Riportiamo una tecnica per la realizzazione di micropockets all'interno membrane elettrofilate in cui studiare il comportamento delle cellule. In particolare, si descrive una combinazione di microstereolithography e elettrofilatura per la produzione di PLGA (Poly (lattide-co-glicolico)) dispositivi biomateriale corneali dotati microfeatures.
Problemi corneali colpiscono milioni di persone in tutto il mondo riducendo la loro qualità di vita in modo significativo. Malattia corneale può essere causata da malattie come l'aniridia o sindrome di Steven Johnson, nonché da fattori esterni come le ustioni chimiche o radiazioni. I trattamenti attuali sono (i) l'uso di innesti corneali e (ii) l'uso di cellule staminali espanso in laboratorio e consegnato su supporti (per esempio, membrana amniotica); questi trattamenti sono relativamente di successo, ma purtroppo possono fallire dopo 3-5 anni. Vi è la necessità di progettare e realizzare nuovi dispositivi biomateriale corneale in grado di imitare in dettaglio l'ambiente fisiologico in cui le cellule staminali risiedono nella cornea. Cellule staminali limbari si trovano nel limbus (zona circolare tra cornea e sclera) in nicchie specifiche conosciute come le palizzate di Vogt. In questo lavoro abbiamo sviluppato una nuova tecnologia di piattaforma che combina due tecniche di produzione all'avanguardia (microstereolithography e electrospinnzione) per la fabbricazione di membrane corneali che imitano una certa misura limbus. Le nostre membrane contengono micropockets artificiali che mirano a fornire le cellule con una protezione come il Palisades di Vogt fare l'occhio.
La cornea, il più esterno del tessuto avascolare centrale dell'occhio, è uno dei più importanti tessuti coinvolti nella visione 1. Ci sono diversi tipi di cellule che mantengono la funzione della cornea. Lo strato superiore più esterno della cornea si compone di cellule epiteliali che possono essere di circa 5-7 strati di spessore 2. Questo strato impedisce invasione batterica nella cornea 3 e permette l'ingresso di ossigeno 4. E 'stato riportato che le cellule staminali dell'epitelio corneale trovano in nicchie o cripte (con dimensioni di 120-150 micron) alla regione periferica della cornea conosciuta come limbus 5,6. Come le cellule staminali si dividono, le cellule figlie noto anche come celle di amplificazione transitori viaggiare fuori delle nicchie e la divisione continua le cellule si muovono centripeto verso l'interno e verso l'alto con conseguente cellule terminalmente differenziate in corrispondenza della zona corneale centrale 7,8. Queste cellule sono normalmente spazzati via con un batter d'occhio exposing nuove cellule sotto 9.
Oltre ad essere la posizione delle cellule staminali epiteliali, limbus gioca anche un ruolo nel mantenere la congiuntiva vascolarizzato dalla regione cornea 10. Danni al limbus potrebbe essere causato da ustioni termiche / chimiche, radiazioni e anche malattie genetiche 10. Quando questo accade, la barriera limbus è ripartito permettendo alle cellule congiuntivali per spostare sulla cornea, vascolarizzante la regione, causando dolore e cecità, in alcuni casi. La condizione è nota come deficit di cellule staminali limbari (LSCD) 10.
