Introduction
L'olfatto è la modalità sensoriale primaria nei roditori, senza il quale non sarebbero in grado di navigare con successo o di sopravvivere nel loro ambiente. E 'particolarmente critico per cuccioli neonati, che non possono né vedere, né udire durante la prima settimana post-natale, per usare l'olfatto al fine di individuare la loro madre per alimentare 1. Come risultato, ratti neonatali possono essere condizionati a preferire gli odori con semplici manipolazioni sperimentali. Una varietà di stimoli sono stati utilizzati come stimolo incondizionato (UCS) per indurre risposte condizionate a nuovi odori (stimolo condizionato, CS) nei neonati, tra cui l'ambiente di nidificazione 2,3, latte lattante 4-6, accarezzando o stimolazione tattile 7- 12, tail pinch 13, saliva materna 13, lieve scossa piede 14-18, e la stimolazione cerebrale intracranica 19. Il presente studio si avvale di un odore precoce preferenza paradigma consolidato in cui un odore, in questo caso menta piperita, is combinata con stimolazione tattile per produrre una preferenza per piperita 24 ore dopo 10,11,20. Questi odori ricordi dipendono dal circuito olfattivo intatto, tra cui in primo luogo il bulbo olfattivo (OB) 21-23 e la corteccia piriforme anteriore (APC) 24,25.
Indagini sperimentali dei primi preferenza odore di apprendimento hanno approfondito e ampliato la nostra comprensione delle basi molecolari e fisiologiche di una memoria mammiferi. Questo modello mammiferi ha diversi vantaggi nello studio dei meccanismi della memoria. In primo luogo, sono state individuate le sorgenti neurali del segnale UCS. Vari stimoli come detto sopra stimolano locus coeruleus noradrenalina rilascio 26, che a sua volta attiva più adrenocettori nel OB e APC, causando effetti cellulari e fisiologici che sostengono l'apprendimento 22,27,28. In secondo luogo, i meccanismi di memoria portante avvengono in strutture neurali laminari ben definite. Ilsemplicità dei circuiti olfattiva nei ratti neonati fornisce ai ricercatori con il quadro ideale con cui scoprire i processi complessi legati alla plasticità sinaptica. Neuroni sensoriali olfattivi (OSN) nel progetto epitelio olfattivo sulla mitrale / cellule tufted in OB e questi mitrale / cellule tufted in progetto di girare ipsilaterally a corteccia piriforme (PC) attraverso il tratto olfattivo laterale (LOT), tra le altre strutture 29. Entrambe le sinapsi OSN della OB 30,31 e la sorte sinapsi 24,25 in aPC sono stati identificati come loci critici per cambiamenti sinaptici che supportano l'apprendimento e la memoria. In terzo luogo, in tenera età nei ratti, ingressi olfattive possono essere facilmente lateralizzato. Ogni APC ha accesso alle informazioni bilaterale odore attraverso la commessura anteriore una volta che questa sostanza bianca è completamente formato in post-natale giorno 12 (PD12) 32. Prima di PD 12, ingresso odore può essere isolato a ipisilateral OB e APC attraverso un'unica narice occlusione 24,25,31,33,34 </ Sup>. Singola narice occlusione permette la formazione della memoria odore dalla narice aperta ed impedire la stessa memoria dei narice occluse prima di PD 12 33. Memoria odore è isolato per l'emisfero ipsilaterale compreso sia OB e APC. Pertanto, ogni pup ratto può essere il proprio controllo per l'apprendimento e alla base della fisiologia.
Nel presente studio, è introdotto l'odore primi protocollo apprendimento preferenza lateralizzato. Questo metodo serve come un potente strumento per studiare i meccanismi neurali alla base dell'apprendimento odore, fornendo un controllo intra-animale 24,25,31, riducendo in tal modo sia il numero di animali necessari e la variazione generale. Naris occlusione è reversibile in quanto il tappo di grasso o naso può essere applicato e rimosso con il minimo stress o danni per l'animale. Qui, in primo luogo, vengono descritte le procedure dettagliate di odore precoce preferenza formazione e test, con un focus sul protocollo lateralizzante con occlusione singola narice con un nose spina. Poi i risultati vengono presentati per dimostrare l'efficacia del singolo occlusione narice a isolare ingresso odore e la produzione di memoria odore lateralizzato. Infine, le potenzialità di utilizzo di questo modello di apprendimento lateralizzato per studiare i cambiamenti fisiologici nel sistema olfattivo che entrambi generano l'apprendimento e la memoria supporto di espressione sono discussi.
