Relatamos uma técnica para a fabricação de microbolsas dentro membranas electrospun para estudar o comportamento das células. Especificamente, descreve-se uma combinação de microstereolithography e de electrospinning para a produção de PLGA (poli (láctido-co-glicólido)) dispositivos de biomateriais córnea equipados com microestruturas.
Problemas da córnea afetam milhões de pessoas em todo o mundo, reduzindo a qualidade de vida de forma significativa. Doença da córnea pode ser causada por doenças como a aniridia ou Síndrome de Steven Johnson, bem como por fatores externos, como queimaduras químicas ou radiações. Os tratamentos atuais são (i) o uso de córneas e (ii) o uso de células-tronco expandidas em laboratório e entregue em suportes (por exemplo, membrana amniótica); estes tratamentos são relativamente bem sucedida, mas, infelizmente, eles podem falhar após 3-5 anos. Existe uma necessidade de conceber e fabricar novos dispositivos de biomateriais capazes de imitar a córnea em pormenor o meio fisiológico em que as células estaminais reside na córnea. As células estaminais do limbo estão localizados no limbo (área circular entre a córnea e esclera) em nichos específicos conhecidos como os Palisades de Vogt. Neste trabalho, desenvolvemos uma nova tecnologia de plataforma que combina duas técnicas de fabricação de ponta (microstereolithography e electrospinning) para a fabricação de membranas de córnea que imitam a um certo ponto do limbo. Nosso membranas contêm microbolsas artificiais que visam fornecer células com proteção como o Palisades de Vogt fazer no olho.
A córnea, o tecido avascular mais exterior central do olho, é um dos tecidos mais importantes envolvidas na visão 1. Existem vários tipos de células que mantêm a função da córnea. A camada mais externa superior da córnea composta por células epiteliais que podem ser de cerca de 5-7 camadas de espessura 2. Essa camada impede a invasão bacteriana na córnea 3 e permite a entrada de oxigênio 4. Tem sido relatado que as células estaminais do epitélio da córnea em mentira nichos ou criptas (com tamanhos de 120-150 um) na região periférica da córnea conhecido como o limbo 5,6. Como as células estaminais se dividem, as células filhas também conhecidas como células amplificadoras transitórias viajar para fora dos nichos e divisão continua como as células se movem para dentro e para cima centripetamente resultando em células terminalmente diferenciadas na região central da córnea 7,8. Estas células são rotineiramente removido com o piscar de olhos exposing novas células por baixo 9.
Além de ser o local das células estaminais epiteliais, o limbo também desempenha um papel em manter a conjuntiva vascularizado longe da região da córnea 10. Danos ao limbo pode ser causada por queimaduras térmicas / produtos químicos, radiação e também doenças genéticas 10. Quando isto acontece, a barreira de limbo é dividido permitindo que as células da conjuntiva para passar para a córnea, vascularização da região, causando dor e em alguns casos, a cegueira. A condição é conhecida como deficiência límbica (LSCD) 10.
Diferentes substratos naturais têm sido descritos como transportadores de células-tronco possíveis para auxiliar na regeneração da córnea. Por exemplo, as membranas à base de colágeno foram usados por Dravida et al. 11 e Rama e colaboradores 12 relataram o uso de fibrina em um estudo com 112 pacientes. No presente, porém o método mais comumente usado de tratamentoé a utilização de membrana amniótica humana a partir de um banco de tecidos e de cultura de células epiteliais do limbo na sua superfície 13,14. Uma vez que uma monocamada formou, a membrana amniótica é colado do lado de células para cima sobre a córnea danificada, que tem todas as células da conjuntiva e do tecido cicatricial cirurgicamente removido a partir dele, antes do transplante de células 14. A membrana amniótica degrada dentro de semanas a meses, deixando as células epiteliais associadas à área desnudada para regenerar o epitélio 15,16. Esta técnica tem sido bem sucedido em restaurar a visão no entanto ainda existem algumas questões práticas que restringem a sua aceitação generalizada clinicamente. À medida que a membrana amniótica é o tecido humano que precisa passar por uma triagem utilizando procedimentos bancários tecido bons antes de serem utilizados para o transplante de células em pacientes. Este rastreio só reduz o risco de transmissão de doenças, mas não pode eliminá-lo completamente 17. Além disso, há relatos de variabilidade no pESEMPENHO da membrana amniótica, devido à variação entre doador 18,19 e diferentes métodos de processamento 19,20. Juntamente com o pequeno risco de transmissão da doença, há a necessidade de centros cirúrgicos para ter acesso a bancos de tecidos bem administradas, que não estão disponíveis a todos.
Embora a membrana amniótica é relativamente bem sucedida, existe uma necessidade para o desenvolvimento de novas alternativas de células portadoras biodegradáveis sintéticos, para o tratamento de doenças da córnea. Transportadores sintéticos superaria a necessidade de bancário procedimentos, bem como eliminar o pequeno risco de transmissão da doença e variabilidade inter-doador. Neste sentido, os materiais tais como o polietileno-glicol e 21,22 23,24 PLGA têm sido estudados.
