Vi rapporterer en metode for fabrikasjon av micropockets innenfor elektrospunnede membraner der å studere celleadferd. Spesielt beskriver vi en kombinasjon av microstereolithography og elektrospinning for produksjon av PLGA (Poly (laktid-ko-glykolid)) corneale biomateriale enheter utstyrt med microfeatures.
Hornhinnen problemene påvirker millioner av mennesker over hele verden reduserer deres livskvalitet betraktelig. Hornhinnen sykdom kan være forårsaket av sykdommer som Aniridia eller Steven Johnson syndrom samt fra eksterne faktorer som for eksempel kjemiske brannsår eller stråling. Nåværende behandlinger er (i) bruken av hornhinnetransplantater, og (ii) bruk av stamcelle ekspandert i laboratoriet og levert på bærere (for eksempel, fostervann membran); disse behandlingene er relativt vellykket, men dessverre de kan mislykkes etter 3-5 år. Det er et behov for å utvikle og produsere nye korneal biomateriale enheter i stand til å etterligne i detalj det fysiologiske miljø hvor stamceller ligge i hornhinnen. Limbale stamceller er lokalisert i limbus (sirkulært område mellom hornhinne og sclera) i spesifikke nisjer kjent som Palisades av Vogt. I dette arbeidet har vi utviklet en ny plattform-teknologi som kombinerer to banebrytende produksjonsteknikker (microstereolithography og electrospinning) for fabrikasjon av corneale membraner som etterligner i en viss grad limbus. Våre membraner inneholder kunstige micropockets som tar sikte på å gi celler med beskyttelse som Palisades av Vogt gjøre i øyet.
Den hornhinnen, avaskulær sentrale ytterste vev i øyet, er en av de viktigste vev som er involvert i syn 1. Det finnes flere typer av celler som opprettholder funksjonen av hornhinnen. Den øvre ytterste lag av hornhinnen består av epitelceller som kan være ca 5-7 lag i tykkelse 2. Dette laget hindrer bakteriell invasjon inn i hornhinnen 3 og tillater oppføring av oksygen fire. Det har blitt rapportert at stamcellene av det corneale epitel ligge i nisjer eller kryptene (med størrelser på 120 til 150 mikrometer) på den perifere delen av hornhinnen som kalles limbus 5,6. Som stamceller dele, dattercellene også kjent som forbigående forsterkerceller reiser ut av nisjene og som divisjonen fortsetter cellene bevege seg sentripetalt innover og oppover, noe som resulterer i terminalt differensierte celler på det sentrale hornhinne region 7,8. Disse cellene blir rutinemessig tørkes bort med blink i øyet exposing nyere celler under ni.
I tillegg til å være plasseringen av de epiteliale stamceller, limbus spiller også en rolle i å holde vaskularisert conjunctiva bort fra hornhinneområdet 10. Skade på limbus kunne være forårsaket av termisk / kjemisk forbrenning, stråling og også genetiske sykdommer 10. Når dette skjer, blir limbus barrieren brytes ned slik at den konjunktivale cellene å bevege seg ut på hornhinnen, vascularizing regionen, forårsaker smerte og blindhet i noen tilfeller. Tilstanden er kjent som limbale stamcellemangel (LSCD) 10.
