हम सेल व्यवहार का अध्ययन करने में जो electrospun झिल्ली के भीतर micropockets के निर्माण के लिए एक तकनीक की रिपोर्ट. विशेष रूप से, हम PLGA (पाली (Lactide सह Glycolide)) microfeatures से लैस कॉर्निया biomaterial उपकरणों के उत्पादन के लिए microstereolithography और electrospinning का एक संयोजन का वर्णन.
कॉर्नियल समस्याओं दुनिया भर में उनके जीवन की गुणवत्ता में काफी कम करने के लाखों लोगों को प्रभावित करते हैं. कॉर्नियल रोग ऐसे Aniridia या स्टीवन जॉनसन सिंड्रोम के रूप में के रूप में भी इस तरह के रासायनिक जल या विकिरण के रूप में बाह्य कारकों से बीमारियों की वजह से हो सकता है. वर्तमान उपचार (मैं) कॉर्निया ग्राफ्ट का उपयोग कर रहे हैं और (द्वितीय) प्रयोगशाला में विस्तार किया है और वाहक (जैसे, एमनियोटिक झिल्ली) पर दिया स्टेम सेल का उपयोग; इन उपचार अपेक्षाकृत सफल रहे हैं, लेकिन दुर्भाग्य से वे 3-5 साल के बाद विफल कर सकते हैं. डिजाइन और विस्तार में स्टेम कोशिकाओं कॉर्निया में रहते हैं जहां शारीरिक वातावरण की नकल करने में सक्षम नई कॉर्निया biomaterial उपकरणों का निर्माण करने की आवश्यकता है. अंगीय स्टेम कोशिकाओं Vogt की Palisades के रूप में जाना विशिष्ट niches में (कॉर्निया और श्वेतपटल के बीच परिपत्र क्षेत्र) किनारी में स्थित हैं. इस काम में हम दो अत्याधुनिक विनिर्माण तकनीक (microstereolithography और electrospinn जोड़ती है जो एक नया मंच तकनीक विकसित की हैएक निश्चित सीमा किनारी को नकल कि कॉर्निया झिल्ली के निर्माण के लिए) आईएनजी. हमारे झिल्ली Vogt की Palisades आंख में कर के रूप में संरक्षण के साथ कोशिकाओं उपलब्ध कराने के उद्देश्य जो कृत्रिम micropockets होते हैं.
कॉर्निया, आंख की avascular केंद्रीय सबसे बाहरी ऊतक, दृष्टि 1 में शामिल सबसे महत्वपूर्ण ऊतकों में से एक है. कॉर्निया के समारोह का कहना है कि कोशिकाओं के कई प्रकार हैं. कॉर्निया के ऊपर सबसे बाहरी परत मोटाई 2 में लगभग 5-7 परतों हो सकता है जो उपकला कोशिकाओं के शामिल हैं. इस परत कॉर्निया 3 में बैक्टीरिया आक्रमण से बचाता है और ऑक्सीजन 4 के प्रवेश की अनुमति देता है. यह बताया गया है कि किनारी 5,6 के रूप में जाना जाता है कॉर्निया के परिधीय क्षेत्र में (120-150 माइक्रोन के आकार के साथ) आलों या तहखाने में कॉर्निया उपकला झूठ की स्टेम कोशिकाओं. स्टेम कोशिकाओं के विभाजन के रूप में, यह भी क्षणिक amplifying कोशिकाओं के रूप में जाना जाता बेटी कोशिकाओं niches के बाहर यात्रा करते हैं और के रूप में विभाजन कोशिकाओं centripetally अंदर की ओर ले जाते हैं और ऊपर की तरफ केंद्रीय कॉर्निया क्षेत्र 7,8 पर टर्मिनली विभेदित कोशिकाओं में जिसके परिणामस्वरूप जारी है. इन कोशिकाओं को नियमित नेत्र ई की झपकी के साथ भाग नष्ट कर रहे हैं9 के नीचे नए कोशिकाओं xposing.
