Мы сообщаем технику для изготовления micropockets пределах electrospun мембран, в которых для изучения поведение клеток. В частности, мы описываем комбинацию microstereolithography и электроформования для производства PLGA (поли (лактид-со-гликолида)) роговицы биоматериала устройств, оснащенных microfeatures.
Роговицы проблемы затрагивают миллионы людей во всем мире, снижающих качество их жизни значительно. Заболевания роговицы может быть вызвано заболеваниями, такими как аниридией или Стивена Джонсона, а также внешними факторами, такими как химические ожоги или радиации. Текущие процедуры (я) использование пересадке роговицы и (II) использование стволовых клеток расширенной в лаборатории и доставлен на носителях (например, амниотической мембраны); эти процедуры являются относительно успешно, но, к сожалению, они могут не через 3-5 лет. Существует необходимость в разработке и производстве новых роговицы биоматериала устройств, способных имитировать подробно физиологическую среду, в которой стволовые клетки находятся в роговице. Лимбальных стволовые клетки находятся в лимба (круговой области между роговицы и склеры) в конкретных нишах, известных как Palisades из Vogt. В этой работе мы разработали новую технологическую платформу, которая объединяет две технологии производства передовые (microstereolithography и electrospinnлуг) для изготовления мембран роговицы, которые имитируют в определенной степени лимба. Наши мембраны содержат искусственные micropockets, которые направлены, чтобы обеспечить клетки с защитой как Палисады из Фогт сделать в глаза.
Роговица, лишенной сосудов центральный наружный самых ткани глаза, является одним из наиболее важных тканей, участвующих в видении 1. Есть несколько типов клеток, которые поддерживают функцию роговицы. Верхний наружный слой роговицы состоит из эпителиальных клеток, которые могут быть около 5-7 слои толщиной 2. Этот слой предотвращает бактериальной инвазии в роговицу 3 и позволяет вводить кислорода 4. Было сообщено, что стволовые клетки эпителия роговицы лежат в нишах или крипт (с размерами 120-150 мкм) в периферийной области роговицы, известного как лимба 5,6. Как стволовые клетки делятся, дочерние клетки также известные как переходных усилительных ячеек путешествовать из ниш и как подразделение продолжает клетки двигаться центростремительно внутрь и вверх в результате терминально дифференцированных клеток в центральной роговицы области 7,8. Эти клетки обычно вытер с миганием глаз еxposing новые клетки под 9.
В дополнение к тому, расположение эпителиальных стволовых клеток, лимба также играет определенную роль в поддержании васкуляризованная конъюнктиву от области роговицы 10. Повреждение лимба может быть вызвано тепловой / химических ожогов, радиации, а также генетических заболеваний 10. Когда это происходит, лимба барьер разбивается позволяя конъюнктивы клетки, чтобы перейти на роговицу, vascularizing регион, вызывая боль и слепоту в некоторых случаях. Состояние известно как дефицита лимбальных стволовых клеток (LSCD) 10.
Различные природные субстраты были зарегистрированы в качестве возможных носителей стволовых клеток для оказания помощи в роговицы регенерации. Например, на основе коллагена мембраны используется Дравида и др. 11 и Рамы и сотрудниками 12 сообщили об использовании фибрина в исследовании с 112 пациентами. В настоящее время, однако наиболее часто используемых метода леченияявляется использование человеческого амниотической мембраны из банка тканей и культуры лимбальных эпителиальных клеток на поверхности 13,14. После того, как монослой сформировался, амниотической мембраны клеток приклеен стороной вверх на поврежденной роговицы, которая имеет все конъюнктивальный клетки и рубцовой ткани хирургическим путем удалены от нее до этого трансплантации клеток 14. Амниотической мембраны снижается в течение нескольких недель или месяцев, покидающих эпителиальные клетки, прикрепленные на обнаженную область для регенерации эпителия 15,16. Эта техника была успешной в восстановлении зрения, однако, есть еще несколько практических вопросов, которые ограничивают его широкое поглощение клинически. В амниотической мембраны ткани человека он должен пройти скрининг с помощью хорошие ткани банковские процедуры перед использованием для трансплантации клеток на больных. Этот скрининг только снижает риск передачи заболеваний, но не может полностью устранить его 17. В дополнение к этому у нас есть сообщения изменчивости в рнаилучших показателей амниотической мембраны вследствие среди вариации доноров 18,19 и различных методов 19,20 обработки. Наряду с небольшим риском передачи болезней есть потребность в хирургических центрах, чтобы иметь доступ к хорошо управляемых банков тканей, не доступных для всех.
Несмотря на то, амниотической мембраны относительно успешным, существует необходимость в разработке новых синтетических биологически разлагаемых альтернатив несущих клеток для лечения заболеваний роговицы. Синтетические носители бы преодолеть необходимость банковских процедур, а также устраняя небольшой риск передачи заболеваний и изменчивости между донорами. В этом смысле материалы, такие как полиэтиленгликоль и PLGA 21,22 23,24 изучались.