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Protocol
Sono utilizzati Sprague Dawley di ratto (Charles River) cuccioli di entrambi i sessi. Cucciolate sono abbattuti a 12 su PD1 (nascita essendo PD0). Le dighe sono mantenuti su una 12 ore di luce / buio ciclo con ad libitum l'accesso al cibo e all'acqua. Procedure sperimentali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale Animal Care del Memorial University.
1 Nose Plug costruzione
NOTA:. Questa procedura è stato adattato e modificato da Cummings et al (1997) 35.
- Aquire polietilene-20 tubo e filo di sutura di seta 3-0.
- Tagliare un piccolo pezzo di polietilene-20 tubo di circa 0,8 mm.
- Discussione sutura di seta attraverso la tubazione disposta in modo tale che vi sia filo su entrambi i lati della sezione del tubo.
- Su una estremità del filo esterno del tappo, un nodo nel filo.
- Estrarre la sezione della tubazione giù sopra il nodo nel thread. Il nodo dovrebbe presentare all'interno del tubo.
- Tagliare le due estremità del filo in modo tale che ~ 2 mm filo sporge da un'estremità del tubo (vedere Figura 1A).
2 Naris occlusione prima di Formazione
- Rimuovere pup dalla diga e mettere in un piatto coperto custodito con biancheria da letto regolari.
- Utilizzare un'applicazione punta di cotone per tamponare una gelatina anestetico locale, 2% Xylocaine, sulle narice da occluso.
- Lasciare il cucciolo di riposare nel piatto per ~ 3 min.
- Tenere il cucciolo delicatamente ma saldamente in mano non dominante.
- Usando la mano dominante, prendere un tappo il naso e tamponare la stessa pappa anestetico locale intorno alla punta da cui il filo non sporga. Questo agirà sia come anestetico per eventuali dolori lievi associati con l'inserimento spina e agirà come un lubrificante all'interno della narice. NOTA: L'effetto di Xylocaine inizia entro un paio di minuti e dura 20-30 minuti. Pups in generale mostrano una buona tolleranza per l'inserimento spina dopo l'applicazione gelatina Xylocaine (minimum lottare e vocalizzazione).
- Inserire delicatamente la spina naso tenendo saldamente il cucciolo e ruotando lentamente la spina con spinte molto dolci fino a quando la spina sia completamente inserita e solo il thread 2 millimetri sporge dalla narice (vedi Figura 1B). Non ci dovrebbero essere sanguinamento da entrambi narice durante questo processo. Sono esclusi e restituiti dighe Pups con sanguinamento durante l'inserimento spina naso
- Consentire agli animali di riposare in questo piatto per 5 minuti in modo da abituare alla spina.
- Rimuovere il cucciolo dal piatto assuefazione e iniziare il paradigma di condizionamento 24.
Figura 1 Costruzione di un tappo naso. A) Schema che mostra le fasi di fare una spina naso. Un filo è tirato attraverso il tubo di polietilene; un nodo è fatto e PULportato al centro del tubo per bloccarlo; due estremità sono tagliate con un residuo di 2 mm su un'estremità del tubo. B) Vista frontale e laterale di un ratto con una spina naso in una narice.
3. Profumato Bedding Preparazione
- Indossando guanti nuovi e in una cappa aspirante per evitare la contaminazione odori, inserire 500 ml di biancheria da letto di trucioli di legno in un sacchetto di plastica.
- Utilizzare una siringa per elaborare 0,3 ml di estratto di menta piperita, e spruzzare questo sopra la biancheria nel sacchetto di plastica.
- Legare la borsa chiusa, agitare vigorosamente il sacchetto, e lasciare la biancheria da letto per riposare in borsa per 5 min.
- Posizionare la biancheria profumata in modo chiaro, poco profondo, scatola acrilica di formazione (20 x 20 x 5 cm 3, Figura 2A) scoperto in una cappa aspirante per 5 minuti prima dell'uso. Una volta che la biancheria da letto viene preparato, scartare questi guanti, e non permettere questi guanti vengano a contatto con gli animali.
- Posizionare la biancheria profumata in una scatola di plastica trasparente identici, e enAssicurarsi che non entri in contatto con la biancheria profumata o guanti utilizzati.
