Vi rapporterer en teknik til fremstilling af mikrolommer inden electrospun membraner til at studere celle adfærd. Specifikt beskrives en kombination af microstereolithography og elektrospinning til fremstilling af PLGA (poly (lactid-co-glycolid)) hornhinde biomateriale, som er udstyret med microfeatures.
Corneal problemer påvirker millioner af mennesker verden reducerer deres livskvalitet betydeligt. Hornhinde sygdom kan være forårsaget af sygdomme som aniridi eller Steven Johnsons syndrom samt af eksterne faktorer såsom kemiske forbrændinger eller stråling. Aktuelle behandlinger er (i) brugen af hornhinde transplantationer, og (ii) anvendelse af stamceller udvidet i laboratoriet og leveret transportvirksomheder (f.eks fosterhinde); disse behandlinger er relativt vellykket, men desværre kan de ikke efter 3-5 år. Der er behov for at designe og fremstille nye hornhinde biomateriale enheder i stand til at efterligne i detaljer det fysiologiske miljø, hvor stamcellerne opholde sig i hornhinden. Limbal stamceller er placeret i limbus (cirkulære område mellem hornhinden og sclera) i bestemte nicher kendt som Palisades af Vogt. I dette arbejde har vi udviklet en ny platform-teknologi, der kombinerer to avancerede fremstillingsteknikker (microstereolithography og electrospinning) til fremstilling af hornhinden membraner, der efterligner et vist omfang limbus. Vores membraner indeholder kunstige mikrolommer som har til formål at give cellerne med beskyttelse som Palisades af Vogt gøre i øjet.
Hornhinden, den avaskulære centrale yderste væv i øjet, er en af de mest vigtige væv, der er involveret i syn 1. Der er flere typer af celler, der opretholder funktionen af hornhinden. Den øverste yderste lag af hornhinden består af epitelceller, der kan være omkring 5-7 lag tykkelse 2. Dette lag forhindrer bakteriel invasion i hornhinden 3 og tillader optagelse af ilt 4. Det er blevet rapporteret, at stamceller hornhindeepitelet ligger i nicher eller krypter (med størrelser på 120-150 um) på det perifere område af hornhinden kaldes limbus 5,6. Som stamcellerne opdele de afledte celler også kendt som forbigående forstærkende celler rejse ud af nicher og som deling fortsætter cellerne bevæger sig centripetalt indad og opad resulterer i terminalt differentierede celler ved den centrale hornhinde område 7,8. Disse celler bliver rutinemæssigt tørres væk med blink i øjet exposing nyere celler under 9.
Ud over at være placeringen af de epiteliale stamceller limbus spiller også en rolle i at holde vaskulariserede bindehinde væk fra hornhinden område 10. Skader på limbus kan skyldes termisk / kemiske forbrændinger, stråling og også genetiske sygdomme 10. Når dette sker, er limbus barriere opdelt tillade konjunktivale celler til at flytte ind på hornhinden, vascularizing regionen, der forårsager smerte og blindhed i nogle tilfælde. Betingelsen er kendt som limbale stamcelle mangel (LSCD) 10.
