Summary
Wij rapporteren een methode voor de fabricage van micropockets binnen electrospun membranen waarin celgedrag te bestuderen. Specifiek beschrijven we een combinatie van microstereolithography en elektrospinnen voor de productie van PLGA (poly (lactide-co-glycolide)) corneale biomateriaal inrichtingen voorzien microfeatures.
Abstract
Hoornvlies problemen invloed hebben miljoenen mensen wereldwijd het verminderen van hun kwaliteit van leven aanzienlijk. Cornea ziekte kan worden veroorzaakt door ziekten zoals Aniridia of Steven Johnson syndroom als door externe factoren zoals chemische brandwonden of straling. Huidige behandelingen zijn (i) het gebruik van cornea transplantaten en (ii) het gebruik van stamcellen uitgebreid in het laboratorium en uitgebracht op dragers (bijvoorbeeld amniotische membraan); deze behandelingen zijn relatief succesvol, maar helaas kunnen ze niet na 3-5 jaar. Er moet ontwerpen en vervaardigen van nieuwe cornea biomateriaal inrichtingen kunnen nabootsen in detail de fysiologische omgeving waarin stamcellen in de cornea bevinden. Limbale stamcellen zijn gelegen in de limbus (cirkelvormige gebied tussen cornea en sclera) specifieke niches zogenaamde Palisades van Vogt. In dit werk hebben we een nieuw platform technologie die twee geavanceerde productietechnieken (microstereolithography en electrospinn combineert ontwikkelding) voor de vervaardiging van corneale membranen nabootsen die tot op zekere hoogte de limbus. Onze membranen bevatten kunstmatige micropockets die tot doel hebben de cellen te voorzien van bescherming als de Palisades van Vogt doen in het oog.
Introduction
Het hoornvlies, de centrale avasculaire buitenste weefsel van het oog, is een van de belangrijkste weefsels betrokken visie 1. Er zijn verschillende types van cellen die de functie van de cornea te behouden. De bovenste buitenste laag van het hoornvlies bestaat uit epitheelcellen die ongeveer 5-7 lagen in dikte 2. Deze laag voorkomt bacteriële invasie in de cornea 3 en maakt toegang van zuurstof 4. Vermeld is dat de stamcellen van het hoornvliesepitheel liggen in nissen of crypten (met afmetingen van 120-150 urn) en omtreksgebied van de cornea zogenaamde limbus 5,6. Omdat de stamcellen verdelen, de dochter cellen ook wel bekend als voorbijgaande versterkend cellen reizen uit de niches en als divisie blijft de cellen bewegen centripetaal naar binnen en naar boven resulteert in terminaal gedifferentieerde cellen in het centrale hoornvlies regio 7,8. Deze cellen worden routinematig veegde met het knipperen van het oog exposing nieuwere cellen eronder 9.
Naast het feit dat de locatie van de epitheliale stamcellen, speelt de limbus een rol om de gevasculariseerde conjunctiva weg van het hoornvlies regio 10. Schade aan de limbus kan worden veroorzaakt door thermische / chemische brandwonden, straling en ook genetische ziekten 10. Wanneer dit gebeurt, is de limbus barrière afgebroken waardoor de bindvliescellen te gaan naar het hoornvlies, vascularizing de regio, waardoor pijn en blindheid in sommige gevallen. De aandoening staat bekend als limbale stamcel deficiëntie (LSCD) 10.
Verschillende natuurlijke substraten zijn gemeld als mogelijk stamcellen dragers voor hulp bij cornearegeneratie. Zo werden op collageen gebaseerde membranen door Dravida et al. 11 en Rama en medewerkers 12 gerapporteerd gebruik van fibrine in een studie met 112 patiënten. Momenteel is echter de meest gebruikte behandelingsmethodeis voor de menselijke amnionmembraan gebruiken van een weefselbank en cultuur limbal epitheelcellen aan het oppervlak 13,14. Zodra een monolaag heeft gevormd, wordt de amnionmembraan gelijmd cel-kant naar boven op het beschadigde hoornvlies waarin alle bindvliescellen en littekenweefsel operatief verwijderd uit het voorafgaand aan deze stamceltransplantatie 14 heeft. De amnionmembraan degradeert binnen weken tot maanden waarbij de epitheelcellen aan het blootgelegde gebied om het epitheel 15,16 regenereren. Deze techniek is succesvol in het herstellen van visie geweest maar er zijn nog een paar praktische zaken die de grootschalige introductie klinisch beperken. Zoals de amnionmembraan is menselijk weefsel moet het ondergaan screening met behulp van goede weefsel bankprocedures voordat het wordt gebruikt voor de stamceltransplantatie op patiënten. Deze screening verlaagt alleen het risico van overdracht van ziekten, maar kan niet volledig elimineren 17. Daarnaast zijn er meldingen van variabiliteit in de p geweestRendementen van de amnionmembraan vanwege inter donor variatie 18,19 en verschillende verwerkingsmethoden 19,20. Naast het kleine risico van overdracht van ziekten is er de eis voor chirurgische centra om de toegang tot goed geleide weefselbanken, die niet voor iedereen beschikbaar zijn.