Forskjellige naturlige underlag har blitt rapportert som mulige stamcelle bærere for å hjelpe i hornhinnen regenerering. For eksempel ble kollagen-baserte membraner som brukes av Dravida et al. 11 og Rama og kolleger 12 rapporterte bruken av fibrin i en undersøkelse med 112 pasienter. I dag er imidlertid den mest brukte metode for behandlinger å bruke menneskelig fostervann membran fra en vev bank og kultur limbale epitelceller på overflaten sin 13,14. Når et monosjikt er dannet, blir fostermembran limt cellesiden opp på skadet kornea som har alle de konjunktivale celler og arrvev kirurgisk fjernet fra det forut for denne celletransplantasjon 14. Foster membran forringer løpet av uker til måneder forlater epitelceller festet til avdekt området for å regenerere epitel 15,16. Denne teknikken har vært vellykket i å gjenopprette visjon men det er fortsatt noen praktiske problemer som begrenser dens utbredt opptak klinisk. Som foster membranen er menneskelig vev det er behov for å gjennomgå screening ved hjelp av god vev banktjenester prosedyrer før de blir brukt for celletransplantasjon på pasienter. Dette screening bare reduserer risikoen for overføring av sykdommer, men kan ikke helt fjerne den 17. I tillegg til dette har det vært rapporter om variasjon i pYtelse av foster membranen på grunn av inter donor variasjon 18,19 og ulike bearbeidingsmetoder 19,20. Ved siden av den lille risikoen for smitteoverføring er det kravet om kirurgiske sentre skal ha tilgang til veldrevne vev banker, ikke tilgjengelige for alle.
Selv foster membranen er relativt vellykket, er det et behov for utvikling av nye syntetiske bionedbrytbare cellebærer alternativer for behandling av korneal sykdom. Syntetiske bærere ville overvinne behovet for banktjenester prosedyrer, så vel som å eliminere den lille risiko for sykdomsoverføring og inter-donor variabilitet. I denne forstand er materialer slik som polyetylenglykol og PLGA 21,22 23,24 undersøkt.
I utviklingen av en syntetisk alternativ til den menneskelige foster membran er det også mulighet til å designe inn i den ønskelige funksjoner for å forhåpentligvis hjelpe overlevelsen av dyrkede celler. Økningenlusion av microfeatures innenfor biomateriale enheter for den spesifikke kontrollen av celle atferd er et voksende område av interesse. Mange forfattere har rapportert arbeidet mot utvikling av kunstige stamceller nisjer 25-30. Denne gruppen har nylig rapportert etableringen av en microfabricated PEGDA fibronectin-biofunctionalized kunstig limbus for levering av limbale epitelceller 22 og en metodikk for fabrikasjon av elektrospunnede biologisk nedbrytbare membraner som inneholder microfabricated lommer for støtte fra limbale epitelceller 31.
Målet med dette arbeidet er å utvikle en ny produksjonsteknologi for utvikling av biomateriale enheter som inneholder microfeatures som etterligner i et omfang de microenvironments der stamceller bor i kroppen. Vi har utviklet en teknikk som kombinerer microstereolithography elektrospinning og som tillater fremstilling av biologisk nedbrytbare mikrostrukturerte membraner som viser flott potensial for vev gjenfødelse applikasjoner.
Det er viktig å legge merke til at selv i dette arbeidet denne teknikken har blitt brukt til fabrikasjon av ringer for hornhinne gjenfødelse, kan teknologien brukes til fabrikasjon av enheter for regenerering av et bredt spekter av epitelvev, f.eks, hud, oral slimhinner, tarm, luftveier, og blære epitel. Nærmere bestemt, i denne studien har vi utviklet en syntetisk bionedbrytbar membran som fungerer på en lignende måte til den fostermembran for å levere celler til hornhinnen. Denne membranen inneholder micropockets på rundt 300 mikrometer (større enn de limbale krypter av Pallisades av Vogt (rundt 150 mikrometer)). Endelig, er det etablert en emballasje protokoll som gjør at disse membraner til å bli lagret ved -20 ° C i mer enn 6 måneder uten å vise noen tegn på sammenbrudd.
Denne studie beskriver (a) en teknikk for fabrikasjon av elektrospunnede membraner innehold microfeatures i dem, og (b) å tilberede slike membraner for klinisk bruk ved vakuumpakking, gamma-stråling og deretter lagring før bruk. I denne søknaden har vi utviklet PLGA membraner som inneholder micropockets som etterligner de fysiske funksjonene i limbale stamcelle nisjer. Målet med denne studien er (i) for å beskrive metoder for å gi leserne den kunnskapen som trengs for å designe og dikte stillasene inneholder microfeatures for forskning på bidraget fra stamcelle nisjer til vev gjenfødelse og (ii) å gi leseren en bedre forståelse av hvordan du lagrer elektrospunnede stillaser for lange perioder av gangen.
