Summary
Mutationsraten bei jungen Saccharomyces cerevisiae Zellen durch Fluktuation Tests gemessen werden zur Mutationshäufigkeiten für Mutterzellen der verschiedenen replikativen Alter vorherzusagen. Magnetische Sortierung und Durchflusszytometrie werden dann verwendet, um tatsächliche Mutationshäufigkeiten und Alter der Mutter Zellen zu messen, um Abweichungen von der erwarteten Mutationsfrequenzen zu ermitteln.
Abstract
Saccharomyces cerevisiae wurde für die Prüfung Mechanismen und Folgen der Genominstabilität ein ausgezeichneter Modellsystem. Informationen aus diesem Hefemodell gewonnen hat für viele Organismen, einschließlich Menschen, da die DNA-Reparatur von DNA-Schäden und Antwortfaktoren sind in verschiedenen Spezies konserviert. Allerdings S. cerevisiae ist noch nicht verwendet worden, um voll anzugehen, ob die Rate der Akkumulation von Mutationen Veränderungen mit zunehmendem replikativen (Mitose) Alter aufgrund technischer Einschränkungen. Zum Beispiel Messungen der Hefe replikativen Lebensdauer durch Mikromanipulation in geringer Zellpopulationen, die die Detektion von seltenen Mutationen zu verhindern. Genetische Methoden, die zur Mutterzellen in der Bevölkerung durch Induktion Tod von Tochterzellen zu bereichern entwickelt worden, aber Populationsgrößen werden noch von der Häufigkeit, mit der zufälligen Mutationen, die die Selektionssysteme gefährden auftreten begrenzt. Das aktuelle Protokoll nutzt magnetische Sorting von Oberflächen-markierten Hefe Mutterzellen groß genug Populationen von Zellen alternde Mutter, um seltene Mutationen durch phänotypische Auswahl quantifizieren zu erhalten. Mutationsraten, durch Fluktuation Tests gemessen, und Mutationsfrequenzen werden zuerst für junge Zellen festgelegt und verwendet, um die Häufigkeit von Mutationen in den Mutterzellen verschiedener replikativen Alters vorherzusagen. Mutation Frequenzen werden dann für sortierte Mutterzellen bestimmt, und das Alter der Mutter Zellen mittels Durchflusszytometrie durch Färbung mit einem fluoreszierenden Reagenz, das Knospe Narben auf ihren Zelloberflächen während der Zellteilung gebildet erkennt bestimmt. Vergleich der vorausgesagten Mutationsfrequenzen auf Grundlage der Anzahl der Zellteilungen zu den Frequenzen experimentell für Mutterzellen einer bestimmten Alters replikativen beobachtet kann dann ermitteln, ob es altersbedingte Veränderungen in der Rate der Akkumulation von Mutationen. Variationen dieses Grundprotokoll die Mittel, um den Einfluss von Veränderungen der spezifischen Genfunktionen untersuchen oderspezifischen Umweltbedingungen auf die Mutation, Mechanismen Akkumulation während replikative Alterung Rechnung zugrunde liegenden Genom-Instabilität.
Introduction
Mikroorganismen wie der Hefe Saccharomyces cerevisiae, sind hervorragende Modelle zur Untersuchung der Mutationsraten, aber diese Modelle nicht voll ausgenutzt worden, um die Akkumulation von Mutationen im mitotischen Alterung von Zellen zu untersuchen. Mutation Akkumulation im Zellkerngenom wurde die Hypothese aufgestellt, um die Alterung von was zu fortschreitenden Verlust (oder Variation) Genfunktionen 1 beitragen. Die Fähigkeit, ein mikrobielles System, um die Mechanismen und Folgen der Mutation Akkumulation während der Alterung kann die Identifizierung von genetischen und Umweltfaktoren diesen Prozess zu beeinflussen, da der einfache genetische Systeme und die einfache Quantifizierung von seltenen phänotypischen Veränderungen in Mikroorganismen stark beschleunigen studieren. DNA-Reparaturfaktoren und DNA-Schadensantwort-Proteine werden auch über verschiedene Arten 2 konserviert und Grund Ähnlichkeiten in Organismen Alterung sind für Organismen so vielfältig wie S. identifiziert cerevisiae eind Säugetiere 3, was es wahrscheinlich macht, dass die Ergebnisse aus Studien in Hefe erhalten wird relevant für Alterung in vielen Organismen sein.