Hoewel het amniotische membraan relatief succesvol is, er een behoefte aan de ontwikkeling van nieuwe synthetische biologisch afbreekbare celdrager alternatieven voor de behandeling van ziekte van het hoornvlies. Synthetische dragers zou overwinnen van de behoefte aan bancaire procedures, alsmede het elimineren van de kleine risico van overdracht van ziekten en inter-donor variabiliteit. In deze zin zijn materialen zoals polyethyleenglycol 21,22 en 23,24 PLGA onderzocht.
Bij de ontwikkeling van een synthetisch alternatief voor de humane amniotische membraan is ook de mogelijkheid te ontwerpen erin gewenste eigenschappen om hopelijk de overleving van de gekweekte cellen. Het inclusion van microfeatures binnen biomateriaal apparaten voor de specifieke controle van de cel gedrag is een opkomend gebied van belang. Veel auteurs hebben gemeld werken aan de ontwikkeling van kunstmatige stamcellen niches 25-30. Deze groep heeft onlangs melding gemaakt van het ontstaan van een microfabricated PEGDA-fibronectine biofunctionalized kunstmatige limbus voor de levering van limbale epitheliale cellen 22 en een methodologie voor de fabricage van elektrogesponnen biologisch afbreekbare membranen die microfabricated zakken voor de ondersteuning van limbale epitheelcellen 31.
Het doel van dit werk is een nieuwe productietechnologie te ontwikkelen voor de ontwikkeling van hulpmiddelen die biomateriaal microfeatures die nabootsen in een mate waarin de micro-omgevingen stamcellen in het lichaam bevinden. We hebben een techniek die microstereolithography en elektrospinnen combineert dat de fabricage van biologisch afbreekbare microstructured membranen die gewel tonen toelaat ontwikkeldt potentieel voor weefselregeneratie toepassingen.
Het is belangrijk te noteren dat, hoewel in dit werk deze techniek is toegepast op de vervaardiging van ringen voor cornearegeneratie kan de technologie worden toegepast op de vervaardiging van inrichtingen voor de regeneratie van een breed scala van epitheliale weefsels, zoals huid, orale slijmvliezen, darmen, luchtwegen, en de blaas epitheel. Specifiek, in dit onderzoek hebben we een synthetisch biologisch afbreekbaar membraan dat functioneert op soortgelijke wijze als de amnionmembraan cellen leveren aan het hoornvlies ontwikkeld. Dit membraan bevat micropockets van ongeveer 300 micrometer (groter dan de limbale crypten van de Pallisades van Vogt (ongeveer 150 pm)). Tenslotte hebben wij een verpakking protocol waarmee deze membranen bij -20 ° C gedurende meer dan 6 maanden worden bewaard zonder enige tekenen van afbraak vastgesteld.
Protocol
Ethiek Verklaring: De ogen die in deze studie werden gebruikt volgens de verklaring over Openheid op Animal Research:
1 Fabrication van PLGA Biologisch afbreekbare Membranen Uitgerust met Micropockets
- De ring steigers zijn gemaakt door een combinatie van microstereolithography en elektrospinnen technieken 31. In wezen kan de werkwijze worden samengevat in 2 delen (i) creëren van PEGDA templates door microstereolithography en (ii) electrospinning op de templates voor de voortplanting van de onderliggende PEGDA structuur (in dit geval een mikro-ring). Deze twee stappen worden in detail beschreven (figuren 1 en 2).
- Fabricage van PEGDA templates door microstereolithography (microSL)
- Vervaardig de ringen met een 2 lagenmodel, met de eerste laag (L1) die de basis van de structuur en de tweede laag (L2) presenteren 6 micropockets met hoef morfologischees in diverse maten 300-500 micrometer. De vervaardiging van PEGDA ringen is recent beschreven door deze groep 22.
- Maak L1 door het tekenen van een 1,2 cm zwarte cirkel met behulp van een geschikte tekenprogramma.
- Maak L2 op dezelfde manier, maar onder andere 8 wit 0.5 x 0.35 mm hoefijzervormige structuren. Verdeel de kleine witte hoefijzer vormen binnen de zwarte cirkel structuur.
- Opslaan L1 en L2 in JPEG-formaat.
- In een donkere glazen flesje, meng polyethyleenglycoldiacrylaat (PEGDA, Mn = 250 g / mol) met 1% w / w Camphorquinone, een fotoinitiator, een magnetische roerder gedurende 20 minuten.
- Vouw de laserstraal van de set-up met behulp van een telescopische lens arrangement microstereolithography en vervolgens projecteren op een computer programmeerbare digitale MultiMirror apparaat (UV-enabled DMD starter kit). OPMERKING: De DMD geeft het beeld (in dit geval een ring) op een spiegel via een 10 cm brandpuntsafstand buis lens. Het beeld wordt dan geleid door de zilver-coated spiegelen in een flacon met het uithardbare polymeer (PEGDA).
- Passen en zorgvuldig reinigen van de optiek van de set-up microstereolithography.
- Put 300 ul van de PEGDA mengsel in een putje van een 12-well weefselkweek plaat. Controleer of de wells worden vooraf bekleed met Teflon of andere non-stick materiaal voor gemakkelijke verwijdering van de structuur na uitharding.
