oclusão naris único com um nsae tampão. Em seguida, os resultados são apresentados para demonstrar a eficácia de oclusão naris único no isolamento de entrada odor e produzindo odor lateralizado memória. Por fim, são discutidas as potencialidades da utilização deste modelo de aprendizagem lateralizado para estudar mudanças fisiológicas no sistema olfativo que ambos geram aprendizado e memória apoio expressão.
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Protocol
Sprague Dawley (Charles River) filhotes de ambos os sexos são usados. As ninhadas são abatidos para 12 no PD1 (nascimento sendo PD0). Os reservatórios são mantidos num ciclo claro / escuro de 12 horas de luz, com acesso ad libitum a comida e água. Os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional da Universidade Memorial.
1. Nose plug Construção
NOTA:. Este procedimento foi adaptado e modificado a partir de Cummings et al (1997) 35.
- Aquire tubulação de polietileno de 20 e 3-0 fio de sutura de seda.
- Corte um pequeno pedaço de polietileno de 20 tubos de aproximadamente 0,8 mm.
- Fio de sutura de seda através do tubo preparado de tal modo que existe rosca de cada lado da secção de tubo.
- Em uma extremidade do fio fora da tomada, dê um nó no fio.
- Puxe a seção de tubulação para baixo sobre o nó no fio. O nó deve apresentar dentro da tubulação.
- Aparar as duas extremidades do fio de tal modo que ~ 2 mm de segmento está saliente a partir de uma extremidade do tubo (ver figura 1A).
2. Naris Oclusão antes do treino
- Remover filhote de barragem e coloque em um prato seguro coberto por uma cama regular.
- Use um aplicativo de ponta de algodão para enxugar uma geléia anestésico local, xilocaína 2%, sobre as naris a ser fechado.
- Permitir que o filhote para descansar no prato para ~ 3 min.
- Segure o filhote com cuidado, mas com firmeza na mão não-dominante.
- Usando a mão dominante, pegar uma ficha nariz e bata na mesma geléia anestésico local em torno da ponta da qual o segmento não está saliente. Isto irá agir como um anestésico para todas as dores menores associadas com plug de inserção e irá funcionar como um lubrificante no interior do naris. NOTA: O efeito da xilocaína começa dentro de alguns minutos e dura 20-30 min. Filhotes em geral mostram boa tolerância para plugue de inserção após a aplicação de xilocaína geléia (mMÍNIMO lutando e vocalização).
- Insira cuidadosamente a ficha nariz segurando firmemente o filhote e girando lentamente a ficha com empurrões muito suaves até que o plugue está totalmente inserido e só o fio 2 mm de largura que se projeta da naris (ver Figura 1B). Não deve haver sangramento de qualquer naris durante este processo. Filhotes com sangramento durante a tomada nariz de inserção são excluídos e voltou para barragens
- Permitir que o animal para descansar neste prato durante 5 min, de modo a habituar-se o tampão.
- Retirar o filhote do prato habituação e começar o paradigma condicionado 24.
Figura 1 construção de uma vela de nariz. A) Esquema mostrando os passos de fazer um encaixe do nariz. A linha é puxada através de tubos de polietileno; um nó é feito e pullevado para o centro do tubo para bloqueá-lo; duas extremidades são cortadas com um resíduo de 2 mm de uma extremidade para fora do tubo. B) frontal e lateral de um rato com um tampão no nariz uma narinas.
3. Perfumado cama Preparação
- Vestindo luvas novas e em um exaustor para evitar a contaminação odor, coloque 500 ml de cama de lascas de madeira em um saco plástico.
- Use uma seringa para elaborar 0,3 ml extrato de hortelã, e pulverizar este sobre a cama no saco plástico.
- Amarre o saco fechado, sacuda o saco vigorosamente, e permitir que a roupa de cama para descansar no saco por 5 min.
- Coloque a roupa de cama perfumada em uma caixa clara, rasa, acrílico treinamento (20 x 20 x 5 cm 3, Figura 2A) descoberto em um exaustor por 5 minutos antes de usar. Uma vez que a roupa de cama é preparada, descarte as luvas, e não permitir que essas luvas para entrar em contato com os animais.
