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Biology

어머니 세포 및 변동 시험의 자기 정렬을 결합에서 유사 분열 세포 노화 동안 게놈 불안정성을 분석합니다 Published: October 16, 2014 doi: 10.3791/51850
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Rensselaer Polytechnic Institute

Summary

변동 테스트를 통해 측정 된 사카로 미세스 세 레비 시아 젊은 세포에서 돌연변이 비율이 상이한 연령의 증식 및 모 세포의 돌연변이 빈도를 예측하는데 사용된다. 자기 정렬 및 유동 세포 계측법은 다음 예측 돌연변이 주파수에서 모든 편차를 식별하기 위해 실제 돌연변이 주파수와 어머니 세포의 나이를 측정하는 데 사용됩니다.

Abstract

사카로 미세스 세 레비 시아는 메커니즘과 게놈 불안정성의 결과를 검사하는 훌륭한 모델 시스템이었다. DNA 수리 및 DNA 손상 반응 인자가 아니라 다양한 종에 걸쳐 보존되어 있기 때문에이 효모 모델에서 얻은 정보는, 인간을 포함한 많은 미생물에 적합하다. 그러나, S. 미세스 세 레비 시아는 아직 완전히 여부 연령 증가 증식 및 (유사 분열)와 돌연변이 변화를 축적의 속도 기술적 제약으로 해결하는 데 사용되지 않았습니다. 예를 들어, 미세 조작을 통한 효모 증식 및 수명의 측정은 드문 돌연변이 검출을 금지하는 세포의 매우 작은 집단을 포함한다. 딸 세포 사멸을 유도함으로써 인구 머더 세포 농축 유전 방법이 개발되어 왔지만, 인구 크기는 여전히 선택 시스템을 손상 무작위 돌연변이가 발생하는 빈도에 의​​해 제한된다. 현재의 프로토콜은 자기 sorti을 활용표면 표지 효모 어머니 세포의 NG는 표현형 선택을 통해 희귀 돌연변이를 계량하는 어머니 세포 노화의 충분한 인구를 얻었다. 변동 테스트를 통해 측정 돌연변이율, 돌연변이 주파수는 제 젊은 세포 확립과 증식 및 다양한 연령대의 어머니 세포에서 돌연변이의 빈도를 예측하는데 사용된다. 돌연변이 빈도는 정렬 된 머더 셀에 대해 결정되며, 셀의 어머니는 나이 세포 분열 동안 그들의 세포 표면에 형성된 봉오리 흉터를 검출하는 형광 시약으로 염색하여 유세포 사용하여 결정된다. 실험적으로 소정의 증식 및 나이 머더 세포 관찰 주파수로 세포 분열의 수에 기초하여 예측 된 돌연변이 주파수의 비교는 축적 돌연변이 비율에 나이 - 관련 변화가 있는지 여부를 식별 할 수있다. 이 기본 프로토콜의 변형이 특정 유전자 기능의 변화의 영향을 조사하는 수단을 제공하거나돌연변이의 축적에 대한 특정 환경 조건 증식 및 노화 동안 메커니즘에게 기본 게놈 불안정성을 해결합니다.

Introduction

이러한 효모 사카로 미세스 세 레비 시아와 같은 미생물, 돌연변이율을 조사하는 우수한 모델이지만,이 모델은 완전히 유사 분열 세포의 노화 동안 돌연변이의 축적을 조사하는 데에 이용되지 않았다. 핵 게놈에서 돌연변이의 축적은 유전자의 기능을 하나 (또는 변형) 진보의 손실이 발생하여 노화에 기여하는 가설이있다. 크게 때문에 손쉬운 유전 시스템이 프로세스에 영향을 미치는 유전 적 및 환경 적 요인들의 식별 및 미생물 희귀 표현형 변화를 정량화의 용이성을 촉진 할 수 노화 동안에 메커니즘과 돌연변이 축적의 영향을 연구하기 위해 미생물 시스템을 사용할 수있는 능력. DNA 수리 인자 및 DNA 손상 반응 단백질이 아니라 다양한 종에 걸쳐 보존되고, 유기체 노화 기본적인 유사성 S. 등 다양한 미생물에 대해 식별 된 cerevisiae의의그것은 가능성이 있음을 만드는 D 포유류 3, 효모의 연구에서 얻은 결과는 많은 생물의 노화와 관련됩니다.

S. 노화에 관한 연구 cerevisiae의 연대기 노화 또는 세포의 증식 및 노화를 측정하는이 노화 모델을 사용한다. 연대 기적 노화 영양분 고갈 3 비 분할 상태 (정지상)에 효모 세포 집단의 생존 능력의 점진적인 손실을 특징으로한다. 연대 기적 노화 모델은 큰 세포 집단 쉽게 돌연변이 세포 표현형 선택을 수행하기 위해이 모델에서 획득되기 때문에 돌연변이는, 4 세를 축적 증가 함을 입증하기 위해 사용되었다. 이 경우에, 변이 축적이 성장 신호 전달 경로 및 산화 적 스트레스 (5)에 의해 영향을받을 것처럼, 이들 각 요소는 다세포 진핵 3에서 에이징 이해에 중요한 것이다. 증식 및 노화 모델은 비대칭을 divisi 악용S. 사이에 연속 셀 세대 세 발생 노화를 조사하는 cerevisiae의 어머니와 딸 세포. 효모 증식 및 노화는 종종 마이크로 유체 장치 6,7에서 효모 세포의 작은 인구의 비디오 현미경을 통해 어머니와 딸 세포, 또는 최근의 작은 인구의 미세 조작을 통해 측정되었다. 제한된 인구 크기는 전체 게놈 정보가 하나의 세포로부터 얻을 수있다 또는 매우 높은 주파수 유전자 변화가 팔을 측정하지 않는 한 유사 분열 노화 동안 돌연변이의 축적을 조사하는 이러한 접근 방식은 잘못 적합하다. 단일 셀의 전체 게놈 서열은 돌연변이의 축적을 조사위한 실질적인 데이터 세트를 제공하지만 표현형 선택 시스템 메커니즘보기 기본 돌연변이 축적 공부 돌연변이 비율을 측정하는 수단을 제공하는 중요한 이점을 가지고있다. 연구는 haploi의 표현형의 선택을 통해 돌연변이 주파수와 속도를 검사합니다증식 및 노화 동안 D 효모 균주는 아직보고되지 않았다.

돌연변이율 일반적 변동 시험 구를 사용하여 측정된다. 돌연변이 빈도 값은 인구 유전자 서열의 변이를 형질 세포의 총 수를 반영한​​다. 이것은 독립적 인 돌연변이가 발생하는 세포와 단순히 기존의 돌연변이를 상속 그 세포의 자손이 포함되어 있습니다. 반대로, 변동 테스트를 통해 측정 돌연변이율 새롭게 각 전지 발전 발생할 독립적 돌연변이의 수를 나타낸다. 이러한 시험은 일반적으로, 표적 서열에서 기존의 돌연변이 세포를 첨가 가까운 포화 배양 성장하고, 선택 배지에서의 성장에 의해 돌연변이 세포를 식별 할 가능성을 감소시키기 위해 낮은 세포 밀도에 많은 복제 배양 물을 접종 포함한다. 복제 개체군에서 식별 돌연변이 세포의 숫자는 난의 수를 추정하기 위해 여러 수학적 모델 중 하나를 사용성장 9시 발생 ndependent 돌연변이. 평균 모집단 크기에 독립적 돌연변이의 수를 비교하는 것은 돌연변이율의 측정 값을 제공한다. S.에서 이 유전자의 기능 상실 돌연변이가 선택 표현형을 생산 이후로 미세스 세 레비 시아는 돌연변이 주파수 및 요금 자주 URA3 및 CAN1 유전자를 사용하여 측정한다. URA3에 의해 코드되는 단백질은 독성 분자 (10)에 5-FOA 변환 이후 URA3 기능의 손실, 5 - 플루오로 오로 산 (5-FOA)에 내성 세포를 렌더링합니다. CAN1에 의해 코드되는 단백질은 세포 11에 아르기닌 canavanine를 전송하기 때문에 CAN1의 기능의 손실, 세포 canavanine, 독성 아르기닌 아날로그에 내성이 될 수 있습니다.