- Schakelaar op de blauwe laser (MBL-III 473 nm; 150 mW) en upload L1 in de ALP3-basissoftware die eerder op de pc zijn geïnstalleerd. Bestraal de eerste laag voor 60 sec. OPMERKING: ALP3-basic is een USB-interface die de verbinding tussen de pc en de digitale microspiegeltjes biedt.
- Naar de bron 250 ul meer PEGDA uploaden L2 zoals hierboven beschreven en bestralen L2 voor 60 sec.
- Verwijder de niet-uitgeharde polymeer en was de ring met isopropanol O / N.
- Vervaardig de ringen met een 2 lagenmodel, met de eerste laag (L1) die de basis van de structuur en de tweede laag (L2) presenteren 6 micropockets met hoef morfologischees in diverse maten 300-500 micrometer. De vervaardiging van PEGDA ringen is recent beschreven door deze groep 22.
- Fabricage van biologisch afbreekbaar PLGA membranen met behulp elektrospinproces
OPMERKING: De PEGDA ringen werden gebruikt als matrijss waarover PLGA werd electrospun de PLGA reproduceren van de onderliggende topografie het gesponnen is via deze sjablonen. Na het spinnen, werd het vel van PLGA polymeer afgepeld van de collector. De laatste PLGA membraan niet de PEGDA ringen die werden bevestigd blijft aan de metalen collector bevatten.- Verdeel de PEGDA ringen op een gegalvaniseerde aluminium plaat (12 cm x 20 cm) voor het creëren van een statische elektrospinproces verzamelaar.
- Bevestig de ringen met behulp van geleidende koolstof tape. Opmerking: Deze ringen eenmaal gevormd worden hergebruikt als sjablonen voor electrospinning.
- Bereid de polymeer-oplossing voor het spinnen. Los PLGA (50/50 DL-lactide (52 mol%): glycolide (48 mol%), 44 kg / mol) in dichloormethaan (DCM) en 20% w / w concentratie.
- Roer O / N voor gebruik.
- Plaats 4 insuline spuiten (stomp, naalden 0,8 cm binnendiameter) op een injectiepomp. OPMERKING: Vier spuiten gegarandeerd sneller elektrospinproces dan het werken met een spuit.
- Plaats 2,5 ml van PLGA oplossing in elke spuit.
- Electrospin met een 30 pl / min debiet en spanningen, variërend van 12 tot 15 kV. Laat dan een ruimte tussen de naalden en de collector van 15 cm.
- Electrospin gedurende 1 uur en 30 minuten en ten slotte zorgvuldig verwijderen van de PLGA elektrogesponnen vel van de collector ter ondersteuning van de PEGDA ringen.
- Snijd de elektrogesponnen steigers in 22 cirkels mm diameter met behulp van een rond gat punch en het verlaten van de ring structuur in het midden.
- Fabricage van PEGDA templates door microstereolithography (microSL)
2 Lange-termijn opslag van PLGA Microfabricated Membranen
Opmerking: De PLGA ringen werden vervaardigd en gesteriliseerd door geaccrediteerde externe bedrijven; monsters werden bestraald met een uitwendige dosisbereik van 25-40 kGy.
- Monteer het membraan in een kleine container (plastic petrischaaltje) en plaats deze in een medische kwaliteit tas.
- Gebruik papieren filter om kleine filterzakken voor de deshydratiemiddelen creëren. To maken de zakken, vouw het filter papier (125 mm diameter) en snijd de resulterende halve cirkel in de helft; Vervolgens sluit de uiteinden aan elkaar met behulp van plakband.
- Vul drie filtreerpapier zakken met 1 g silica oranje, kobalt (II) chloride en koper (II) sulfaat, respectievelijk.
- Zet de drie zakken droogmiddel in de medische kwaliteit zak samen met de electrospun membraan.
- In de tas een in de handel verkrijgbaar zes spot luchtvochtigheid indicator kaart aan een vochtophoping tijdens de opslagperiode te detecteren.
- Gebruik een stofzuiger heatsealmachine stofzuigen en sluit de zak.
- Stuur de ring membranen aan een extern bedrijf voor de γ-straling.
- WINKEL γ-bestraald PLGA membranen bij een groot temperatuurbereik van -20 ° C tot +37 ° C in een vochtige omgeving in een incubator met 5% CO2.
- Bericht opslag, onderzoekt de luchtvochtigheid indicator om te bevestigen dat het niveau van vochtigheid onder 30%.
- Use Scanning Electron Microscopy (SEM) integriteit vezel beoordelen.
3 Isolatie van limbale Explantaten
Konijn limbal explantaten werden geïsoleerd uit de ogen van konijnen (verkregen uit een boerderij waar konijnen worden gefokt voor consumptie).
- Ontsmet de ogen van konijnen met behulp van antiseptische oplossing (3%).
- Reinig de ogen door het verwijderen van overtollig weefsel rond het hoornvlies.
- Scheid de limbale gebied (aangeduid als een dunne cirkelvormige ruimte tussen het hoornvlies (transparant) en de sclera (witte)) van de rest van de cornea met behulp van een dissectie microscoop.
- Gesneden in segmenten (ongeveer 1,5 cm lang) onder de dissectie microscoop.
- Ontsmet de limbale segmenten in 1,5% antiseptische oplossing gedurende 1 minuut.
- Snijd de limbale segmenten in kleine stukjes (100-500 micrometer) met een scalpel.
