Wij rapporteren een methode voor de fabricage van micropockets binnen electrospun membranen waarin celgedrag te bestuderen. Specifiek beschrijven we een combinatie van microstereolithography en elektrospinnen voor de productie van PLGA (poly (lactide-co-glycolide)) corneale biomateriaal inrichtingen voorzien microfeatures.
Hoornvlies problemen invloed hebben miljoenen mensen wereldwijd het verminderen van hun kwaliteit van leven aanzienlijk. Cornea ziekte kan worden veroorzaakt door ziekten zoals Aniridia of Steven Johnson syndroom als door externe factoren zoals chemische brandwonden of straling. Huidige behandelingen zijn (i) het gebruik van cornea transplantaten en (ii) het gebruik van stamcellen uitgebreid in het laboratorium en uitgebracht op dragers (bijvoorbeeld amniotische membraan); deze behandelingen zijn relatief succesvol, maar helaas kunnen ze niet na 3-5 jaar. Er moet ontwerpen en vervaardigen van nieuwe cornea biomateriaal inrichtingen kunnen nabootsen in detail de fysiologische omgeving waarin stamcellen in de cornea bevinden. Limbale stamcellen zijn gelegen in de limbus (cirkelvormige gebied tussen cornea en sclera) specifieke niches zogenaamde Palisades van Vogt. In dit werk hebben we een nieuw platform technologie die twee geavanceerde productietechnieken (microstereolithography en electrospinn combineert ontwikkelding) voor de vervaardiging van corneale membranen nabootsen die tot op zekere hoogte de limbus. Onze membranen bevatten kunstmatige micropockets die tot doel hebben de cellen te voorzien van bescherming als de Palisades van Vogt doen in het oog.
Het hoornvlies, de centrale avasculaire buitenste weefsel van het oog, is een van de belangrijkste weefsels betrokken visie 1. Er zijn verschillende types van cellen die de functie van de cornea te behouden. De bovenste buitenste laag van het hoornvlies bestaat uit epitheelcellen die ongeveer 5-7 lagen in dikte 2. Deze laag voorkomt bacteriële invasie in de cornea 3 en maakt toegang van zuurstof 4. Vermeld is dat de stamcellen van het hoornvliesepitheel liggen in nissen of crypten (met afmetingen van 120-150 urn) en omtreksgebied van de cornea zogenaamde limbus 5,6. Omdat de stamcellen verdelen, de dochter cellen ook wel bekend als voorbijgaande versterkend cellen reizen uit de niches en als divisie blijft de cellen bewegen centripetaal naar binnen en naar boven resulteert in terminaal gedifferentieerde cellen in het centrale hoornvlies regio 7,8. Deze cellen worden routinematig veegde met het knipperen van het oog exposing nieuwere cellen eronder 9.
Naast het feit dat de locatie van de epitheliale stamcellen, speelt de limbus een rol om de gevasculariseerde conjunctiva weg van het hoornvlies regio 10. Schade aan de limbus kan worden veroorzaakt door thermische / chemische brandwonden, straling en ook genetische ziekten 10. Wanneer dit gebeurt, is de limbus barrière afgebroken waardoor de bindvliescellen te gaan naar het hoornvlies, vascularizing de regio, waardoor pijn en blindheid in sommige gevallen. De aandoening staat bekend als limbale stamcel deficiëntie (LSCD) 10.