I form av klinisk anvendelse, er lagring av ring membraner av overordnet betydning. I dette arbeidet ble nedbrytningen av ringen undersøkt over en periode på 6 måneder. Nedbrytning avmembraner er drevet av hydrolyse så ved ganske enkelt å holde membranene fuktighetsfrie prosessen stanses. Blackwood et al. Rapportert at ved å variere forholdet mellom PLA til PGA, nedbrytning av membranen 32 endres. Denne studie viste også at ved å øke mengden av PGA, nedbrytningshastigheten for elektrospunnede membraner økt in vivo-22. Her har det vist seg at med vakuumpakking membranene sammen med noen tørkemiddel og bestråle dem og lagre dem ved lav temperatur i 6 måneder, er det ingen endring i fiberintegritet og nedbrytning. I dag er 6 måneder så langt som vi har studert med disse membranene som inneholder micropockets men lagring av data for ett år har blitt rapportert på vanlig elektrospunnede membraner ved -20 ° C 22 og vi har nå upubliserte data for deres lagring ved -20 ° C for 2 år uten noen tegn til degradering. Dermed for langtidslagring vil det bli anbefalt å lagre dem tørr ved -206, C, men det er mulig å lagre dem ved RT selv i India i minst 6 måneder (muligens mye lenger). Inkludering av en fuktighetsindikator gir en enkel måte å kontrollere at emballasjen har holdt membraner tørre i så fall vil de være egnet til formålet.
Overføring av celler fra disse ringene til 3D hornhinne modeller ble vist når du plasserer limbale eksplantater innenfor micropockets. Denne gruppen har nylig rapportert overføring av cellene til et in vitro kanin hornhinne modell ved å plassere eksplantater på vanlig PLGA membraner (membraner uten ringstrukturer) for 24. Ved hjelp av den nåværende microfabricated stillaser celle overføring har blitt tatt et skritt videre som vi kan nå spesifikt finne vev explants innenfor microfeatures. Evnen til å plassere de eksplantater direkte i nisjene også tillater kirurgen å bruke membraner direkte i den kirurgiske teater unngå behovet for et renrom først å utvide limbale stamceller. Selv om dette stykke work har vært fokusert på utvikling av enheter for hornhinnesykdom, kan dette microfabrication teknologien også brukes for å utvikle enheter for mange andre programmer. Fremtidig arbeid vil utforske fabrikasjon av konstruksjoner for regenerering av andre vev som hud og bein.
Mens utformingen og innledende fabrikasjonen av PEGDA mikrostrukturer kan være tidkrevende, en gang fremstille strukturene kan brukes om igjen mange ganger uten degradering. Derfor kan den etterfølgende fabrikasjon av PLGA mikrostrukturerte biodegraderbare membraner ved electro bli utført på en tilsvarende sats til fremstilling av ren ('ustrukturerte') membraner etter monteringen av oppsamleren. Selv i dette arbeidet har vi benyttet microstereolithography for fabrikasjon av muggsopp, kan andre fabrikasjon metoder som for eksempel 3D-utskrift eller sprøytestøping også brukes. Følgelig kan den underliggende formen være laget av andre polymerer eller metaller i stedet for PEGDA. Som sådan denne teknikken er svært allsidig og forskere kan enkelt tilpasse metoden for å matche sine egne behov og fasiliteter.