No desenvolvimento de uma alternativa sintética para a membrana amniótica humana, há também a possibilidade de conceber nele características desejáveis para ajudar a esperança de sobrevivência das células em cultura. O inclusion de microestruturas dentro de dispositivos de biomateriais para controle específico de comportamento das células é uma área emergente de interesse. Muitos autores relatam trabalho para o desenvolvimento de células-tronco artificiais nichos 25-30. Este grupo relatou recentemente a criação de um limbo PEGDA artificial microfabricado biofunctionalized-fibronectina para a entrega de células epiteliais do limbo 22 e um método para a fabricação de membranas biodegradáveis contendo electrospun bolsos microfabricados para o suporte das células epiteliais do limbo 31.
O objetivo deste trabalho é desenvolver uma nova tecnologia de fabricação para o desenvolvimento de dispositivos de biomateriais contendo microestruturas que imitam a uma extensão dos microambientes em que as células-tronco residir no corpo. Desenvolvemos uma técnica que combina microstereolithography electrospinning e que permite a fabricação de membranas microestruturadas biodegradáveis que mostram greapotencial t para aplicações de regeneração de tecidos.
É importante notar que, embora neste trabalho esta técnica foi aplicada para a fabricação de anéis para a regeneração da córnea, a tecnologia pode ser aplicada para a fabricação de dispositivos para a regeneração de uma ampla gama de tecidos epiteliais, por exemplo, da pele, oral epitélio mucosa, intestino, respiratórias e urinárias. Especificamente, no presente estudo, nós desenvolvemos uma membrana sintética biodegradável, que funciona de uma maneira semelhante à membrana amniótica para entregar células para a córnea. Esta membrana contém microbolsas de cerca de 300 um (maiores do que as criptas do limbo das Pallisades de Vogt (cerca de 150 um)). Por fim, temos estabelecido um protocolo de embalagem que permite que estas membranas a serem armazenados a -20 ° C durante mais de 6 meses sem mostrar quaisquer sinais de degradação.
Este estudo descreve (a) uma técnica para a fabricação de membranas electrospun contendo microestruturas dentro deles e (b) a preparação de tais membranas para utilização clínica de embalagem por vácuo, e, em seguida, a irradiação gama de armazenamento antes da sua utilização. Nesta aplicação particular temos desenvolvido membranas de PLGA contendo microbolsas que imitam as características físicas dos nichos de células-tronco do limbo. Os objetivos deste estudo são: (i) para descrever métodos para fornecer leitores com o conhecimento necessário para projetar e fabricar andaimes contendo microfeições para a investigação sobre a contribuição de nichos de células-tronco para regeneração de tecidos e (ii) para fornecer ao leitor uma melhor compreensão de forma a armazenar andaimes electrospun por longos períodos de tempo.
Em termos de aplicação clínica, o armazenamento das membranas anel é de suma importância. Neste trabalho, a degradação do anel foi estudada ao longo de um período de 6 meses. Degradação domembranas é impulsionado por hidrólise tão simplesmente mantendo as membranas umidade sem o processo é interrompido. Blackwood et al. Relataram que através da variação da proporção de PLA em PGA, a degradação da membrana muda 32. Este estudo também demonstrou que, ao aumentar a quantidade de AGP, a taxa de degradação das membranas electrospun in vivo aumentada 22. Aqui demonstrou-se que, com a embalagem a vácuo das membranas, juntamente com alguns dessecante e irradiando-os e armazenando-os a temperaturas baixas durante 6 meses, não há nenhuma mudança na integridade das fibras e degradação. No momento, seis meses é o máximo que temos estudado com estas membranas contendo microbolsas mas os dados de armazenamento de um ano tem sido relatada em membranas electrospun simples a -20 ° C 22 e agora temos dados inéditos para o seu armazenamento a -20 ° C para 2 anos sem quaisquer sinais de degradação. Assim, para o armazenamento de longo prazo seria recomendável para armazená-los seco a -206; C, mas é possível armazená-las à temperatura ambiente, mesmo na Índia há pelo menos 6 meses (possivelmente muito mais tempo). A inclusão de um indicador de umidade dá uma forma fácil de verificar que a embalagem tem mantido membranas secas, caso em que será adequado para o efeito.
Transferência de células desses anéis para modelos 3D de córnea foi mostrado ao colocar explantes limbo dentro dos microbolsas. Este grupo informou recentemente a transferência de células em um modelo de córnea de coelho in vitro, colocando explantes em membranas de PLGA simples (membranas sem estruturas de anéis) 24. Utilizando a presente andaimes microfabricados transferência de células foi dado mais um passo que podemos agora localizar especificamente explantes de tecido dentro das microestruturas. A capacidade de colocar os explantes directamente dentro dos nichos também permite que o cirurgião utilize as membranas directamente no teatro cirúrgico evitando a necessidade de uma sala de limpeza para a primeira expandir as células estaminais do limbo. Embora este pedaço de work tem sido focada no desenvolvimento de dispositivos para a doença da córnea, esta tecnologia microfabricação também pode ser aplicada para desenvolver dispositivos para diversas outras aplicações. Trabalho futuro explorar a fabricação de construções para a regeneração de outros tecidos, tais como pele e osso.