Studien des Alterns in S. cerevisiae nutzen zwei Alterungsmodelle, die chronologische Alterung oder replikative Alterung von Zellen zu messen. Chronologischer Alterung wird durch den progressiven Verlust der Lebensfähigkeit der Hefe-Zellpopulationen, die in einer nicht-teilenden Zustand (stationäre Phase) sind durch Nährstoffverarmung 3 gekennzeichnet. Die chronologische Alterung Modell wurde verwendet, um zu zeigen, dass Mutationen akkumulieren mit zunehmendem Alter 4, da große Zellpopulationen sind leicht in diesem Modell erhalten, um phänotypische Auswahl für mutierten Zellen durchzuführen. In diesem Fall erscheint Mutation Akkumulation von wachstumsSignalWege und oxidativer Stress 5 beeinflußt werden, und jeder dieser Faktoren für das Verständnis Alterung in vielzelligen Eukaryoten 3. Die replikative Alterung Modell nutzt die asymmetrische divisiauf zwischen S. cerevisiae Mutter und Tochter Zellen für die Untersuchung von Hautalterung, die mit aufeinanderfolgenden Zellgenerationen 3 auftritt. Hefe replikative Alterung wurde oft durch Mikromanipulation von kleinen Populationen von Mutter und Tochter Zellen, oder in jüngerer Zeit durch Videomikroskopie von kleinen Populationen von Hefezellen in mikrofluidischen Bauteilen 6,7 gemessen worden. Begrenzte Populationsgrößen machen diese Ansätze wenig geeignet für die Untersuchung von Mutation Akkumulation während der mitotischen Alterung, es sei denn gesamten Genoms Information wird aus einzelnen Zellen erhalten oder sehr hohe Frequenz genetischen Veränderungen werden gemessen 8. Gesamtgenom-Sequenzierung von Einzelzellen bietet erhebliche Datenmengen für die Untersuchung Mutation Akkumulation, aber phänotypische Selektion Systeme haben den wichtigen Vorteil, dass sie ein Mittel zur Messung Mutationsraten zu Grunde liegenden Mechanismen zu studieren Mutation Akkumulation. Studien zur Mutationshäufigkeiten und Preise durch phänotypische Auswahl in haploi prüfend Hefestämme während replikative Alterung noch nicht berichtet worden.
Mutationsraten werden häufig mit Tests Fluktuation 9 gemessen. Mutationshäufigkeit Werte spiegeln die Gesamtzahl der Zellen, die eine Mutation in einem Gen-Sequenz in einer Population. Dies umfasst Zellen, in denen unabhängige Mutationen auftreten und alle Nachkommen dieser Zellen, die einfach erben bereits vorhandenen Mutationen. Im Gegensatz dazu Mutationsraten durch Fluktuation Tests gemessen entsprechen der Anzahl der unabhängigen Mutationen, die neu mit jeder Zelle Generation auftreten. Diese Prüfungen umfassen typischerweise viele Impfen Replika-Kulturen bei niedriger Zelldichte, um die Wahrscheinlichkeit des Hinzufügens von Zellen mit vorbestehenden Mutation in einer Zielsequenz, Züchten der Kulturen in der Nähe der Sättigung, und Identifizieren mutanten Zellen durch Wachstum auf Selektivmedium zu reduzieren. Die Anzahl der mutierten Zellen in den Wiederholungspopulationen identifiziert werden dann in einer von mehreren mathematischen Modelle verwendet, um die Anzahl von i zu schätzenndependent Mutationen, die während des Wachstums 9 entstand. Vergleichen der Anzahl von unabhängigen Mutationen auf die durchschnittliche Bevölkerungszahl stellt ein Maß für die Mutationsrate. In S. cerevisiae Mutationshäufigkeiten und Preise werden häufig gemessen mit den URA3 und CAN1 Gene, da loss-of-function Mutationen in diesen Genen produzieren Selektionsphänotypen. Verlust des URA3-Funktion macht Zellen resistent gegen 5-Fluororotsäure (5-FOA), da das Protein codiert URA3 konvertiert 5-FOA in einem toxischen Molekül 10. Verlust der Funktion der Zellen ermöglicht CAN1 beständig Canavanin, einer toxischen Arginin Analog zu werden, da das Protein durch CAN1 codiert transportiert Arginin und Canavanin in Zellen 11.
