Nous rapportons une technique pour la fabrication de micropoches dans les membranes électrofilées dans lequel étudient le comportement des cellules. Plus précisément, nous décrivons une combinaison de microstéréolithographie électrofilage et pour la production de PLGA (poly (lactide-co-glycolide)), des dispositifs de biomatériaux équipés de micro-caractéristiques de la cornée.
Problèmes de cornée touchent des millions de personnes dans le monde en réduisant leur qualité de vie de manière significative. Maladie de la cornée peut être causée par des maladies telles que Aniridie ou le syndrome de Steven Johnson, ainsi que par des facteurs externes tels que des brûlures chimiques ou de radiations. Les traitements actuels sont (i) l'utilisation de greffes de cornée et (ii) l'utilisation de cellules souches étendu dans le laboratoire et remis sur des supports (par exemple, la membrane amniotique); ces traitements sont relativement efficace, mais malheureusement, ils peuvent échouer au bout de 3-5 ans. Il est nécessaire de concevoir et de fabriquer de nouveaux dispositifs de biomatériaux capables de mimer la cornée en détail l'environnement physiologique où les cellules souches se trouvent dans la cornée. Des cellules souches limbiques sont situés dans le limbe (zone circulaire entre la cornée et la sclère) dans des créneaux spécifiques connus sous le nom de Vogt palissades. Dans ce travail, nous avons développé une nouvelle technologie de plate-forme qui combine deux techniques de fabrication de pointe (microstéréolithographie et electrospinnING) pour la fabrication de membranes qui imitent la cornée dans une certaine mesure du limbe. Nos membranes contiennent micropoches artificiels dont le but est de fournir des cellules de protection comme le Palisades Vogt faire dans l'œil.
La cornée, le tissu avasculaire extérieur plus centrale de l'oeil, est l'un des tissus les plus importants impliqués dans une vision. Il existe plusieurs types de cellules qui conservent la fonction de la cornée. La couche supérieure externe de la cornée est composée de cellules épithéliales qui peuvent être d'environ 5-7 couches d'épaisseur 2. Cette couche empêche l'invasion bactérienne dans la cornée et 3 permet l'entrée d'oxygène 4. Il a été rapporté que les cellules souches de l'épithélium de la cornée se trouvent dans des niches ou des cryptes (avec des tailles de 120 à 150 um) dans la région périphérique de la cornée du limbe connu comme 5,6. Comme les cellules souches se divisent, les cellules filles aussi appelées cellules d'amplification transitoire voyagent sur des niches et que la division continue les cellules se déplacent de façon centripète vers l'intérieur et vers le haut résultant dans des cellules différenciées à la région centrale de la cornée 7,8. Ces cellules sont régulièrement effacés avec le clin d'œil exposing nouvelles cellules sous 9.
En plus d'être l'emplacement des cellules souches épithéliales, le limbe joue également un rôle dans le maintien de la conjonctive vascularisée loin de la région de la cornée 10. Dommages au limbe peut être causée par des brûlures thermiques / chimiques, les radiations et aussi les maladies génétiques 10. Lorsque cela se produit, la barrière de la limbe est décomposé en permettant aux cellules de la conjonctive de se déplacer sur la cornée, la vascularisation de la région, causant de la douleur et de la cécité dans certains cas. La condition est connue comme la carence en cellules souches limbiques (LSCD) 10.