При разработке синтетический альтернативу амниотической мембраны человека есть также возможность проектировать в нее желаемые качества, мы надеемся помочь выживанию культивируемых клеток. Вклучастия и вовлечения из microfeatures пределах биоматериала устройств для конкретного контроля поведения клеток является новым область интересов. Многие авторы сообщили о своей работе в направлении развития искусственных стволовых клеток ниши 25-30. Эта группа недавно сообщила о создании микроизготовленном PEGDA фибронектином biofunctionalized искусственного лимба на поставку лимбальных эпителиальных клеток 22 и методологии для изготовления electrospun биоразлагаемых мембран, содержащих микроизготовленном карманы для поддержки лимбальных эпителиальных клеток 31.
Целью данной работы является разработка инновационных технологий производства, для развития биоматериала устройств, содержащих microfeatures которые имитируют до такой степени, в микросреды, в которой стволовые клетки находятся в организме. Мы разработали методику, которая объединяет microstereolithography и электропрядения, что позволяет изготовление биоразлагаемых микроструктурированном мембран, которые показывают GREAт потенциал для применения регенерации тканей.
Важно заметить, что, хотя в этой работе этот метод был применен к изготовлению колец для регенерации роговицы, технология может быть применена для изготовления устройств для регенерации широком диапазоне эпителиальных тканей, например, кожи, ротовой эпителий слизистой оболочки, кишечника, дыхательных и мочевого пузыря. В частности, в данном исследовании мы разработали синтетический биоразлагаемый мембраны, который функционирует таким же образом, чтобы амниотической мембраны для доставки клеток к роговице. Эта мембрана содержит micropockets в размере около 300 мкм (больше, чем лимбальных криптах Pallisades из Фогт (около 150 мкм)). Наконец, мы создали упаковку протокол, который позволит эти мембраны должны храниться при температуре -20 ° С в течение более 6 месяцев, не проявляя никаких признаков поломки.
Это исследование описывает (а) технику для изготовления electrospun мембран, содержащей microfeatures внутри них и (б) Как подготовить такие мембраны для клинического использования вакуумной упаковке, гамма-облучения и затем хранение до использования. В данном конкретном приложении мы разработали PLGA мембран, содержащих micropockets которые имитируют физические особенности лимбальных ниши стволовых клеток. Целями данного исследования являются (я) для описания методов предоставить читателям знания, необходимые для проектирования и изготовления строительных лесов, содержащие microfeatures для исследований в вклада стволовых клеток ниш к регенерации тканей и (II), чтобы предоставить читателю лучше понять о том, как сохранить electrospun каркасов в течение длительных периодов времени.
С точки зрения клинического применения, хранение кольцевых оболочек имеет первостепенное значение. В этой работе, деградация кольца изучали в течение 6 месяцев. ДеградацияМембраны приводится в действие таким образом, гидролиз, просто держать мембраны, свободной от влаги процесс останавливается. Blackwood и соавт. Сообщили, что путем изменения соотношения PLA, чтобы PGA, деградация мембраны изменяется 32. Это исследование также показало, что при увеличении количества ФГА, скорость деградации electrospun мембран увеличилась в естественных условиях 22. При этом было показано, что при вакуумной упаковки мембран вместе с некоторым осушителем и облучение их и хранить их при низких температурах в течение 6 месяцев, нет никаких изменений в целостности и деградации волокон. В настоящее время 6 месяцев является, насколько мы изучали с эти мембраны, содержащие micropockets но хранение данных за 1 год, как сообщается на простых electrospun мембран при -20 ° С 22 и у нас теперь есть неопубликованные данные для их хранения при температуре -20 ° C в течение 2 лет без признаков деградации. Таким образом, для длительного хранения он будет рекомендуется хранить их сухой при -206; C, но можно хранить их при комнатной температуре даже в Индии, по крайней мере 6 месяцев (возможно, гораздо больше). Включение индикатора влажности дает простое средство проверки, что упаковка сохранила мембран сухие и в этом случае они будут пригодны для этой цели.
Передача клеток из этих колец в 3D-моделей роговицы было показано при размещении лимбальных эксплантов в течение micropockets. Эта группа недавно сообщила передачу клеток на в пробирке кролика роговицы модели, акцент эксплантов на равнине ПМГК мембран (оболочек без кольцевых структур) 24. С помощью настоящего микроизготовленном лесов передачу клеток было принято еще один шаг вперед, как мы можем теперь специально найти ткани эксплантов в течение microfeatures. Возможность размещения эксплантов непосредственно в нишах также позволяет хирургу использовать мембраны непосредственно в хирургическом театре избегая необходимость чистого помещения на первом расширять лимбальных стволовые клетки. Хотя этот кусок врк было сосредоточено на разработке устройств для заболеваниями роговицы, это микротехнологий технология может быть также применен для разработки устройств для многих других приложений. Будущая работа будет исследовать изготовление конструкций для регенерации других тканей, таких как кожа и кости.
