Vi rapporterar en teknik för tillverkning av micropockets inom elektrospunna membran på sig att studera cellens beteende. Specifikt beskriver vi en kombination av microstereolithography och electro för framställning av PLGA (poly (laktid-sam-glykolid)) korneala biomaterial enheter utrustade med microfeatures.
Hornhinnan problem påverkar miljontals människor världen minskar deras livskvalitet avsevärt. Hornhinnan sjukdom kan orsakas av sjukdomar som aniridi eller Steven Johnsons syndrom och av externa faktorer såsom kemiska brännskador eller strålning. Nuvarande behandlingar är (i) användning av hornhinnan transplantat och (ii) användning av stamceller expand i laboratoriet och levereras på bärare (t.ex. fosterhinnan); Dessa behandlingar är relativt framgångsrika, men tyvärr kan de inte efter 3-5 år. Det finns ett behov av att konstruera och tillverka nya hornhinnan biomaterial enheter som kan efterlikna i detalj den fysiologiska miljö där stamceller är bosatta i hornhinnan. Limbus stamceller finns i limbus (cirkulär yta mellan hornhinnan och senhinnan) i specifika nischer som kallas Palisades av Vogt. I detta arbete har vi utvecklat en ny plattform teknik som kombinerar två banbrytande tillverkningsteknik (microstereolithography och electrospinning) för tillverkningen av korneala membran som efterliknar i viss utsträckning limbus. Våra membran innehåller artificiella micropockets som syftar till att förse cellerna med skydd som Palisades i Vogt gör i ögat.
Hornhinnan, den avaskulära centrala yttre mest vävnad i ögat, är en av de viktigaste vävnaderna är involverade i syn 1. Det finns flera typer av celler som upprätthåller funktionen av hornhinnan. Den översta yttersta skiktet av hornhinnan består av epitelceller som kan vara ca 5-7 skikt i tjocklek 2. Detta skikt förhindrar bakterieinvasion i hornhinnan 3 och tillåter inträde av syre 4. Det har rapporterats att stamcellema hornhinneepitelet lie i nischer eller kryptor (med storlekar av 120 till 150 | im) vid det perifera området av hornhinnan kallas limbus 5,6. Eftersom stamcellerna delar, dottercellerna även känd som övergående förstärkningsceller resa ut av de nischer och som division fortsätter cellerna rör sig centripetalt inåt och uppåt vilket resulterar i terminalt differentierade celler i det centrala hornhinnan området 7,8. Dessa celler rutinmässigt torkas bort med blink i ögat exposing nyare celler under 9.
Förutom att vara platsen för de epitelstamceller, limbus spelar också en roll i att hålla vaskulariserad bindhinnan bort från hornhinnan regionen 10. Skador på limbus kan orsakas av termisk / kemiska brännskador, strålning och även genetiska sjukdomar 10. När detta händer är limbus barriären bryts ned vilket gör att konjunktivala celler att gå vidare till hornhinnan, vascularizing regionen, orsakar smärta och blindhet i vissa fall. Tillståndet kallas limbus stamceller brist (LSCD) 10.
Olika naturliga substrat har rapporterats som möjliga stamcellsbärare för medhjälp i hornhinnan förnyelse. Till exempel var kollagenbaserade membran används av et al. Dravida 11 och Rama och medarbetare 12 rapporterade användningen av fibrin i en studie med 112 patienter. För närvarande emellertid den mest använda metoden för behandlingär att använda mänskliga fosterhinnan från en vävnadsbank och kultur limbus epitelceller på ytan 13,14. När ett monolager har bildats, är den fosterhinnan limmade cellsidan upp på den skadade hornhinnan, som har alla konjunktivala celler och ärrvävnad opererats bort från det före detta celltransplantation 14. Den fosterhinnan degraderar inom veckor till månader lämnar epitelcellerna bifogas den blottlagda området för att regenerera epitel 15,16. Denna teknik har varit framgångsrik i att återställa synen men det finns fortfarande några praktiska frågor som begränsar dess utbredda upptag kliniskt. Eftersom fosterhinnan är mänsklig vävnad den behöver genomgå säkerhetskontroll med bra vävnadsbankförfaranden innan de används för celltransplantation på patienter. Denna screening sänker bara risken för överföring av sjukdomar, men kan inte helt eliminera den 17. Utöver detta har det förekommit rapporter om variabilitet i pULLGÖRANDE av fosterhinnan på grund av bland donator variation 18,19 och olika bearbetningsmetoder 19,20. Vid sidan av den lilla risken för överföring av sjukdomar finns kravet på kirurgiska centra för att få tillgång till välskötta vävnadsbanker, som inte är tillgängliga för alla.
Trots att fosterhinnan är relativt framgångsrika, finns det ett behov för utvecklingen av nya syntetiska bionedbrytbara cell carrier alternativ för behandling av korneal sjukdom. Syntetiska bärare skulle övervinna behovet av bankförfaranden samt eliminera den lilla risk för sjukdomsspridning och interdonator variabilitet. I denna mening har material såsom polyetylenglykol 21,22 och PLGA 23,24 studerats.