उपकला स्टेम कोशिकाओं का स्थान होने के अलावा, किनारी भी कॉर्निया क्षेत्र 10 से दूर vascularized कंजाक्तिवा रखने में एक भूमिका निभाता है. किनारी को नुकसान थर्मल / रासायनिक जल, विकिरण और भी आनुवंशिक रोगों 10 की वजह से हो सकता है. जब ऐसा होता है, किनारी बाधा, नेत्रश्लेष्मला कोशिकाओं कॉर्निया पर स्थानांतरित करने की अनुमति क्षेत्र vascularizing, कुछ मामलों में दर्द और अंधापन के कारण टूट गया है. हालत अंगीय स्टेम सेल की कमी (LSCD) 10 के रूप में जाना जाता है.
विभिन्न प्राकृतिक substrates कॉर्निया उत्थान में सहायता के लिए संभव स्टेम सेल वाहक के रूप में सूचित किया गया है. उदाहरण के लिए, कोलेजन आधारित झिल्ली द्रविड़ एट अल. 11 और राम और सहकर्मियों 12 से 112 मरीजों के साथ एक अध्ययन में आतंच के उपयोग की सूचना दी इस्तेमाल किया गया. उपचार की वर्तमान हालांकि सबसे अधिक इस्तेमाल किया विधिइसकी सतह 13,14 पर एक ऊतक बैंक और संस्कृति अंगीय उपकला कोशिकाओं से मानव एमनियोटिक झिल्ली का प्रयोग होता है. एक monolayer का गठन किया है एक बार, एमनियोटिक झिल्ली शल्य चिकित्सा से पहले इस सेल प्रत्यारोपण 14 करने के लिए इसे से हटा सभी नेत्रश्लेष्मला कोशिकाओं और निशान ऊतक है जो क्षतिग्रस्त कॉर्निया पर अप सेल साइड चिपके है. एमनियोटिक झिल्ली उपकला 15,16 पुनर्जीवित करने के लिए denuded क्षेत्र से जुड़ी उपकला कोशिकाओं छोड़ने के महीने के लिए सप्ताह के भीतर degrades. इस तकनीक हालांकि चिकित्सकीय इसके व्यापक तेज प्रतिबंधित जो कुछ व्यावहारिक मुद्दों पर अभी भी कर रहे हैं दृष्टि बहाल करने में सफल रहा है. एमनियोटिक झिल्ली मानव ऊतक है कि यह रोगियों पर सेल प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया जा रहा से पहले अच्छा ऊतक बैंकिंग प्रक्रियाओं का उपयोग स्क्रीनिंग से गुजरना करने की जरूरत है. इस स्क्रीनिंग केवल रोगों के संचरण के जोखिम को कम करती है, लेकिन यह पूरी तरह से 17 को खत्म नहीं कर सकते हैं. इस के अलावा पी में परिवर्तनशीलता की रिपोर्ट किया गया हैकारण इंटर दाता भिन्नता 18,19 और विभिन्न प्रसंस्करण विधियों 19,20 को एमनियोटिक झिल्ली की erformance. रोग संचरण का छोटा सा जोखिम के बगल शल्य चिकित्सा केन्द्रों सभी के लिए उपलब्ध नहीं अच्छी तरह से चलाने के ऊतक बैंकों, के लिए उपयोग करने के लिए आवश्यकता होती है.
एमनियोटिक झिल्ली अपेक्षाकृत सफल है, कार्निया की बीमारी के इलाज के लिए नई सिंथेटिक biodegradable सेल वाहक विकल्प के विकास के लिए एक की जरूरत है. सिंथेटिक वाहक प्रक्रियाओं बैंकिंग के रूप में अच्छी तरह से रोग संचरण और अंतर दाता परिवर्तनशीलता के छोटे जोखिम को नष्ट करने के लिए आवश्यकता को दूर करेगा. इस अर्थ में, इस तरह के पॉलीथीन ग्लाइकोल 21,22 और PLGA 23,24 के रूप में सामग्री का अध्ययन किया गया है.
मानव एमनियोटिक झिल्ली को एक सिंथेटिक विकल्प के विकास में उम्मीद है कि संवर्धित कोशिकाओं के अस्तित्व में मदद करने के लिए इसे में वांछित सुविधाओं डिजाइन करने के लिए वहाँ भी संभावना है. इंकसेल व्यवहार के विशिष्ट नियंत्रण के लिए biomaterial उपकरणों के भीतर microfeatures के lusion हित के एक उभरते क्षेत्र है. कृत्रिम स्टेम कोशिकाओं के विकास को 25-30 niches के प्रति कई लेखकों काम की सूचना दी है. इस समूह ने हाल ही में अंगीय उपकला कोशिकाओं 22 के वितरण और अंगीय उपकला कोशिकाओं 31 के समर्थन के लिए microfabricated जेब युक्त electrospun biodegradable झिल्ली के निर्माण के लिए एक पद्धति के लिए एक microfabricated PEGDA फ़ाइब्रोनेक्टिन-biofunctionalized कृत्रिम किनारी की रचना की सूचना दी है.