- Coloque a cama sem cheiro em uma caixa de plástico idêntico claro, e enCertifique-se de que não entram em contato com a roupa de cama perfumada ou luvas usadas.
4. Odor Condicionado Paradigm (ver imagem na Figura 2A)
Os filhotes passam por uma única sessão condicionado, em PD 6 ou múltiplas sessões de julgamento (uma sessão por dia, PD 3-6).
- Coloque o filhote habituado a cama perfumada. Para odor controle só (O / S -) filhotes, deixe estes filhotes de cachorro na cama por 10 min, em seguida, vá para o passo 4.5. Para experimental odor + curso (O / S +) filhotes, continue com os seguintes passos nesta seção.
- Curso o filhote durante 30 segundos usando um pincel pequeno. Use rápidos movimentos circulares principalmente em torno da região posterior do filhote.
- Permitir que o filhote para descansar por 30 seg.
- Repita os passos 4.2 e 4.3 para um total de 10 min (ou seja, 10 pares de afago + odor).
- Remover filhote da caixa de condicionamento, retire a ficha nariz e devolver o cachorro para a represa.
O teste ocorre em vários pontos temporais (por exemplo, 24 ou 48 h) a seguir à sessão de treino final. O teste é realizado numa câmara de teste de aço inoxidável (30 x 20 x 18 cm 3), que é colocada em cima de duas caixas de formação (caixa de formação é descrita no ponto 3.4), separadas por uma zona neutra 2 cm. Uma caixa de treinamento contém cama com aroma de hortelã-pimenta, enquanto a outra caixa contém limpo, roupa de cama sem cheiro. O chão da câmara de teste é uma grade de metal, que é então coberto por uma folha removível de malha de plástico (Figura 2B).
- Prepare uma hortelã-pimenta e uma cama sem cheiro como por secção 3, e colocar cada caixa em lados opostos da câmara de teste de 2 cm de distância. Coloque a malha de plástico sobre o chão de metal da grade da câmara de teste.
- Retirar o filhote da barragem e coloque um dab empresa de graxa de silicone inodoro nas narisque está ocluído durante o treinamento. Voltar a aplicar o lubrificante ao longo do procedimento de teste como primeiro necessário. NOTA: oclusão naris aleatória durante o treinamento e teste podem ser considerados para evitar viés.
- Coloque cachorro na zona neutra da câmara de teste.
- Permitir que o filhote para explorar a câmara por 1 min, registrando quanto tempo o cachorro passou ao longo dos dois lados da câmara (ou seja, mais de hortelã-pimenta ou roupa de cama neutra-perfumada).
- Permitir que o filhote para descansar por 1 min em uma câmara de retenção de plástico coberto.
- Repita os passos 5.2 e 5.3 para um total de 10 min (ou seja, 5 ensaios de teste, separados por 5 ensaios de descanso) mudar a orientação inicial de que o filhote na câmara, a fim de controlar as preferências de direção.
- Imediatamente após o teste, limpe a graxa do naris.
- Insira um noseplug polietileno no naris oposto conforme a secção 2 e permitir que o animal em repouso por 10 min.
- Teste o filhote, mais uma vez, como em 5.3 -5.6, retire a ficha, e devolver o cachorro para a represa. Remover e limpar a rede de plástico da câmara de ensaio com 95% de etanol e permitir que o líquido se evapore. Coloque a malha para trás antes de testar o próximo filhote.
NOTA: A aplicação de graxa de silicone na primeira oclusão naris durante o teste impede a chance de sangramento e estresse associado com plug nariz de inserção.
Figura formação preferência 2 odor precoce e testes. A) formação odor precoce preferência usando o odor + acariciando paradigma. B) Dois escolha odor testes de preferência com roupa de cama de hortelã-pimenta, de um lado, o controle da cama sem cheiro no lado oposto. A zona neutra dois centímetros é colocado no meio.
6. testar a eficácia de uma única Naris Oclusão
nt "> Este experimento é realizado para determinar se a oclusão naris único leva à ativação lateralizado do sistema olfativo.- Realize oclusões NARIs unilaterais em PD 6 ou 7 filhotes, conforme descrito na seção 2.
