Summary
Il tratto corticospinale, una delle principali vie sensomotori, può essere lesionato unilateralmente nel tronco cerebrale roditori per testare terapie neuroplasticità induzione per il sistema nervoso centrale. Questa procedura chirurgica ("pyramidotomy") e valutazioni postoperatorie sono descritti in questo protocollo.
Abstract
Il tratto corticospinale (CST) può essere completamente tagliato unilateralmente nelle piramidi midollari del tronco encefalico roditore. Il CST è un tratto del motore che ha grande importanza per il controllo muscolare distale nell'uomo e, in misura minore, nei roditori. Un taglio unilaterale di una piramide risultati in perdita di CST innervazione del midollo spinale principalmente sul lato controlaterale del midollo spinale che porta alla disabilità motoria transitoria arti anteriori e sostenuta perdita di destrezza. Proiezioni ipsilaterale del tratto corticospinale sono minori. Abbiamo affinato il nostro metodo chirurgico per aumentare le possibilità di lesioni completezza. Descriviamo cura post-chirurgica. Deficit del test Montoya scala pellet raggiungere e il test scala orizzontale mostrato qui vengono rilevati fino a 8 settimane postinjury. Deficit del test allevamento cilindro sono rilevati solo transitoriamente. Pertanto, il test del cilindro può essere adatti per il rilevamento di ripresa a breve termine. Noi mostriamo come, elettrofisiologicamentee anatomicamente, si possono valutare le lesioni e cambiamenti plastici. Abbiamo anche descrivono come analizzare le fibre del CST illeso spuntano attraverso la linea mediana nelle aree svantaggiate. E 'difficile ottenere> 90% lesioni complete costantemente a causa della vicinanza all'arteria basilare nel midollo allungato e il tasso di sopravvivenza può essere bassa. Approcci chirurgici alternativi e test comportamentali sono descritti in questo protocollo. Il modello pyramidotomy è un buon strumento per valutare trattamenti neuroplasticità induzione, che aumentano germinazione di fibre intatte dopo l'infortunio.
Introduction
Il tratto corticospinale (CST) è una delle vie principali del motore nel midollo spinale umano. Danni a questo tratto dopo midollo spinale risultati lesioni a notevole perdita di destrezza. Il CST è particolarmente importante per il movimento motorio negli esseri umani, come il movimento cifre e il controllo muscolare distale. Si trova anche nei roditori anche se la sua posizione anatomica all'interno del midollo spinale è diversa da quella degli esseri umani e danni CST è meno invalidante 1-4.
Un modello in vivo di lesioni CST comporta pyramidotomy unilaterale, dove uno piramide nel tronco cerebrale ventrale è tagliato rostrale alla decussazione (Figura 1). Le piramidi sono una caratteristica anatomica chiaro sul lato ventrale del midollo allungato attraverso il quale il CST viene eseguito prima che decussatus. Nei ratti, la maggior parte delle fibre (circa il 95%) decussate all'estremità caudale del midollo e si trovano successivamente nella parte mediale dorsale del midollo spinale. Tuttavia, approximately 10% delle fibre decussated eseguito nelle colonne dorsolaterali. Il restante ~ 5% di fibre rimanere non incrociato sul lato ipsilaterale e viaggiare nella parte mediale ventrale 5,6. Dopo pyramidotomy midollo spinale perde il suo ingresso diretto dal CST controlaterale (Figura 1).
Il modello pyramidotomy è particolarmente buona per testare le risposte delle fibre intatte del unlesioned CST ad un trattamento. Esso consente la valutazione di plasticità e germinazione delle fibre intatte in tutta la linea mediana del midollo spinale, che innervano le zone denervati. Il tratto corticospinale è stato osservato a germogliare notevolmente modelli lesioni spinali e la media in particolare degli arti anteriori 7-10 recupero. Un trattamento potrebbe mirare a migliorare questo recupero degli arti anteriori. L'efficacia di una terapia può essere testato con le valutazioni comportamentali, tecniche di tracciabilità anatomiche del tratto unlesioned e terminali esperimenti elettrofisiologici 3,11,12. </ P>
Il vantaggio rispetto alla maggior parte degli altri modelli preclinici di lesioni spinali è che colpisce in particolare un tratto rispetto ad altre lesioni spinali spesso interessano più tratti. Solo un tratto in una chiara, superficiale posizione anatomica è lesionato. Un altro vantaggio è che l'pyramidotomy è un modello di lesione riproducibile. Si tratta di una risorsa adatta in vivo per i ricercatori di testare l'effetto di potenziali terapie neuroplasticità induzione, che mirano a recupero della funzione motoria dopo lesioni o disturbi che colpiscono il sistema motorio 13,14.
Protocol
Dichiarazione etica: Tutte le procedure sono in accordo con le linee guida del Regno Unito Home Office e Animali (Procedure Scientifiche) Act del 1986.