Différents substrats naturels ont été rapportés en tant que supports de cellules souches possibles pour aider à la régénération de la cornée. Par exemple, les membranes à base de collagène ont été utilisés par dravidien et al. 11 et Rama et ses collègues 12 ont signalé l'utilisation de fibrine dans une étude de 112 patients. À l'heure actuelle cependant la méthode la plus couramment utilisée de traitementest d'utiliser la membrane amniotique humaine à partir d'une banque de tissus et de la culture des cellules épithéliales limbiques sur sa surface 13,14. Une fois qu'une monocouche est formée, la membrane amniotique est collée cellule vers le haut sur la cornée endommagée, ce qui a toutes les cellules de la conjonctive et de tissus cicatriciels enlevée chirurgicalement de celle-ci avant cette transplantation de cellules 14. La membrane amniotique se dégrade en quelques semaines à quelques mois en laissant les cellules épithéliales attachés à la zone dénudée pour régénérer l'épithélium 15,16. Cette technique a réussi à restaurer la vision mais il ya encore quelques questions pratiques qui restreignent son adoption généralisée cliniquement. Comme la membrane amniotique est un tissu humain, il doit subir un dépistage par les procédures de la banque de tissus de bons avant d'être utilisé pour la transplantation de cellules sur des patients. Ce dépistage ne réduit le risque de transmission de maladies, mais ne peut pas éliminer complètement 17. En plus de cela, il ya eu des rapports de la variabilité de la performance de la membrane amniotique due à la variation des donateurs entre 18,19 et différentes méthodes de traitement 19,20. Parallèlement le faible risque de transmission de maladies, il ya la nécessité de centres de chirurgie d'avoir accès à des banques de tissus bien gérées, ne sont pas disponibles pour tous.
Bien que la membrane amniotique est relativement de succès, il existe un besoin pour le développement de nouvelles alternatives synthétiques biodégradables de support cellulaire pour le traitement des maladies de la cornée. Transporteurs synthétiques seraient surmonter la nécessité de procédures bancaires ainsi que d'éliminer le faible risque de transmission de la maladie et de la variabilité inter-bailleurs de fonds. En ce sens, des matériaux tels que le polyethylene glycol 21,22 et 23,24 PLGA ont été étudiés.
En développant une alternative synthétique de la membrane amniotique humain, il ya aussi la possibilité de concevoir en elle des caractéristiques souhaitables pour aider espérons la survie des cellules cultivées. La inclusion de microcaractéristiques au sein des dispositifs de biomatériaux pour le contrôle spécifique du comportement des cellules est un domaine d'intérêt. De nombreux auteurs ont rapporté des travaux sur le développement des cellules souches artificielles niches 25-30. Ce groupe a récemment rapporté la création d'un PEGDA fibronectine biofunctionalized limbe artificielle micro-usiné pour la livraison des cellules epitheliales limbiques et 22 une méthode pour la fabrication de membranes électrofilées biodégradables contenant des micro-usinés poches pour le support de cellules epitheliales limbiques 31.
Le but de ce travail est de développer une nouvelle technologie de fabrication pour le développement de dispositifs biomatériaux contenant microcaractéristiques qui imitent dans une certaine mesure les micro-environnements dans lesquels les cellules souches se trouvent dans le corps. Nous avons développé une technique qui combine microstéréolithographie et électrofilature qui permet la fabrication de membranes biodégradables microstructurées qui montrent GREAt potentiel pour des applications de régénération tissulaire.
Il est important de remarquer que, bien que dans ce travail de cette technique a été appliquée à la fabrication de plaques pour la régénération de la cornée, la technologie peut être appliquée à la fabrication de dispositifs pour la régénération d'une large gamme de tissus épithéliaux, par exemple la peau, par voie orale épithélium muqueuse, de l'intestin, des voies respiratoires, et de la vessie. Plus précisément, dans cette étude, nous avons mis au point une membrane synthétique biodégradable, qui fonctionne d'une manière similaire à la membrane amniotique pour fournir des cellules de la cornée. Cette membrane contient micropoches de l'ordre de 300 um (plus grand que les cryptes limbiques des Pallisades de Vogt (environ 150 pm)). Enfin, nous avons mis en place un protocole d'emballage qui permet à ces membranes à être conservés à -20 ° C pendant plus de 6 mois sans montrer aucun signe de rupture.