- Após cerca de 5 minutos de habituação, coloque o filhote em um recipiente de plástico coberta e expô-la a 30 mL de óleo de hortelã-pimenta pura embebido em um pedaço de tecido para 10 min.
- Imediatamente após a exposição ao odor de hortelã-pimenta, o cachorro injectar por via intraperitoneal (ip) com hidrato de cloral (400 mg / kg), como um anestésico geral, ou pentobarbitol, (150 mg / kg).
- Uma vez completamente anestesiado (não apresentando resposta a cauda ou pé de aperto), transcardialmente perfundir o cachorro com soluções geladas de solução salina (0,9%) durante ~ 1 min, seguido por paraformaldeído (4%, dissolvido em solução tampão de fosfato 0,1 M, PBS ).
- Depois de 10 min de perfusão paraformaldeído, recolher o cérebro e colocá-lo em paraformaldeído a noite a 4 ° C, em seguida transfer o cérebro para uma solução de sacarose (20% em PBS) durante uma 24 horas adicionais.
- Cortar fatias cerebrais coronais de 30 um, com uma espessura de criostato. Recolha de OB e PC fatias e montagem em lâminas revestidas com gelatina, seguida por coloração imuno-histoquímica para o padrão pCREB anticorpo 21,25,30.
7 Teste da Reversibilidade da Única Naris Oclusão
Esta experiência testa se o efeito de bloqueio é reversível às 24 horas após a remoção da tomada de nariz.
- Realize oclusões NARIs unilaterais em PD 6 ou 7 filhotes, conforme descrito na seção 2.
- Depois de 15 min (equivalente à duração da oclusão naris durante o treino - 5 min habituação + 10 min de treinamento), retire a ficha nariz, e devolver o cachorro para a represa.
- 24 horas depois, expor o filhote para o odor de hortelã em um recipiente de plástico coberta por 10 minutos, conforme descrito em 6.2.
- Siga mesmos passos em seitaíons de 6,3-6,6.
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Representative Results
Aqui vamos rever alguns dos resultados previamente estabelecidos 24 para demonstrar a eficácia da oclusão naris em isolar entrada odor e aprender a um hemisfério, ea reversibilidade do método.
Oclusão Único naris durante o treinamento preferência odor precoce leva a uma memória odor lateralizado 24. A memória é confinado ao naris poupados (Figura 3). Quando os filhotes são testados quanto à preferência de odor com a mesma naris ocluído durante a formação, eles mostram preferência pelo odor condicionado (por exemplo, hortelã-pimenta). Quando os filhotes são testados com as narinas ocluídas opostos, eles não mostram preferência pelo odor condicionado. Juntos, estes resultados sugerem que uma memória preferência odor só se forma e se expressa através das narinas poupados submetidos ao odor + acariciando condicionamento associativo.
Figura 3. oclusão naris Individual induz aprendizagem odor lateralizado. Comportamental O protocolo é mostrada no painel superior. Odor + acariciando (O / S +) ou odor só (O / S -) animais com único naris ocluído durante o treinamento, foram submetidos a testes de odor preferência em primeiro lugar com o mesmo naris ocluído depois com o naris frente oclusa. O painel inferior mostra a percentagem de tempo gasto ao longo da cama com aroma de hortelã-pimenta entre os diferentes grupos em um teste de odor duas escolha. * P <0,05. As barras de erro, média ± SEM. Reproduzido de Fontaine et al. J. Neuroscience (2013) com permissão.
Os resultados do treinamento lateralizados odor na ativação lateralizado do sistema olfativo durante a exposição odor (Figura 4) 24. Oclusão naris única impede a ativação do OB e do PC do duri hemisfério ipsilateralng exposição odor. Isso é demonstrado pelo monitoramento da fosforilação de CREB no OB, eo PC. Como mostrado na Figura 4, utilizando imuno-histoquímica, a CREB fosforilado (pCREB) é significativamente menor no hemisfério ocluída após exposição odor de hortelã-pimenta, em comparação com o hemisfério contralateral poupado. Coloração de Nissl (Figura 4A) demonstra corpos celulares comparáveis na camada de células mitral de OB, e na camada de células piramidais do PC de ambos os hemisférios. No entanto, pCREB é significativamente menos nas duas camadas de células no hemisfério ipsilateral ao naris oclusa (Figura 4B).