В то время как дизайн и начальная изготовление микроструктур PEGDA может занять много времени, как только сфабрикованы структуры можно использовать много раз без ухудшения. Таким образом, последующее изготовление PLGA микроструктурированных биоразлагаемых мембран электропрядения может быть выполнена при сопоставимой скоростью, чтобы при производстве плоских ('неструктурированных') мембран после сборки мусора. Хотя в этой работе мы использовали microstereolithography для изготовления пресс-формы, может быть также использованы другие способы изготовления, такие как 3D-печати или литья под давлением. Таким образом, в основе формы могут быть изготовлены из других полимеров или металлов, а из ПЭGDA. Таким эта техника является очень гибким и исследователи могут легко адаптировать метод для удовлетворения их собственных потребностей и средств.
Дом в-microstereolithography настройки используются в данном исследовании не позволит подготовку конструкций с особенностями в рамках 30 мкм; это не является ограничением для роговицы применения описанного здесь, но это может иметь решающее значение в оформлении других моделей. В таком случае других методов, таких как 2 фотона полимеризации (2PP) может представлять интерес, однако техника электропрядения не может позволить воспроизводство структур на шкале субмикронного (это в настоящее время изучается нашей группой).
Критические шаги в процессе изготовления являются (я) Избегая overcuring шаблонов PEGDA, которые можно контролировать, регулируя время и количество фотоинициатора. (II) Управление электропрядения условия, такие как температура и влажность. (III) Хранение соответствующим образом в electrospuн кольцевые мембраны, использующие вакуум-упаковку и осушители.
Таким образом, путем размещения лимбальных эксплантов ткани в microfeatures мембраны мы показали клеток отросток из эксплантатов на ниши, клеточного переноса на кролика раненых роговицы и последующей повторной эпителизации роговицы. Деградация мембран хранили при различных температурах также были изучены и упаковка протокол, который обеспечивает долговременное хранение мембран была разработана, причем последний важное значение в развитии мембраны для клинического применения.
The authors have nothing to disclose.
We gratefully acknowledge funding from the Wellcome Trust Affordable Healthcare for India and an EPSRC Landscape Fellowship for Ilida Ortega as well as contributions from The Electrospinning Company Ltd.
Name of reagents/material/equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Poly lactic-co-glycolic acid | Purac | PDLG5004 | |
Dichloromethane | Sigma Aldrich Or Fisher | 270997 Or D/1850/17 | >99.8% contains 50-150 ppm amylene stabiliser |
Digital Micromirror Device (DMD) Discovery 1100 Controller Board & Starter Kit | Texas Instruments | 1076N732 (UV) | |
473 nm Laser | Laser 2000 | MBL-III | 150 mW |
Poly (ethylene glycol) diacrylate | Sigma Aldrich | 475629 | Mn = 250g/mol 500 ml |
DEMEM + Glutamax | Fisher | 12077549 | |
Ham’ s F12 | Labtech biosera | LMH1236/500 | |
Fetal Bovine Serum | Labtech biosera | FB-1090/50 | |
EGF | R&D | 236-EG-200 | |
Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-1G | |
Amphotericin | Sigma Aldrich | A2942-100ml | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100ml | |
DAPI | Sigma Aldrich | 32670 | |
Propidium Iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
Thrombin | Sigma Aldrich | T9326 | |
Fibrinogen | Sigma Aldrich | F3879 | |
p63 | Sigma Aldrich | P3737 | |
CK3 | Merck Millipore | CLB218 | |
Hematoxylin | SLS | HHS16-500ML | |
Eosin | Sigma Aldrich | HT110232-1L | |
Medical grade bag (PET/Foil/LDPE) Peelable pouch | Riverside Medical Ltd. Derby, UK | Foil laminate PET/Foil/LDPE, (12,7,50) | |
gamma- irradiation (Sterilisation) | Applied Sterilisation Technologies (Synergy Health Laboratory Services (SHLS), Abergavenny UK) – external dose range of 25-40KGy | N/A | |
Silica gel orange | Sigma Aldrich | 10087 | |
Cobalt (II) chloride | Sigma Aldrich | 232696 | |
Copper (II) sulphate | Sigma-Aldrich | C-1297 | |
Six spot humidity indicator card | SCC, USA | 6HIC200 | |
Vacuum heat seal machine | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | VS518 | |
Andrew James Vacuum Sealer rolls 28cm X 40 metre rolls | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | BR2805 | |
Scanning Electron Microscopy (SEM) | Philips/FEI XL-20 SEM | N/A | |
Confocal Microscope | Zeiss LSM 510 META | N/A | |
Videne Antiseptic Solution | Ecolab, Swindon, UK | N/A | 3% |