Forskellige naturlige substrater er blevet rapporteret som mulige stamceller bærere til medvirken i hornhinde regenerering. For eksempel blev collagen-baserede membraner anvendes af Dravida et al. 11 og Rama og kolleger 12 rapporterede anvendelsen af fibrin i en undersøgelse med 112 patienter. Men på nuværende tidspunkt det mest almindeligt anvendte metode til behandlinger at bruge menneskelige fosterhinde fra en vævsbank og kultur limbal epitelceller på dens overflade 13,14. Når et monolag er dannet, fosterhinde limet celle opad på den beskadigede hornhinden som har alle de konjunktivale celler og arvæv kirurgisk fjernet fra det forud for denne celletransplantation 14. Den fosterhinde nedbrydes inden for uger til måneder forlader epitelceller er knyttet til det blottede område for at regenerere epitel 15,16. Denne teknik har været en succes med at genoprette vision, men der er stadig et par praktiske spørgsmål, der begrænser dens udbredte optagelse klinisk. Som den fosterhinde er humant væv er det nødvendigt at gennemgå screening ved hjælp af god væv bankprocedurer inden de anvendes til celle transplantation på patienter. Denne screening kun sænker risikoen for overførsel af sygdomme, men kan ikke helt fjerne den 17. Ud over dette har der været rapporter om variabilitet i PPFYLDELSE af fosterhinde grundet inter donor variation 18,19 og forskellige forarbejdningsmetoder 19,20. Ved siden af den lille risiko for overførsel af sygdomme der er kravet til kirurgiske centre skal have adgang til veldrevne vævsbanker, ikke er tilgængelige for alle.
Selvom fosterhinde er forholdsvis vellykket, er der behov for udvikling af nye syntetiske bionedbrydelige celle carrier alternativer til behandling af hornhinden sygdom. Syntetiske luftfartsselskaber vil kunne imødekomme behovet for bankprocedurer samt eliminere den lille risiko for overførsel af sygdomme og inter-donor variabilitet. I denne forstand har materialer såsom polyethylenglycol 21,22 og PLGA 23,24 undersøgt.
I udviklingen af en syntetisk alternativ til den menneskelige fosterhinde er der også mulighed for at designe ind i det ønskelige træk til forhåbentlig hjælpe overlevelsen af de dyrkede celler. Udtagningenlusion af microfeatures inden biomateriale indretninger til specifik styring af celle adfærd er en spirende område af interesse. Mange forfattere har rapporteret arbejde hen imod udviklingen af kunstige stamceller nicher 25-30. Denne gruppe har for nylig rapporteret om oprettelsen af et mikrofabrikeret PEGDA fibronectin-biofunctionalized kunstig limbus til levering af limbal epitelceller 22 og en metode til fremstilling af electrospun bionedbrydelige membraner indeholdende mikrofabrikerede lommer til støtte af limbal epitelceller 31.
Målet med dette arbejde er at udvikle en ny produktionsteknologi til udvikling af biomateriale apparater indeholdende microfeatures som efterligner et omfang de mikromiljøer, hvor stamceller opholde sig i kroppen. Vi har udviklet en teknik, der kombinerer microstereolithography og elektrospinning, der tillader fremstilling af biologisk nedbrydelige mikrostrukturerede membraner, der viser stot potentiale for vævsregeneration applikationer.
Det er vigtigt at bemærke, at selv om der i dette arbejde har denne teknik været anvendt til fremstilling af ringe til hornhinden regenerering, kan teknologien anvendes til fremstilling af anordninger til regenerering af en bred vifte af epitelvæv, fx hud, oral slimhinder, tarm, respiratoriske og blære epiteler. Specifikt i denne undersøgelse har vi udviklet en syntetisk bionedbrydelig membran, der fungerer på en måde svarende til den fosterhindemembranen at levere celler til hornhinden. Denne membran indeholder mikrolommer på omkring 300 um (større end de limbal krypter af Pallisades af Vogt (omkring 150 um)). Endelig har vi etableret en emballage protokol, som tillader disse membraner skal opbevares ved -20 ° C i mere end 6 måneder uden at vise nogen tegn på nedbrydning.
Denne undersøgelse beskriver (a) en teknik til fremstilling af electrospun membraner indeholdende microfeatures i dem og (b), hvordan man forbereder sådanne membraner til klinisk brug ved vakuum pakning, gammastråling og derefter opbevaring før brug. I denne særlige anvendelse har vi udviklet PLGA membraner indeholdende mikrolommer der efterligner de fysiske træk ved de limbal stamcelle nicher. Formålene med denne undersøgelse er (i) at beskrive metoder til at give læserne med den nødvendige viden til at designe og fabrikere stilladser indeholder microfeatures til forskning i bidrag stamceller nicher til vævsregenerering og (ii) at give læseren en bedre forståelse af, hvordan man opbevarer electrospun stilladser i lange perioder.