1. Chirurgia e Injury
NOTA: L'utilizzo ratti di peso superiore a 220 g può aiutare con il recupero post-operatorio, se il chirurgo ritiene animali spesso perdono più del 10% del loro peso corporeo preoperatoria.
- Prima dell'intervento, verificare gli animali per la loro preferenza zampa con il test di allevamento cilindri 15 o il Montoya staicase test di 24. Preferibilmente, tagliare la piramide / il CST corrispondente alla zampa anteriore dominante.
NOTA: Per due giorni prima dell'intervento, inserire i seguenti elementi nelle gabbie, in modo che i ratti familiarizzare con i prodotti alimentari che sarà utile durante il recupero da un intervento chirurgico: pacchi idrogel, pastone, e alti integratori alimentari calorici. Versioni sterili di questi integratori alimentari sono disponibili presso vari fornitori. - Anestetizzare femminile Ltrare ratti incappucciati (peso compreso tra 200 e 250 g) con isoflurano (5% per l'induzione e il 1 ° e il 2% per la manutenzione) in ossigeno (portata: 1,5 l / min). NOTA: La scelta di anestetico è importante. Anestetico inalazione consente una regolazione più rapida della profondità dell'anestesia di ketamina, che è anche comunemente usato. Isoflurano consente un migliore controllo della frequenza respiratoria e profondità. La scelta di anestetico è isoflurano. NOTA: L'utilizzo ratti di peso superiore a 220 g può aiutare con il recupero post-operatorio, se il chirurgo ritiene animali spesso perdono più del 10% del loro peso corporeo preoperatoria.
- Somministrare Carprofen sottocutanea come analgesico quando gli animali sono anestetizzati per ridurre l'infiammazione e per fornire analgesia. Nota: Carprofen è dato durante l'intervento chirurgico pyramidotomy nel nostro laboratorio secondo il consiglio del nostro veterinario. Gli oppiacei possono causare ulteriore depressione respiratoria durante l'intervento chirurgico.
- Mantenere gli animali a 37 ° C durante l'intervento chirurgico mediante una casaSistema othermic coperta e una sonda di temperatura rettale.
- Confermare completa anestesia controllando per il ritiro reflex zampa pizzico e lo sbattere delle palpebre.
Nota: Opzionale: Per contrastare problemi respiratori durante l'intervento chirurgico, intubazione e la ventilazione potrebbe essere fattibile. Tuttavia, tenere a mente che la trachea deve essere spostato durante l'intervento chirurgico. - Una volta anestetizzato, posizionare il topo in posizione supina, la barba al collo ventrale e sterilizzare con 1% salviette clorexidina e / o cotone imbevuto di alcol. Applicare una coperta chirurgica sterile sull'animale e mantenere l'area sterile in ogni momento.
- Una volta anestetizzato, posizionare il topo in posizione supina, radere al collo ventrale e sterilizzare con 1% di clorexidina e alcool salviette. Applicare una coperta chirurgica sterile sull'animale e mantenere l'area sterile in ogni momento.
NOTA: Facoltativamente, la testa del ratto può essere fissato in un telaio stereotassico in posizione supina durante l'intervento chirurgico per disabilitare la mobilità della testa, vale a direoccipitale. - Fare un Long 2 a 3 cm incisione mediana dal mento a quasi la fine rostrale dello sterno con un bisturi sterile (# 10). Facoltativamente, applicare piccole morsetti bulldog a ritrattare la pelle.
- Blunt sezionare gli strati superiori di tessuto, come le ghiandole (ad esempio ghiandole sottomascellari e ghiandola parotide) e muscoli che coprono la trachea con azione inversa con le forbici smussati e pinze dentate. Rimanere sempre sulla linea mediana. I tessuti dovrebbero separare facilmente.
- Una volta che la trachea è esposto, spostarlo di lato. La linea mediana è visibile sotto con due cuscinetti di grasso bianco, che segna la linea mediana alla fine rostrale.
- Rostrale ai cuscinetti di grasso bianco, tessuti sezionare smussato fino a quando la superficie ventrale del cranio (l'osso basioccipital) è raggiunto.
- Inserire divaricatori lungo dentellate (lunghezza dente 5,5 millimetri o 16 mm) per mantenere la trachea spostato verso un lato (massimo 1 cm) e per esporre la base del cranio. Spostamento della trachea può obstruct respirazione.
NOTA: Per alcuni animali, allentare i divaricatori in più volte durante l'intervento chirurgico per rimuovere la tensione sulla trachea, ad esempio ogni 10 min per 2 min. Divaricatori Hook possono essere utilizzati al posto dei divaricatori lunghi denti per ridurre lo sforzo di spostamento. - Cauterizzare attentamente piccoli vasi sanguigni visibile alla fine rostrale andando verso la laringe per evitare emorragie.