Vid utvecklingen av ett syntetiskt alternativ till den humana fosterhinnan finns det också möjlighet att designa in i den önskvärda särdrag för att förhoppningsvis hjälpa överlevnaden av de odlade cellerna. Den inclusion av microfeatures inom biomaterial anordningar för särskilda kontrollen av cellbeteende är ett framväxande område av intresse. Många författare har rapporterat arbete för att utveckla artificiella stamceller nischer 25-30. Denna grupp har nyligen rapporterat att skapa en mikro PEGDA fibronektin-biofunctionalized artificiella limbus för leverans av limbus epitelceller 22 och en metod för tillverkning av elektrospunna nedbrytbara membraner som innehåller mikrofabricerade fickor för att stödja limbus epitelceller 31.
Syftet med detta arbete är att utveckla en ny tillverkningsteknik för utveckling av biomaterial som innehåller microfeatures som efterliknar en omfattning de mikromiljöer där stamceller är bosatta i kroppen. Vi har utvecklat en teknik som kombinerar microstereolithography och electro som möjliggör tillverkning av biologiskt nedbrytbara mikrostrukturerade membran som visar great potential för vävnadsregenereapplikationer.
Det är viktigt att notera att även i detta arbete denna teknik har tillämpats på tillverkning av ringar för hornhinnan förnyelse, kan tekniken tillämpas på tillverkning av anordningar för regenerering av ett brett spektrum av epitelvävnader, t.ex. huden, oralt slemhinnor, tarm, andnings och blås epitel. Specifikt i denna studie har vi utvecklat en syntetisk bionedbrytbar membran, som fungerar på ett liknande sätt till det amnionmembran att leverera celler till hornhinnan. Detta membran innehåller micropockets på cirka 300 m (större än limbus kryptor i Pallisades av Vogt (ca 150 nm)). Slutligen har vi etablerat en förpacknings protokoll som gör dessa membran som ska förvaras vid -20 ° C i mer än 6 månader utan att visa några tecken på nedbrytning.
Denna studie beskriver (a) en teknik för tillverkning av elektrospunna membran innehåller microfeatures inom dem och (b) hur man förbereder sådana membran för klinisk användning av vakuumförpackning, gammastrålning och sedan lagring före användning. I denna speciella tillämpning har vi utvecklat PLGA membran innehållande micropockets som efterliknar de fysiska funktionerna i limbus stamcells nischer. Syftet med denna studie är (i) för att beskriva metoder för att ge läsarna den kunskap som behövs för att utforma och tillverka ställningar innehåller microfeatures för forskning om bidrag stamcells nischer för vävnadsregenerering och (ii) för att ge läsaren en bättre förståelse av hur man lagrar elektrospunna ställningar under långa tidsperioder.
I termer av klinisk tillämpning, är lagringen av de ringmembran av största vikt. I detta arbete var nedbrytningen av ringen studerades under en period av 6 månader. Nedbrytning avmembran drivs genom hydrolys så genom att helt enkelt hålla membranen fuktfri processen stoppas. Blackwood et al. Rapporterade att genom att variera förhållandet av PLA till PGA, nedbrytningen av membranet förändrar 32. Denna studie visade också att genom att öka mängden av PGA, nedbrytningshastigheten av elektrospunna membran ökade in vivo 22. Här har det visat sig att med vakuum förpackning membranen tillsammans med några torkmedel och bestråla dem och lagra dem vid låga temperaturer i 6 månader, finns det ingen förändring i fiber integritet och nedbrytning. För närvarande är så långt vi har studerat dessa membran innehåller micropockets men datalagring för 1 år har rapporterat om vanligt elektrospunna membran vid -20 ° C 22 och vi har nu opublicerade data för lagring vid -20 ° C 6 månader i 2 år utan några tecken på nedbrytning. Sålunda för långtidsförvaring det skulle rekommenderas att lagra dem torka vid -206; C, men det är möjligt att förvara dem vid RT även i Indien under minst 6 månader (eventuellt mycket längre). Införandet av en indikator luftfuktighet ger en enkel kontroll av att förpackningen har hållit membran torrt i vilket fall de kommer att passa för ändamålet.
Överföring av celler från dessa ringar till 3D hornhinna modeller visades vid placering limbus explants inom micropockets. Denna grupp rapporterade nyligen överföring av celler på en in vitro kaninhornhinna modell genom att placera explants på vanligt PLGA membran (membran utan ringstrukturer) 24. Med användning av föreliggande mikrofabricerade byggnadsställningar cellöverföring har tagits ett steg längre eftersom vi nu specifikt kan lokalisera vävnadsexplantat inom microfeatures. Förmågan att placera explantaten direkt inom de nischer tillåter även kirurgen att använda membranen direkt på det kirurgiska teater undvika behovet av ett renrum för att först expandera limbus stamceller. Även denna del av work har fokuserat på utvecklingen av anordningar för hornhinnans sjukdom, kan denna mikrofabrikation teknik tillämpas även för att utveckla produkter för många andra tillämpningar. Framtida arbete kommer att undersöka tillverkningen av konstruktioner för regenerering av andra vävnader såsom hud och ben.