इस काम का उद्देश्य एक हद तक कोशिकाओं को शरीर में रहते स्टेम जिसमें microenvironments नकल जो microfeatures युक्त biomaterial उपकरणों के विकास के लिए एक नई विनिर्माण प्रौद्योगिकी विकसित करने का है. हम grea बताते हैं कि biodegradable microstructured झिल्ली के निर्माण की अनुमति देता है कि microstereolithography और electrospinning को जोड़ती है जो एक तकनीक विकसित की हैऊतक उत्थान अनुप्रयोगों के लिए टी संभावित.
यह इस काम में इस तकनीक का कार्निया उत्थान के लिए छल्ले का निर्माण करने के लिए लागू किया गया है, हालांकि, प्रौद्योगिकी उपकला ऊतकों की एक विस्तृत श्रृंखला के उत्थान, जैसे, त्वचा, मौखिक के लिए उपकरणों का निर्माण करने के लिए लागू किया जा सकता है कि सूचना के लिए महत्वपूर्ण है म्यूकोसा, आंत, श्वसन, और मूत्राशय epithelia. विशेष रूप से, इस अध्ययन में हम कॉर्निया कोशिकाओं देने के लिए एमनियोटिक झिल्ली को एक समान तरीके से काम करता है जो एक कृत्रिम biodegradable झिल्ली का विकास किया है. यह झिल्ली के आसपास 300 मीटर की micropockets शामिल ((बड़ा Vogt की Pallisades की अंगीय तहखाने से लगभग 150 मीटर)). अंत में, हम इन झिल्ली टूटने के कोई लक्षण दिखाने के बिना अधिक से अधिक 6 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर जमा होने की अनुमति देता है जो एक पैकेजिंग प्रोटोकॉल की स्थापना की है.
इस अध्ययन में उनके भीतर microfeatures युक्त electrospun झिल्ली का निर्माण और कैसे वैक्यूम पैकिंग, गामा विकिरण और फिर भंडारण से पहले का उपयोग करने से नैदानिक इस्तेमाल के लिए इस तरह की झिल्ली तैयार करने के लिए (ख) के लिए (एक) एक तकनीक का वर्णन है. इस विशेष आवेदन में हम अंगीय स्टेम सेल आलों की शारीरिक विशेषताओं की नकल जो micropockets युक्त PLGA झिल्ली का विकास किया है. इस अध्ययन का उद्देश्य (मैं) ऊतक उत्थान और (ii) एक बेहतर समझ के साथ पाठक प्रदान करने के लिए स्टेम सेल niches के योगदान में अनुसंधान के लिए microfeatures युक्त scaffolds के लिए डिजाइन और निर्माण के लिए आवश्यक ज्ञान के साथ पाठकों को उपलब्ध कराने के लिए विधियों का वर्णन करने के लिए कर रहे हैं के समय की लंबी अवधि के लिए electrospun scaffolds स्टोर करने के लिए कैसे.