Husets microstereolithography oppsett brukt i denne studien vil ikke tillate utarbeidelse av konstruksjoner med funksjoner henhold 30μm; dette er ikke en begrensning for hornhinnen søknaden beskrevet her, men det kan være avgjørende i utformingen av andre modeller. I så fall andre teknikker som to foton polymerisasjon (2PP) kunne være av interesse men electrospinning teknikken kanskje ikke tillate reproduksjon av strukturer på sub-micron skala (dette blir nå studert av vår gruppe).
Kritiske trinn innenfor fabrikasjon prosessen er (i) Unngå overcuring av PEGDA maler som kan kontrolleres ved å justere tid og mengder fotoinitiator. (Ii) Kontroll av elektrospinnings forhold som temperatur og fuktighet. (Iii) Lagring hensiktsmessig den electrospun ring membraner ved hjelp av vakuum-pakking og tørkemidler.
I sammendrag, ved å plassere limbale vev eksplantater innenfor microfeatures av membranen har vi vist celleutvekst fra eksplantater i nisjer, celleoverføring på en kanin hornhinne såret og etterfølgende re-epitelisering av hornhinnen. Nedbrytningen av membraner som er lagret ved forskjellige temperaturer er også blitt studert og en emballasje protokoll som tillater langtidslagring av membraner har blitt utviklet, hvor sistnevnte er viktig i utviklingen av membraner for klinisk bruk.
The authors have nothing to disclose.
We gratefully acknowledge funding from the Wellcome Trust Affordable Healthcare for India and an EPSRC Landscape Fellowship for Ilida Ortega as well as contributions from The Electrospinning Company Ltd.
Name of reagents/material/equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Poly lactic-co-glycolic acid | Purac | PDLG5004 | |
Dichloromethane | Sigma Aldrich Or Fisher | 270997 Or D/1850/17 | >99.8% contains 50-150 ppm amylene stabiliser |
Digital Micromirror Device (DMD) Discovery 1100 Controller Board & Starter Kit | Texas Instruments | 1076N732 (UV) | |
473 nm Laser | Laser 2000 | MBL-III | 150 mW |
Poly (ethylene glycol) diacrylate | Sigma Aldrich | 475629 | Mn = 250g/mol 500 ml |
DEMEM + Glutamax | Fisher | 12077549 | |
Ham’ s F12 | Labtech biosera | LMH1236/500 | |
Fetal Bovine Serum | Labtech biosera | FB-1090/50 | |
EGF | R&D | 236-EG-200 | |
Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-1G | |
Amphotericin | Sigma Aldrich | A2942-100ml | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100ml | |
DAPI | Sigma Aldrich | 32670 | |
Propidium Iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
Thrombin | Sigma Aldrich | T9326 | |
Fibrinogen | Sigma Aldrich | F3879 | |
p63 | Sigma Aldrich | P3737 | |
CK3 | Merck Millipore | CLB218 | |
Hematoxylin | SLS | HHS16-500ML | |
Eosin | Sigma Aldrich | HT110232-1L | |
Medical grade bag (PET/Foil/LDPE) Peelable pouch | Riverside Medical Ltd. Derby, UK | Foil laminate PET/Foil/LDPE, (12,7,50) | |
gamma- irradiation (Sterilisation) | Applied Sterilisation Technologies (Synergy Health Laboratory Services (SHLS), Abergavenny UK) – external dose range of 25-40KGy | N/A | |
Silica gel orange | Sigma Aldrich | 10087 | |
Cobalt (II) chloride | Sigma Aldrich | 232696 | |
Copper (II) sulphate | Sigma-Aldrich | C-1297 | |
Six spot humidity indicator card | SCC, USA | 6HIC200 | |
Vacuum heat seal machine | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | VS518 | |
Andrew James Vacuum Sealer rolls 28cm X 40 metre rolls | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | BR2805 | |
Scanning Electron Microscopy (SEM) | Philips/FEI XL-20 SEM | N/A | |
Confocal Microscope | Zeiss LSM 510 META | N/A | |
Videne Antiseptic Solution | Ecolab, Swindon, UK | N/A | 3% |