모두 유전 적, 물리적 정렬 전략이 성공적으로 S.의 큰 인구를 얻기 위해 사용되었다 cerevisiae의 어머니 세포 증식 및 노화의 조사를 용이하게하기 위해. 유전 전략은 인구의 딸 세포 생존에 선택 영리한 방법을 포함한다. 어머니 농축 프로그램 (MEP)는에 loxP 사이트 (12)를 포함하도록 설계되었습니다 두 가지 중요한 유전자의 딸 고유의 중단으로 이어지는, 외동 딸 세포에 Cre 호텔의 재조합 효소의 발현 베타 - 에스트라 디올 유도를 포함한다. MEP 균주 유도제의 부재 하에서 통상적으로 성장 될 수 있지만, 머더 세포 딸 세포는 세포주기 (12)를 통해 처음으로 진행 중에 통상 M-단계에서 체포 반면, 유도 다음 분할 할 것이다. 이 시스템은 크게 노화 중에 돌연변이 축적을 연구하는 데 사용되지는 않았지만, 이는 노화 머더 셀 13,14에서 이형의 손실 배체 효모 균주의 게놈 불안정성 비교적 빈번한 형태뿐만 아니라 생화학 적 변화를 연구하는 데 사용되어왔다. 마찬가지로, 도터 피뢰기 시스템 S. 딸의 특정 식을 포함 cerevisiae URA3 유전자 15. 5-FOA가되는 URA3을 표현하는 점 딸 세포가 죽을 것이다, 배지에 첨가 될 때까지 어머니 세포가 15 성장을 계속하는 동안 딸 - 피뢰기 균주는 일반적으로 성장한다. 이러한 머더 세포 농축 시스템에 유용하지만, 이들은 선택 시스템을 구성하는 유전자 기능의 유지에 의존한다. 선택 시스템의 하나 이상의 구성 요소의 임의의 돌연변이가 선택 벗어나 지수 딸 세포 증식 될 수있다. MEP 균주의 개발 과정에서, 적절한 크기의 인구가 선택 (12)을 벗어날 수있는 돌연변이 딸 세포의 모양을 회피하기로 결정했다. 그러나, 인구 규모에서이 제한 증식 및 노화 동안 게놈 불안정성의 드문 형태의 탐지를 타협. 인구의 크기에 제한이 부분적으로 각 유전자의 두 카피가 가장 때문에, 선택 시스템에 공헌하여 배체 효모 균주를 사용함으로써 극복 될 수있다돌연변이 가능성이 12 열성이 될 것이다. 그러나 이배체 균주의 사용은 쉽게 쉽게 반수체 효모 세포에서 검출 될 수있는 것에 비해 돌연변이를 검출 할 수 이벤트의 유형을 제한한다.

물리적 정렬 전략 어머니 세포의 큰 인구에 풍부하게 레이블이없는 딸 세포에서 레이블이 세포 표면 어머니 세포의 분리를 포함한다. S.의 세포 표면 단백질이 관찰 (세포벽 단백질) cerevisiae의 딸 세포는 새로 그들은 16을 생산 딸 세포 레이블없이 어머니 세포에 라벨을 악용 한 신진 동안 합성된다. 예를 들어, 비오틴과의 표면에 표지 된 효모 세포의 초기 집단을 성장시킬 수 있고, 그 다음 초기 모집단 생성 딸 세포는 그들의 표면 상에 비오틴을 함유하지 않기 때문에 16 정렬 안티 비오틴 마이크로 비드 및 자석을 사용하여 자신의 딸 세포로부터 분리 . 직렬 성장과정렬 어머니 세포의 점진적 이전 인구가 획득하고 분석 할 수 있습니다. 이 절차는 효모 13,14,17,18의 증식 및 세포 노화시 생리 및 유전자 발현의 변화를 조사하기 위해 성공적으로 사용되어왔다. 현재의 방법은 잠재적으로 희귀 한 형질 변이 또는 선택 사항을 정량 게놈 불안정성의 다른 형태의 축적을 측정 할 목적으로 머더 셀이 풍부 비오틴 라벨링 및 자기 정렬 기술을 적응시킨다. 직렬 성장 및 물리적 정렬 점진적 이전 머더 세포에서 돌연변이 축적 분석뿐만 아니라 자신의 딸 세포 집단을 허용한다. 생성 당 돌연변이 비율의 결정은 예측 된 돌연변이 빈도가 세포 분열의 특정한 번호를받은 머더 셀에 대해 계산 될 수있다. 예측 주파수 값으로 인해 관찰 mutati에서 세포 분열의 추가 라운드, 상당한 편차로 예상 증가를 기반으로하고 있기 때문에예측 값과 비교 주파수에 축적 돌연변이의 비율 연령별 변화에 대한 증거를 제공합니다. 이 프로토콜을 이용하여, 유동 세포 계측법에 의해 분석하여 결합 머더 세포 세포 분열 부위에 대응 봉오리 흉터의 형광 염색을 신속하게 정렬 및 정렬되지 않은 집단의 연령 분포를 결정하는데 사용될 수있다. 이러한 반응성 산소 종을 검출하기 위해 사용되는 것과 같은 추가의 형광 시약은 또한이 프로토콜 동안 이용 될 수있다. 전반적으로,이 프로토콜은 노화 관련 유전자의 불안정성에 영향을 미치는 유전 적, 환경 적 요인을 연구에 적합 모델 생물의 노화와 관련된 세포의 생리적 변화에 대한 상관 관계에 대한 가능성이있는 게놈 불안정성 연령에 따라 변화를 효율적으로 분석 할 수 있습니다.

Protocol

미디어 및 솔루션의 1 준비

  1. 효모 추출물 - 펩톤 - 포도당 (YPD) 표준 프로토콜에 대한 다양한 매체를 이용하여 세포를 성장. 2 % 박토 - 펩톤, 1 % 효모 추출물, YPD 배지 대 2 % 글루코스 용액을 제조하고 고체 매질 (19)에 대해 2 % 박토 - 한천을 추가한다. 살균 압력솥. 특정 성장 조건이나 돌연변이 효모를 테스트하기 위해, 필요한 경우, 다른 매체를 사용합니다.
  2. canavanine 내성 돌연변이에 대한 선택 60 ㎎ / ℓ의 canavanine (SC-인수 + canavanine)와 아르기닌 부족 고체 합성 완전 배지를 확인합니다. 아르기닌 (강하 믹스)가없는 아미노산, 2 % 글루코스, 0.2 % 완전한 보완 혼합물없이 0.67 % 박토 효모 질소베이스, 및 2 % 박토 한천 19 인 용액을 제조 하였다. 오토 클레이브 및 20 ㎎ / ㎖ 원액에서 canavanine을 추가하는 멋진 전에 19 (4 ° C에 저장, 필터 소독).
    1. 5 - 플루오로 오로 산 (5-FOA)를 포함하는 고체 합성 완전 배지를 확인합니다. 500 준비아미노산없이 1.34 % 박토 효모 질소베이스, 4 % 포도당, 0.4 % 완전한 보완 혼합물 및 0.2 % 5-FOA이며 용액을 19 ㎖의 필터 - 멸균. 그 다음, 오토 클레이브 (500) 4 % 박토 한천 용액 ㎖, 차가운 짧게, 그리고 500 ㎖의 필터 - 멸균 양액과 혼합한다. 다른 돌연변이 분석에 대한 적절한 대체 용지를 사용하십시오.
  3. 비오틴 라벨링, 500ml의 1X 포스페이트 137 mM 염화나트륨, 2.7 mM의 염화칼륨, 10.14 mM의 인산 나트륨, 및 1.77 mM의 인산 칼륨 이염, pH가 함유 완충 식염수 (PBS) 용액 8 스토어 4 ° C를 만들고에 유지 사용하는 동안 얼음.
  4. 멸균, 초순수에서 새로운 5 밀리미터 비오틴 재고를 확인하십시오.
  5. , 비오틴 라벨을 해소 1X PBS의 500 ML, 100 mM의 글리신을 확인하십시오. 4 ° C에서 저장하고 사용하는 동안 얼음에 보관하십시오.
  6. 사용 된 세포 및 실험 기간의 수에 따라, 1X PBS, 2 mM의 EDTA, 0.5 %를 함유하는 비드 BOVI 표지 버퍼 1-2 L 할NE 혈청 알부민. 필터 소독 및 탈 가스 버퍼입니다. 4 ° C에서 저장하고 사용하는 동안 얼음에 보관하십시오.
  7. 세포 생존율 측정에 사용하기위한 RT에서 1X PBS에 0.​​4 %의 트리 판 블루 용액, 필터 소독, 저장을 준비한다.
  8. 밀 배아 응집소 (WGA) 형광 복합체 나누어지는 작은 볼륨 (~ 100 μL)는 세포 나이를 결정하는 데 사용하기 위해 포장 호일 (또는 불투명)의 microcentrifuge 튜브에서 -20 ° C에 저장합니다.