NOTA: Per evitare cauterizzare i vasi sanguigni nervo laringeo ricorrente sono accuratamente tirati dalla parete di tessuto prima di essere cauterizzato. - Regolare il microscopio per il resto della chirurgia.
- Rimuovere il periostio che copre la base del cranio con una pinza sottile. Regolare i divaricatori per ottenere la migliore visualizzazione possibile per la perforazione.
- Senti la superficie irregolare dell'osso basioccipital con una pinza sottile, notando una elevazione sulla linea mediana, che copre l'arteria basilare. Rostralmente, il teschio viene allevato come un leggera convessità.
- A seconda di quale parte si desidera la lesione, praticare un foro di circa 1 millimetro lateralmente alla linea mediana in movimenti mediolaterale.
NOTA: Ricordare che il ratto è in posizione supina, e il suo lato sinistro può essere sul lato destro investigatori! - Una volta che un buco è fatto, allargare verso la linea mediana con piccole verticali su e verso il basso-movimenti con il trapano fino dell'arteria basilare è chiaramente visibile e allargare lateralmente per almeno 2 mm.
- Assicurarsi che l'arteria basilare è chiaramente visibile. La piramide può essere identificato dal suo forma leggermente sporgenti (Figura 2) e confinante vasi sanguigni.
- Rimuovere eventuali frammenti ossei rimanenti con una pinza sottile.
- Applicare una goccia di Doxapram cloridrato, uno stimolante respiratorio, sulla lingua.
- Aprire la dura longitudinalmente con un ago calibro 26 e una pinza sottile lateralmente alla arteria basilare. Immergetevi nel liquido cerebrospinale (CSF) e un sanguinamento con bastoncini di cotone.
- Evitare Injury all'arteria basilare, effettuare un taglio largo 1,5 mm circa attraversa la larghezza della piramide e 0,5 mm di profondità con Vännäs Spring forbici perpendicolare dell'arteria basilare (Figura 2) per interrompere le fibre CST.
NOTA: Segnare i microscissors anticipo a 0.5 mm dalla punta. Una volta che la dura viene aperta l'arteria basilare può essere spostata leggermente permettendo un lato migliore accesso alla piramide. - Ripetere il taglio con la punta di un ago calibro 26 per garantire la lesione comprende le fibre vicine dell'arteria basilare.
- Fermare l'emorragia con una leggera pressione applicata da bastoncini di cotone. Facoltativamente, il taglio può essere coperto con Gelfoam.
- Rimuovere i divaricatori, sostituire i tessuti e sutura solo la pelle, con 3-0 punti di sutura Vicryl.
- Dopo l'intervento chirurgico, mantenere l'animale in un incubatore a 32 ° C fino a quando completamente sveglio e amministrare 5 ml di soluzione salina per via sottocutanea, se necessario. Non lasciare l'animale incustodito.
- Dare Carporfen sottocutaneacome antinfiammatori e come un analgesico per il post-chirurgica del dolore un giorno dopo l'intervento chirurgico.
- Monitorare animali strettamente per una settimana dopo l'intervento chirurgico e almeno una volta alla settimana successivamente.
- Come richiesto dopo l'intervento chirurgico, confezioni di gel luogo di idratazione, cibo purea bambino, pastone e chow secca sul pavimento della gabbia. Fornire bottiglie d'acqua con lunghi beccucci (privi valvole cuscinetti a sfera).
Representative Results
I tassi di sopravvivenza.
In uno studio rappresentativo condotto da noi abbiamo avuto un tasso di sopravvivenza di 16 su 20 ratti femmina incappucciati Lister (da 200 a 250 g). La complicanza più comune è difficoltà respiratorie a causa dello spostamento della trachea o danni ai centri respiratori del tronco encefalico appena dorsale alle piramidi (solitarii nucleo, ambigue e parabrachilis). Risultati simili sono stati riportati in letteratura 16.
Esiti comportamentali.
Una serie di test comportamentali sono stati utilizzati per valutare il risultato sensomotorio dopo pyramidotomy nei roditori: il test di scala orizzontale, il singolo pellet raggiungimento di prova, la prova di allevamento cilindro e test della scala Montoya sono le valutazioni comportamentali più comunemente utilizzati. Altri test descritti in letteratura sono il pellet raggiungimento test, test corda, analisi del cammino e test nastro adesivo3,17-19. La maggior parte di questi mostrano un deficit motorio funzionale 1 settimana dopo infortunio. Attualmente, la maggior parte degli studi descritti in letteratura solo eseguire test comportamentali fino a 42 giorni 4,11,13,20,21, o per un tempo più breve 3,18,22. Abbiamo effettuato test comportamentali per un periodo prolungato di tempo e visto sostanzialmente pieno recupero della funzione motoria 8 settimane dopo pyramidotomy per alcuni dei test comportamentali, tranne il test della scala Montoya e test scaletta orizzontale. Questo è probabilmente per diversi motivi. In primo luogo, il CST rostrale infortunato alla lesione può formare sinapsi sui neuroni nel tronco encefalico che agiscono come relè indiretti a neuroni motori del midollo spinale. In secondo luogo, il illeso (controlaterale) CST possono germogliare e forme sinapsi sui neuroni del tronco encefalico e del midollo spinale che agiscono come relè di motoneuroni. In terzo luogo, gli altri tratti motori risparmiato come i tratti reticulospinal, vestibulospinal o rubrospinal possono assumere una qualche funzione. Così, una t durataeffetto RATTAMENTO è difficile da rilevare con molti test comportamentali nel modello pyramidotomy. Alcuni test comportamentali in questo modello però potrebbe indicare recupero accelerato subito dopo l'infortunio, che è legato ad un trattamento.