- Bewaar de kleine stukjes weefsel in kweekmedium (DMEM + Glutamax: Ham's F12 (1: 1), 10% foetaal runderserum, 1 U / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycine, 2,5 ug / ml amfotericine, 10 ng / ml EGF en 5 ug / ml insuline) bij 37 ° C en 5% CO2 tot gebruik (niet meer dan 60 min).
4 uitgroei van de Cellen van limbale Explantaten
Konijn limbale explantaten werden zowel vers gesponnen microfabricated membranen en membranen die vacuüm verpakt en bewaard gedurende 6 maanden bij -20 ° C werden geplaatst.
- De producten van de ring scaffolds met 15 gl fibrinelijm (1: 1 mengsel van fibrinogeen uit humaan plasma in een concentratie van 18,75 mg / ml trombine en uit humaan plasma in een concentratie van 2,5 U / ml) met een cel schraper voor het verspreiden van de fibrine gelijkmatig.
- Plaats de weefselexplantaten direct op de PLGA micropockets met behulp van een 25 G naald en een dissectie microscoop.
- Voeg celcultuurmedia zeer voorzichtig om te voorkomen dat het losmaken van de explantaten.
- Veranderen de media om de 3 dagen (in paragraaf 3.7 beschreven media recept) en kEEP in kweek gedurende 2 weken in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
- Bevestig de monsters met 3,7% gebufferde formaldehyde gedurende 10 min gevolgd door 3 wassingen met PBS.
- Tegenkleuring door incubatie in 1 ug / ml 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) of propidium jodide (PI) voor 10 min bij kamertemperatuur.
- Was 3 keer in PBS en monsters worden bedekt met een folie.
- Afbeelding van de monsters met behulp van een fluorescentiemicroscoop bij golflengten van 543 nm en 800 nm (twee-foton).
5 Oprichting Konijn Gewonde Cornea 3D Modellen
- Reinig en ontsmet de ogen van konijnen, zoals hierboven beschreven.
- Wond de konijnenogen door onderdompeling in 0,14% ammoniumhydroxide gedurende 5 minuten.
- Spoel de ogen in PBS en schraap het epitheel met een sclerotoom mes.
- Knippen en isoleren het hoornvlies-scleral knop verwijdert alle resterende weefsel.
- Plaats de hoornvliezen epitheliale zijde naar beneden opeen steriele beker en vul deze met 0,5% agar gemaakt in DMEM.
- Eenmaal ingesteld, zet de hoornvliezen epitheliale zijde naar boven, in kleine petrischalen en voeg voedingsbodems (recept hierboven beschreven) tot het limbale gebied. OPMERKING: Bedek de gehele hoornvlies; houden de orgelcultuur in het lucht-water grensvlak.
6 Isolatie van limbale Explantaten en inclusie van Ring Steigers in Rabbit Cornea 3D Modellen
- De producten van de ring membranen met 15 gl fibrinelijm (1: 1 mengsel van fibrinogeen in een concentratie van 18,75 mg / ml en trombine bij een concentratie van 2,5 U / ml) .Gebruik een cel schraper zoals hierboven beschreven.
- Plaats de weefselexplantaten direct op de PLGA micropockets met behulp van een 25 G naald en een dissectie microscoop.
- Leg de ringen met de weefselexplantaten op de blootgelegde hoornvliezen met de explants naar boven en op interfaces lucht-vloeistof. (Deze voorwaarden zijn eerder beschreven 22).
- Handhaaf de orgelcultuur modellen voor4 weken in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO2 verandert de media om de 2 dagen.
7 Beoordeling van cornearegeneratie en Stem Cell Onderhoud
- Na 4 weken, bevestig de hoornvliezen met behulp van 3,7% formaldehyde.
- Verwerk de hoornvliezen voor conventionele histologie tot 6 pm paraffinecoupes produceren.
- Vlek met hematoxyline en eosine (H & E).
- Voor immunocytochemie, Dewax de secties in xyleen (3min) en rehydrateren in 100% ethanol (1 min), 70% ethanol (1 min) en gedestilleerd water (2 min).
- Bakenen de gebieden af met een Dako pen om kleine gebieden af te bakenen en het overmatig gebruik van antilichamen voorkomen.
- Behandel de afgebakende gebieden met 0,05% trypsine (100 ul) gedurende 20 min (37 ° C).
- Grondig wassen met PBS en voeg 100 ul van serum 10% geitenmelk (blokkeren) gedurende 1 uur.
- Incubeer de monsters met 100 pl monoklonaal antilichaam cytokeratin 3 (CK3) en 100 gl van p63 in 1% geit serum O / N bij 4 ° C.
- Wassen met PBS en behandeld met 100 ui gebiotinyleerd secundair anti-muis antilichaam (1: 1000 in 1% geit serum) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Voeg 100 ul van FITC-streptavidine (1: 100 in 1% geit serum) gedurende 30 min bij kamertemperatuur.
- Behandel de monsters met DAPI zoals hierboven beschreven.
- Beeld de monsters met behulp van een fluorescentiemicroscoop bij golflengten van 800 nm (twee-foton) en 488 nm.