돌연변이 속도 및 주파수의 2 결정

  1. 표준 배양 조건에서 성장한 세포 변동 테스트를 이용하여 셀 당 생성 기준선 돌연변이율을 확립한다. 열한 초기 정지상 (~ 10 8 세포 / ㎖)에 1000 ~ 5000 세포 / ml의 초기 밀도에서 1 ㎖의 문화를 복제에 칠을 성장.
    1. 2000 및 집락 형성 - 단위 / ㎖를 결정하기 위해 비 선택 배지 (YPD)에 1-4 μl를 확산 각 복제 문화를 들면, 세포 하나를 희석한다. 펠렛 ~ 2400 X에서 세포를 나머지100 ㎕의 물에 마이크로 원심 및 재현 탁에서 1 분 g는 돌연변이를 식별하는 선택적 매체에 전파합니다. 식민지를 계산하기 전에 30 ° C에서 삼일 (세포의 성장 속도에 따라 필요에 따라 배양 시간을 조정)에 대한 번호판을 품어.
    2. 선택 배지에 수득 된 돌연변이 콜로니 (R)의 수에 기초하여 상기 시험에서 발생한 독립적 돌연변이 (m)의 수를 결정한다. 9 아래의 식 연구에 대한 돌연변이 식민지의 평균 수를 대입하여 m를 찾기 위해 레아 - Coulson 평균 추정을 사용합니다. 수학 식의 좌측 거의 0이 될 때까지 그런 m의 값을 대체.
      식 (1)
    3. 돌연변이 비율을 판단하기 위해, 먼저 복제 배양과 부피 평균 콜로니 - 형성 단위 / ㎖를 곱하여 선택 배지 상에 확산 가능한 세포 수의 평균을 계산선택적 매체에 ml의 확산에 문화. 셀 당 생성 돌연변이율을 수득 가능한 세포의 평균 숫자로 본 단계 2.1.2에서 m의 값을 나눈다.
  2. 단계 2.1.3에서 설명 된 바와 같이 개별적으로 시험 각 복제에 선택적 배양 용 매체 상에 확산 가능한 세포의 개수를 계산한다. 돌연변이 빈도를 얻기 위해 선택 배지 상에 확산 가능한 세포의 수에 의해 얻어진 배양 돌연변이 콜로니 (R)의 수를 나눈다. 기준 돌연변이 주파수와 2.1 단계에서 복제 문화에서 개별 돌연변이 주파수의 평균 또는 중간 값을 사용합니다.
  3. 돌연변이 축적 연령별 변화를 테스트 할 때 필요 돌연변이 빈도의 변화에​​ 라벨링 공정 결과가 고려되어야하는 경우를 결정하기 위해 비오틴 라벨링 세포 (3.2 및 3.4 단계) 전후의 주파수 측정을 수행.

3 비오틴 라벨링

  1. 세인트reak S. cerevisiae의 YPD 매체에 -80 ° C에서 글리세롤에서 1-3 일 동안 30 ° C에서 배양한다.
  2. 멸균 피펫 팁을 사용하여, 물 보관 1 ㎖ (또는 그 이상)의 연속 판에서 전송 세포를 염두에 행진의 두껍게 성장 부분의 1 ~ 1.5 cm 약 10 8 세포를 줄 것이다. 혈구를 사용하여 정확한 세포 밀도를 결정합니다.
  3. 변형 (또는 처리 조건) 컬렉션 포인트 당 돌연변이 빈도가 결정되는 또는 선택 배지에 샘플링 당 적어도 5-10 돌연변이 콜로니를 수득하기에 충분한 모집단 크기 당 10 8 세포 레이블 (단계 2.2에서 돌연변이 빈도에 기초하여). 변형 / 조건 별 기준 측정을위한 추가 열 여덟 세포를 포함합니다.
  4. 제조 업체에서, 5 mM의 비오틴 시약 스톡을 사용 부드럽게 배양 동안 바위를 제외하고 표준 절차에 따라 비오틴 레이블입니다. 모든 원심 분리 단계에 대한 3000 XG에 4 ° C에서 5 분 동안 스핀,이야4 ° C 이상의 온도에서 회전 인스 증가 세포의 손실로 이어질 수 있습니다. 최종 세척 후, 물에 10 8 표지 세포 / ml의 농도로 세포를 일시.
  5. 트리 판 블루 염색을 이용하여 세포의 생존 능력을 확인합니다. 물 23 μL 및 1X PBS에 0.​​4 % 트리 판 블루의 67 μL와 세포의 10 μl를 희석. 혈구를 사용하여 라이브 (흠) 죽은 (염색) 세포를 득점하기 전에 실온에서 적어도 40 분 동안 품어.
  6. 게놈 불안정성, 나이 셀 및 기타 관련 특성에 대한베이스 라인 값을 측정한다 (섹션 5, 6 참조, 및 7).
  7. 삼각 플라스크 (약 5 × 106 세포 / ml) 10 8 세포 당 YPD 배지 20 ㎖에 비오틴 - 표지 된 세포 이동. 10 8 세포 / ml (4-5 셀 세대)의 대략적인 밀도 문화 (들) 20 ° C에서 16 ~ 18 시간 성장하지만, 세포가 정지 단계에 도달 할 수 없습니다. 30 ° C에서 성장을위한 짧은 배양 시간을 사용합니다. 바이오틴 표지 다 유지4 ° C에서 ELL 학생까지 몇 시간 전에 매체에 첨가, 성장기 및 수집의 타이밍을 최적화하기 위해 필요한 경우.

4 구슬 라벨링 및 자기 정렬

  1. 성장기 후, 혈구를 이용하여 세포 밀도를 결정하는 문화의 분취 액을 희석한다. 3,000 X g에서 4 ° C에서 5 분 동안 원심 분리하여 펠렛 세포. 상층 액을 붓고.
  2. 다음, 비드 라벨 ​​버퍼의 30 ㎖에 펠렛을 일시 중단 텍싱 원심 분리 및 4.1 절에서와 같이 상층 액을 주입하여 세포를 씻으십시오. 씻어 반복합니다.
  3. 완전 소용돌이로 교반하여 10 총 8 개 세포 당 50 ㎕의 비드 라벨 버퍼에 세포를 재현 탁. 혼합하기 위해 잠시 열 여덟 총 세포와 소용돌이 당 2 μL에게 자석 구슬을 추가합니다. 에서 온라인 프로토콜에서 수정 (혼합 주기적으로 반전, 10 분 동안 얼음에 품어 http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf </>).
  4. 비드 라벨 ​​버퍼의 30 ㎖의 세포를 세 번 씻으십시오.
  5. 세포를 재현 탁 아르 단지 때까지 중간 설정에 10 총 8 개 세포 당 0.5 ㎖의 비드 라벨 버퍼와 잠시 소용돌이 펠렛을 추가합니다. 남아있는 세포 덩어리를 제거하기 위해 50 ML 튜브로 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 부어. 필요한 경우, 이전 컬럼에로드 1-2 시간 동안 얼음에 세포를 둡니다.
  6. 자기 열이 바인딩 세척, 자기 비드 표지 어머니 세포를 용출 제조업체의 권장 프로토콜을 따르십시오. 표지 세포의 증가 복구의 경우, 2 × 10 9 총 세포 당 하나 이상의 열을 사용합니다.
    1. 그들은 흐름을 차단하므로, 열을로드 할 때 발생하는 거품을 제거합니다. 제거에 온라인 프로토콜에서 수정 구슬 (사이에 갇혀되는 것을 세포를 방지하기 위해 세척 사이의 구분에 열을 대체 http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf).
    2. 원하는 경우, 머더 세포에 의해 생성 젊은 세포를 분석하는 바인딩 및 세정 단계에서 흐를 저장한다. 단계 4.7에 설명 된대로 세포를 집중.
    3. 한 번에 여러 개의 샘플을 처리하기 위해 다중 열 구분 기호를 사용합니다. 같은 포집 관에 동일한 샘플의 용출 여러 열은 처리 시간 감소 및 세포의 손실을 감소시킵니다.
  7. 4 ° C에서 5 분 동안 3,000 XG에서 원심 분리하여 용출 어머니 세포를 집중. 대기음은 1 만 모두 10 8 원래 바이오틴 표지 세포 당 버퍼 ML. 소용돌이가 잠시 버퍼를 남아있는 세포를 일시 중단합니다.
  8. 세포의 분취 액을 희석하고 셀 밀도 및 혈구를 사용하여 세포 생존율을 결정 트리 판 블루로 염색하고 (단계 3.5 참조). 회수 된 세포의 총 수를 계산한다.
    1. 세포의 수는 예상보다 실질적으로 높은 경우, 젊은 세포 오염을 제거하려고하는 다른 칼럼을 통해 용출 샘플을 통과한다.세포의 수는 예상보다 실질적으로 낮은 경우, 머더 세포의 수율을 개선하기 위해 시도하는 또 다른 칼럼을 통해 샘플을 통해 저장된 유동을 전달한다.
  9. 섹션 5 또는 6에 설명 된대로하지 않고, 다시 자신의 증식 및 연령 (단계 3.7)을 증가시키고 비드 표시하고 (단계를 4.1-4.8.1) 정렬하여 수행하는 YPD 배지에서 세포를 성장, 추가 분석을 위해 세포를 사용하여 비오틴 라벨을 반복해야합니다.