Verschillende natuurlijke substraten zijn gemeld als mogelijk stamcellen dragers voor hulp bij cornearegeneratie. Zo werden op collageen gebaseerde membranen door Dravida et al. 11 en Rama en medewerkers 12 gerapporteerd gebruik van fibrine in een studie met 112 patiënten. Momenteel is echter de meest gebruikte behandelingsmethodeis voor de menselijke amnionmembraan gebruiken van een weefselbank en cultuur limbal epitheelcellen aan het oppervlak 13,14. Zodra een monolaag heeft gevormd, wordt de amnionmembraan gelijmd cel-kant naar boven op het beschadigde hoornvlies waarin alle bindvliescellen en littekenweefsel operatief verwijderd uit het voorafgaand aan deze stamceltransplantatie 14 heeft. De amnionmembraan degradeert binnen weken tot maanden waarbij de epitheelcellen aan het blootgelegde gebied om het epitheel 15,16 regenereren. Deze techniek is succesvol in het herstellen van visie geweest maar er zijn nog een paar praktische zaken die de grootschalige introductie klinisch beperken. Zoals de amnionmembraan is menselijk weefsel moet het ondergaan screening met behulp van goede weefsel bankprocedures voordat het wordt gebruikt voor de stamceltransplantatie op patiënten. Deze screening verlaagt alleen het risico van overdracht van ziekten, maar kan niet volledig elimineren 17. Daarnaast zijn er meldingen van variabiliteit in de p geweestRendementen van de amnionmembraan vanwege inter donor variatie 18,19 en verschillende verwerkingsmethoden 19,20. Naast het kleine risico van overdracht van ziekten is er de eis voor chirurgische centra om de toegang tot goed geleide weefselbanken, die niet voor iedereen beschikbaar zijn.
Hoewel het amniotische membraan relatief succesvol is, er een behoefte aan de ontwikkeling van nieuwe synthetische biologisch afbreekbare celdrager alternatieven voor de behandeling van ziekte van het hoornvlies. Synthetische dragers zou overwinnen van de behoefte aan bancaire procedures, alsmede het elimineren van de kleine risico van overdracht van ziekten en inter-donor variabiliteit. In deze zin zijn materialen zoals polyethyleenglycol 21,22 en 23,24 PLGA onderzocht.
Bij de ontwikkeling van een synthetisch alternatief voor de humane amniotische membraan is ook de mogelijkheid te ontwerpen erin gewenste eigenschappen om hopelijk de overleving van de gekweekte cellen. Het inclusion van microfeatures binnen biomateriaal apparaten voor de specifieke controle van de cel gedrag is een opkomend gebied van belang. Veel auteurs hebben gemeld werken aan de ontwikkeling van kunstmatige stamcellen niches 25-30. Deze groep heeft onlangs melding gemaakt van het ontstaan van een microfabricated PEGDA-fibronectine biofunctionalized kunstmatige limbus voor de levering van limbale epitheliale cellen 22 en een methodologie voor de fabricage van elektrogesponnen biologisch afbreekbare membranen die microfabricated zakken voor de ondersteuning van limbale epitheelcellen 31.
Het doel van dit werk is een nieuwe productietechnologie te ontwikkelen voor de ontwikkeling van hulpmiddelen die biomateriaal microfeatures die nabootsen in een mate waarin de micro-omgevingen stamcellen in het lichaam bevinden. We hebben een techniek die microstereolithography en elektrospinnen combineert dat de fabricage van biologisch afbreekbare microstructured membranen die gewel tonen toelaat ontwikkeldt potentieel voor weefselregeneratie toepassingen.
Het is belangrijk te noteren dat, hoewel in dit werk deze techniek is toegepast op de vervaardiging van ringen voor cornearegeneratie kan de technologie worden toegepast op de vervaardiging van inrichtingen voor de regeneratie van een breed scala van epitheliale weefsels, zoals huid, orale slijmvliezen, darmen, luchtwegen, en de blaas epitheel. Specifiek, in dit onderzoek hebben we een synthetisch biologisch afbreekbaar membraan dat functioneert op soortgelijke wijze als de amnionmembraan cellen leveren aan het hoornvlies ontwikkeld. Dit membraan bevat micropockets van ongeveer 300 micrometer (groter dan de limbale crypten van de Pallisades van Vogt (ongeveer 150 pm)). Tenslotte hebben wij een verpakking protocol waarmee deze membranen bij -20 ° C gedurende meer dan 6 maanden worden bewaard zonder enige tekenen van afbraak vastgesteld.
