我们报告的静电膜,用来研究细胞行为中micropockets的制造技术。具体地,我们描述了用于生产的PLGA(聚(丙交酯 – 共 – 乙))配备有微特征角膜生物材料的设备microstereolithography和静电纺丝的组合。
角膜问题影响全球数百万人减少了他们的生活质量显著。角膜疾病可以由疾病如无虹膜或史蒂芬约翰逊综合症以及由外部因素如化学烧伤或辐射引起的。目前的治疗是(i)使用的角膜移植物以及(ii)利用扩展在实验室和交付的载体( 例如 ,羊膜)干细胞;这些治疗都是比较成功的,但不幸的是,他们可以经过3-5年的失败。有必要设计和制造能够详细模拟,其中干细胞位于角膜的生理环境新角膜生物材料的设备。角膜缘干细胞存在于被称为沃格特的山花园具体龛(角膜和巩膜之间的圆形区域)的缘。在这项工作中,我们已经开发出一种新的平台技术,该技术结合了两种尖端的制造技术(microstereolithography和electrospinn荷兰国际集团),用于模仿在一定程度上角膜缘角膜膜的制造。我们的膜含有人工micropockets其目的是为细胞提供保护,沃格特的帕利塞德做的眼睛。
角膜,眼睛的缺血性中心外大多数组织,是涉及视力1的最重要的组织之一。有几种类型的细胞维持角膜的功能。角膜的顶部最外层包括上皮细胞,可以是在厚度2约5-7层。这层防止细菌侵入到角膜3,并允许氧气4的条目。据报道,该角膜上皮在于龛或隐窝(具有120-150微米大小)在被称为角膜缘5,6角膜的周边区域的干细胞。由于干细胞分裂,子细胞也被称为短暂扩充细胞行驶出龛,并为司继续在细胞移动向心向内和向上导致终末分化细胞在角膜中央区7,8。这些细胞经常擦去眼睛E的眨眼xposing新的细胞下方9。
除了 是上皮干细胞的位置,角膜缘也起着从角膜区域10保持血管的结膜走了作用。损害角膜缘可以通过热/化学烧伤,辐射和也遗传疾病10引起的。当此情况发生时,角膜缘屏障被分解使结膜细胞移动到角膜,血管化的区域,引起疼痛和失明的情况。该情况被称为角膜缘干细胞缺陷(LSCD)10。
不同的天然底物已被报告为可能的干细胞的载体用于辅助在角膜再生。例如,胶原基膜使用Dravida 等 11罗摩和他的同事12日报道在112例患者的研究中使用的纤维蛋白。在治疗的本但是最常用的方法是利用人类羊膜从组织库和文化角膜缘上皮细胞在其表面13,14。一旦单层形成,羊膜粘细胞面朝上到受损的角膜有所有的结膜细胞和疤痕组织从它这个细胞移植14前手术切除。星期内的羊膜降低到几个月留下附着在裸露面积以再生上皮15,16的上皮细胞。该技术已成功地恢复视力但仍然有其临床上限制了它的广泛摄取一些实际问题。由于羊膜是人体组织,它需要进行良好的用组织库的程序被用于对患者的细胞移植前筛查。这种筛选不仅降低了疾病传播的风险,但不能完全消除17。除了这已经有变化的,在p报告羊膜由于跨施主变异18,19和加工方法不同19,20 erformance。除了疾病传播的风险小有用于外科中心能够获得良好的运行组织库,而不是提供给所有的要求。
虽然羊膜是比较成功的,有必要对角膜疾病的治疗的新合成的生物可降解的细胞载体的替代品的开发。综合运营商将克服需要银行程序,以及消除疾病传播和跨捐助变性的风险小。在这个意义上说,材料,如聚乙二醇21,22和PLGA 23,24进行了研究。
在发展中的合成替代羊膜也有设计成其期望的功能,希望帮助培养的细胞的存活的可能性。政府间谈判在生物材料设备微特征为细胞行为的具体控制lusion感兴趣的新兴领域。许多作者报道工作,争取人工干细胞的发展龛25-30。这个小组最近报告创立了微加工PEGDA纤维连接蛋白biofunctionalized人工角膜缘的角膜缘上皮细胞22的交付和含微加工口袋角膜缘上皮细胞31的支持静电的生物降解膜的制作的方法。
这个工作的目的是开发一种新的制造技术用于容纳微特征的模拟的程度,其中干细胞存在于身体的微环境中的生物材料的设备的开发。我们已经开发出结合microstereolithography和静电纺丝的技术,它允许显示格雷亚可生物降解的微结构化的膜的制造中吨潜力的组织再生程序。
注意到,虽然在此工作此技术已经被应用到环角膜再生的制造中,该技术可以应用于器件的制造为各种上皮组织的再生, 例如 ,皮肤,口腔是很重要粘膜,肠,呼吸,和膀胱上皮细胞。具体地说,在该研究中,我们开发了一种合成的生物可降解的膜以相同的方式发挥功能的羊膜来提供细胞对角膜。该膜含有大约300微米micropockets(大于沃格特的Pallisades的角膜缘隐窝(约150微米))。最后,我们建立了封装协议,它允许存储这些膜在-20℃,6个月以上没有显示出崩溃的迹象。