증식 및 연령 (5) 결정

  1. 이 섹션의 모든 단계에 대한 RT에서 5,000 XG에서 2 분 동안 세포를 스핀. 1.5 ㎖의 원심 분리 관에 복구 세포 (~ 10 8 세포 / ml) 25 μl를 넣고 PBS 1X 1 ㎖로 두 번 씻는다. 상층 액을 기음.
    1. WGA 공역의 나누어지는 해동, 와류 믹스, 단백질 응집체를 제거하기 위해 잠시 회전합니다. 차의 표면에 꽃 봉오리 흉터에 라벨을 PBS 1 배 180 ㎕의 형광 분자에 결합 WGA의 20 μL에서 세포를 일시 중단전자 셀. 호일로 1.5 ㎖의 원심 분리 관을 덮고 부드러운 30 분 동안 30 ° C에서 락을 함께 품어.
    2. 1 ㎖의 1X PBS로 3 회 세척 할 것.
  2. 형광 현미경, 라벨 슬라이드 들어 안티 퇴색 방지제를 이용 표준 프로토콜 당 마운트. 완전 이미징 동안 세포의 움직임을 방지하기 위해 커버 슬립을 밀봉하기 전에 어둠 속에서 (몇 일까지) 슬라이드를 치료. 셀 시대의 대표적인 측정을 얻기 위해 샘플 당 적어도 50 세포에 꽃 봉오리 흉터를 계산합니다. 최대 필요한 경우, 새싹 흉터를 볼 1개월에 대한 저장 슬라이드.
    1. 대안 적으로, 단계 5.1.2 후 PBS 1X 1 ㎖에 현탁 세포를 유세포 분석기를 수행하여 WGA-공액로부터 형광 신호의 강도를 결정. WGA - 알렉사 488에 대한 505 nm의 긴 패스 필터와 405 nm의 여기 레이저와 30분의 530 nm의 방출 필터를 사용하여 각 수거 장소에 대한 흠없는 컨트롤을 포함합니다.
  3. 에 현미경으로 계산 젊은 세포와 세 세포에 대한 그래프 봉오리 흉터x 축에 동일한 세포 집단에서 WGA-공액 형광 정규화 기하 평균에 대하여 y 축 (염색 등비 / 흠 기하 평균). 이 관계에 대한 선형 추세선의 방정식을 구하십시오. 후속 실험에서, 식 X 용 세포 집단의 WGA-공액 형광 강도의 정규화 기하 평균을 대체하여 시료의 평균 기포 나이를 결정하기 위해 Y 해결.

6 돌연변이 주파수

  1. 단계 2.1.1에 설명 된대로 확산은 YPD 매체와 선택적 매체에 단계 4.7에서 완충액 어머니 세포를 분류. 1 분 동안 5,000 XG에서 선택 배지와 스핀 셀에 대한 재현 탁 어머니 세포 1 ㎖를 사용합니다.
    참고 : 세포가 나이가 인구에 비 실행 가능하고 노화 세포의 수를 증가를 보상하기 위해 연령 증가로 YPD 매체에 희석 세포의 큰 볼륨을 확산.
    1. YPD 배지로부터 선택 배지 플레이트 부화각각 3, 4 일 동안 30 ° C에서 6.1 단계. 아주 오래된 세포 또는 느리게 성장하는 균주 일주에 배양 시간을 위로 늘립니다. 단계 2.2에 설명 된대로 돌연변이 주파수를 계산합니다.

7 감안할 때 증식 및 연령에 대한 예측 돌연변이 주파수를 계산

  1. 중요한 정렬을위한 정렬 머더 세포의 평균 연령에서 초기 셀 모집단의 평균 연령을 감산함으로써 실험 과정 위에 비오틴 표지 된 세포의 증식 및 연령의 평균 증가를 계산한다. 단계 5.2에서 계산 된 세포 나이를 사용하거나 5.2.2 단계.
  2. 단계 7.1에서 계산 된 평균 세포 연령의 증가에 의해 단계 2.1.3에서 얻어진 돌연변이 속도를 곱하십시오. 관련된 세포 증식 및 연령에 대한 예측값 돌연변이 빈도를 결정하는 단계 2.2에서 계산 된 초기 모집단의 기준 변이 주파수에이 값을 추가한다.

Representative Results

도 1의 흐름도 돌연변이율, 주파수 및 셀 나이가 측정되는 지점을 포함한 전반적인 절차의 단계를 보여준다. 그 라벨 및 자기 정렬을위한 적절한 모집단 크기를 선택하기위한 필요가 있기 때문에 정확한 주파수와 젊은 세포 집단의 돌연변이 (또는 게놈 불안정성의 다른 형태)의 비율을 결정하는 단계, 제 중요한 단계이다. 비율 값은 변동 시험 구를 사용하여 설정 될 수있다. 5-FOA에 대한 저항성을 URA3 유전자의 canavanine 저항 또는 돌연변이를 부여 CAN1 유전자의 돌연변이에 대해 선택한 BY4741 유전 적 배경 20 효모 균주의 예제 결과는 그림 2에 나타내었다. 세포 대표 20 ° C에서 성장했다 대표 주파수의 실험 속도 실험, 그리고 20 ° C와 30 ° C에서. 이러한 초기 온도는 세포 집단이 성장하기 때문에 사용했다30 ° C에서 다음 후속 대표 정렬 실험을 위해 20 ° C에서 성장했다. 독립적 인 임상 시험 비율 값은 염색체 V에 정상적인 위치에 CAN1 유전자가 변형에 대한 비오틴 라벨링 후 초기 셀 인구와 세포에 대한 차이가 없었다, 왼쪽 팔 텔로미어 (telomere)에서 약 32 킬로의 쌍 ( www.yeastgenome.com ) ( 그림 2A, 라벤더 열). CAN1의 돌연변이 속도는 염색체 V에 정상 위치에서 CAN1 유전자의 삭제 및 약 25 킬로의 쌍 텔로미어 (telomere)에서 염색체 VIII의 오른쪽 팔에 CAN1의 삽입을 가진 초 효모의 초기 인구 실질적으로 높았다 (21) (도 2B). CAN1 유전자 돌연변이 빈도는 하나의 성장 온도에서 초기 세포 집단과 비오틴 표지 된 세포에 대한 차이가 없었다 (FIgure의 2A, 파란색 열). 그러나, 돌연변이 주파수가 20 ° C에서 얻어진 30 ° C에서 돌연변이 주파수보다 더 높은 것으로 밝혀졌다. 이 온도 효과를 CAN1 유전자로 제한 여부를 테스트하기 위해, 우리는 염색체 VIII에 삽입 CAN1이 효모를 사용하여 5-FOA에 저항을 선택하여 URA3의 변이를 측정 하였다. 이 균주는 또한 염색체 V에 정상적인 사이트에서 URA3의 삭제 및 VIII 염색체 텔로미어 (21)로부터 약 40 킬로 쌍의 오른팔 상 URA3의 삽입이있다. 돌연변이 주파수는이 염색체 위치 (그림 2C)에서도 URA3 20 ° C에서 높았다. 전반적으로,이 성장 온도가 돌연변이의 주파수에 영향을 미칠 수 있음을 증명하지만, 비오틴 라벨링 돌연변이 주파수에 영향을 미치는 것으로 보이지 않는다. 따라서 돌연변이 속도와 초기 인구에 대한 주파수는 같은 성장 템피에서 결정해야성장과 정렬의 라운드에 사용됩니다 rature. 이것은 종래의 돌연변이 또는 유전자 재배 열의 다른 유형을 조사하기 프로토콜을 사용하여 게놈 불안정성을 미치지 않는 것을 바이오틴 라벨을 확인하는 것이 바람직하다.