Med hensyn til klinisk anvendelse, oplagring af ringen membraner er af afgørende betydning. I dette arbejde blev nedbrydningen af ringen undersøgt over en periode på 6 måneder. Nedbrydning afmembraner er drevet ved hydrolyse ved bare at holde membranerne fugtfri processen standset. Blackwood et al. Rapporterede, at ved at variere forholdet PLA PGA nedbrydningen af membranen ændrer 32. Denne undersøgelse viste også, at ved at øge mængden af PGA nedbrydningshastigheden af electrospun membraner forøget in vivo 22. Her er det blevet vist, at med vakuum pakning membranerne sammen med nogle tørremiddel og bestråle dem og opbevare dem ved lave temperaturer for 6 måneder, er der ingen ændring i fiberen integritet og nedbrydning. På nuværende tidspunkt, 6 måneder er så vidt vi har studeret med disse membraner indeholdende mikrolommer men lagring af data i 1 år er blevet rapporteret på almindeligt electrospun membraner ved -20 ° C 22 og vi har nu upublicerede data for deres opbevaring ved -20 ° C i 2 år uden tegn på nedbrydning. Således langtidsopbevaring det ville blive anbefalet at gemme dem tørre ved -206, C, men det er muligt at opbevare dem ved stuetemperatur, selv i Indien i mindst 6 måneder (muligvis meget længere). Inddragelsen af en fugtighed indikator giver et let middel til at kontrollere, at emballagen har holdt membraner tørre i hvilket tilfælde de vil være egnet til formålet.
Overførsel af celler fra disse ringe til 3D hornhinde-modeller blev vist, når du placerer limbal eksplantater indenfor mikrolommer. Denne gruppe nylig rapporteret overførsel af celler på en in vitro-kanin cornea model ved at placere eksplantater på almindeligt PLGA membraner (membraner uden ringstrukturer) 24. Brug af nuværende mikrofabrikerede stilladser celleoverførsel er taget et skridt videre, da vi kan nu specifikt lokalisere vævseksplantater indenfor microfeatures. Evnen til at placere eksplantaterne direkte i nicherne giver også kirurgen at anvende membranerne direkte i operationsstue undgå behovet for en renrum først udvide limbal stamceller. Selv om dette stykke arbejdk har været fokuseret på udviklingen af anordninger til hornhinde sygdom, kan denne mikrofabrikation teknologien også anvendes til udvikling af udstyr til mange andre applikationer. Det fremtidige arbejde vil undersøge fremstillingen af konstruktioner for regenerering af andre væv, såsom hud og knogle.
Selv om udformningen og den indledende fremstilling af PEGDA mikrostrukturer kan være meget tidskrævende, når fabrikeret strukturer kan genanvendes mange gange uden nedbrydning. Derfor kan den efterfølgende fremstilling af PLGA mikrostruktureret bionedbrydelige membraner ved electrospinning udføres på en sammenlignelig sats på produktion af glatte (»ustrukturerede«) membraner efter montering af solfangeren. Selv om vi i dette arbejde har brugt microstereolithography til fremstilling formene, kan andre fremstillingsmetoder såsom 3D-print eller sprøjtestøbning også anvendes. Følgelig kunne den underliggende skimmel være lavet af andre polymerer eller metaller i stedet for PEGDA. Som sådan denne teknik er meget alsidig og forskerne kan nemt tilpasse den metode, der passer til deres egne behov og faciliteter.