这项研究描述了静电膜含在其中微特征的制造及(b)如何准备这类膜用于临床使用的真空包装,γ辐照,然后贮存在使用前(A)的技术。在这个特定的应用程序,我们已经开发出含micropockets的模仿角膜缘干细胞小生境的物理特性PLGA膜。本研究的目的是:(i)描述的方法,为读者提供设计和制作含有微特征的研究棚架成的干细胞小生境组织再生及(ii)提供一个更好地了解读者的贡献所需要的知识如何存储电纺支架的很长一段时间。
在临床应用方面,环膜的存储是极其重要的。在这项工作中,该环的降解进行了研究历时6个月。退化膜是通过水解只须保持无水分的过程中暂停该膜从动左右。黑木等人报告说,通过改变聚乳酸的比例PGA,膜的降解发生变化32。本研究还表明,通过提高PGA的量,电纺膜的降解速率在 体内 22增加。这里已经示出了用真空包装的膜连同一些干燥剂和照射它们,并将它们存储在低温下为6个月,没有在纤维完整性和降解没有发生变化。目前,6个月是因为我们已经研究了用含有micropockets但存储数据这些膜1年已报道在普通静电膜在-20℃下22,现在我们有未公布的数据的储存于-20℃下尽可能2年未降解的迹象。因此,对于长期贮存将被推荐给存储它们干燥,在-206,C,但有可能甚至在印度将它们存储在RT至少6个月(可能更长)。列入湿度指标给出检查包装一直保持膜干在这种情况下,他们将适合为目的的一种简单方法。
从这些环到3D模型角膜细胞的转移micropockets内放置角膜缘外植体时,被证明。该小组最近通过将植在普通PLGA膜(无膜环结构)24日报道转移细胞到体外兔角膜模型。使用本微构支架细胞移植已经采取了一步,因为我们现在特别是微特征中定位组织块。在壁龛内直接将外植体的能力,也可以让医生直接在手术影院避免了洁净室的需要首先扩大角膜缘干细胞使用的膜。虽然这片WOR的k具有集中在用于角膜疾病设备的发展,这种微细加工技术还可以应用于开发了许多其它的应用程序的设备。未来的工作将探索构建体的制造对其它组织如皮肤和骨的再生。
而PEGDA微结构的设计和最初的制造可能是耗时的,一旦制造的结构可以在不降低反复使用多次。因此,PLGA微结构的生物降解膜的通过电纺丝的后续制造可以以相同的速度收集器的装配如下进行,以生产纯(“非结构化”)膜。虽然在本工作中,我们已经使用microstereolithography用于制造模具,其它制造方法,例如三维印刷或注射成型,可以也使用。因此,底层的模具可以由PE制成的出其它的聚合物或金属的,而不是GDA。因此这种技术是非常灵活,研究人员可以很容易地适应方法,以符合自己的需求和设施。
在内部 microstereolithography设置在该研究中使用将不会允许与下30μm的特征的制备构建体;这不是对这里所描述的角膜应用的限制,但它可以是在其它型号的设计是至关重要的。在这种情况下,其他技术如2光子聚合(2PP)可能会感兴趣但是静电纺丝技术可能不允许在亚微米尺度的结构的再现(这是目前正在研究通过我们的组)。
制造过程中的关键步骤是:(i)避免的PEGDA模板,可以通过调整时间和光引发剂的量来控制的overcuring。 (ⅱ)控制电纺丝条件,例如温度和湿度。 (三)妥善保存的electrospu采用真空包装,干燥剂Ñ环膜。
总之,通过在膜的微特征内放置角膜缘组织的外植体,我们已经表明,从上的适当位置区域,小区转移的外植体的细胞生长到兔子受伤角膜和随后的再上皮化的角膜。存储在不同的温度下,膜的降解也进行了研究,并包装协议,它允许长期贮存的膜已被开发出来,后者是在发展中的膜用于临床使用是必不可少的。
The authors have nothing to disclose.
We gratefully acknowledge funding from the Wellcome Trust Affordable Healthcare for India and an EPSRC Landscape Fellowship for Ilida Ortega as well as contributions from The Electrospinning Company Ltd.
Name of reagents/material/equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Poly lactic-co-glycolic acid | Purac | PDLG5004 | |