Representative Results
Elektrogesponnen microfabricated ringen werden vervaardigd met behulp van een combinatie van microstereolithography en elektrospinproces (figuren 1 en 2). PEGDA ringen van verschillende afmetingen werden vervaardigd onder toepassing microstereolithography (figuur 3); deze techniek kan de fabricage structuren in de orde van cm en de gelijktijdige integratie van microfeatures. In dit geval, ringen diameters 1,2-1,6 cm bevattende micropockets van 350-500 urn vervaardigd (figuur 4).
In termen van productie, steriliseren en verpakken van materialen voor toekomstig klinisch gebruik werd vastgesteld dat vacuümverpakking in medische kwaliteit zakken de mogelijkheid langetermijnopslag van PLGA membranen (Figuur 5) te bereiken aanzienlijk verbeterd; het gebruik van een medische kwaliteit zak (PET / folie / LDPE) met een dikte van 0,12 mm toegestaan ons een langere houdbaarheid te bereiken. Dit werd onderzocht door het sturen Membranes onze medewerkers in India en membranen werden opgeslagen gedurende maanden bij -20 ° C, bij kamertemperatuur en bij 37 ° C in opzettelijk vochtige omstandigheden (vochtige incubator). Figuur 5 toont dat met de opzettelijk provocerende opslagomstandigheden op 37 ° C onder vochtige omstandigheden, membranen slechts stabiel gedurende ongeveer 1 maand onder niet-vacuüm omstandigheden, maar bereikte 3 maanden opslag onder vacuüm omstandigheden (figuur 5 en tabel 1).
Tabel 1 toont de verbeterde opslagomstandigheden dat zelfs onder geselecteerde bevorderlijk wateropname en zwelling vezels als men aandacht besteed aan de keuze van de zak vroeger omstandigheden worden bereikt.
De ringen ondersteund cel uitgroei van limbale explantaten in verschillende omstandigheden (i) ringen vers en (ii) ringen 6 maanden bewaard (figuur 6). Cel overdracht werd bereikt na 4 weken bij placing de PLGA membranen op 3D-modellen gewond. Cellen gegroeid uit het weefsel explantaten die op de membranen een nieuw epitheel van de eerder blootgelegde cornea (figuur 7). Positieve (hoornvlies zonder behandeling) en negatieve controles (gewonden cornea) werden in kweek gehouden voor dezelfde tijdsperioden. De negatieve controles bevestigde het ontbreken van vorming van nieuw epitheel in afwezigheid van toegevoegde cellen. Immunocytochemie aangetoond dat de cellen groeien uit de explantaten waren corneale epitheelcellen omdat zij positief voor de corneale differentiatiemerker CK3 (Figuur 7E) waren.
Figuur 1 Schematische voorstelling van microstereolithography opgezet voor het creëren van PEGDA ringen.
her.within-page = "always"> 
Figuur 2 Schematische voorstelling van elektrospinproces gebruik PEGDA microfabricated ringen als sjablonen.
Figuur 3 (A) toont een voorbeeld van een statische collector (gegalvaniseerd aluminium plaat met PEGDA ringen) voor het spinnen van microfabricated PLGA membranen. (B) en (E) tonen verschillende electrospun matten worden losgetrokken van statische collectoren. (C) shows PEGDA templates van verschillende grootte benadrukken de veelzijdigheid van het gebruik microstereolithography voor de vervaardiging van de ondergrond. (D) toont een PLGA microfabricated replica./files/ftp_upload/51826/51826fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4 SEM beeld van een PEGDA ring met een hoefijzer microfeature (A); hoge vergroting SEM beeld van een microfabricated pocket (B). Fase contrast beeld van een PLGA ring met een hoefijzer microfeature (C); sterke vergroting fase contrast beeld van een microfabricated pocket (D). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5 Effect van temperatuur en tijd van opslag van vacuüm en niet vacuüm verpakt PLGA (50/50) membranen (44 kg / mol) met microgefabriceerde ringen over 6 maanden. membraan integriteit werd gescoord als volledig intact vezels (+++), een vezel zwelling (++), fiber samenvoegen (+) of geen intacte vezels (-). SEM beelden en drie deshydratiemiddelen (silica oranje, kobalt (II) chloride en koper (II) sulfaat) geen veranderingen in de vezels integriteit of vochtigheid. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6 Fluorescentie beelden die uitgroei van LEC van limbale explantaten op vers gemaakte biologisch afbreekbaar PLGA ringen (A, B) en ringen na 6 maanden opslag bij -20° C (C, D). Afbeeldingen (A) en (B) komen overeen met cellen gekleurd met DAPI (blauw) en propidiumjodide (rood) respectievelijk. Afbeelding b is een orthogonale uitzicht vanaf een confocale z-stack van een explant geplaatst op een microfabricated zak. Afbeeldingen (C) en (D) tonen positieve kleuring voor p63 (groen). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7 (A) toont een konijn cornea model gewonden met een ring steiger en weefsel explantaten op het schavot welke eerder was bekleed met fibrinelijm (B) en (C) zijn positieve en negatieve controles.; de positieve controle is een frisse rabbijn . t hoornvlies en de negatieve controle een cornea waar het epitheel opzettelijk verwijderd (de negatieve controle werd ook gekweekt gedurende 4 weken) (D) is een H & E beeld van een tissue engineered hoornvlies na 4 weken in kweek; de figuur toont de nieuwe meerlagige epitheel gevormd door de cellen die uit de explantaten die op de niches (E) is een afbeelding immunocytochemie blijkt mobiele uitgroei van een limbale explantaat.; kernen worden gekleurd met DAPI (blauw) en de cellen toont positieve kleuring voor cytokeratine 3, een hoornvlies differentiatiemarker (groen). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| PLGA (50/50) | x, "> Fiber integriteit membranen opgeslagen bij 37 ° C vochtig|||||||
| Dag 0 | Maand 1 | Maand 2 | Maand 3 | Maand 4 | Maand 5 | Maand 6 | |
| Niet vacuüm verpakt | +++ | - | - | - | - | - | - |
| Gestofzuigd (Bag A) (PE, PA Composite) Dikte: 0,14 mm | +++ | + | - | 64px; "> -- | - | - | |
| Gestofzuigd (Bag B) (PET / folie / LDPE) Dikte: 0,75 mm | +++ | +++ | +++ | + | - | - | - |
Tabel 1: Effect van vacuüm en verschillende opslag zakken op de integriteit van PLGA (50/50) membranen (44 kg / mol) onderzocht meer dan 6 maanden opslag. Membraan integriteit werd gescoord als volledig intacte vezels (+++), sommige vezels zwellen (++), fiber samenvoegen (+) of geen intacte vezels (-).