Diversi substrati naturali sono stati segnalati come possibili vettori di cellule staminali per aiutare nella rigenerazione della cornea. Ad esempio, le membrane a base di collagene sono stati utilizzati da Dravida et al. 11 e Rama e collaboratori 12 hanno riportato l'uso di fibrina in uno studio con 112 pazienti. Attualmente però il metodo più comunemente usato di trattamentoè quello di utilizzare la membrana amniotica umana da una banca di tessuti e cellule epiteliali limbari cultura sulla sua superficie 13,14. Dopo un monostrato è formata, la membrana amniotica è incollato cella rivolta verso l'alto sulla cornea danneggiata che ha tutte le cellule congiuntivali e tessuto cicatriziale chirurgicamente rimosso da esso prima di questo trapianto di cellule 14. La membrana amniotica degrada nel giro di settimane o mesi lasciando le cellule epiteliali attaccate alla zona denudato per rigenerare l'epitelio 15,16. Questa tecnica ha avuto successo nel ripristinare la visione ma ci sono ancora alcune questioni pratiche che restringono la sua capillare diffusione clinicamente. Poiché la membrana amniotica è tessuto umano ha bisogno di sottoporsi a screening utilizzando buone procedure bancarie tessuto prima di essere utilizzato per il trapianto di cellule su pazienti. Questo lo screening riduce solo il rischio di trasmissione di malattie, ma non può eliminare completamente 17. Oltre a questo ci sono state segnalazioni di variabilità nel prestazioni della membrana amniotica a causa della variazione dei donatori tra 18,19 e diversi metodi di lavorazione 19,20. Accanto al piccolo rischio di trasmissione della malattia vi è l'obbligo per i centri chirurgici di avere accesso alle banche dei tessuti ben gestite, non sono disponibili a tutti.
Sebbene la membrana amniotica è relativamente efficace, è necessario per lo sviluppo di nuove alternative sintetiche biodegradabili carrier cella per il trattamento della malattia corneale. Vettori sintetici potrebbero eliminare la necessità di procedure bancarie, nonché eliminando il piccolo rischio di trasmissione di malattie e di variabilità inter-donatore. In questo senso, materiali come polietilene glicole 21,22 e 23,24 PLGA sono stati studiati.
Nello sviluppo di una alternativa di sintesi alla membrana amniotica umana vi è anche la possibilità di progettare in esso caratteristiche desiderabili per aiutare spera la sopravvivenza delle cellule in coltura. Il inclusion di microfeatures all'interno di dispositivi di biomateriali per il controllo specifico del comportamento delle cellule è un settore emergente di interesse. Molti autori hanno riportato il lavoro verso lo sviluppo di cellule staminali artificiali nicchie 25-30. Questo gruppo ha recentemente segnalato la creazione di un PEGDA limbo artificiale microfabbricazione fibronectina-biofunctionalized per la consegna delle cellule epiteliali limbari 22 e una metodologia per la realizzazione di membrane biodegradabili elettrofilate contenenti tasche microfabbricati per il sostegno delle cellule epiteliali limbari 31.
Lo scopo di questo lavoro è quello di sviluppare una nuova tecnologia di produzione per lo sviluppo di dispositivi biomateriali contenenti microfeatures che imitano in misura i microambienti in cui le cellule staminali risiedono nel corpo. Abbiamo sviluppato una tecnica che combina microstereolithography e elettrofilatura che permette la realizzazione di membrane microstrutturate biodegradabili che mostrano Great potenziale per le applicazioni di rigenerazione dei tessuti.
È importante notare che, sebbene in questo lavoro questa tecnica è stata applicata alla fabbricazione di anelli per la rigenerazione della cornea, la tecnologia può essere applicata alla fabbricazione di dispositivi per la rigenerazione di una vasta gamma di tessuti epiteliali, ad esempio, la pelle, orale epiteli mucosa, intestino, delle vie respiratorie, e della vescica. In particolare, in questo studio abbiamo sviluppato una membrana biodegradabile sintetico che funziona in modo simile alla membrana amniotica per fornire cellule alla cornea. Questa membrana contiene micropockets di circa 300 micron (più grandi delle cripte limbari dei Pallisades di Vogt (circa 150 micron)). Infine, abbiamo stabilito un protocollo di confezionamento che consente queste membrane devono essere conservati a -20 ° C per più di 6 mesi senza mostrare alcun segno di rottura.
Questo studio descrive (a) una tecnica per la realizzazione di membrane elettrofilate contenente microfeatures al loro interno e (b) come preparare tali membrane per l'uso clinico da imballaggio di vuoto, raggi gamma e lo stoccaggio poi prima dell'uso. In questa particolare applicazione che abbiamo sviluppato membrane PLGA contenenti micropockets che imitano le caratteristiche fisiche delle nicchie di cellule staminali limbari. Gli obiettivi di questo studio sono: (i) per descrivere i metodi per fornire ai lettori le conoscenze necessarie per progettare e fabbricare scaffold contenenti microfeatures per la ricerca sul contributo di nicchie di cellule staminali per la rigenerazione dei tessuti e (ii) di fornire al lettore una migliore comprensione di come memorizzare ponteggi elettrofilate per lunghi periodi di tempo.