4. Odore condizionata Paradigm (Vedi immagine in figura 2A)
Pups subiscono una singola sessione di condizionamento, il PD 6, o sessioni di prove multiple (una seduta al giorno, PD 3-6).
- Posizionare il cucciolo abituato a biancheria da letto profumato. Per il controllo degli odori solo (O / S -) cuccioli, lasciare questi cuccioli sulla biancheria da letto per 10 minuti, quindi passare al punto 4.5. Per la corsa sperimentale odore + (O / S +) cuccioli, continuano i seguenti passaggi in questa sezione.
- Stroke il cucciolo per 30 secondi con un piccolo pennello. Usa movimenti circolari rapidi principalmente intorno alla regione posteriore del cucciolo.
- Lasciare il cucciolo a riposare per 30 sec.
- Ripetere i punti 4.2 e 4.3 per un totale di 10 min (cioè 10 coppie di carezze + odore).
- Rimuovere pup dalla casella di condizionamento, rimuovere il tappo il naso e tornare il cucciolo alla diga.
Test avviene in vari momenti (ad esempio, 24 o 48 ore) a seguito della sessione di allenamento finale. Il test viene effettuato in una camera di acciaio inossidabile test (30 x 20 x 18 cm 3), che è posto sulla parte superiore di due scatole di formazione (training casella è descritto in 3.4), separate da una zona neutra 2 cm. Una scatola di formazione contiene biancheria da letto di menta profumata, mentre l'altra scatola contiene pulita, biancheria da letto inodore. Il pavimento della camera di prova è una griglia metallica, che viene poi ricoperto da un foglio rimovibile di rete plastica (Figura 2B).
- Preparare una menta piperita e una biancheria profumata ai sensi dell'articolo 3, e porre ogni casella sotto lati opposti della camera di prova, 2 cm l'uno dall'altro. Inserire la rete plastica sul pavimento metallo-griglia della camera di prova.
- Rimuovere il cucciolo dalla diga e mettere una piccola quantità di grasso inodore ferma al silicone sulle nariceche è occluso durante l'allenamento. Re-applicare il grasso durante la prima procedura di test come necessario. NOTA: naris occlusione casuale durante l'allenamento e le prove possono essere considerate per evitare distorsioni.
- Posizionare pup in zona neutra della camera di prova.
- Lasciare il cucciolo di esplorare la camera per 1 minuto, registrando per quanto tempo il cucciolo ha speso sopra i due lati della camera (cioè più di menta piperita o di letti neutro profumato).
- Lasciare il cucciolo a riposare per 1 minuto in una camera di contenimento di plastica coperto.
- Ripetere i punti 5.2 e 5.3 per un totale di 10 min (cioè 5 prove di laboratorio, separati da 5 studi di riposo) commutazione l'orientamento iniziale del cucciolo nella camera per controllare per le preferenze di direzione.
- Subito dopo il test, rimuovere il grasso dalla narice.
- Inserire una noseplug polietilene nella narice opposta di cui al punto 2 e consentire agli animali di riposare per 10 min.
- Testare il cucciolo ancora una volta come in 5.3 -5.6, rimuovere il tappo, e tornare il cucciolo alla diga. Rimuovere e pulire la rete di plastica della camera di test con etanolo al 95% e che il liquido evapori. Posizionare la maglia indietro prima di testare il prossimo cucciolo.
NOTA: Applicare grasso al silicone al primo occlusione narice durante i test previene il rischio di sanguinamento e di stress associato con l'inserimento spina naso.
Figura 2 odore precoce preferenza di formazione e test. A) la formazione degli odori precoce preferenza utilizzando odore + accarezzare paradigma. B) Due scelta odore test preferenza con biancheria da letto di menta piperita su un lato, il controllo di letti inodore sul lato opposto. Una zona neutra 2 cm è messo in mezzo.
6. testare l'efficacia del singolo Naris Occlusione
nt "> Questo esperimento viene eseguito per determinare se l'occlusione singola narice porta all'attivazione lateralizzato del sistema olfattivo.- Eseguire occlusioni Naris unilaterali sul PD 6 o 7 cuccioli come descritto nella sezione 2.
- Dopo ~ 5 min assuefazione, mettere il cucciolo in un contenitore di plastica coperto ed esporlo a 30 ml di olio di menta piperita puro imbevuti di un pezzo di tessuto per 10 min.