Beide genetische und physikalische Sortierung Strategien wurden erfolgreich eingesetzt, um größere Populationen von S. erhalten cerevisiae Mutterzellen, Untersuchungen der replikativen Altern erleichtern. Genetische Strategien umfassen clevere Ansätze, die gegen die Tochter des Zellüberlebens in einer Population aus. Die Mutter Anreicherungsprogramm (MEP) beinhaltet Beta-Estradiol Induktion von Cre-Rekombinase-Expression nur in Tochterzellen, was zu Tochter-spezifischen Störung der zwei Gene, welche entwickelt wurden, um loxP 12 enthalten. MEP-Stämme können in der Regel in Abwesenheit des Induktors kultiviert werden, sondern nur die Mutterzellen teilen sich weiter nach Induktion, während Tochterzellen in M-Phase in der Regel während der ersten Progression durch den Zellzyklus 12 zu verhaften. Während dieses System nicht verwendet worden, um allgemein zu studieren Mutation Akkumulation während der Alterung wurde verwendet, um den Verlust der Heterozygotie, eine relativ häufige Form von Genominstabilität in diploiden Hefestämme sowie biochemische Veränderungen Alterung Mutterzellen 13,14 studieren. Ebenso beinhaltet die Tochter-Ableiter System Tochter-spezifische Expression des S. cereviSIAE URA3 Gen 15. Tochter-Ableiter Stämme wachsen in der Regel bis 5-FOA wird zum Medium gegeben, an welcher Stelle Tochterzellen exprimieren URA3 sterben wird, während Mutter Zellen weiter wachsen 15. Diese sind nützlich, Systeme für Mutterzellen zu bereichern, aber sie sind auf die Wartung der Gen-Funktionen, die das Auswahlsystem bilden abhängen. Zufallsmutationen in einer oder mehreren Komponenten des Selektionssystems kann in Tochterzellen, die die Auswahl entweichen und sich vermehren exponentiell führen. Bei der Entwicklung der MEP-Stämme, wurden entsprechende Populationsgrößen bestimmt das Aussehen der Mutante Tochterzellen, die die Auswahl 12 entweichen könnten. Doch diese Grenze in Bevölkerungsgröße beeinträchtigt die Erkennung von seltenen Formen der Genom-Instabilität während der replikativen Alterung. Diese Beschränkung auf die Bevölkerungsgröße konnte teilweise durch die Verwendung diploiden Hefestämme mit zwei Kopien von jedem Gen, die zur Auswahlsystem, da die meisten überwunden werdenMutationen wahrscheinlich rezessiv 12 sein. Verwendung von diploiden Stämme beschränkt jedoch die Arten von Mutationsereignisse, die im Vergleich zu denen, die sich leicht in haploiden Hefezellen detektiert werden kann leicht nachgewiesen werden kann.
Physikalische Sortierung Strategien umfassen Isolierung von Mutterzellen mit einem markierten Zelloberfläche von unmarkierten Tochterzellen für große Populationen von Mutterzellen zu bereichern. Die Beobachtung, dass die Zelloberflächenproteine (Zellwandproteine) von S. cerevisiae Tochterzellen sind neu bei angeh wurde genutzt, um Zellen zu markieren, ohne Mutter Kennzeichnung der Tochterzellen, die sie produzieren 16 synthetisiert. Zum Beispiel kann eine anfängliche Population von Hefezellen, die auf ihrer Oberfläche mit Biotin markiert gezüchtet werden und dann von ihrer Tochterzellen mit Anti-Biotin-Mikrokugeln und 16 magnetische Sortierung, da die Tochterzellen nach der Anfangspopulation erzeugt nicht Biotin enthalten auf ihrer Oberfläche isoliert . Serien Wachstum undSortierung ermöglicht schrittweise älteren Bevölkerung von Mutterzellen zu erhalten und analysiert werden. Dieses Verfahren wurde erfolgreich eingesetzt, um Veränderungen in der Zellphysiologie und Genexpression während replikative Alterung Hefe 13,14,17,18 untersuchen. Die aktuelle Methode passt sich diese Biotin-Markierung und