Medan konstruktionen och inledande tillverkningen av PEGDA mikrostrukturer kan vara tidskrävande, en gång fabricerade strukturerna kan återanvändas många gånger utan försämring. Därför kan den efterföljande tillverkningen av PLGA mikro nedbrytbara membraner genom elektrospinning utföras i samma takt som produktionen av vanligt ("ostrukturerade") membran efter monteringen av samlare. Även i detta arbete har vi använt microstereolithography för tillverkning av formarna, kan andra tillverkningsmetoder såsom 3D-tryckning eller formsprutning användas också. Följaktligen kan den underliggande form vara gjorda av andra polymerer eller metaller i stället för PEGDA. Som sådan här tekniken är mycket mångsidig och forskare kan lätt anpassa metoden för att matcha sina egna behov och faciliteter.
Den egna microstereolithography installation som används i denna studie kommer inte att tillåta framställning av konstruktioner med funktioner inom 30 um; Detta är inte en begränsning för hornhinnans ansökan beskrivs här, men det kan vara avgörande för utformningen av andra modeller. I så fall andra tekniker såsom 2 fotonen polymerisation (2PP) kan vara av intresse men electro tekniken kanske inte tillåta reproduktion av strukturer på under micron skala (detta håller på att studeras av vår grupp).
Kritiska steg inom tillverkningsprocessen är (i) Undvika overcuring av PEGDA mallar som kan kontrolleras genom att justera tid och mängder fotoinitiator. (Ii) Styra electro betingelser såsom temperatur och fuktighet. (Iii) Lagring lämpligt att electrospun ringmembran som utnyttjar vakuum-förpackning och torkmedel.
Sammanfattningsvis genom att placera limbus vävnadsexplantat inom microfeatures membranets vi har visat cell utväxt från explantaten på nischområden, överföring cellen på en kanin sårad hornhinnan och därefter åter läkningen av hornhinnan. Nedbrytningen av membranen som är lagrade vid olika temperaturer har också studerats och en förpackningsprotokoll som tillåter långtidslagring av membran har utvecklats, varvid den senare är viktig i att utveckla membraner för klinisk användning.
The authors have nothing to disclose.
We gratefully acknowledge funding from the Wellcome Trust Affordable Healthcare for India and an EPSRC Landscape Fellowship for Ilida Ortega as well as contributions from The Electrospinning Company Ltd.
Name of reagents/material/equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Poly lactic-co-glycolic acid | Purac | PDLG5004 | |
Dichloromethane | Sigma Aldrich Or Fisher | 270997 Or D/1850/17 | >99.8% contains 50-150 ppm amylene stabiliser |
Digital Micromirror Device (DMD) Discovery 1100 Controller Board & Starter Kit | Texas Instruments | 1076N732 (UV) | |
473 nm Laser | Laser 2000 | MBL-III | 150 mW |
Poly (ethylene glycol) diacrylate | Sigma Aldrich | 475629 | Mn = 250g/mol 500 ml |
DEMEM + Glutamax | Fisher | 12077549 | |
Ham’ s F12 | Labtech biosera | LMH1236/500 | |
Fetal Bovine Serum | Labtech biosera | FB-1090/50 | |
EGF | R&D | 236-EG-200 | |
Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-1G | |
Amphotericin | Sigma Aldrich | A2942-100ml | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100ml | |
DAPI | Sigma Aldrich | 32670 | |
Propidium Iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
Thrombin | Sigma Aldrich | T9326 | |
Fibrinogen | Sigma Aldrich | F3879 | |
p63 | Sigma Aldrich | P3737 | |
CK3 | Merck Millipore | CLB218 | |
Hematoxylin | SLS | HHS16-500ML | |
Eosin | Sigma Aldrich | HT110232-1L | |
Medical grade bag (PET/Foil/LDPE) Peelable pouch | Riverside Medical Ltd. Derby, UK | Foil laminate PET/Foil/LDPE, (12,7,50) | |
gamma- irradiation (Sterilisation) | Applied Sterilisation Technologies (Synergy Health Laboratory Services (SHLS), Abergavenny UK) – external dose range of 25-40KGy | N/A | |
Silica gel orange | Sigma Aldrich | 10087 | |
Cobalt (II) chloride | Sigma Aldrich | 232696 | |
Copper (II) sulphate | Sigma-Aldrich | C-1297 | |
Six spot humidity indicator card | SCC, USA | 6HIC200 | |
Vacuum heat seal machine | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | VS518 | |
Andrew James Vacuum Sealer rolls 28cm X 40 metre rolls | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | BR2805 | |
Scanning Electron Microscopy (SEM) | Philips/FEI XL-20 SEM | N/A | |
Confocal Microscope | Zeiss LSM 510 META | N/A | |
Videne Antiseptic Solution | Ecolab, Swindon, UK | N/A | 3% |