예상 한 바와 같이,도 2a에 도시 돌연변이율 값은 대응하는 주파수 측정보다 몇 배 더 낮다. 돌연변이율이 성장 기간의 끝에서의 돌연변이 빈도를 측정하면서, 인구 돌연변이 세포의 누적 수를, 세포 분열의 각 라운드 새로운 돌연변이 세포의 모양을 측정하기 때문에 차이가 발생한다. 이러한 시험을위한 요금 및 95 % 신뢰 구간은 재생 가능한 결과가 반복 실험의 최소 수는이 프로토콜에 대한 제안 재판 당 일곱 복제 배양을 사용하여 수득 할 수 있음을 보여준다.

초기 주파수 및 속도 값이 결정되면, 모집단 크기는 CH되어야적절한 세포가 안정적으로 돌연변이 주파수를 결정하는 정렬의 여러 라운드 후 존재하는 것을 보장 OSEN. 주파수 및 요금도 2a에 도시 된 것과 유사한 경우 노화 동안 분석 될 시점마다 열 여덟 세포의 인구에 레이블을하는 것은 적절하다. 이 결정은 또한 정렬 각 라운드 후 복구하는 방법을 효율적으로 표시된 어머니 세포에 따라 달라집니다. 표지 된 세포를 어머니 회수 효율을 신속하고 간단하게 각각의 정렬을위한 컬럼에서 용출 된 셀의 수를 결정하고, 세포 형태를 조사 혈구를 사용하여 평가 될 수있다. 두 주요 포인트는 예를 들어 회수 효율 데이터 (도 3a)에 의해 도시된다 : 세포의 회수 번호 제 정렬 후 예상보다 높게 나타날 수 있고, 세포의 작은 점진적인 손실은 계속 정렬로 예상된다. 첫 번째 정렬 한 후 몇 가지 실험에서 세포의 예상보다 더 많은 수의 수는 입술초기 인구에있는 세포에 꽃 봉 오리의 라벨에서 ULT. 바이오틴 라벨하는 셀의 수를 결정할 때 봉오리와 효모 세포는 전형적으로 하나의 셀로서 획득된다. 초기 인구에있는 꽃 봉오리의 레이블은, 그러나, 허용하는 그 꽃 봉오리에서 개발하는 세포는 정렬하는 동안 열을 유지한다. 회수 효율의 판정이 발생에 영향은 초기 셀 모집단 싹 세포 분획에 의존한다. 높은 세포 수에 대한 제 2 전위 이유 후 정렬 한 정렬 동안 세포 분열을 완료 할 수있다이 시점에서 더 큰 싹 세포있을 경향이 있다는 것이다. 따라서, 여전히 어머니 세포 부착 큰 싹이 정렬하지만 용출 세포 검사시 다음과 같은 별개의 셀을 표시 할 수있다. 세포의 일부 손실이 증가하고, 각 라운드의 선별 관찰하는 동안 프로토콜의 각 라운드 후에 세포 80-90 %를 신뢰성 유지 될 수있다orting. 이는 표지 세포의 80 % 이상이 불필요하게 큰 초기 셀 모집단에 레이블 필요성을 피하기 위해 절연되는 것을 보장하는 절차를 연습하는 노력 가치가있다. 첫 번째 정렬 이후에 복구에 약간의 변화가 있었다 비록 첫 번째 정렬 (30 분 YPD 배지에서 1 mM의 과산화수소) 후 가벼운 스트레스 세포의 치료는 성장과 정렬의 계속 라운드 세포의 효율적인 복구를 방지하지 않았다 스트레스 (그림 3A).

세포 형태 및 생존을 판독 또한 어머니 세포의 성공적인 분리를 확인하기위한 비 선택 배지에서 세포를 전파 할 때 콜로니 형성 단위의 농도를 결정하는 데 사용 희석 / 볼륨을 조정하기위한 모두 유용하다. 어머니 세포는 딸 세포 (그림 3B)에 비해 점점 더 큰하고 나이가 더 불규칙한 모양이된다. 어머니 세포 샘플 따라서 주로 대형 IRR 구성되어야실험이 분류의 각 라운드를 통해 진행 egularly 세포 모양. 일정한 형상의 많은 작은 타원형 셀의 존재는 그 머더 셀이 적절히 딸 세포로부터 분리되지 않는 나타낼 수있다. 첫째 5-10 세포 세대 동안 많은 변화가 없을 수도 있지만 어머니 세포의 생존 능력은 점진적으로 성장하고 정렬 각 라운드로 감소한다. 콜로니를 형성 할 수있는 세포의 수는 세포의 노화에 의한 형성, 세포 무결성 직접 염색의 일부 형태에 의해 실행 가능한 것으로 결정되는 셀의 수보다 훨씬 더 극적으로 감소시킬 수있다. 직접 염색 방법에 의한 생존은 제 (약 80 % 이하)를 감소하기 시작하면, 콜로니 생존 세포의 능력에보다 극적인 감소를 기대 부 밀도를 형성 측정하는 희석 및 볼륨을 조절해야 할 수도 양식 식민지 (이 몇 배 감소)이다.

정렬 개체군 및 개체군의 제어 증식 및 나이 모 세포로부터의 돌연변이 빈도 데이터가 축적 돌연변이 레이트의 연령별 변화에 대해 분석되기 전에 결정되어야한다. 이 꽃 봉오리 흉터 검출 시약 (그림 5)에 대한 신호를 정량화하는 어머니 세포에 꽃 봉오리 흉터의 수동 계산 (그림 4) 또는 유동 세포 계측법을 통해 통해 수행 할 수 있습니다. 버드 흉터가 상대적으로 낮은 배경 신호가 WGA 형광 복합체 (그림 4C)를 이용하여 표시 할 수 있습니다. 그림 4a는 분류 절차의 샘플을 통해 흐름에서 대부분의 세포는 0 또는 1 봉오리 흉터가 있음을 보여줍니다. 컬럼에서 용출 세포는 주로 세 어머니 세포 (그림 (b)와 5)입니다. 일반적으로> 용출 세포의 90 %가 그림 5에 그 결과 유동 세포 계측법에서 쉽게 볼 수있는 어머니의 세포이다. 상대적으로 적은 꽃 봉오리 흉터 세포 (<6) OBTained 비오틴 매우 느리게 분할되어 머더 세포 반대로, 성장의 중요한 라운드 동안 세포 분열의 몇 라운드를 시행하는 표지되지 않은 세포의 오염을 나타낼 수 정렬 이상이 발사 후. 세포 시대의 변화는 인구의 모든 세포가 균일하게 성장하는 경우 정렬의 후속 라운드로 증가 할 수 있습니다.