Cette étude décrit (a) une technique pour la fabrication de membranes électrofilées microcaractéristiques contenant en leur sein, et (b) la préparation de telles membranes pour l'utilisation clinique de l'emballage sous vide, l'irradiation gamma et ensuite le stockage avant l'utilisation. Dans cette application particulière, nous avons mis au point des membranes de PLGA contenant des micro-poches qui imitent les caractéristiques physiques des niches de cellules souches limbiques. Les objectifs de cette étude sont (i) de décrire les méthodes à fournir aux lecteurs les connaissances nécessaires pour concevoir et fabriquer des échafaudages contenant microcaractéristiques pour la recherche sur la contribution des niches de cellules souches pour la régénération des tissus et (ii) de fournir au lecteur une meilleure compréhension de façon à stocker des échafaudages électrofilées pendant de longues périodes de temps.
En termes d'application clinique, le stockage des membranes d'anneau est d'une importance primordiale. Dans ce travail, la dégradation de l'anneau a été étudiée sur une période de 6 mois. La dégradation de l'membranes est entraîné par hydrolyse afin de simplement garder les membranes humidité sans le processus est arrêté. Blackwood et al. Rapporté qu'en faisant varier le rapport de PLA de PGA, la dégradation de la membrane change 32. Cette étude a également montré que, en augmentant la quantité d'AMP, le taux de membranes électrofilées de dégradation in vivo accrue 22. Ici, il a été montré que l'emballage sous vide avec les membranes avec un peu desséchant et les irradiant et en les stockant à basse température pendant 6 mois, il n'y a pas de changement dans l'intégrité de la fibre et de la dégradation. À l'heure actuelle, 6 mois est aussi loin que nous avons étudié avec ces membranes contenant micropoches mais les données de stockage pendant 1 an a été rapporté sur les membranes électrofilées simples à -20 ° C 22 et nous avons maintenant des données inédites pour leur stockage à -20 ° C pour 2 ans sans aucun signe de dégradation. Ainsi, pour le stockage à long terme, il serait recommandé de les stocker à sec à -206, C, mais il est possible de les stocker à la température ambiante, même en Inde pendant au moins 6 mois (peut-être beaucoup plus longue). L'inclusion d'un indicateur d'humidité donne un moyen facile de vérifier que l'emballage a gardé membranes sèches dans ce cas, ils seront aptes à l'emploi.
Transfert des cellules de ces anneaux aux modèles 3D de la cornée a été montré lors de la passation des explants limbiques dans les micropoches. Ce groupe a récemment rapporté le transfert des cellules sur un modèle in vitro de la cornée de lapin en plaçant les explants sur des membranes plates PLGA (membranes sans structures cycliques 24). Utilisation du transfert de cellules de échafaudages microfabriqués présent a été pris un peu plus loin que nous pouvons maintenant localiser précisément explants de tissus dans les microcaractéristiques. La possibilité de placer directement les explants dans les créneaux permet également au chirurgien d'utiliser les membranes directement dans la salle d'opération en évitant la nécessité d'une salle blanche à la première expansion des cellules souches limbiques. Bien que ce morceau de work a été axée sur le développement de dispositifs pour les maladies de la cornée, cette technologie de microfabrication peut également être demandée pour des dispositifs pour de nombreuses autres applications en développement. Les travaux à venir découvrir la fabrication de constructions pour la régénération d'autres tissus tels que la peau et les os.
Alors que la conception et la fabrication initiale des microstructures PEGDA peuvent prendre beaucoup de temps, une fois fabriqué les structures peuvent être réutilisés plusieurs fois sans dégradation. Par conséquent, la fabrication ultérieure de membranes biodégradables PLGA microstructurée par électrofilature peut être effectuée à un taux comparable à la production de «non structurées (') membranes lisses suite à l'assemblage du collecteur. Bien que, dans ce travail, nous avons utilisé microstéréolithographie pour fabriquer des moules, d'autres méthodes de fabrication telles que l'impression en 3D ou de moulage par injection peuvent être également utilisés. En conséquence, le moule sous-jacent peut être fabriqué à partir de polymères ou d'autres métaux au lieu de PEGDA. En tant que tel cette technique est très polyvalent et chercheurs peut facilement adapter la méthode en fonction de leurs propres besoins et des installations.