Test Cilindro allevamento 3,4,23
Sulla base del test di allevamento cilindro CST corrispondente alla zampa anteriore dominante è stato ferito. I ratti sono posti in un cilindro di plexiglass e comportamento allevamento viene osservato per un periodo di 3 min. Prelesione c'era una leggera preferenza per l'uso di una zampa, zampa dominante, durante l'esplorazione verticale (Figura 3A). La lesione colpisce il lato dominante e l'uso della zampa controlesionale scesa al 28% a 1 settimana Determina postinjury (ripetute ANOVA p <0,05; post-hoc analisi ha rivelato animali hanno deficit significative a settimana 1, 2 e 3, p <0,05, Fisher LSD). 4 settimane postinjury gli animali recuperati und usato la zampa anteriore interessata per il 45% dei posteriori, e dopo 6 settimane questo era il 57% (n = 16, media ± viene visualizzato errore standard). Topi Analogamente, Starkey et al. (4) hanno valutato utilizzando il test del cilindro fino a 42 giorni dopo pyramidotomy e segnalato una significativa diminuzione dell'uso della zampa interessata per tutto il periodo di prova.
Test Montoya Scala 24
Ratti richiedono preformazione per questo test per acclimatarsi prima di lesioni. Per aumentare la motivazione durante gli animali sessione di test sono cibo limitata a 15 g di cibo per ratti la sera prima. I ratti alimentari privati sono posti nella scala Montoya per 15 min. Su ogni lato, vi è una scala di 7 gradini con pozzetti, ciascuno contenente 3 pellets. Il numero totale di pellet recuperati su ogni lato sono registrati. Il numero di pellet recuperati con la zampa anteriore controlesionale / colpita è diminuita significativamente dal 61% pre-lesione al3% 3 giorni postinjury (Figura 3B). La possibilità di recuperare pellet era ancora significativamente compromessa a 4 settimane postinjury con il 20% di pellet recuperati. Ratti mostrano un deficit significativo fino alla settimana 8 con solo il 29% dei pellet mangiato in quel momento (Misure ripetute ANOVA p <0.05, analisi post hoc ha rivelato animali hanno disavanzi significativi sul lato controlesionale a tutti settimane, p <0.05, Fisher LSD). Il zampe anteriori ipsilesionale è influenzato fino a 1 settimana postinjury; tuttavia questo recupera dalle seconda settimana (Misure ripetute ANOVA p <0.05, analisi post hoc ha rivelato animali hanno deficit significativi a Day 3 e Settimana 1 sulla zampa anteriore ipsilesionale, p <0.05, di Fisher LSD). I deficit iniziali della zampa anteriore ipsilesionale potrebbero essere spiegate con la lesione della parte ipsilaterale del tratto corticospinale che attraversa la piramide taglio, con conseguente germinazione e recupero.
OrizzontaleTest Ladder 25
Ratti richiedono preformazione per questo test. Ratti a piedi tre volte una scala lunga 1 m con spaziatura gradino irregolare. I video vengono analizzati più avanti al rallentatore e il numero totale di piede scivola e manca di ogni zampa è quantificato. Il grafico in Figura 3C rappresenta il numero totale di mancate e slittamenti del lato colpito e meno interessato (forepaw + hindpaw) come percentuale del numero totale di passi effettuati. I ratti hanno un significativo aumento del numero di errori 1 settimana postinjury con il 10% o 11% sul lato interessato e sul lato meno colpite rispettivamente. Questo deficit è persistente sul lato controlesionale / colpiti fino alla settimana 8 con errori 10% fatta, però, si risolve nella parte ipsilesionale / meno colpite da 2 settimane (Misure ripetute ANOVA, analisi post hoc ha rivelato animali hanno disavanzi significativi a tutti settimane il lato controlesionale e disavanzi significativi a settimana 1 e 3 sul ipsilesionalelato, p <0.05, di Fisher LSD).