In termini di applicazione clinica, la memorizzazione delle membrane ad anello è di fondamentale importanza. In questo lavoro, la degradazione dell'anello è stato studiato in un periodo di 6 mesi. Degradazione delmembrane è guidato da idrolisi così semplicemente mantenendo le membrane di umidità-libera il processo viene fermato. Blackwood et al. Riferito che variando il rapporto di PLA di PGA, la degradazione della membrana cambia 32. Questo studio ha anche dimostrato che aumentando la quantità di PGA, il tasso di degradazione delle membrane elettrofilate aumentato in vivo 22. Qui è stato dimostrato che con sottovuoto membrane insieme ad alcuni essiccante e irradiante e la loro memorizzazione a bassa temperatura per 6 mesi, non vi è alcun cambiamento nella integrità e la degradazione della fibra. Allo stato attuale, a 6 mesi è quanto abbiamo studiato con queste membrane contenenti micropockets ma i dati di archiviazione per 1 anno è stato segnalato su membrane elettrofilate pianura a -20 ° C e 22 ora abbiamo dati inediti per la loro conservazione a -20 ° C per 2 anni senza alcun segno di degrado. Così per la conservazione a lungo termine sarebbe consigliabile asciugare conservare a -206; C ma è possibile conservarli a RT anche in India per almeno 6 mesi (possibilmente molto più lungo). L'inclusione di un indicatore di umidità dà un mezzo semplice per verificare che l'imballaggio ha mantenuto le membrane secche nel qual caso sarà in forma per lo scopo.
Trasferimento di cellule da questi anelli a modelli cornea 3D è stato mostrato durante il posizionamento espianti limbari entro i micropockets. Questo gruppo ha recentemente riportato il trasferimento di cellule su un modello in vitro di coniglio cornea mettendo espianti su membrane piane PLGA (membrane senza strutture ad anello) 24. Utilizzando il presente ponteggi microfabbricati trasferimento di cellule è stato fatto un passo ulteriore, come possiamo ora individuare specificamente espianti di tessuto all'interno delle microfeatures. La possibilità di collocare gli espianti direttamente all'interno delle nicchie consente inoltre al chirurgo di utilizzare le membrane direttamente in sala chirurgica evitando la necessità di una camera sterile per espandere prima le cellule staminali limbari. Anche se questo pezzo di work è stata focalizzata sullo sviluppo di dispositivi per la malattia corneale, questa tecnologia microfabbricazione può essere applicata anche per lo sviluppo di dispositivi per molte altre applicazioni. I lavori futuri esplorerà la realizzazione di costrutti per la rigenerazione di altri tessuti come la pelle e ossa.
Mentre la progettazione e la fabbricazione iniziale delle microstrutture PEGDA può richiedere molto tempo, una volta fabbricato le strutture possono essere riutilizzati più volte senza degradazione. Pertanto, la successiva realizzazione di membrane biodegradabili PLGA microstrutturata da elettrospinning può essere effettuata ad una velocità paragonabile alla produzione di strisciamento ('non strutturati') membrane dopo il montaggio del collettore. Anche se in questo lavoro abbiamo utilizzato microstereolithography per la fabbricazione degli stampi, potrebbero essere utilizzati anche altri metodi di fabbricazione come il 3D-stampa o stampaggio a iniezione. Di conseguenza, lo stampo sottostante potrebbe essere realizzato con altri polimeri o metalli invece di PEGDA. Come tale questa tecnica è molto versatile e ricercatori può facilmente adattare il metodo per soddisfare i propri bisogni e le strutture.