- Subito dopo l'esposizione odore menta piperita, iniettare il cucciolo per via intraperitoneale (ip) con cloralio idrato (400 mg / kg) come anestetico generale o pentobarbitol, (150 mg / kg).
- Una volta completamente anestetizzato (mostrando alcuna risposta alla coda o il piede pizzico), transcardiaca profumato il cucciolo con le soluzioni di ghiaccio-freddo di soluzione fisiologica (0,9%) per ~ 1 min, seguito da paraformaldeide (4%, disciolto in soluzione tampone fosfato 0.1 M, PBS ).
- Dopo 10 min di paraformaldeide perfusione, raccogliere il cervello e metterlo in paraformaldeide notte a 4 ° C, poi transfer il cervello di una soluzione di saccarosio (20% in PBS) per altre 24 ore.
- Tagliare le fette di cervello coronali a 30 micron di spessore, con un criostato. Raccogliere OB e PC fette e montare su vetrini rivestiti di gelatina, seguita da colorazione immunoistochimica standard per pCREB anticorpi 21,25,30.
7 Verifica del Reversibilità del singolo Naris Occlusione
Questo esperimento test se l'effetto di blocco è reversibile a 24 ore dopo la rimozione del tappo naso.
- Eseguire occlusioni Naris unilaterali sul PD 6 o 7 cuccioli come descritto nella sezione 2.
- Dopo 15 min (equivalente alla durata dell'occlusione narice durante l'allenamento - 5 min assuefazione + 10 min di formazione), rimuovere il tappo naso, e restituire il cucciolo alla diga.
- 24 ore più tardi, esporre il cucciolo per l'odore di menta piperita in un contenitore di plastica coperto per 10 minuti come descritto al punto 6.2.
- Seguire le stesse operazioni in settaioni 6,3-6,6.
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Representative Results
Qui passiamo in rassegna alcuni dei risultati stabiliti in precedenza 24 per dimostrare l'efficacia dell'occlusione narice a isolare ingresso odore e imparare a un emisfero, e la reversibilità di questo metodo.
Occlusione singola narice durante l'allenamento precoce preferenza odore conduce ad una memoria odore lateralizzato 24. La memoria è limitata alla narice risparmiato (Figura 3). Quando i cuccioli sono testati per la preferenza odori con la stessa narice occlusa come durante l'allenamento, mostrano la preferenza per l'odore condizionato (ad esempio, menta piperita). Quando i cuccioli sono testati con i narice opposta occlusi, non mostrano alcuna preferenza per l'odore condizionata. Insieme, questi risultati suggeriscono che una memoria preferenza odore si forma e si esprime attraverso le narice risparmiati che hanno subito l'odore + accarezzando condizionata associativa solo.
Figura 3 singola narice occlusione induce apprendimento odore lateralizzato. Il protocollo comportamentale viene visualizzata nel pannello superiore. Odore + accarezzare (O / S +) o l'odore solo (O / S -) animali con singola narice occlusa durante l'allenamento, sottoposti a test di preferenza odore prima con la stessa narice occlusa poi con la narice opposta occluse. Il pannello inferiore mostra la percentuale di tempo speso più di biancheria da letto di menta profumata tra i diversi gruppi in un test di odore due scelta. * P <0,05. Le barre di errore, media ± SEM. Tratto da Fontaine et al. J. Neuroscienze (2013) con il permesso.
I lateralizzati risultati della formazione in odore di attivazione lateralizzato del sistema olfattivo durante l'esposizione odore (Figura 4) 24. Singola narice occlusione impedisce l'attivazione dell'OB e il PC dell'emisfero Duri ipsilateraleng esposizione odore. Ciò è dimostrato dal monitoraggio fosforilazione di CREB in OB, e il PC. Come mostrato in figura 4, utilizzando l'immunoistochimica, CREB fosforilata (pCREB) è significativamente inferiore nell'emisfero occluso seguito all'esposizione odore di menta piperita, rispetto all'emisfero controlaterale risparmiato. Colorazione Nissl (Figura 4A) mostra corpi cellulari paragonabili nello strato di cellule mitrale della OB, e nello strato di cellule piramidali del PC di entrambi gli emisferi. Tuttavia, pCREB è significativamente minore in entrambi gli strati di cellule del omolaterale emisfero narice occlusa (Figura 4B).