Test elettrofisiologici
In un terminale elettrofisiologico set-up l'animale è stato anestetizzato per via intraperitoneale con uretano. Durante il procedimento, è stato mantenuto a 37 ° C ± 1 ° C. La regione del collo ventrale, le sue zampe anteriori e regione toracica sono stati rasati e disinfettati con iodio macchia. Le piramidi sono stati esposti come descritto in precedenza e il nervo radiale è stata esposta nella parte superiore del braccio da un approccio ventrale incisione della pelle e il grande pettorale. L'estremità distale del nervo radiale è stato tagliato e il nervo fu posta su due fili argento Attacco elettrodi in un bagno di olio minerale. O piramide è stata stimolata con elettrodi bipolari concentrici a diverse profondità di 5 impulsi a 300 Hz e ampiezza crescente stimolazione. Le registrazioni sono state effettuate sempre dal nervo radiale del braccio disabili (Figura 4).
Anim illesoals aveva una forte risposta a latenze tra 12 a 20 msec nel nervo radiale quando la piramide controlaterale è stata stimolata (Figura 4B). Stimolazione omolaterale traduce solo in attivazione occasionale (Figura 4C). Gli animali che hanno ricevuto precedenti pyramidotomies, sul lato controlaterale al braccio di registrazione mostrano alcuna risposta nel nervo radiale quando il tratto lesionato viene stimolata sopra della lesione (Figura 4B '). Tuttavia, la stimolazione delle fibre CST nelle piramidi ipsilaterale alla registrazione elettrodi hanno determinato una maggiore attivazione del nervo radiale rispetto agli animali illesi a 12 settimane postinjury (Figura 4C ').
Risultati anatomici.
Gli animali sono stati sacrificati 10 settimane dopo l'intervento chirurgico in base alla Tabella 1 degli animali (Procedure Scientifiche) Act 1986. Due settimane prima, il CST indenne è stata tracciata con biotinilatoammina destrano (BDA) iniezioni nel corteccia motoria ipsilaterale 26 al braccio disabili (Figura 1). Questo consente la quantificazione di fibre lesionate, che attraversano la linea mediana e forniscono il controlesionale midollo spinale (Figura 5C, D). Animali illeso hanno solo poche fibre che attraversano la linea mediana, mentre questo aumenta in risposta al danno. Midollo spinale cervicale trasversa sono state colorate con proteina chinasi C (PKC) gamma di valutare la percentuale di denervazione nel CST lesionato (Figura 5E) 16. In alternativa, la completezza della lesione può essere valutata iniettando BDA tracciante nella corteccia motore sul lato ipsilesionale della lesione pyramidotomy. L'assenza di etichettatura nel controlaterale dorsomediale CST e la ipsilaterale ventromediale CST costituisce una prova di completa transection unilaterale.
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Figura 1: Schema che mostra i tratti corticospinali nel ratto e assotomia unilaterale del CST nelle piramidi immagine Top:. Neuroni cortico origine nel livello 5 cellule piramidali corticali. Biotinilato ammina destrano (rappresentato in verde) viene iniettato nella corteccia controlesionale due settimane prima della fine dell'esperimento. Immagine Middle: I tratti formano le piramidi sulla superficie ventrale del midollo e allo svincolo spinomedullary la maggior parte degli assoni decussate. Pyramidotomy unilaterale avviene nel midollo caudale (in rosso). Immagine inferiore: La maggior parte dei tratti corticospinali malandato nelle parti dorsomediale e dorsolaterale del midollo spinale. Una minoranza resta ipsilaterally e corre ventromedially.
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Figura 2: vista ventrale del cervello di ratto. Le piramidi si distinguono perché sono sollevate, convessità parallele (scatola gialla). I confini delle piramidi sono definite medialmente dal dell'arteria basilare (BAS) sulla linea mediana e lateralmente alla base della convessità a metà strada tra l'arteria basilare e l'arteria paraolivary (Pol) come si vede in (C). Craniotomy avviene tramite l'arteria basilare e laterale estendendo all'arteria paraolivary (riquadro rosso in C). Una piramide è tagliato perpendicolarmente dell'arteria basilare (linea rossa in C, taglio viene visualizzato sul campione in A e B). Le lesioni poste troppo caudale vicino alle arterie vertebrali (vert) sarà incompleta perché il CST inizia a decussate e perché l'arteria vertebrale si trova lontano dalla linea mediana. (C) Immagine tratto da "The Rat sistema nervoso" di George Paxinos 27. NOTA: Questa figura mostra una lesione sul lato sinistro delle immagini: questo è rig dell'animaleht piramidale tratto perché è sdraiato supino. Si noti, tuttavia, che il video mostra una lesione a sinistra del tratto piramidale dell'animale.