नैदानिक आवेदन के संदर्भ में, अंगूठी झिल्ली का भंडारण सर्वोपरि महत्व का है. इस काम में, अंगूठी की गिरावट 6 महीने की अवधि में अध्ययन किया गया. की गिरावटझिल्ली बस नमी मुक्त प्रक्रिया रोक दी है झिल्ली रखकर इतना हाइड्रोलिसिस से प्रेरित है. ब्लैकवुड एट अल. पीजीए को पीएलए का अनुपात अलग से, झिल्ली की गिरावट 32 कि परिवर्तन की सूचना दी. इस अध्ययन में यह भी पीजीए की राशि बढ़ाने के द्वारा, electrospun झिल्ली की गिरावट की दर विवो 22 में वृद्धि दर्ज की गई. यहाँ यह निर्वात कुछ desiccant के साथ झिल्ली पैकिंग और उन्हें irradiating और 6 महीने के लिए कम तापमान पर उन्हें भंडारण के साथ, फाइबर अखंडता और गिरावट में कोई बदलाव नहीं आया है कि दिखाया गया है. वर्तमान में, 6 महीने के रूप में अब तक हम 1 वर्ष -20 डिग्री सेल्सियस 22 पर सादे electrospun झिल्ली पर सूचना दी और अब हम -20 डिग्री सेल्सियस पर उनके भंडारण के लिए अप्रकाशित जानकारी है किया गया है के लिए इन झिल्लियों micropockets लेकिन भंडारण डेटा को रोकने के साथ अध्ययन किया है के रूप में है गिरावट के कोई लक्षण के बिना 2 साल के लिए. इस प्रकार लंबी अवधि के भंडारण के लिए यह -20 पर उन्हें सूखी स्टोर करने के लिए सिफारिश की जाएगी6, सी, लेकिन यह (संभवतः बहुत लंबे समय तक) में कम से कम 6 महीने के लिए भी भारत में आरटी पर उन्हें स्टोर करने के लिए संभव है. एक नमी सूचक का समावेश पैकेजिंग वे प्रयोजन के लिए फिट हो जाएगा, जो मामले में सूखे की झिल्ली को रखा गया है कि जाँच के लिए एक आसान साधन देता है.
Micropockets भीतर अंगीय explants रखकर जब 3 डी कॉर्निया मॉडल को इन छल्लों से कोशिकाओं का स्थानांतरण दिखाया गया था. इस समूह ने हाल ही में सादे PLGA झिल्ली (अंगूठी संरचनाओं के बिना झिल्ली) 24 पर explants रखकर इन विट्रो खरगोश कॉर्निया मॉडल पर कोशिकाओं के हस्तांतरण की सूचना दी. वर्तमान microfabricated scaffolds सेल हस्तांतरण का उपयोग हम अब विशेष रूप से microfeatures भीतर ऊतक explants ढूँढ सकते हैं के रूप में एक कदम और आगे ले जाया गया है. आलों के भीतर सीधे explants जगह करने की क्षमता भी सर्जन पहली अंगीय स्टेम कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए एक cleanroom की जरूरत से बचने शल्य थिएटर में सीधे झिल्ली का उपयोग करने की अनुमति देता है. Wor के इस टुकड़े हालांकिकश्मीर कार्निया रोग के लिए उपकरणों के विकास पर ध्यान केंद्रित किया गया है, इस microfabrication तकनीक भी कई अन्य अनुप्रयोगों के लिए उपकरणों के विकास के लिए लागू किया जा सकता है. भविष्य के काम में इस तरह के त्वचा और हड्डी के रूप में अन्य ऊतकों के उत्थान के लिए निर्माणों के निर्माण का पता लगाने जाएगा.
PEGDA microstructures के डिजाइन और प्रारंभिक निर्माण समय लगता हो सकता है whilst, एक बार संरचनाओं गिरावट के बिना कई बार reused किया जा सकता गढ़े. इसलिए, electrospinning द्वारा PLGA microstructured biodegradable झिल्ली के बाद निर्माण कलेक्टर के विधानसभा निम्नलिखित सादा ('असंरचित') झिल्ली का उत्पादन करने के लिए एक तुलनीय दर पर किया जा सकता है. इस काम में हम नए नए साँचे fabricating के लिए microstereolithography का इस्तेमाल किया है हालांकि, इस तरह के 3 डी प्रिंटिंग या इंजेक्शन मोल्डिंग के रूप में अन्य निर्माण विधियों का भी इस्तेमाल किया जा सकता है. तदनुसार, अंतर्निहित ढालना पीई के बजाय अन्य पॉलिमर या धातु से बाहर किया जा सकता हैजीडीए. जैसे यह तकनीक बहुत बहुमुखी है और शोधकर्ताओं ने आसानी से अपनी जरूरतों और सुविधाओं के मैच के लिए विधि अनुकूलन कर सकते हैं.
30μm के तहत सुविधाओं के साथ निर्माणों की तैयारी की अनुमति नहीं होगी इस अध्ययन में इस्तेमाल घर में microstereolithography सेट अप; इस यहाँ वर्णित कॉर्निया आवेदन के लिए एक सीमा नहीं है, लेकिन यह अन्य मॉडल के डिजाइन में महत्वपूर्ण हो सकता है. यह मामला अन्य तकनीकों में इस तरह के रूप में 2 फोटॉन polymerization (2PP) हालांकि electrospinning तकनीक (यह वर्तमान में हमारे समूह द्वारा अध्ययन किया जा रहा है) उप माइक्रोन पैमाने पर संरचनाओं के प्रजनन की अनुमति नहीं हो सकता है ब्याज की हो सकती है.