La casa in-microstereolithography set-up utilizzato in questo studio non consentirà la preparazione di costrutti con le caratteristiche sotto 30μm; questa non è una limitazione di applicazione corneale qui descritto ma potrebbe essere fondamentale nella progettazione di altri modelli. In tal caso altre tecniche come 2 fotone polimerizzazione (2PP) potrebbe essere di interesse ma la tecnica elettrofilatura potrebbe non consentire la riproduzione delle strutture su scala sub-micron (questo è attualmente in fase di studio da parte del nostro gruppo).
Passaggi critici all'interno del processo di fabbricazione sono (i) Evitare l'overcuring dei modelli PEGDA che possono essere controllati da tempo e quantità di fotoiniziatore regolazione. (Ii) Controllo condizioni electrospinning quali la temperatura e l'umidità. (Iii) Memorizzazione adeguatamente il electrospumembrane anello n utilizzando sottovuoto e disidratanti.
In sintesi, ponendo espianti tissutali limbus nei microfeatures della membrana abbiamo dimostrato escrescenza cella da espianti su settori di nicchia, trasferimento cella su una cornea di coniglio ferito e successiva riepitelizzazione della cornea. La degradazione delle membrane conservati a temperature diverse è stato anche studiato e un protocollo di imballaggio che permette una conservazione a lungo termine delle membrane è stata sviluppata, quest'ultimo essendo essenziale nello sviluppo di membrane per uso clinico.
The authors have nothing to disclose.
We gratefully acknowledge funding from the Wellcome Trust Affordable Healthcare for India and an EPSRC Landscape Fellowship for Ilida Ortega as well as contributions from The Electrospinning Company Ltd.
Name of reagents/material/equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Poly lactic-co-glycolic acid | Purac | PDLG5004 | |
Dichloromethane | Sigma Aldrich Or Fisher | 270997 Or D/1850/17 | >99.8% contains 50-150 ppm amylene stabiliser |
Digital Micromirror Device (DMD) Discovery 1100 Controller Board & Starter Kit | Texas Instruments | 1076N732 (UV) | |
473 nm Laser | Laser 2000 | MBL-III | 150 mW |
Poly (ethylene glycol) diacrylate | Sigma Aldrich | 475629 | Mn = 250g/mol 500 ml |
DEMEM + Glutamax | Fisher | 12077549 | |
Ham’ s F12 | Labtech biosera | LMH1236/500 | |
Fetal Bovine Serum | Labtech biosera | FB-1090/50 | |
EGF | R&D | 236-EG-200 | |
Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-1G | |
Amphotericin | Sigma Aldrich | A2942-100ml | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100ml | |
DAPI | Sigma Aldrich | 32670 | |
Propidium Iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
Thrombin | Sigma Aldrich | T9326 | |
Fibrinogen | Sigma Aldrich | F3879 | |
p63 | Sigma Aldrich | P3737 | |
CK3 | Merck Millipore | CLB218 | |
Hematoxylin | SLS | HHS16-500ML | |
Eosin | Sigma Aldrich | HT110232-1L | |
Medical grade bag (PET/Foil/LDPE) Peelable pouch | Riverside Medical Ltd. Derby, UK | Foil laminate PET/Foil/LDPE, (12,7,50) | |
gamma- irradiation (Sterilisation) | Applied Sterilisation Technologies (Synergy Health Laboratory Services (SHLS), Abergavenny UK) – external dose range of 25-40KGy | N/A | |
Silica gel orange | Sigma Aldrich | 10087 | |
Cobalt (II) chloride | Sigma Aldrich | 232696 | |
Copper (II) sulphate | Sigma-Aldrich | C-1297 | |
Six spot humidity indicator card | SCC, USA | 6HIC200 | |
Vacuum heat seal machine | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | VS518 | |
Andrew James Vacuum Sealer rolls 28cm X 40 metre rolls | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | BR2805 | |
Scanning Electron Microscopy (SEM) | Philips/FEI XL-20 SEM | N/A | |
Confocal Microscope | Zeiss LSM 510 META | N/A | |
Videne Antiseptic Solution | Ecolab, Swindon, UK | N/A | 3% |