Enquanto a concepção e fabrico inicial das microestruturas PEGDA pode ser demorado, uma vez fabricadas as estruturas pode ser reutilizado muitas vezes sem degradação. Portanto, a fabricação posterior de membranas biodegradáveis PLGA microestruturada por eletrofiação pode ser realizada a uma taxa comparável à produção de ('não estruturados') membranas planas após a montagem do coletor. Embora neste trabalho que temos utilizado microstereolithography para a fabricação dos moldes, outros métodos de fabricação, tais como 3D-impressão ou de moldagem por injeção pode ser usado também. Por conseguinte, o molde subjacente poderia ser feito de outros polímeros ou de metais em vez de PEGDA. Como tal, esta técnica é muito versátil e pesquisadores podem facilmente adaptar o método para combinar as suas próprias necessidades e instalações.
A casa em microstereolithography-set-up utilizado neste estudo não irá permitir a preparação de construções com características menores de 30 um; isto não é uma limitação para a aplicação da córnea descrito aqui, mas pode ser crucial para a concepção de outros modelos. Nesse caso, os de outras técnicas, tais como 2 polimerização fóton (2PP) poderiam ser de interesse no entanto, a técnica de electrospinning poderão não permitir a reprodução das estruturas na escala sub-micron (este está a ser estudada pelo nosso grupo).
As etapas críticas no processo de fabricação são: (i) Evitar o overcuring dos modelos PEGDA que podem ser controlados por tempo e quantidade de fotoiniciador de ajuste. (Ii) Controlar as condições de electrospinning, tais como temperatura e umidade. (Iii) Armazenar adequadamente o electrospumembranas n anel utilizando vácuo-embalagem e dessecantes.
Em resumo, por colocação dentro de explantes de tecido do limbo das microestruturas da membrana mostrámos excrescência de células a partir dos explantes no nichos, a transferência de células para uma ferida da córnea de coelho e subsequente re-epitelização da córnea. A degradação das membranas armazenadas a diferentes temperaturas, também tem sido estudado e um protocolo de embalagem que permite o armazenamento a longo prazo das membranas tem sido desenvolvido, o último sendo essencial no desenvolvimento de membranas para utilização clínica.
The authors have nothing to disclose.
We gratefully acknowledge funding from the Wellcome Trust Affordable Healthcare for India and an EPSRC Landscape Fellowship for Ilida Ortega as well as contributions from The Electrospinning Company Ltd.
Name of reagents/material/equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Poly lactic-co-glycolic acid | Purac | PDLG5004 | |
Dichloromethane | Sigma Aldrich Or Fisher | 270997 Or D/1850/17 | >99.8% contains 50-150 ppm amylene stabiliser |
Digital Micromirror Device (DMD) Discovery 1100 Controller Board & Starter Kit | Texas Instruments | 1076N732 (UV) | |
473 nm Laser | Laser 2000 | MBL-III | 150 mW |
Poly (ethylene glycol) diacrylate | Sigma Aldrich | 475629 | Mn = 250g/mol 500 ml |
DEMEM + Glutamax | Fisher | 12077549 | |
Ham’ s F12 | Labtech biosera | LMH1236/500 | |
Fetal Bovine Serum | Labtech biosera | FB-1090/50 | |
EGF | R&D | 236-EG-200 | |
Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-1G | |
Amphotericin | Sigma Aldrich | A2942-100ml | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100ml | |
DAPI | Sigma Aldrich | 32670 | |
Propidium Iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
Thrombin | Sigma Aldrich | T9326 | |
Fibrinogen | Sigma Aldrich | F3879 | |
p63 | Sigma Aldrich | P3737 | |
CK3 | Merck Millipore | CLB218 | |
Hematoxylin | SLS | HHS16-500ML | |
Eosin | Sigma Aldrich | HT110232-1L | |
Medical grade bag (PET/Foil/LDPE) Peelable pouch | Riverside Medical Ltd. Derby, UK | Foil laminate PET/Foil/LDPE, (12,7,50) | |
gamma- irradiation (Sterilisation) | Applied Sterilisation Technologies (Synergy Health Laboratory Services (SHLS), Abergavenny UK) – external dose range of 25-40KGy | N/A | |
Silica gel orange | Sigma Aldrich | 10087 | |
Cobalt (II) chloride | Sigma Aldrich | 232696 | |
Copper (II) sulphate | Sigma-Aldrich | C-1297 | |
Six spot humidity indicator card | SCC, USA | 6HIC200 | |
Vacuum heat seal machine | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | VS518 | |
Andrew James Vacuum Sealer rolls 28cm X 40 metre rolls | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | BR2805 | |
Scanning Electron Microscopy (SEM) | Philips/FEI XL-20 SEM | N/A | |
Confocal Microscope | Zeiss LSM 510 META | N/A | |
Videne Antiseptic Solution | Ecolab, Swindon, UK | N/A | 3% |