निर्माण की प्रक्रिया के भीतर महत्वपूर्ण कदम समय और photoinitiator की मात्रा का समायोजन करके नियंत्रित किया जा सकता है, जो PEGDA टेम्पलेट्स के overcuring बचना (मैं) कर रहे हैं. (Ii) जैसे तापमान और आर्द्रता के रूप में electrospinning स्थितियों पर नियंत्रण. (Iii) उचित electrospu भंडारणवैक्यूम पैकिंग और desiccants का उपयोग n अंगूठी झिल्ली.
संक्षेप में, झिल्ली की microfeatures भीतर अंगीय ऊतक explants रखकर हम एक खरगोश घायल कॉर्निया और कॉर्निया के बाद फिर से epithelization पर आला क्षेत्रों, सेल हस्तांतरण पर explants से सेल परिणाम से पता चला है. अलग तापमान पर संग्रहित झिल्ली की गिरावट का भी अध्ययन किया गया है और झिल्ली की लंबी अवधि के भंडारण की अनुमति देता है जो एक पैकेजिंग प्रोटोकॉल नैदानिक इस्तेमाल के लिए झिल्ली के विकास में आवश्यक जा रहा है, बाद विकसित किया गया है.
The authors have nothing to disclose.
We gratefully acknowledge funding from the Wellcome Trust Affordable Healthcare for India and an EPSRC Landscape Fellowship for Ilida Ortega as well as contributions from The Electrospinning Company Ltd.
Name of reagents/material/equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Poly lactic-co-glycolic acid | Purac | PDLG5004 | |
Dichloromethane | Sigma Aldrich Or Fisher | 270997 Or D/1850/17 | >99.8% contains 50-150 ppm amylene stabiliser |
Digital Micromirror Device (DMD) Discovery 1100 Controller Board & Starter Kit | Texas Instruments | 1076N732 (UV) | |
473 nm Laser | Laser 2000 | MBL-III | 150 mW |
Poly (ethylene glycol) diacrylate | Sigma Aldrich | 475629 | Mn = 250g/mol 500 ml |
DEMEM + Glutamax | Fisher | 12077549 | |
Ham’ s F12 | Labtech biosera | LMH1236/500 | |
Fetal Bovine Serum | Labtech biosera | FB-1090/50 | |
EGF | R&D | 236-EG-200 | |
Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-1G | |
Amphotericin | Sigma Aldrich | A2942-100ml | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100ml | |
DAPI | Sigma Aldrich | 32670 | |
Propidium Iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
Thrombin | Sigma Aldrich | T9326 | |
Fibrinogen | Sigma Aldrich | F3879 | |
p63 | Sigma Aldrich | P3737 | |
CK3 | Merck Millipore | CLB218 | |
Hematoxylin | SLS | HHS16-500ML | |
Eosin | Sigma Aldrich | HT110232-1L | |
Medical grade bag (PET/Foil/LDPE) Peelable pouch | Riverside Medical Ltd. Derby, UK | Foil laminate PET/Foil/LDPE, (12,7,50) | |
gamma- irradiation (Sterilisation) | Applied Sterilisation Technologies (Synergy Health Laboratory Services (SHLS), Abergavenny UK) – external dose range of 25-40KGy | N/A | |
Silica gel orange | Sigma Aldrich | 10087 | |
Cobalt (II) chloride | Sigma Aldrich | 232696 | |
Copper (II) sulphate | Sigma-Aldrich | C-1297 | |
Six spot humidity indicator card | SCC, USA | 6HIC200 | |
Vacuum heat seal machine | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | VS518 | |
Andrew James Vacuum Sealer rolls 28cm X 40 metre rolls | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | BR2805 | |
Scanning Electron Microscopy (SEM) | Philips/FEI XL-20 SEM | N/A | |
Confocal Microscope | Zeiss LSM 510 META | N/A | |
Videne Antiseptic Solution | Ecolab, Swindon, UK | N/A | 3% |