Deze studie beschrijft (a) een techniek voor de fabricage van membranen die electrospun microfeatures in hen en (b) hoe dergelijke membranen bereiden voor klinisch gebruik door vacuüm verpakken, gammastraling en vervolgens opslag vóór gebruik. In deze specifieke toepassing kennen wij PLGA membranen die micropockets die de fysische eigenschappen van de limbale stamcellen niches nabootsen ontwikkeld. De doelstellingen van deze studie zijn (i) om methoden te beschrijven om de lezers met de kennis die nodig is om steigers met microfeatures voor onderzoek te ontwerpen en te fabriceren naar de bijdrage van stamcellen niches naar weefselregeneratie en (ii) om de lezer een beter inzicht te bieden te bieden hoe electrospun scaffolds slaan voor langere tijd.
In termen van klinische toepassing, de opslag van de ring membranen is van het grootste belang. In dit werk, de afbraak van de ring werd bestudeerd gedurende een periode van 6 maanden. Degradatie van demembranen wordt door hydrolyse, zodat door eenvoudig houden van de membranen vochtvrij het proces wordt gestopt. Blackwood et al. Gemeld dat door variatie van de verhouding van PLA PGA, de afbraak van het membraan verandert 32. Deze studie werd gevonden dat door de hoeveelheid van PGA, de afbraaksnelheid van electrospun membranen verhoogde in vivo 22. Hier is aangetoond dat bij vacuümverpakking de membranen samen met enkele droogmiddel en ze te bestralen en bewaring bij lage temperaturen gedurende 6 maanden is er geen verandering in de vezel integriteit en afbraak. Momenteel 6 maanden zover wij hebben bestudeerd deze membranen die micropockets maar opslaggegevens 1 jaar gemeld op effen electrospun membranen bij -20 ° C 22 Wij hebben nu ongepubliceerde data voor de opslag bij -20 ° C 2 jaar zonder tekenen van degradatie. Dus voor lange termijn opslag zou worden aanbevolen om ze droog te bewaren bij -206, C maar het is mogelijk om te slaan bij kamertemperatuur zelfs India ten minste 6 maanden (mogelijk veel langer). De opname van een luchtvochtigheid indicator geeft een eenvoudig middel om te controleren of de verpakking membranen droog in welk geval zij geschikt zijn voor het doel zal zijn heeft gehouden.
Overdracht van de cellen van deze ringen om 3D-modellen hoornvlies werd getoond bij het plaatsen van limbal explants binnen de micropockets. Deze groep rapporteerde onlangs overdracht van cellen op een in vitro konijn hoornvlies model door het plaatsen explants op gewoon PLGA membranen (vliezen zonder ring structuren) 24. Met behulp van de huidige microfabricated steigers cel overdracht is genomen een stap verder als we kunnen nu specifiek lokaliseren weefselexplantaten binnen de microfeatures. De mogelijkheid om de explantaten direct in de niches plaats maakt ook de chirurg de membranen direct gebruik in de operatiezaal vermijden van de noodzaak van een cleanroom eerste uitbreiding van de limbale stamcellen. Hoewel dit stuk van de WORk is gericht op de ontwikkeling van inrichtingen voor corneale ziekte, kan deze microfabricagetechnologie ook toegepast voor het ontwikkelen van inrichtingen voor vele andere toepassingen. Verder onderzoek zal de fabricage van constructen staand voor de regeneratie van andere weefsels zoals huid en botten.
Hoewel het ontwerp en de fabricage van de oorspronkelijke PEGDA microstructuren tijdrovend kan zijn, wanneer de structuren vervaardigd kunnen vele malen worden hergebruikt zonder kwaliteitsverlies. Derhalve kan de daaropvolgende fabricage van PLGA microgestructureerde afbreekbare membranen door electrospinning na inbouw van een collector worden uitgevoerd bij een vergelijkbare snelheid om de productie van gladde (ongestructureerde) membranen. Hoewel in dit onderzoek hebben wij gebruik microstereolithography voor het vervaardigen van de matrijzen kunnen andere fabricagemethoden zoals 3D-printen of spuitgieten worden gebruikt. Bijgevolg kan de onderliggende vorm van andere polymeren of metalen worden in plaats van PEGDA. Als zodanig is deze techniek is zeer veelzijdig en onderzoekers kunnen eenvoudig de methode om hun eigen behoeften en faciliteiten passen aan te passen.