Figura 4 resultados de oclusão naris único na ativação lateralizado do sistema olfativo durante a exposição odor. A) Nissl do bulbo olfatório(OB) e piriforme anterior córtex (APC). B) expressões PCREB nos hemisférios oclusa e poupados após a exposição de hortelã em um único naris filhote ocluído. As setas indicam a camada de células mitral na camada celular piramidal e OB na aPC. As barras de escala, 500 um. Reproduzido de Fontaine et al. J. Neuroscience (2013) com permissão.
O efeito de um único ensaio (15-20 min) oclusão naris é transitória e reversível, e não resulta em dano neuronal visível a longo prazo que pode levar à percepção de odor alterado e ativação neuronal reduzida a odores durante o teste 24. Como indexados por coloração pCREB no OB e o PC (Figura 5), as expressões pCREB em células mitrais do OB, e as células piramidais no PC para odor exposição são comparáveis entre os hemisférios oclusa e poupados, 24 horas após a remoção do a ficha nariz - o mesmo ponto de tempo que o odor testes preferênciaé realizada após o treinamento preferência odor cedo.
Figura 5 Avaliação de reactividade neuronal após oclusão reversível narinas. Coloração PCREB do OB e o aPC, 24 horas após a remoção de um tampão de nariz em um cachorro. As setas indicam a camada de células mitral na camada celular piramidal e OB na aPC. MCL, camada de células mitral. PCL, a camada de células piramidais. As barras de escala, de 500 mm para baixo e ampliação de 100 um para uma ampliação maior.
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Discussion
O modelo de aprendizagem e memória odor lateralizado em filhotes de rato dentro de uma janela de tempo crítico foi estabelecido pela primeira vez por Hall e colegas. Em uma série de estudos 33,34,36, eles mostraram que uma memória preferência odor poderia ser lateralizado por odores + leite pares para um naris em PD 6 em filhotes de ratos. Memória preferência era robusto quando o mesmo naris estava aberta durante o treinamento e teste, mas não observada quando o naris oclusa foi desbloqueado e testado. No entanto, a PD 12, quando as conexões comissural anterior do córtex olfatório anterior se tornar funcional 32, os naris destreinados só poderia apoiar a expressão da preferência odor adquiridos em PD 6 Lesão da comissura anterior restaurou a memória lateralizado para que ele não era mais acessível a partir do naris destreinado 33. Este modelo de aprendizagem lateralizado foi replicado com êxito com um odor + acariciando 24,25,31 paradigma. Odor + acariciando treinamento com único occ narislusion em PD 6 leva a uma memória lateralizado no PD 7 31. repetidas oclusões NARIs solteiro no PD 3-6 leva a uma memória mais lateralizado que dura pelo menos 48 horas 24.
Os resultados lateralizados protocolo aprendizagem odor em "cérebro dividido" em animais individuais. Este modelo tem grandes vantagens para estudar o comportamento e as mudanças bio-fisiológicos subjacentes. Por exemplo, comparando as saídas de comportamento através de um modelo assunto dentro-suficiente reduz variações entre animal projetos. Os filhotes nesta idade precoce variam consideravelmente em sua atividade e capacidade de resposta. Controle Intra-animais elimina a variabilidade individual inerente desempenho e capacidade de resposta, bem como diferenças intrínsecas em Biologia pela avaliação de alterações moleculares e fisiológicos. Além disso, este modelo infantil poderosa de aprendizagem lateralizado nos dá a oportunidade de relacionar o desempenho da memória individual a fisiologia individual e avaliar ªe bases de memórias de diferentes durações 24,25,31. Usando este modelo de aprendizagem lateralizado em combinação com experiências ex vivo, comparando a fisiologia dos dois hemisférios, dentro dos mesmos animais, tem sido recentemente demonstrado que a aprendizagem odor precoce induz plasticidade sináptica, tais como o aumento das respostas dos receptores de AMPA em sinapses em ambos OB 31, e APC 24,25. Transmissão sináptica aumentada após aprendizagem odor cedo se traduz em uma produção aumentada em rede olfativo Representações 24.