Den interne microstereolithography set-up, der anvendes i denne undersøgelse vil ikke tillade fremstillingen af konstruktioner med funktioner under 30 um; dette er ikke en begrænsning for den corneale anvendelse her beskrevet, men det kan være af afgørende betydning i udformningen af andre modeller. I så fald andre teknikker såsom 2 foton polymerisation (2PP) kunne være af interesse dog elektrospinningsprocessen teknik kan ikke tillade reproduktion af strukturer på sub-micron skala (dette er i øjeblikket ved at blive undersøgt af vores gruppe).
Kritiske trin i fremstillingsprocessen er (i) Undgå overcuring af PEGDA skabeloner, som kan kontrolleres ved at justere tid og mængder af fotoinitieringsmiddel. (Ii) Styring Electrospinning betingelser, såsom temperatur og fugtighed. (Iii) Lagring på passende electrospun ring membraner ved hjælp af vakuum-pakning og tørremidler.
Sammenfattende vi ved at placere limbal vævseksplantater inden microfeatures af membranen har vist celleudgroning fra eksplantaterne på nicher, overførsel celle på en kanin sårede hornhinde og efterfølgende re-epitelisering af hornhinden. Nedbrydningen af de membraner, der er lagret ved forskellige temperaturer er også blevet undersøgt, og en emballage protokol, som tillader langtidslagring af membraner er blevet udviklet, som er nødvendigt at udvikle membraner til klinisk brug.
The authors have nothing to disclose.
We gratefully acknowledge funding from the Wellcome Trust Affordable Healthcare for India and an EPSRC Landscape Fellowship for Ilida Ortega as well as contributions from The Electrospinning Company Ltd.
Name of reagents/material/equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Poly lactic-co-glycolic acid | Purac | PDLG5004 | |
Dichloromethane | Sigma Aldrich Or Fisher | 270997 Or D/1850/17 | >99.8% contains 50-150 ppm amylene stabiliser |
Digital Micromirror Device (DMD) Discovery 1100 Controller Board & Starter Kit | Texas Instruments | 1076N732 (UV) | |
473 nm Laser | Laser 2000 | MBL-III | 150 mW |
Poly (ethylene glycol) diacrylate | Sigma Aldrich | 475629 | Mn = 250g/mol 500 ml |
DEMEM + Glutamax | Fisher | 12077549 | |
Ham’ s F12 | Labtech biosera | LMH1236/500 | |
Fetal Bovine Serum | Labtech biosera | FB-1090/50 | |
EGF | R&D | 236-EG-200 | |
Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-1G | |
Amphotericin | Sigma Aldrich | A2942-100ml | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100ml | |
DAPI | Sigma Aldrich | 32670 | |
Propidium Iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
Thrombin | Sigma Aldrich | T9326 | |
Fibrinogen | Sigma Aldrich | F3879 | |
p63 | Sigma Aldrich | P3737 | |
CK3 | Merck Millipore | CLB218 | |
Hematoxylin | SLS | HHS16-500ML | |
Eosin | Sigma Aldrich | HT110232-1L | |
Medical grade bag (PET/Foil/LDPE) Peelable pouch | Riverside Medical Ltd. Derby, UK | Foil laminate PET/Foil/LDPE, (12,7,50) | |
gamma- irradiation (Sterilisation) | Applied Sterilisation Technologies (Synergy Health Laboratory Services (SHLS), Abergavenny UK) – external dose range of 25-40KGy | N/A | |
Silica gel orange | Sigma Aldrich | 10087 | |
Cobalt (II) chloride | Sigma Aldrich | 232696 | |
Copper (II) sulphate | Sigma-Aldrich | C-1297 | |
Six spot humidity indicator card | SCC, USA | 6HIC200 | |
Vacuum heat seal machine | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | VS518 | |
Andrew James Vacuum Sealer rolls 28cm X 40 metre rolls | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | BR2805 | |
Scanning Electron Microscopy (SEM) | Philips/FEI XL-20 SEM | N/A | |
Confocal Microscope | Zeiss LSM 510 META | N/A | |
Videne Antiseptic Solution | Ecolab, Swindon, UK | N/A | 3% |