선형 관계가 WGA-형광 신호 강도 및 셀당 봉오리 흉터의 수 사이에 확립되는 경우 더 큰 세포 집단은 세포의 나이를 평가하는 것이 더 빨리 사용할 수있다. 이 분석을 위해, 모든 WGA-형광 신호 강도의 정규화. 이전 셀에서 증가 된 배경 형광을 고려하여 적절한 흠 세포군 (딸 또는 어머니)에 대해 얻어진 신호에 의해 염색 된 세포의 신호를 분할함으로써 달성 4 피규어되며 같은 대표 세포 인구의 5는 분석.수동 계수는 각각 딸 세포 (그림 4A)과 어머니 세포 집단 (그림 4B)에 대해 0.95와 11.4의 평균 증식 및 나이를 설립했다. 이 두 집단과 세 개의 추가 인구에 대한 표준화 된 WGA-신호 (3.0, 6.9, 14.4의 평균 연령은) 각 인구 (그림 5B)에 대한 봉오리 흉터의 평균 수 역모를 꾸몄다되었다. 이 선형 관계는 셀 나이 빠르고 정확한 결정을 가능하게 유세포 통해 얻어진 정규화 WGA-신호로부터 평균 기포 나이를 결정하는 장래 실험 균주와 같은 시약으로 사용될 수있다. 제어 인구 여전히 실험 간의 유사한 염색 효율을 확인하기 위해 포함되어야한다.

돌연변이의 축적에 나이의 영향은 효율적 돌연변이율 값을 획득하는 세포를 선별하고, 세포 노화가 이루어진다 결정 이전 단계되면 해결 될 수있다. 뉴시점의 mber가되는 결정될 수있다 주파수 비오틴 표지 된 세포 집단의 크기 및 신뢰성있는 결과를 얻기 위해 선택 배지에 도포해야하는 셀의 수에 의존한다. 나이 돌연변이율 변경 후 어머니 세포 노화에 대한 관찰 된 돌연변이 주파수는 유일하게 세포 분열의 추가 라운드에 따라 예상과 다른해야합니다. 예측 된 돌연변이 주파수 관찰 돌연변이 빈도의 비교 축적 돌연변이 비율에 나이 - 관련 차이를 식별 할 수있다. 프로토콜의 섹션 7에 기재된 바와 같이, 상기 예측 된 주파수는 초기 셀 모집단에 대한 기준선 돌연변이율 초기 인구 돌연변이 빈도에 첨가 머더 세포의 증식 및 연령의 증가의 생성물로부터 수득 할 수있다. CAN1 돌연변이 빈도의 증가는 염색체 V에 정상 위치에 CAN1으로 부담 증가의 평균 기포 나이가 관찰되었다(그림 6A)와 염색체 VIII (그림 6B)의 오른쪽 팔에 CAN1로 변형한다. 도 6a 어머니 세포에 대한 관찰 된 돌연변이 주파수로하거나 예측 주파수 아래 비슷하기 때문에, 데이터는 돌연변이 속도의 시대 별 변화에 대한 증거를 제공하지 않습니다. 대조적으로, 염색체상의 VIII CAN1 가진 균주의 모 세포의 돌연변이 주파수는 예측 된 주파수 (도 6b)보다 높았다. 그래프에서 예측 된 주파수 관측 인해 돌연변이 빈도의 큰 증가로 로그 스케일이 y 축에 사용할 수 있었기 때문에 매우 증가 나타나지 않음에 유의. 따라서,도 6b의 결과가 축적 돌연변이의 비율 연령별 증가를지지하는 증거를 제공 않습니다. 도 6a 및도 6b에서 데이터 세트에 대한 결과의 차이는 diffe 가능성 CAN1의 게놈 위치를 임대. 관측 이러한 유형의 세포의 연령 돌연변이 비율에 영향을주는 메커니즘을 연구하고 증식 및 나이와 변이 축적을 설명하기위한 모델을 개발하기 위해 가설을 개발하기위한 시작점을 제공한다.

그림 1
그림 1 흐름 효모 증식 및 노화 동안 돌연변이의 축적을 조사하기위한 전반적인 절차도. 흑백 텍스트 및 화살표는 절차의 주요 단계를 나타냅니다. 곡선 화살표는 재성장과 같은 셀의 정렬의 추가적인 라운드를 점진적으로 더 오래된 세포를 얻기 위해 사용되는 것을 반영한다. 보라색 ​​화살표와 텍스트는 언급 측정이 이루어지는되는 단계를 나타냅니다. 주파수 - 주파수.

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젊은 세포 집단에서 돌연변이의 빈도와 속도의 2 결정 그림. (A) 변이체 콜로니 주파수 / 요금을 계산하기 위해 선택 배지에 도포 가능한 세포의 총 수에 비해 CAN1 유전자의 기능 상실 돌연변이 선택하는 SC-인자 + canavanine 배지에 세포를 확산에 의해 선택되었다. 비오틴 라벨링 (IP) 또는 비오틴 라벨링 (PB) 전후 초기 집단의 세포가 포화 상태에 5,000 세포 / ml의 농도에서 초기 YPD 배지를 사용하여 성장시켰다. 라벤더 열은 속도 측정을 나타내며, 파란색 열은 표시 온도 (20 ° C와 30 ° C)에서 수행 주파수 측정을 나타냅니다. 일곱 복제 문화의 세트는 각 시험 재배하고 2-5 독립적 인 실험을 실시 하였다. 독립적 인 시험에 대해 계산 된 개별 속도 값이 표시되고,이 시험에 대한 오차 막대는 95 % 신뢰 구간이 확인 대표온라인 계산기 (22)를 사용하여 거라고. 주파수는 수단과 표준 편차를 나타냅니다. 사용 부분에 대한 5-FOA에 돌연변이 식민지에 대한 선택 다음 얻어진 염색체 VIII의 오른쪽 팔에 CAN1와 균주를 사용하여. (C) 돌연변이 주파수를 설명 된대로 (B) CAN1 돌연변이 비율이 얻어 표현 염색체 VIII의 오른팔에있는 URA3 유전자 변형. 그렇지 않으면 방법은 부품 용으로하고, 그 수단에 서너 독립적 시험에 대한 표준 편차가 표시되어있다.

그림 3
정렬 각 라운드 후에 용출 셀의 수를 계산함으로써 결정 효율을 정렬 3 실시 예를도. (A) 바이오틴 표지가 1로 설정 한 후, 각 집단에서 시작 셀의 총 개수, 및 t 자기 세포 분류의 각 라운드로부터 용출 된 시료에 존재하는 세포의 수는 전 체 표지 된 세포 분획을 얻기 위해 그 초기 값으로 나누었다. 전체 세포 수는 혈구를 사용하여 얻은 세포 수로부터 결정 하였다. 오렌지 컬럼은 평균 및 표준 프로토콜 다음의 3 개의 독립적 인 실험에 대한 표준 편차를 나타낸다. 블루 컬럼은 세포가 바로 제 정렬 한 후, 30 분 동안 1 mM의 과산화수소로 처리 된 두 개의 독립적 인 실험에 대해 평균 및 표준 편차를 나타낸다. (B)의 크기와 비오틴 라벨링 (포스트 바이오틴)과 머더 세포 후에 세포의 형태를 표준 시야 현미경 20X 목표를 사용하여 표시 자기 정렬의 세 번째 라운드 (일종의 세 어머니 세포) 후 회복되었다. 배경에 흰색 선은 표준 혈구에서 볼 수있는 가장 작은 사각형을 결합 선입니다.K ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
수동 봉오리 흉터 계수를 사용하여 증식 및 연령의 그림 4 결정. 공 초점 현미경은 488 nm에서 검출 543분의 458 나노 미터 대역 통과와 505 nm의 장거리 패스에서 (여기 WGA 형광 복합체로 표지 개별 셀에 꽃 봉오리 흉터를 계산하는 데 사용 된 필터 조합으로). 자기 정렬 (N = 62)의 세 번째 라운드 다음 (A) (딸 세포를 통해 흐름 세포의 수동 봉오리 흉터 카운트). (B) 용출 세포의 수동 봉오리 흉터 카운트 (어머니 세포) 다음 자기 정렬 (N = 54)의 세 번째 라운드. (C) 어머니 세포가 유지 위트 염색 후 3 배 줌 63X 기름 침지 목표를 사용하여 촬영하는 자기 정렬의 세 번째 라운드 다음하 WGA 형광 복합체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
유동 세포 계측법 사용하여 증식 및 연령의 그림 5 결정. WGA 형광 복합체로 염색 만 세포의 샘플을 488 nm에서 검출 30분의 530의 대역 통과와 505 장거리 패스 필터 세트에 여기를 사용하여 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. (A 딸 세포 인구 또는 자기 정렬의 3 라운드 후 용출액 (어머니 세포)에 대한 특정 WGA 형광 강도와 세포의 수를 묘사) 히스토그램. 인구는 그림 4에서 분석들에 해당합니다. 블루 세로 선을 DAU의 대부분에 해당하는 위치를 표시모세포 히스토그램 ghter 세포. (B) 각각에 도시 인구 세포 세 가지 추가 인구 (평균 연령 3.0, 17.5, 14.4)의 형광 신호에 대한 정규화 된 기하학적 평균의 기하 평균의 비로서 계산되었다 염색 된 세포 및 해당 세포 집단 흠의 기하 평균. 이러한 값은 (도 4 및 데이터는 도시되지 않음) 각각의 전체 인구 봉오리 흉터의 평균에 비해 플롯. 이 비교의 트렌드 라인이 R 값은 그래프에 주어진다.