La maison en microstéréolithographie set-up utilisé dans cette étude ne permettra pas la préparation de constructions avec des caractéristiques moins de 30 microns; ce n'est pas une limitation de l'application de la cornée est décrit ici, mais il pourrait être essentielle dans la conception d'autres modèles. Dans ce cas, d'autres techniques telles que la polymérisation de 2 photons (2PP) pourrait être d'intérêt mais la technique de électrofilature pourrait ne pas permettre la reproduction des structures à l'échelle sub-micronique (ce qui est actuellement à l'étude par notre groupe).
Les étapes critiques dans le processus de fabrication sont (i) d'éviter la surcuisson des modèles PEGDA qui peuvent être contrôlés en ajustant le temps et les quantités de photo-initiateur. (Ii) contrôler les conditions électrofilage tels que la température et l'humidité. (Iii) Le stockage appropriée la electrospumembranes n anneau à l'aide de l'emballage sous vide et desséchants.
En résumé, en plaçant des explants de tissu du limbe dans les microcaractéristiques de la membrane, nous avons montré l'excroissance des cellules des explants sur le créneaux, le transfert des cellules sur une cornée de lapin blessé et après réépithélisation de la cornée. La dégradation des membranes stockés à différentes températures a également été étudié et un protocole de conditionnement qui permet le stockage à long terme de membranes a été mise au point, cette dernière étant indispensable à l'élaboration des membranes pour une utilisation clinique.
The authors have nothing to disclose.
We gratefully acknowledge funding from the Wellcome Trust Affordable Healthcare for India and an EPSRC Landscape Fellowship for Ilida Ortega as well as contributions from The Electrospinning Company Ltd.
Name of reagents/material/equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Poly lactic-co-glycolic acid | Purac | PDLG5004 | |
Dichloromethane | Sigma Aldrich Or Fisher | 270997 Or D/1850/17 | >99.8% contains 50-150 ppm amylene stabiliser |
Digital Micromirror Device (DMD) Discovery 1100 Controller Board & Starter Kit | Texas Instruments | 1076N732 (UV) | |
473 nm Laser | Laser 2000 | MBL-III | 150 mW |
Poly (ethylene glycol) diacrylate | Sigma Aldrich | 475629 | Mn = 250g/mol 500 ml |
DEMEM + Glutamax | Fisher | 12077549 | |
Ham’ s F12 | Labtech biosera | LMH1236/500 | |
Fetal Bovine Serum | Labtech biosera | FB-1090/50 | |
EGF | R&D | 236-EG-200 | |
Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-1G | |
Amphotericin | Sigma Aldrich | A2942-100ml | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100ml | |
DAPI | Sigma Aldrich | 32670 | |
Propidium Iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
Thrombin | Sigma Aldrich | T9326 | |
Fibrinogen | Sigma Aldrich | F3879 | |
p63 | Sigma Aldrich | P3737 | |
CK3 | Merck Millipore | CLB218 | |
Hematoxylin | SLS | HHS16-500ML | |
Eosin | Sigma Aldrich | HT110232-1L | |
Medical grade bag (PET/Foil/LDPE) Peelable pouch | Riverside Medical Ltd. Derby, UK | Foil laminate PET/Foil/LDPE, (12,7,50) | |
gamma- irradiation (Sterilisation) | Applied Sterilisation Technologies (Synergy Health Laboratory Services (SHLS), Abergavenny UK) – external dose range of 25-40KGy | N/A | |
Silica gel orange | Sigma Aldrich | 10087 | |
Cobalt (II) chloride | Sigma Aldrich | 232696 | |
Copper (II) sulphate | Sigma-Aldrich | C-1297 | |
Six spot humidity indicator card | SCC, USA | 6HIC200 | |
Vacuum heat seal machine | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | VS518 | |
Andrew James Vacuum Sealer rolls 28cm X 40 metre rolls | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | BR2805 | |
Scanning Electron Microscopy (SEM) | Philips/FEI XL-20 SEM | N/A | |
Confocal Microscope | Zeiss LSM 510 META | N/A | |
Videne Antiseptic Solution | Ecolab, Swindon, UK | N/A | 3% |