Discussion
Deze studie beschrijft (a) een techniek voor de fabricage van membranen die electrospun microfeatures in hen en (b) hoe dergelijke membranen bereiden voor klinisch gebruik door vacuüm verpakken, gammastraling en vervolgens opslag vóór gebruik. In deze specifieke toepassing kennen wij PLGA membranen die micropockets die de fysische eigenschappen van de limbale stamcellen niches nabootsen ontwikkeld. De doelstellingen van deze studie zijn (i) om methoden te beschrijven om de lezers met de kennis die nodig is om steigers met microfeatures voor onderzoek te ontwerpen en te fabriceren naar de bijdrage van stamcellen niches naar weefselregeneratie en (ii) om de lezer een beter inzicht te bieden te bieden hoe electrospun scaffolds slaan voor langere tijd.
In termen van klinische toepassing, de opslag van de ring membranen is van het grootste belang. In dit werk, de afbraak van de ring werd bestudeerd gedurende een periode van 6 maanden. Degradatie van demembranen wordt door hydrolyse, zodat door eenvoudig houden van de membranen vochtvrij het proces wordt gestopt. Blackwood et al. Gemeld dat door variatie van de verhouding van PLA PGA, de afbraak van het membraan verandert 32. Deze studie werd gevonden dat door de hoeveelheid van PGA, de afbraaksnelheid van electrospun membranen verhoogde in vivo 22. Hier is aangetoond dat bij vacuümverpakking de membranen samen met enkele droogmiddel en ze te bestralen en bewaring bij lage temperaturen gedurende 6 maanden is er geen verandering in de vezel integriteit en afbraak. Momenteel 6 maanden zover wij hebben bestudeerd deze membranen die micropockets maar opslaggegevens 1 jaar gemeld op effen electrospun membranen bij -20 ° C 22 Wij hebben nu ongepubliceerde data voor de opslag bij -20 ° C 2 jaar zonder tekenen van degradatie. Dus voor lange termijn opslag zou worden aanbevolen om ze droog te bewaren bij -206, C maar het is mogelijk om te slaan bij kamertemperatuur zelfs India ten minste 6 maanden (mogelijk veel langer). De opname van een luchtvochtigheid indicator geeft een eenvoudig middel om te controleren of de verpakking membranen droog in welk geval zij geschikt zijn voor het doel zal zijn heeft gehouden.
Overdracht van de cellen van deze ringen om 3D-modellen hoornvlies werd getoond bij het plaatsen van limbal explants binnen de micropockets. Deze groep rapporteerde onlangs overdracht van cellen op een in vitro konijn hoornvlies model door het plaatsen explants op gewoon PLGA membranen (vliezen zonder ring structuren) 24. Met behulp van de huidige microfabricated steigers cel overdracht is genomen een stap verder als we kunnen nu specifiek lokaliseren weefselexplantaten binnen de microfeatures. De mogelijkheid om de explantaten direct in de niches plaats maakt ook de chirurg de membranen direct gebruik in de operatiezaal vermijden van de noodzaak van een cleanroom eerste uitbreiding van de limbale stamcellen. Hoewel dit stuk van de WORk is gericht op de ontwikkeling van inrichtingen voor corneale ziekte, kan deze microfabricagetechnologie ook toegepast voor het ontwikkelen van inrichtingen voor vele andere toepassingen. Verder onderzoek zal de fabricage van constructen staand voor de regeneratie van andere weefsels zoals huid en botten.