Figura 4. risultati singola narice occlusione in lateralizzato l'attivazione del sistema olfattivo durante l'esposizione odore. A) Nissl colorazione del bulbo olfattivo(OB) e anteriore, la corteccia piriforme (APC). B) espressioni pCREB negli emisferi occlusi e risparmiati in seguito ad esposizione di menta piperita in una sola narice pup occluso. Le frecce indicano strato di cellule mitrale in OB e piramidale strato di cellule in APC. Bar Scala, 500 micron. Tratto da Fontaine et al. J. Neuroscience (2013) con il permesso.
L'effetto di un singolo trial (15-20 min) narice occlusione è transitorio e reversibile, e non provoca danno neuronale visibili a lungo termine che potrebbe portare alla percezione degli odori alterata e ridotta attivazione neuronale di odori durante il test 24. Come indicizzato da pCREB colorazione nell'OB e il PC (Figura 5), espressioni pCREB nelle cellule mitrali della OB, e le cellule piramidali del PC di odore di esposizione sono comparabili tra gli emisferi occluse e risparmiati, 24 ore dopo la rimozione del la spina naso - lo stesso punto di tempo che l'odore test preferenzaè effettuata seguendo una formazione preferenza odore presto.
Figura 5 Valutazione della reattività neuronale seguente reversibile narice occlusione. PCREB colorazione del OB e APC, 24 ore dopo la rimozione di un tappo il naso in un cucciolo. Le frecce indicano strato di cellule mitrale in OB e piramidale strato di cellule in APC. MCL, strato di cellule mitrale. PCL, strato di cellule piramidali. Barre di scala, 500 micron per l'ingrandimento inferiore e 100 micron per un ingrandimento superiore.
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Discussion
L'apprendimento e la memoria odore modello lateralizzato in cuccioli di ratto all'interno di una finestra temporale critica è stata fondata da Hall e colleghi. In una serie di studi 33,34,36, hanno mostrato che una memoria preferenza odore potrebbe essere lateralizzato da odori + latte abbinamenti a una narice al PD 6 cuccioli di ratto. Memoria preferenza è stata forte quando la stessa narice era aperto durante l'allenamento e test, ma non osserva quando la narice occlusa era sbloccato e testato. Tuttavia, a PD 12, quando le connessioni anteriori commissurali dalle cortecce olfattive anteriori diventano funzionale 32, le narice non addestrato da solo potrebbe sostenere l'espressione della preferenza odore acquisita al PD 6 Lesione della commessura anteriore ripristinato la memoria lateralizzante quindi non era più accessibile dalla narice inesperto 33. Questo modello di apprendimento lateralizzato è stato replicato con successo con un odore + accarezzare 24,25,31 paradigma. Odore + accarezzando la formazione con uso singola naricelusion sul PD 6 porta ad una memoria lateralizzato su PD 7 31. ripetute occlusioni Naris singoli su PD 3-6 porta ad una memoria più lunga lateralizzato che dura almeno 48 ore 24.
I risultati lateralizzati protocollo apprendimento odore di "cervello diviso" nei singoli animali. Questo modello ha grandi vantaggi per studiare il comportamento ed i cambiamenti bio-fisiologico base di quest'ultima. Ad esempio, confrontando le uscite comportamentali utilizzando un modello soggetto entro-riduce sufficientemente variazioni di tra-animali disegni. Pups a questa età precoce variano notevolmente nella loro attività e la reattività. Controllo intra-animale elimina la variabilità individuale insita in termini di prestazioni e reattività, nonché le differenze intrinseche nella biologia della valutazione dei cambiamenti molecolari e fisiologici. Inoltre, questo potente modello infantile di apprendimento lateralizzato ci dà l'opportunità di mettere in relazione le prestazioni della memoria individuale alla fisiologia individuale, e di valutare thE fondamenti di memorie di diverse durate 24,25,31. Usando questo modello di apprendimento lateralizzato in combinazione con ex vivo esperimenti confrontando la fisiologia dei due emisferi entro gli stessi animali, E 'stato recentemente dimostrato che l'apprendimento odore precoce induce la plasticità sinaptica, come l'aumento delle risposte del recettore AMPA a sinapsi sia nel OB 31, e APC 24,25. Trasmissione sinaptica avanzata seguente apprendimento odore precoce si traduce in una potenza maggiore in rete olfattiva Rappresentazioni 24.