Dichloromethane | Sigma Aldrich Or Fisher | 270997 Or D/1850/17 | >99.8% contains 50-150 ppm amylene stabiliser |
Digital Micromirror Device (DMD) Discovery 1100 Controller Board & Starter Kit | Texas Instruments | 1076N732 (UV) | |
473 nm Laser | Laser 2000 | MBL-III | 150 mW |
Poly (ethylene glycol) diacrylate | Sigma Aldrich | 475629 | Mn = 250g/mol 500 ml |
DEMEM + Glutamax | Fisher | 12077549 | |
Ham’ s F12 | Labtech biosera | LMH1236/500 | |
Fetal Bovine Serum | Labtech biosera | FB-1090/50 | |
EGF | R&D | 236-EG-200 | |
Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-1G | |
Amphotericin | Sigma Aldrich | A2942-100ml | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100ml | |
DAPI | Sigma Aldrich | 32670 | |
Propidium Iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
Thrombin | Sigma Aldrich | T9326 | |
Fibrinogen | Sigma Aldrich | F3879 | |
p63 | Sigma Aldrich | P3737 | |
CK3 | Merck Millipore | CLB218 | |
Hematoxylin | SLS | HHS16-500ML | |
Eosin | Sigma Aldrich | HT110232-1L | |
Medical grade bag (PET/Foil/LDPE) Peelable pouch | Riverside Medical Ltd. Derby, UK | Foil laminate PET/Foil/LDPE, (12,7,50) | |
gamma- irradiation (Sterilisation) | Applied Sterilisation Technologies (Synergy Health Laboratory Services (SHLS), Abergavenny UK) – external dose range of 25-40KGy | N/A | |
Silica gel orange | Sigma Aldrich | 10087 | |
Cobalt (II) chloride | Sigma Aldrich | 232696 | |
Copper (II) sulphate | Sigma-Aldrich | C-1297 | |
Six spot humidity indicator card | SCC, USA | 6HIC200 | |
Vacuum heat seal machine | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | VS518 | |
Andrew James Vacuum Sealer rolls 28cm X 40 metre rolls | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | BR2805 | |
Scanning Electron Microscopy (SEM) | Philips/FEI XL-20 SEM | N/A | |
Confocal Microscope | Zeiss LSM 510 META | N/A | |
Videne Antiseptic Solution | Ecolab, Swindon, UK | N/A | 3% |