Estudos futuros devem explorar as bases moleculares da memória odor que utilizam este modelo de aprendizagem lateralizado. Isso inclui estudos de correlação olhando proteínas e genes ativados após a aprendizagem e estudos causais olhando para os efeitos do ganho de função e perda de função das proteínas e dos genes de interesse particular. Outra possibilidade interessante e importante é poder to relacionar alterações fisiológicas e moleculares para a força de memória comportamental. Para cada filhote, é possível derivar uma primeira medida de memória preferência para as narinas abertas e oclusas. Subsequentes ex vivo experiências com os correspondentes córtices treinadas e não treinadas proporcionaria mudanças fisiológicas correlatas. É possível, no entanto, que o odor reexposição preferência durante o teste se irá alterar a força sináptica, ou que outras regiões do cérebro contribuir de forma significativa para a expressão de memória. Nos nossos estudos actuais, fisiologia e comportamento são levadas a cabo em grupos separados. Isso remove as preocupações sobre testes comportamentais que influenciam os próprios parâmetros de interesse.
Uma advertência usando tampão nariz é potencial dano ao tecido neural que está associado com a ficha de inserção e remoção. Por esta razão, o cuidado deve foram tomadas em inserção do plug and filhotes nariz com sangramento durante a inserção deve ser excluída, para evitar qualquer potencial ef longo prazofects associadas a hemorragia, tais como a inflamação. Bloqueio prolongado (horas, dias ou meses) de naris ou ablação permanente do epitélio olfativo leva a privação de longo prazo olfativo, dano neural, e redução das atividades neuronais no OB e PC 37-41, apesar de alguns destes efeitos, devido à prolongada oclusão naris são totalmente reversíveis 39,40. Integridade do tecido após oclusão aguda naris (~ 15 min) foi validada através de coloração imuno-histoquímica de pCREB, um marcador neuronal dependente de atividade, que tem demonstrado ser reduzido no PC de camundongos adultos jovens após 5 dias naris oclusão 39. níveis pCREB no OB ipsilateral e PC do naris ocluídos foram significativamente menos durante a exposição odor de menta, confirmando a lateralização bem sucedida de rendimento olfativo em filhotes de ratos durante a oclusão naris. No entanto, 24 horas após a remoção da tomada de nariz, no momento do teste de odor preferência, os níveis são comparáveis pCREB in ambos os hemisférios, sugerindo o efeito de oclusão aguda é totalmente reversível 24. Portanto, a falta de preferência a hortelã-pimenta testado com o naris anteriormente oclusa é devido à falta de memória, mas não devido a uma alteração ou uma ausência de percepção de odor associado a danos nos tecidos durante os testes. Além disso, registros eletrofisiológicos de controle O / S - animais (com um naris ocluído durante a exposição odor sem acariciando) não mostraram diferenças nas fEPSPs ou número de células piramidais ativados visto com imagem de cálcio - confirmando também não há nenhuma alteração funcional no córtex piriforme devido a estas de curto prazo oclusões NARIs reversíveis 24,25.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polythylene 20 tubing | Intramedic | 427406 | Non-radiopaque, Non-toxic |
| 3-0 Silk suture thread | Syneture | Sofsilk | Non-absorbent |
| Silicone grease | Warner Instrument | 64-0378 | Odorless |
| 2% Xylocaine gel | AstraZeneca | Prod. No 061 | Lidocaine hydrochloride jelly, purchased at local pharmacy |
| Paint brush | Dynasty | 206R | Similar size/other brands work too |
| Peppermint extract | Sigma-Aldrich | W284807 | Other brands should be okay too |
| Training box | Custom-made | N/A | Acrylic box (20 x 20 x 5 cm3), see Figure 2A. Parameters and material for the box are not critical and can be modified. Material used should be odorless and does not absorb odors |
| Testing chamber | Custom-made | N/A | Stainless steel (30 x 20 x 18 cm3), see Figure 2B. Parameters and material for the chamber are not critical and can be modified. For example, an acrylic chamber instead of a stainless steel one can be used |
| pCREB antibody | Cell Signaling | 9198 | Ser 133 (87G3) Rabbit mAb |
| Chloral hydrate | Sigma-Aldrich | C8383 | N/A |
| Paraformaldehype | Sigma-Aldrich | P6148 | N/A |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | N/A |
References
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