Hoewel het ontwerp en de fabricage van de oorspronkelijke PEGDA microstructuren tijdrovend kan zijn, wanneer de structuren vervaardigd kunnen vele malen worden hergebruikt zonder kwaliteitsverlies. Derhalve kan de daaropvolgende fabricage van PLGA microgestructureerde afbreekbare membranen door electrospinning na inbouw van een collector worden uitgevoerd bij een vergelijkbare snelheid om de productie van gladde (ongestructureerde) membranen. Hoewel in dit onderzoek hebben wij gebruik microstereolithography voor het vervaardigen van de matrijzen kunnen andere fabricagemethoden zoals 3D-printen of spuitgieten worden gebruikt. Bijgevolg kan de onderliggende vorm van andere polymeren of metalen worden in plaats van PEGDA. Als zodanig is deze techniek is zeer veelzijdig en onderzoekers kunnen eenvoudig de methode om hun eigen behoeften en faciliteiten passen aan te passen.
De eigen microstereolithography opstelling in deze studie wordt de bereiding van constructen faciliteiten onder 30 urn niet toestaan; dit is geen beperking voor de corneale toepassing beschreven maar belangrijk in het ontwerp van andere modellen kunnen zijn. In dat geval andere technieken kan zoals 2 foton polymerisatie (2PP) van belang zijn echter de electrospinning techniek zou niet toestaan dat de reproductie van structuren op de sub-micron schaal (dit wordt momenteel onderzocht door onze groep).
Kritische stappen in het fabricage proces (i) voorkomen dat de overcuring van de PEGDA templates die kan worden geregeld door het aanpassen van tijd en hoeveelheid foto-initiator. (Ii) Instellen electrospinning zoals temperatuur en vochtigheid. (Iii) Het opslaan van de juiste wijze van de electrospun ring membranen met behulp van vacuüm-verpakking en droogmiddelen.
Samenvattend, door het plaatsen van limbale weefselexplantaten binnen de microfeatures van het membraan we aangetoond cel uitgroei van de explantaten op niches, celoverdracht naar een konijn verwond hoornvlies en daaropvolgende re-epithelisatie van het hoornvlies. De afbraak van de membranen opgeslagen bij verschillende temperaturen is ook bestudeerd en een verpakking protocol dat langetermijnopslag van membranen maakt ontwikkeld, de laatste is essentieel ontwikkeling membranen voor klinisch gebruik.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly (lactic-co-glycolic acid) | Purac | PDLG5004 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich Or Fisher | 270997 Or D/1850/17 | >99.8% contains 50-150 ppm amylene stabilizer |
| Digital Micromirror Device (DMD) Discovery 1100 Controller Board & Starter Kit | Texas Instruments | 1076N732 (UV) | |
| 473 nm Laser | Laser 2000 | MBL-III | 150 mW |
| Poly (ethylene glycol) diacrylate | Sigma Aldrich | 475629 | Mn = 250 g/mol, 500 ml |
| DEMEM + Glutamax | Fisher | 12077549 | |
| Ham’s F12 | Labtech biosera | LMH1236/500 | |
| Fetal Bovine Serum | Labtech biosera | FB-1090/50 | |
| EGF | R&D | 236-EG-200 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-1G | |
| Amphotericin | Sigma Aldrich | A2942-100ml | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100ml | |
| DAPI | Sigma Aldrich | 32670 | |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
| Thrombin | Sigma Aldrich | T9326 | |
| Fibrinogen | Sigma Aldrich | F3879 | |
| p63 | Sigma Aldrich | P3737 | |
| CK3 | Merck Millipore | CLB218 | |
| Hematoxylin | SLS | HHS16-500ML | |
| Eosin | Sigma Aldrich | HT110232-1L | |
| Medical grade bag (PET/Foil/LDPE) Peelable pouch | Riverside Medical Ltd. Derby, UK | Foil laminate PET/Foil/LDPE, (12,7,50) | |
| Gamma- irradiation (Sterilization) | Applied Sterilisation Technologies (Synergy Health Laboratory Services (SHLS), Abergavenny UK) - external dose range of 25-40 KGy | ||
| Silica gel orange | Sigma Aldrich | 10087 | |
| Cobalt (II) chloride | Sigma Aldrich | 232696 | |
| Copper (II) sulfate | Sigma-Aldrich | C-1297 | |
| Six spot humidity indicator card | SCC, USA | 6HIC200 | |
| Vacuum heat seal machine | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | VS518 | |
| Andrew James Vacuum Sealer rolls 28 cm x 40 meter rolls | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | BR2805 | |
| Scanning Electron Microscope (SEM) | Philips/FEI XL-20 SEM | ||
| Confocal Microscope | Zeiss LSM 510 META | ||
| Videne Antiseptic Solution | Ecolab, Swindon, UK | 3% |
References
- Ambati, B. K., et al. Corneal avascularity is due to soluble VEGF receptor-1. Nature. 443, 993-997 (2006).
- Reinach, P., Capó-Aponte, J., Mergler, S., Pokorny, K. Ophthalmic Diseases And Drug DeliveryOphthalmology Research. Ch 2, Ocular Transporters. Tombran-Tin, J., Barnstable, C. J. 2, Humana Press. 17-46 (2008).
- Kinoshita, S., et al. Characteristics of the Human Ocular Surface Epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 20, 639-673 (2001).
- Fatt, I., Bieber, M. T. The steady-state distribution of oxygen and carbon dioxide in the in vivo cornea: I. The open eye in air and the closed eye. Experimental Eye Research. 7, 103-112 (1968).