Figura 3:. I risultati rappresentativi per il test allevamento del cilindro, Montoya scala pellet raggiungere prova e prova Scala orizzontale C'è un deficit motorio rilevato da tutti i test dopo la lesione. Tuttavia, nessun deficit può essere rilevato con il test di allevamento del cilindro a 4 settimane postinjury, mentre i deficit prolungati possono essere rilevati con il test scala Montoya e il test di scala orizzontale fino a 8 settimane postinjury (n = 16 per gruppo, mezzi e errore standard sono mostrato). L'asterisco indica p <0.05 rispetto al basale pre-lesione (test LSD di Fisher). Si prega di fare clic suqui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4:. Elettrofisiologia valutare il tratto corticospinale prima e dopo pyramidotomy (A) mostra il set-up per l'esperimento terminale. Stimoliamo le piramidi con un treno di 5 impulsi a varie profondità rostrali al sito di lesione e decussation. Il tratto rosso è il tratto leso. Registriamo dal nervo radiale sul lato controlesionale. (B) e (C) visualizza esempio registrazioni con stimolazione ipsilesionale o la stimolazione controlesionale prima o 12 settimane dopo pyramidotomy. Stimolazioni ipsilesionale evocano più potenziali d'azione composto (picchi nella traccia) nel nervo radiale prima lesione (B). Questi sono abolite dalla ferita e l'attività non Return entro 12 settimane (B '). Stimolazione controlesionale evoca rare potenziali d'azione unico composto pre-lesione (C). 12 settimane dopo l'attività lesioni notevolmente è aumentata (C '), probabilmente a causa di assoni intatti spuntano tra la linea mediana e plastica cambiamenti all'interno del midollo spinale. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5:. Valutazione anatomica dopo pyramidotomy (A, B, C, D) biotinilato ammina destrano è stato utilizzato per tracciare il tratto corticospinale iniettando nella corteccia del motore corrispondente al CST unlesioned (vedere verde in Figura 1). Il mediale dorsale, i componenti mediali ventrali del CST sono chiaramente visibili (A, dorsale parte mediale ingrandita in B). (C) e (D) sono ingrandimenti da (A) di fibre di germinazione attraverso la linea mediana nella materia grigia del lato denervata in risposta ad un trattamento. Per valutare la completezza della lesione sezioni trasversali del livello cervicale 4 (12 settimane postinjury tessuti) sono stati tagliati e colorati con anticorpi contro PKC gamma (E). Il CST sul lato sinistro dell'immagine è intatto e può essere visto sporgenti oltre la linea mediana nel lato denervata, presumibilmente a causa della disintegrazione strutturale dorsale feriti CST.
Discussion
Abbiamo descritto il modello di lesioni pyramidotomy. Il tratto corticospinale viene tagliato a livello del tronco cerebrale. Da un punto di vista tecnico questa chirurgia richiede molta cautela e precisione. Il tronco encefalico ospita i centri respiratori ei centri cardiovascolari in più nuclei, come il nucleo ambiguo e solitarii incorporato nella formazione reticolare sotto le piramidi. Se si effettua il taglio troppo profondo questo può portare a difficoltà respiratorie improvvise, che possono essere fatali. Diamo Dopram appena prima del taglio per aumentare l'attività respiratoria per evitare una brusca cessazione respirazione. Se l'arresto della respirazione vale ventilazione l'animale per i seguenti cinque minuti con ossigeno come può recuperare. Inoltre, il danno all'arteria basilare deve assolutamente essere evitato. Complicazioni durante i primi giorni postinjury sono: un'altra emorragia nel tronco cerebrale che colpisce le funzioni vitali, una notevole perdita di peso, diffic respirazione graveulties dovuti allo spostamento della trachea e gravi problemi di orientamento e di equilibrio degli animali a causa di una vasta ferita comprese le olive appena laterali alle piramidi. Queste complicazioni possono essere trattate come end-point e animali possono essere sottoposti a eutanasia. Un attento monitoraggio durante la prima settimana dopo l'intervento chirurgico è essenziale. Cibo supplementare può essere somministrato in modo da controbilanciare la perdita di peso. Infiammazione delle vie aeree (respirazione roca) risolve di norma entro uno o due giorni. Generalmente, gli animali giovani sono più facili da utilizzare come loro collo è meno profonda. Inoltre, sono più resistenti e hanno meno complicazioni respiratorie.
Si richiede una certa pratica per ottenere una lesione completa del CST con un pyramidotomy. Allo stesso modo, in due studi di Steward et al. 16, che si propose di replicare un ex esperimento Benowitz et al. 28, riportato tassi di mortalità, inizialmente elevati e che alcuni di loro lesioni erano incomplete. Behaviouraldeficit sarà anche variabili. Si consiglia un nuovo chirurgo esegue molti interventi pratica pyramidotomy prima di effettuare un esperimento completo per testare una terapia candidato. Modi per prevenire lesioni incomplete sono ripercorrendo il taglio con un ago ipodermico assicurandosi le fibre corticospinal vicine dell'arteria basilare sono interrotti, come descritto in questo protocollo. Altre opzioni sono per aspirare il sito della lesione con una pipetta di aspirazione bicchiere capovolto, come descritto in Zhou et al., 2003 29. Un filo di tungsteno fine può anche essere usato per tagliare il tratto 22. Un'alternativa alla pyramidotomy è quello di tagliare la C3 dorsale cervicale CST unilateralmente e poi a tagliare con un approccio ventrale C2 parte ventrale ipsilesionale del CST 18. Tuttavia probabilmente, una lesione completa non è necessaria se l'obiettivo è quello di studiare la germinazione del controlesionale CST; se la maggioranza della piramide è lesionato e una risposta germinazione dal lato unlesioned verifica questo può essere sufficiente.