magnetische Sortiertechnik für Mutterzellen mit dem Ziel der Messung der Anreicherung potenziell seltene Mutationen oder andere Formen der Genom-Instabilität durch phänotypische Auswahl untersucht zu bereichern. Serien Wachstum und physikalische Sortierung die eine Analyse der Mutation Akkumulation in zunehmend älteren Mutterzellen, als auch in ihrer Tochter Zellpopulationen. Bestimmung des Mutationsraten pro Generation ermöglicht eine vorhergesagte Mutationsfrequenz für Mutterzellen, die eine bestimmte Anzahl von Zellteilungen durchlaufen haben, berechnet werden. Seit vorhergesagt Frequenzwerte auf den erwarteten Anstieg durch zusätzliche Runden der Zellteilung, erhebliche Abweichungen in den beobachteten Mutati basierendauf Frequenzen im Vergleich zu den vorhergesagten Werten belegen altersspezifische Veränderungen in der Rate der Akkumulation von Mutationen. Über dieses Protokoll können Fluoreszenzfärbung von Narben, die Knospe zu Websites von Zellteilungen auf Mutter-Zellen mit der Durchflusszytometrie gekoppelt entsprechen verwendet werden, um schnell festzustellen, die Altersverteilung der Bevölkerung sortierte und unsortierte werden. Zusätzliche fluoreszierende Reagenzien, wie sie zum Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies verwendet werden, können auch in diesem Protokoll verwendet werden. Insgesamt ist dieses Protokoll ermöglicht eine effiziente Analyse der altersabhängigen Veränderungen in der Genominstabilität mit dem Potenzial für Korrelation zu altersbedingten physiologischen Veränderungen Zelle in einem Modellorganismus gut geeignet für die Untersuchung der genetischen und umweltbedingten Faktoren, die alterungsbedingte Genominstabilität beeinflussen.
Protocol
1. Herstellung der Medien und Lösungen
- Wachsen Zellen unter Verwendung von Hefeextrakt-Pepton-Glukose (YPD) reichen Medium für die Standard-Protokoll. Bereiten Sie eine 2% Bacto-Pepton, 1% Hefeextrakt, 2% Glucose-Lösung für YPD-Medium und mit 2% Bacto-Agar für Festmedium 19. Autoklaven sterilisieren. Verwenden Sie ein alternatives Medium, falls erforderlich, um eine bestimmte Wachstumsbedingung oder mutierte Hefestamm testen.
- Machen festen Kunst komplette Medium ohne Arginin mit 60 mg / L Canavanin (SC-arg + Canavanin), die für Canavanin resistenten Mutanten zu wählen. Bereiten Sie eine Lösung, die 0,67% Bacto-Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren, 2% Glucose, 0,2% komplette Ergänzung Mischung ohne Arginin (Dropout-mix), und 2% Bacto-Agar 19 ist. Autoklaven und cool vor der Zugabe Canavanin von einer 20 mg / ml Stammlösung (steril filtriert, bei 4 ° C gelagert) 19.
- Machen festen Kunst komplette Medium mit 5-Fluororotsäure (5-FOA). Bereiten 500ml einer Lösung, die 1,34% Bacto-Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren, 4% Glucose, 0,4% abgeschlossen Ergänzungsgemisches und 0,2% 5-FOA und Filter-sterilisiert 19. Autoklaven 500 ml einer 4% Bacto-Agar-Lösung, cool kurz, und dann mit dem 500 ml steril filtriert Nährlösung mischen. Verwenden Sie geeignete alternative Medien für andere Mutationsassays.
- Für Biotin-Markierung, stellen 500 ml 1x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)-Lösung enthält 137 mM Natriumchlorid, 2,7 mM Kaliumchlorid, 10.14 mM Dinatriumhydrogenphosphat und 1,77 mM Kaliumhydrogenphosphat, pH 8. Lagerung bei 4 ° C und halten Sie auf Eis während des Gebrauchs.
- Machen Sie eine frische 5 mM Biotin Lager in sterilen, hochreinem Wasser.
- Zu löschen Biotin-Markierung, stellen 500 ml 1x PBS, 100 mM Glycin. Lagerung bei 4 ° C und während der Verwendung auf Eis zu halten.