- Shortt, A. J., et al. Characterization of the Limbal Epithelial Stem Cell Niche: Novel Imaging Techniques Permit In Vivo Observation and Targeted Biopsy of Limbal Epithelial Stem Cells. STEM CELLS. 25, 1402-1409 (2007).
- Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. British Journal of Ophthalmology. 89, 529-532 (2005).
- Thoft, R. A., Friend, J. The X, Y, Z hypothesis of corneal epithelial maintenance. Investigative Ophthalmolog., & Visual Science. 24, 1442-1443 (1983).
- Lehrer, M. S., Sun, T. T., Lavker, R. M. Strategies of epithelial repair: modulation of stem cell and transit amplifying cell proliferation. Journal of Cell Science. 111, 2867-2875 (1998).
- Djalilian, A., et al. Down-regulation of Notch signaling during corneal epithelial proliferation. Molecular Vision. 14, 1041-1049 (2008).
- Dua, H. S., Azuara-Blanco, A. Limbal Stem Cells of the Corneal Epithelium. Survey of Ophthalmology. Survey. 44, 415-425 (2000).
- Dravida, S., et al. A biomimetic scaffold for culturing limbal stem cells: a promising alternative for clinical transplantation. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 2, 263-271 (2008).
- Rama, P., et al. Limbal Stem-Cell Therapy and Long-Term Corneal Regeneration. New England Journal of Medicine. 363, 147-155 (2010).
- Koizumi, N., Inatomi, T., Suzuki, T., Sotozono, C., Kinoshita, S. Cultivated corneal epithelial stem cell transplantation in ocular surface disorders. Ophthalmology. 108, 1569-1574 (2001).
- Fatima, A., et al. Technique of cultivating limbal derived corneal epithelium on human amniotic membrane for clinical transplantation. Journal of Postgraduate Medicine. 52, 257-261 (2006).
- Nubile, M., et al. Amniotic membrane transplantation for the management of corneal epithelial defects: an in vivo confocal microscopic study. British Journal of Ophthalmology. 92, 54-60 (2008).
- Nubile, M., et al. In Vivo Analysis of Stromal Integration of Multilayer Amniotic Membrane Transplantation in Corneal Ulcers. American Journal of Ophthalmology. 151, 809-822 (2011).
- Dua, H. S. Amniotic membrane transplantation. British Journal of Ophthalmology. 83, 748-752 (1999).
- Gicquel, J., et al. Epidermal Growth Factor Variations in Amniotic Membrane Used for Ex Vivo Tissue Constructs. Tissue Engineering Part A. 15, 1919-1927 (2009).
- Connon, C. J., et al. The variation in transparency of amniotic membrane used in ocular surface regeneration. British Journal of Ophthalmology. 94, 1057-1061 (2010).
- Hopkinson, A., McIntosh, R. S., Tighe, P. J., James, D. K., Dua, H. S. Amniotic Membrane for Ocular Surface Reconstruction: Donor Variations and the Effect of Handling on TGF-β Content. Investigative Ophthalmolog., & Visual Science. 47, 4316-4322 (2006).
- Sitalakshmi, G., et al. Ex Vivo Cultivation of Corneal Limbal Epithelial Cells in a Thermoreversible Polymer (Mebiol Gel) and Their Transplantation in Rabbits: An Animal Model. Tissue Engineering Part A. 15, 407-415 (2008).
- Ortega, I., Deshpande, P., Gill, A. A., MacNeil, S., Claeyssens, F. Development of a microfabricated artificial limbus with micropockets for cell delivery to the cornea. Biofabrication. 5, (2013).
- Deshpande, P., et al. Using poly(lactide-co-glycolide) electrospun scaffolds to deliver cultured epithelial cells to the cornea. Regenerative Medicine. 5, 395-401 (2010).
- Deshpande, P., et al. Simplifying corneal surface regeneration using a biodegradable synthetic membrane and limbal tissue explants. Biomaterials. 34, 5088-5106 (2013).
- Wheeldon, I., Ahari, A. F., Khademhosseini, A. Microengineering Hydrogels for Stem Cell Bioengineering and Tissue Regeneration. Charlottesv Va. 15, 440-448 (2010).
- Moeller, H. C., Mian, M. K., Shrivastava, S., Chung, B. G., Khademhosseini, A. A microwell array system for stem cell culture. Biomaterials. 29, 752-763 (2008).
- Fisher, O. Z., Khademhosseini, A., Langer, R., Peppas, N. A. Bioinspired Materials for Controlling Stem Cell Fate. Accounts Chem. Res. 43, 419-428 (2010).
- Raimondi, M. T., et al. Three-dimensional structural niches engineered via two-photon laser polymerization promote stem cell homing. Acta Biomaterialia. 9, 4579-4584 (2013).
- Gobaa, S., et al. Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput. Nat Meth. 8, 949-955 (2011).
- Truckenmüller, R., et al. Fabrication of cell container arrays with overlaid surface topographies. Biomedical Microdevices. 14, 95-107 (2012).
- Ortega, Í, Ryan, A. J., Deshpande, P., MacNeil, S., Claeyssens, F. Combined microfabrication and electrospinning to produce 3-D architectures for corneal repair. Acta Biomaterialia. 9, 5511-5520 (2013).
- Blackwood, K. A., et al. Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement. Biomaterials. 29, 3091-3104 (2008).