Uno scopo del modello pyramidotomy lesione è per l'ablazione un lato del tratto corticospinale e utilizzare terapie neuroplasticità indurre per stimolare la plasticità e la germinazione delle fibre non intatta feriti. Per testare le terapie neuro-protettivo questo modello non è adatto e altri modelli di pregiudizio, come le lesioni contusione dovrebbe essere usato. I risultati di pyramidotomies vengono valutati più spesso con i test comportamentali e anatomia. Il test scala orizzontale, la prova allevamento cilindro e test della scala Montoya sono valutazioni comportamentali più comunemente usati. Altri test descritti in letteratura sono il pellet raggiungere prova, prova corda arrampicata, analisi del cammino e il test 3,17-19 nastro adesivo. Tuttavia, i risultati della prova comportamentale più spesso solo monitorati fino ad un massimo di 42 giorni postlesion 3,4,11,17,18,20-22. Da esperienze passate, roditori recuperano più funzioni in momenti successivi, senza alcun intervento di trattamento. Abbiamo dimostrato that test scala orizzontale e test raggiungendo Montoya scala pellet rilevano disabilità fino ad un punto di tempo. Essi possono essere utilizzati per misurare recupero funzionale a causa di un trattamento. La completezza della lesione è giudicato da PKC gamma colorazione (che etichette fibre CST nelle colonne dorsali) del midollo spinale a livello cervicale rostrale o eriocromo colorazione Cyanine di sezioni trasversali del sito della lesione. Biotinilato ammina destrano può essere iniettato nella corteccia controlesionale per valutare la germinazione delle fibre intatte attraverso la linea mediana nella zona del midollo spinale denervata.
In conclusione, il modello pyramidotomy è buono per la valutazione, neuroplasticità indurre le capacità di un farmaco trattamento per le lesioni del sistema nervoso centrale, se l'intervento è padroneggiata con successo. Si valuta la plasticità delle fibre intatte. Il passo successivo sarebbe quello di utilizzare un modello più clinicamente rilevanti come lesioni contusione per valutare la capacità del farmaco di superare injuri grandies interessano più tratti.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla International Spinal Research Trust e il Rosetrees Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carprofen | Norbrook | Vm No; 02000/4229 | give 5 mg/kg twice daily |
| Homeothermic Blanket System | Harvard Instruments | 507222F | |
| Isoflurane | Abbott | B506 | |
| Fine Scissors- Tough Cut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11019-12 | |
| Long-toothed Alm retractors | Fine Science Tools | 17009-07 | |
| cautery system kit | Harvard Instruments | 726067 | |
| fine Dumont forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Carbon Steel burrs | Fine Science Tools | 19007-07 | |
| Dopram V-drops | Pfizer | apply 1 drop to tongue | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| gelfoam | Equimedical | EQU705001 | |
| 3-0 Vicryl sutures | Ethicon | ||
| operating microscope | Zeiss | ||
| Compact Anaesthesia System Isoflurane K/F Single Gas | VetTech Solutions | ||
| Scales | Ohaus | NVT3201 | |
| Carbon Steel Scalpel blades No. 10 | Swann-Morton | 201 | |
| 25g needles | Terumo | NN-2525R | |
| syringes (1 ml and 5 ml) | Terumo | SS+01T1 / SS*05SE1 | |
| Saline (Sodium Chloride 0.9%) | Fresenius Kabi | Pl 08828/0178 | |
| cotton buds | Johnson and Johnson | 5000207582502 | sterilize before use |
References
- Lemon, R. N.
- Lemon, R. N., Griffiths, J. Comparing the function of the corticospinal system in different species: organizational differences for motor specialization. Muscle & nerve. 32, 261-279 (2005).
- Starkey, M. L., et al. Assessing behavioural function following a pyramidotomy lesion of the corticospinal tract in adult mice. Experimental neurology. 195, 524-539 (2005).
- Starkey, M. L., Bartus, K., Barritt, A. W., Bradbury, E. J. Chondroitinase ABC promotes compensatory sprouting of the intact corticospinal tract and recovery of forelimb function following unilateral pyramidotomy in adult mice. Eur J Neurosci. 36, 3665-3678 (2012).
- Brosamle, C., Schwab, M. E. Cells of origin, course, and termination patterns of the ventral, uncrossed component of the mature rat corticospinal tract. The Journal of comparative neurology. 386, 293-303 (1997).