그림 6
그림이 날기에 설명 된대로 증식 및 노화 동안 예측하고 관찰 돌연변이 주파수 사이 그림 6 비교. CAN1 유전자의 돌연변이 세포가 선정되었다염색체 V (A)의 정상 위치 또는 염색체 VIII (B)의 오른팔에 CAN1와 g 균주. 세포는 이전에 비오틴 라벨링 후 20 ° C에서 30 ° C에서 고체 배지에서 재배되었다. 관측 된 주파수 값은 오렌지 열 (OBS)과 갈색 열 (전)으로 표시됩니다 세 세포에 대한 예측 주파수로 표시됩니다. 각 그래프의 첫 번째 열은 4 개의 독립적 인 시험 (PB)에 대한 비오틴 라벨링 후 최초 돌연변이 주파수의 평균과 표준 편차를 보여줍니다. 열 아래의 숫자는 각 인구 (세포 나이)에 대한 봉오리 흉터의 평균 수를 나타냅니다. 도 2a (IP 칼럼) 및도 2b에 도시 한 초기 속도 값을 사용하여 각 프로토콜의 섹션 7에 기재된 바와 같이 독립 예측값을 측정 하였다. 이러한 독립적 인 값은 다음 평균 하였다. 관측 값은 세 가지 시험의 수단이다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다.

Discussion

이 프로토콜은 자원을 사용하기 위해 여러 가지 방법을 조합하고 효율적으로 유사 분열 세포 노화 동안 게놈 불안정성의 연구에 적용 할 cerevisiae의 모델 시스템에서 사용할 수있는 사카로 접근한다. 분석의 다양한 표현형이 선택을 통해 게놈 불안정성의 다른 형태를 정량화하는 돌연변이 또는 염색체 재 배열의 특정 형태의 축적이 가능 연령별 변화를 연구하기 위해 자기 정렬과 결합 될 수있다. 전체 게놈 시퀀싱 방법은 나이와 게놈에 발생하는 변화의 전체 유형에 대한 자세한 정보를 제공 할 수 있지만, 돌연변이 레이트 측정을 얻기 위해 표현형 선택 시스템을 사용하기 위해 우선적으로 유전 적 변화의 특정 유형을 분리하는 능력은 역학적 연구를위한 중요한 장점은 노화 관련 유전자 불안정성의 측면. 나이 세포의 결정 및 전위 합리화 physiologi 병렬 측정을 수행 할흐름을 통해 학적 변화는 세포 계측법 특정 연령대 동안 다른 세포 변화와 게놈 불안정성의 상관 관계를하는 효율적인 수단을 제공합니다. 축적 돌연변이의 비율의 잠재적 연령에 의존하는 변화의 결정이 필요합니다 1)주의 젊은 세포 인구의 비율의 결정, 세포 연령이) 정확한 결정, 3) 안정적으로 재현성있게 측정 할 수있는 어머니 세포의 충분히 큰 개체군을 풍부하게 할 수있는 능력 노년 게놈 불안정성. 이 접근법은 효​​모 모델 시스템은 요금 및 / 또는 mitotically 활성 세포 게놈 불안정성의 주파수에 의존 연령 변화에 책임 기전을 형성에 기여할 수있다. 또한, 유전 적, 환경 적 요인이 빠르게 연령에 의존 게놈의 불안정성에 공헌 평가 될 수있다. 궁극적으로, 이러한 특성화는 돌연변이가 증식 및 노화 과정에 누적되는 방식을 설명 모델의 개발로 이어질 수 있습니다.

이 방법은 이러한 사건의 속도를 측정하기 위해 선택 가능 표현형의 모양을 통해 돌연변이 또는 게놈 불안정성의 다른 유형을 검출 할 수있는 능력에 달려있다. 그러나, 분석 설계의 창의성은 게놈 불안정성의 여러 측면을 조사 할 수 있도록 할 수 있습니다. 예를 들어 URA3 및 CAN1 유전자는 게놈 위치 결과에 어떠한 영향을 테스트하기 위해 다른 게놈 위치에 배치 될 수있다. 기능 유전자의 대립 유전자에 특정 비 기능 유전자 대립 형질의 복귀는 특정 돌연변이 프로세스를 테스트 할 수 있습니다. 또한, 유전자 또는 반복 서열을 가진 유전자를 플 랭킹 여러 비활성 대립 유전자의 도입은 각각 복원 또는 유전자 기능의 손실을 통해 재조합 사건을 조사하는데 사용될 수있다. 변동 시험이 다양한 게놈 불안정성 이벤트 (9)의 속도를 결정하기위한 표준 접근법이다. 프로토콜은 무타을 결정하기 위해 잘 받아 들여 비교적 간단 레아 - Coulson 중간 추를 사용하여 작성기 속도는 MSS-최우 추정기 방법 돌연변이율 구를 결정 최상의 접근 간주 되더라도, 다양한 연구에 더 접근 할 수 있도록한다. MSS-최우 추정기는 이전에 상세히 9에서 검토되었으며, 다른 방법으로 사용될 수 있지만,보다 복잡한 계산을 필요로한다. 또한,이 방법으로 돌연변이 비율을 계산하는 무료 소프트웨어는 22 사용할 수있게되었습니다. 돌연변이 비율의 재현 조치를 구하기 충분한 복제 문화를 사용하여 충분히 낮은 초기 세포 밀도에서 문화 접종을 포함하여 실험 설계의 몇 가지 측면에주의를 요구하는 만 배 이상, 선택 적절한 문화 볼륨 인구의 크기가 증가하여 전체 있도록 세포의 인구는 선택 배지에 확산 될 수 있습니다. 후자의 지점에 대해, 앞서 설명한 공식 배양 teste의 분율에 기초한 돌연변이 빈도를 조정하기 위해 사용될 수있다D 구. 배양의 성장 속도의 변동이 재현 돌연변이율의 판정, 및 최근 23를 설명 하였지만 이러한 상황에서 더욱 재현 가능한 결과를 산출 할 수 개질 중앙값 기반 추정기를 복잡하게 할 수있다.

정확하게 셀 나이를 측정 할 수있는 능력은 오래 세포 게놈 불안정성 주파수 인한 젊은 세포의 이벤트 레이트에 기대 값과 다른 여부를 설정하기위한 또 다른 중요한 인자이다. WGA는 서로 다른 형광 분자 접합 사용할 수 있기 때문에 우리는 배경과 유연성의 측면에서 모두 흰색 염색을 calcofluor하는 것이 바람직 할 WGA 염색을 발견했다. 이러한 유연성은 형광 시약과 다른 세포의 특성을 동시에 측정을 위해 더 많은 기회를 제공 할 수 있습니다. 초기 작업은 더 이어질 수 신호 WGA 염색에 대한 강도 및 세포 봉오리 흉터의 수 사이의 대응 관계를 설정하는유동 세포 계측법을 통해 세포 연령의 신속한 결정. 이 방법은 또한 전형적으로 측정의 재현성 향상을위한 현미경으로 관찰되는 것보다 큰 크기 개체군의 사용을 허용한다. 모든 연령의 결정이 세포의 현미경 검사를 통해 할 수 있지만, 우리는 접근 유동 세포 계측법 연령에 의존 게놈의 불안정성에 영향을 미치는 요인의 신속한 선별을 용이하게 느낀다.