De eigen microstereolithography opstelling in deze studie wordt de bereiding van constructen faciliteiten onder 30 urn niet toestaan; dit is geen beperking voor de corneale toepassing beschreven maar belangrijk in het ontwerp van andere modellen kunnen zijn. In dat geval andere technieken kan zoals 2 foton polymerisatie (2PP) van belang zijn echter de electrospinning techniek zou niet toestaan dat de reproductie van structuren op de sub-micron schaal (dit wordt momenteel onderzocht door onze groep).
Kritische stappen in het fabricage proces (i) voorkomen dat de overcuring van de PEGDA templates die kan worden geregeld door het aanpassen van tijd en hoeveelheid foto-initiator. (Ii) Instellen electrospinning zoals temperatuur en vochtigheid. (Iii) Het opslaan van de juiste wijze van de electrospun ring membranen met behulp van vacuüm-verpakking en droogmiddelen.
Samenvattend, door het plaatsen van limbale weefselexplantaten binnen de microfeatures van het membraan we aangetoond cel uitgroei van de explantaten op niches, celoverdracht naar een konijn verwond hoornvlies en daaropvolgende re-epithelisatie van het hoornvlies. De afbraak van de membranen opgeslagen bij verschillende temperaturen is ook bestudeerd en een verpakking protocol dat langetermijnopslag van membranen maakt ontwikkeld, de laatste is essentieel ontwikkeling membranen voor klinisch gebruik.
The authors have nothing to disclose.
We gratefully acknowledge funding from the Wellcome Trust Affordable Healthcare for India and an EPSRC Landscape Fellowship for Ilida Ortega as well as contributions from The Electrospinning Company Ltd.
Name of reagents/material/equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Poly lactic-co-glycolic acid | Purac | PDLG5004 | |
Dichloromethane | Sigma Aldrich Or Fisher | 270997 Or D/1850/17 | >99.8% contains 50-150 ppm amylene stabiliser |
Digital Micromirror Device (DMD) Discovery 1100 Controller Board & Starter Kit | Texas Instruments | 1076N732 (UV) | |
473 nm Laser | Laser 2000 | MBL-III | 150 mW |
Poly (ethylene glycol) diacrylate | Sigma Aldrich | 475629 | Mn = 250g/mol 500 ml |
DEMEM + Glutamax | Fisher | 12077549 | |
Ham’ s F12 | Labtech biosera | LMH1236/500 | |
Fetal Bovine Serum | Labtech biosera | FB-1090/50 | |
EGF | R&D | 236-EG-200 | |
Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-1G | |
Amphotericin | Sigma Aldrich | A2942-100ml | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100ml | |
DAPI | Sigma Aldrich | 32670 | |
Propidium Iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
Thrombin | Sigma Aldrich | T9326 | |
Fibrinogen | Sigma Aldrich | F3879 | |
p63 | Sigma Aldrich | P3737 | |
CK3 | Merck Millipore | CLB218 | |
Hematoxylin | SLS | HHS16-500ML | |
Eosin | Sigma Aldrich | HT110232-1L | |
Medical grade bag (PET/Foil/LDPE) Peelable pouch | Riverside Medical Ltd. Derby, UK | Foil laminate PET/Foil/LDPE, (12,7,50) | |
gamma- irradiation (Sterilisation) | Applied Sterilisation Technologies (Synergy Health Laboratory Services (SHLS), Abergavenny UK) – external dose range of 25-40KGy | N/A | |
Silica gel orange | Sigma Aldrich | 10087 | |
Cobalt (II) chloride | Sigma Aldrich | 232696 | |
Copper (II) sulphate | Sigma-Aldrich | C-1297 | |
Six spot humidity indicator card | SCC, USA | 6HIC200 | |
Vacuum heat seal machine | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | VS518 | |
Andrew James Vacuum Sealer rolls 28cm X 40 metre rolls | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | BR2805 | |
Scanning Electron Microscopy (SEM) | Philips/FEI XL-20 SEM | N/A | |
Confocal Microscope | Zeiss LSM 510 META | N/A | |
Videne Antiseptic Solution | Ecolab, Swindon, UK | N/A | 3% |