- Brosamle, C., Schwab, M. E. Ipsilateral, ventral corticospinal tract of the adult rat: ultrastructure, myelination and synaptic connections. Journal of neuroctology. 29, 499-507 (2000).
- Bareyre, F. M., et al. The injured spinal cord spontaneously forms a new intraspinal circuit in adult rats. Nat Neurosci. 7, 269-277 (2004).
- Chen, Q., Smith, G. M., Shine, H. D. Immune activation is required for NT-3-induced axonal plasticity in chronic spinal cord injury. Exp Neurol. 209, 497-509 (2008).
- Z'Graggen, W. J., et al. Compensatory sprouting and impulse rerouting after unilateral pyramidal tract lesion in neonatal rats. J Neurosci. 20, 6561-6569 (2000).
- Rosenzweig, E. S., et al. Extensive spontaneous plasticity of corticospinal projections after primate spinal cord injury. Nat Neurosci. 13, 1505-1510 (2010).
- Z'Graggen, W. J., Metz, G. A., Kartje, G. L., Thallmair, M., Schwab, M. E. Functional recovery and enhanced corticofugal plasticity after unilateral pyramidal tract lesion and blockade of myelin-associated neurite growth inhibitors in adult rats. J Neurosci. 18, 4744-4757 (1998).
- Kartje-Tillotson, G., O'Donoghue, D. L., Dauzvardis, M. F., Castro, A. J. Pyramidotomy abolishes the abnormal movements evoked by intracortical microstimulation in adult rats that sustained neonatal cortical lesions. Brain Res. 415, 172-177 (1987).
- Thallmair, M., et al. Neurite growth inhibitors restrict plasticity and functional recovery following corticospinal tract lesions. Nature Neuroscience. 1, 124-131 (1998).
- Akbik, F. V., Bhagat, S. M., Patel, P. R., Cafferty, W. B., Strittmatter, S. M. Anatomical plasticity of adult brain is titrated by Nogo Receptor 1. Neuron. 77, 859-866 (2013).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacol. 39, 777-787 (2000).
- Steward, O., Sharp, K., Yee, K. M. A re-assessment of the effects of intracortical delivery of inosine on transmidline growth of corticospinal tract axons after unilateral lesions of the medullary pyramid. Experimental neurology. 233, 662-673 (2012).
- Thallmair, M., et al. Neurite growth inhibitors restrict plasticity and functional recovery following corticospinal tract lesions. Nature neuroscience. 1, 124-131 (1998).
- Weidner, N., Ner, A., Salimi, N., Tuszynski, M. H. Spontaneous corticospinal axonal plasticity and functional recovery after adult central nervous system injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3513-3518 (2001).
- Schnell, L., Schneider, R., Kolbeck, R., Barde, Y. A., Schwab, M. E. Neurotrophin-3 enhances sprouting of corticospinal tract during development and after adult spinal cord lesion. Nature. 367, 170-173 (1994).
- Starkey, M. L., Bleul, C., Maier, I. C., Schwab, M. E. Rehabilitative training following unilateral pyramidotomy in adult rats improves forelimb function in a non-task-specific way. Experimental neurology. 232, 81-89 (2011).
- Ueno, M., Hayano, Y., Nakagawa, H., Yamashita, T. Intraspinal rewiring of the corticospinal tract requires target-derived brain-derived neurotrophic factor and compensates lost function after brain injury. Brain : a journal of neurology. 135, 1253-1267 (2012).
- Maier, I. C., et al. Constraint-induced movement therapy in the adult rat after unilateral corticospinal tract injury. J Neurosci. 28, 9386-9403 (2008).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
- Montoya, C. P., Campbell-Hope, L. J., Pemberton, K. D., Dunnett, S. B. The "staircase test": a measure of independent forelimb reaching and grasping abilities in rats. Journal of neuroscience methods. 36, 219-228 (1991).
- Soblosky, J. S., Song, J. H., Dinh, D. H. Graded unilateral cervical spinal cord injury in the rat: evaluation of forelimb recovery and histological effects. Behavioural brain research. 119, 1-13 (2001).
- Soleman, S., Yip, P., Leasure, J. L., Moon, L. Sustained sensorimotor impairments after endothelin-1 induced focal cerebral ischemia (stroke) in aged rats. Experimental neurology. 222, 13-24 (2010).
- Paxinos, G. The Rat Nervous System. , Academic Press, Inc. (1995).
- Benowitz, L. I., Goldberg, D. E., Madsen, J. R., Soni, D., Irwin, N. Inosine stimulates extensive axon collateral growth in the rat corticospinal tract after injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 13486-13490 (1999).
- Zhou, L., Baumgartner, B. J., Hill-Felberg, S. J., McGowen, L. R., Shine, H. D. Neurotrophin-3 expressed in situ induces axonal plasticity in the adult injured spinal cord. J Neurosci. 23, 1424-1431 (2003).