안정적으로 세포 나이를 측정하는 것 외에도, 고려 머더 세포 성장 및 세포의 정렬 각 연속 라운드로 받도록 허용하는 세포의 분할 수에 부여 될 필요가있다. 세포가 원하는 세포 밀도에 도달하기 전에 더 많은 세포 분열을 겪게 할 수있는 작은 초기 인구 크기 또는 더 큰 문화의 볼륨을 사용합니다. 예를 들어, 다른 연구자들은 적은 experime 오래 된 세포를 얻는 명백한 장점을 가지고 아주 오래된 효모 세포 (16)을 얻기 위해 정렬의 두 라운드를 사용했다ntal 단계. 세포를 선별하기 전에 더 많은 세포 분열을 완료 할 수 있도록 배양 부피를 증가 여부를 고려할 때 염두에 단일 열에서 처리 될 수있는 셀들의 총 개수에 대한 제한을 유지한다. 하나의 세포 집단을 정렬하기 위해 여러 컬럼의 사용을 필요로 할 수있는 더 큰 문화의 볼륨을 사용합니다. 세포 종류 / 수집 지점 사이의 세포 분열의 적은 라운드를 받아야하는 경우 또한, 다음의 수명 동안 별개의 시점에서 예상 돌연변이 주파수의 편차를 관찰 할 더 많은 기회가있다. 예를 들어, 수명 동안에 만에 초기 샘플링 늦은 시점은 데이터 돌연변이 빈도가 꾸준히 증가를 나타내는, 그러나 신속하고 고원이 돌연변이 주파수가 증가를 표시 할 수 있습니다 수명 동안 추가 중간 시간에 샘플링을 생성 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 이전 머더 세포를 분리하기 때문에, 연령 돌연변이율 변화의 더 직접적인 측정치를 얻을 수있는 기회가있다. 변동 시험은 ㄱ 수E는 돌연변이율이 젊은 세포를 사용하여 얻은 속도 다를 여부를 결정하기 위해 서로 다른 연령의 어머니 세포를 사용하여 수행. 그들이 성장이 변동 시험에 대한 문화가 오래되고 젊은 세포의 혼합물이 될 것입니다 동안, 젊은 세포로 시작 획득 속도에서 어떤 편차는 이전 시작 인구의 사용에 기인 할 수있다.

정확하게 재현 게놈 불안정성을 측정하기 위해 세 머더 셀 충분히 큰 집단을 수득하는 능력은 이러한 접근법의 성공에 매우 중요하다. 프로토콜은 이러한 목적을 위해 특히 자기 정렬 시스템의 사용을 설명하지만, 다른 그룹은 다른 시스템 (14, 18) (자재 도표 참조) 어머니 효모 세포를 분류 하였다. 제조 업체의 일부 프로토콜 최적화가 요구 될 수 있지만 이러한 대안이 시스템은 또한,이 방법으로 작동합니다. 에 관계없이 사용 된 특정 시스템의 인구 크기는 필요연구를 위해 선택된 돌연변이 또는 게놈 재 배열 된 형태의 주파수에 따라 D 다르다. 최소한 충분히 머더 세포 돌연변이 빈도를 계산하는 인구 당 적어도 하나의 돌연변이 콜로니를 얻을​​ 수있을한다. 만 0-5 돌연변이 식민지가 인구 크기 및 인구 규모도 작은 증가를 기대하는 경우 5-10 돌연변이 식민지가 예상되어, 크게 재현성을 향상시킬 수 있도록 실제로, 결과는 매우 변수가 될 수 있습니다. 비오틴 라벨링 인구 시작되면, 각각의 정렬을위한 회수 효율 구 모 세포의 돌연변이 빈도를 측정하기 위해 필요한 적절한 모집단 크기를 식별하기 위해 고려 될 필요가있다. 각 정렬 후 어머니 세포의 90 % 회복, 원래 인구의 59 %는 성장과 정렬의 5 라운드 이후에 복구 할 수있다. 이것은 ~ 33 % 성장의 5 라운드 후 원래 인구의 복구 및 표시 어머니 세포의 80 %를 복구하는 경우 정렬에 떨어각 종류의시 에드. 인구의 크기가 2-3 배 감소가 쉽게 인구 당 돌연변이 식민지의 신뢰할 수없는 번호로 이어질 수 있기 때문에, 저주파 이벤트를 측정 할 때 측정 및 복구를 극대화하는 것이 중요합니다.

에 확대 또는 유사 분열 세포 노화 동안 게놈 불안정성의 폭 넓은 이해를 얻기 위해이 프로토콜을 수정하기위한 수많은 옵션이 있습니다. 간단한 예는 유전자 기능, 미디어 변경, 또는 다른 환경 조건 변화의 변화는 나이와 돌연변이의 축적을 분석하는 방법을 변경하는 등. 변형 된 유전자의 기능 또는 적절한 조건에서 젊은 세포 돌연변이 비율을 측정 및 제어 세포 집단에서 다르게 속도 값에 의해 예측 된 것보다 돌연변이와 다르게 축적 여부를 결정하기 위해 사용될 것이다. 증식 및 노화 동안 다른 지점에서 세포 집단은 반응성 산소 종 또는 DNA 손상 에이전트와 같은 특정 스트레스에 노출 될 수있다.산화 적 스트레스에 노출 과도 중성 실질적 정렬 셀 (도 3)를 수행하는 능력을 변화시키지 않았지만, 가혹한 응력은 세포의 회복을 복잡있다. 예비 실험은 어머니 세포가 여전히 특정 스트레스 후 효율적으로 복구 할 수 있는지 확인하기 위해 필요하다. 또한, 절연 어머니 세포의 세포질 특성 3 노화와 연관되는 활성 산소 종, 미토콘드리아와 액포 형태 및 기타 생리 학적 특성의 수준을 포함하여 상세하게 분석 될 수있다. 또한, 머더 세포 또는 추가 처리 조작 개시 인구 수 있었다. 엄마와 딸 세포가 물리적으로 절차를 수행하는 동안 분리되어 있기 때문에, 딸 세포는 여전히도 분석을 위해 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 딸 세포 또는 효모 어머니와 딸 세포 사이 손상 거대 분자의 비대칭 상속의 생리 학적 특성의 변화 S.의 이점을 가능하게 cerevisiae의 모델 시스템은 효율적으로 세포 유사 분열 동안 노화 유전자 변화의 축적에 대한 책임을 조사기구에 적용될 수있다.

Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

이 작품은이 문서의 내용은 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 반영하지 않습니다 PHM에 국립 보건원 (NIH)의 노화에 국립 연구소에서 부여 R00AG031911에 의해 부분적으로 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Thermo Scientific 21335 100 mg
Anti-Biotin Microbeads Miltenyi Biotec 130-090-485 2 ml MicroBeads conjugated to monoclonal mouse anti-biotin antibodies (isotype: mouse IgG1)
MACS LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401 25 columns suitable for QuadroMACS separator
QuadroMACS separator Miltenyi Biotec 130-090-976 Separator Only
QuadroMACS Starting Kit Miltenyi Biotec 130-091-051 Includes: QuadroMACS Separator (130-090-976), MACS MultiStand (130-042-303), LS Columns (130-042-401), MACS 15 ml Tube Rack (130-091-052), One 2 ml unit of MACS MicroBeads. Note: Alternative systems include Dynabeads Biotin Binder and MagnaBind Magnetic Beads
BD Falcon Cell Strainer, 40 µm BD Biosciences 352340 40 µm for use with BD Falcon 50 ml Conical Tubes. 50 per pack
Trypan Blue Sigma-Aldrich T6146 Powder, filtering after dissolving important to remove particulates
Wheat germ agglutinin Alexa Fluor488 Life Technologies W11261 Conjugates with different excitation/emission spectra could also be used
ProLong Gold antifade reagent Life Technologies P36930 10 ml, other antifade reagents could also be used

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미생물학 문제 92 노화 돌연변이 유전체 불안정성, 자기 정렬 어머니 세포 증식 및 노화
어머니 세포 및 변동 시험의 자기 정렬을 결합에서 유사 분열 세포 노화 동안 게놈 불안정성을 분석합니다<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em
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Patterson, M. N., Maxwell, P. H. Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (92), e51850, doi:10.3791/51850 (2014).

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