Gli studi futuri dovrebbero esplorare le basi molecolari della memoria odore che utilizzano questo modello di apprendimento lateralizzato. Questo include studi correlazionali guardando proteine e geni attivati a seguito di apprendimento, e gli studi causali guardando gli effetti di guadagno-di-funzione e la perdita-di-funzione di proteine e geni di particolare interesse. Un'altra possibilità interessante ed importante è essere in grado to riguardare cambiamenti fisiologici e molecolari alla forza della memoria comportamentale. Per ogni cucciolo, è possibile ricavare una misura prima memoria preferenza per le narici aperte e occluse. Successivi esperimenti ex vivo sui corrispondenti cortecce formati e addestrati avrebbero fornito cambiamenti fisiologici correlativi. E 'possibile, tuttavia, che odore ri-esposizione durante la preferenza collaudo stesso sarà altera la forza sinaptica, o che altre regioni del cervello contribuiscono in modo significativo alla espressione della memoria. Nei nostri studi attuali, fisiologia e del comportamento vengono effettuate su coorti separate. Questo elimina le preoccupazioni circa i test comportamentali che influenzano gli stessi parametri di interesse.
Un avvertimento con tappo naso è il potenziale danno tissutale neurale che è associato con l'inserimento spina e la rimozione. Per questo motivo, occorre stata presa inserimento della spina naso e cuccioli con sanguinamento durante l'inserimento devono essere esclusi, al fine di evitare ogni potenziale ef-lungo terminefetti associati a sanguinamento, come l'infiammazione. Blocco prolungato (ore, giorni o mesi) di narice o ablazione permanente di epitelio olfattivo conduce alla privazione a lungo termine olfattiva, danno neurale, e ridotte le attività neuronali nel OB e PC 37-41, anche se alcuni di questi effetti dovuti alla prolungata naris occlusione sono completamente reversibili 39,40. L'integrità dei tessuti a seguito acuta narice occlusione (~ 15 min) è stato convalidato da colorazione immunoistochimica di pCREB, un marcatore neuronale attività-dipendente, che ha dimostrato di ridurre nel PC di giovani topi adulti dopo 5 giorni narice occlusione 39. livelli pCREB in OB ipsilaterale e PC dei narice occluse erano significativamente meno durante l'esposizione menta piperita odore, confermando la lateralizzazione successo di velocità olfattiva in cuccioli di ratto durante la narice occlusione. Tuttavia, 24 ore dopo la rimozione del tappo naso, al momento del test preferenza odori, i livelli pCREB sono comparabili in entrambi gli emisferi, suggerendo l'effetto di occlusione acuta è completamente reversibile 24. Pertanto, la mancanza di preferenza di menta piperita testato con la narice precedentemente occlusa è dovuto alla mancanza di memoria, ma non a causa di una alterazione o la mancanza di percezione dell'odore associata a danno tissutale durante i test. Inoltre, le registrazioni elettrofisiologiche di controllo O / S - animali (con una sola narice occlusa durante l'esposizione odore senza carezze) non hanno mostrato differenze nei fEPSPs o numero di cellule piramidali attivate osservati con l'imaging del calcio - anche la conferma non vi è alcun cambiamento funzionale nella corteccia piriforme a causa di questi a breve termine reversibili occlusioni Naris 24,25.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polythylene 20 tubing | Intramedic | 427406 | Non-radiopaque, Non-toxic |
| 3-0 Silk suture thread | Syneture | Sofsilk | Non-absorbent |
| Silicone grease | Warner Instrument | 64-0378 | Odorless |
| 2% Xylocaine gel | AstraZeneca | Prod. No 061 | Lidocaine hydrochloride jelly, purchased at local pharmacy |
| Paint brush | Dynasty | 206R | Similar size/other brands work too |
| Peppermint extract | Sigma-Aldrich | W284807 | Other brands should be okay too |
| Training box | Custom-made | N/A | Acrylic box (20 x 20 x 5 cm3), see Figure 2A. Parameters and material for the box are not critical and can be modified. Material used should be odorless and does not absorb odors |
| Testing chamber | Custom-made | N/A | Stainless steel (30 x 20 x 18 cm3), see Figure 2B. Parameters and material for the chamber are not critical and can be modified. For example, an acrylic chamber instead of a stainless steel one can be used |
| pCREB antibody | Cell Signaling | 9198 | Ser 133 (87G3) Rabbit mAb |
| Chloral hydrate | Sigma-Aldrich | C8383 | N/A |
| Paraformaldehype | Sigma-Aldrich | P6148 | N/A |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | N/A |
References
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