- Abhängig von der Anzahl von Zellen verwendet und die Dauer des Experiments, stellen 1-2 L des Wulst-Markierungspuffer, enthaltend 1 × PBS, 2 mM EDTA, 0,5% Bovine Serumalbumin. Filter sterilisieren und de-Gaspuffer. Lagerung bei 4 ° C und während der Verwendung auf Eis zu halten.
- Bereiten Sie eine 0,4% Trypanblau-Lösung in 1x PBS, Filter zu sterilisieren, und lagern bei RT für den Einsatz in der Lebensfähigkeit der Zellen-Messungen.
- Aliquot kleinen Volumina (~ 100 ul) einer Weizenkeim-Agglutinin (WGA) fluoreszierendes Konjugat bei -20 ° C in Folie (oder opak) Mikrozentrifugenröhrchen für die Verwendung bei der Bestimmung Zellalter zu speichern.
2. Bestimmung der Mutationsrate und Frequenz
- Stellen Sie eine Baseline-Mutationsrate pro Zelle Generation mit Fluktuation Tests für Zellen unter Standardkulturbedingungen gewachsen. Wachsen sieben bis elf replizieren 1 ml Kulturen von einer Anfangsdichte von 1.000-5.000 Zellen / ml bis zur frühen stationären Phase (~ 10 8 Zellen / ml).
- Für jede Wiederholung Kultur, verdünnte Zellen 1: 2.000 und verteilt 1-4 ul auf nicht-selektiven Medium (YPD) an Kolonie-bildenden-Einheiten / ml zu bestimmen. Pellet restlichen Zellen bei ~ 2.400 xg für 1 min in einer Mikro und resuspendieren in 100 ul Wasser auf selektiven Medium zu verbreiten, um Mutanten zu identifizieren. Inkubation erfolgt für drei Tage bei 30 ° C vor dem Zählen der Kolonien (einzustellen Inkubationszeit bezogen auf die Wachstumsrate von Zellen erforderlich).
- Bestimmung der Anzahl von unabhängigen Mutationen (m), die basierend auf der Anzahl der Mutantenkolonien (r) auf selektivem Medium erhalten werden, in dem Prozess aufgetreten. Verwenden Sie die Lea-Coulson Median Schätzer m durch Einsetzen der Median der Anzahl der Mutantenkolonien für r in der Formel unter 9 zu finden. Dann Ersatzwerte für m, bis die linke Seite der Gleichung ist praktisch Null.
- Um zu bestimmen, Mutationsrate, berechnen wir zuerst die durchschnittliche Anzahl an lebensfähigen Zellen auf einem selektiven Medium verteilt, indem die durchschnittliche Koloniebildungseinheiten / ml der Replika-Kulturen und das Volumender Kultur in ml Ausbreitung auf Selektivmedium. Teilen Sie die m-Wert aus Schritt 2.1.2 dieses durchschnittliche Anzahl der lebensfähigen Zellen, die Mutationsrate pro Zelle Generation zu erhalten.
- Individuell berechnen die Anzahl der lebensfähigen Zellen auf Selektivmedium für jede Wiederholung Kultur in einer Studie aus, wie in Schritt 2.1.3 beschrieben. Teilen die Anzahl der Mutantenkolonien (r) durch die Anzahl der lebensfähigen Zellen auf einem selektiven Medium verteilt, um die Mutationshäufigkeit zu erhalten, für eine Kultur erhalten. Verwenden Sie von den Replika-Kulturen in Schritt 2.1 als Basis Mutationsfrequenz der Durchschnitt oder Median der einzelnen Mutationshäufigkeiten.
- Machen Frequenzmessungen vor und nach der Markierung mit Biotin-Zellen (Schritte 3.2 und 3.4), um zu bestimmen, ob die Markierungsschritt führt zu einer Änderung der Häufigkeit von Mutationen, die müssen berücksichtigt werden, wenn die Prüfung auf altersspezifische Veränderungen Mutation Akkumulation werden.
3. Biotin Labeling
- Streak S. cerevisiae aus einem Glycerin-Stamm bei -80 ° C auf YPD-Medium und Inkubation bei 30 ° C für 1-3 Tage.
- Mit einer sterilen Pipettenspitze, Transferzellen aus dem Streifen Platte auf 1 ml (oder mehr) von Wasser unter Berücksichtigung, dass 1-1,5 cm dick gewachsen eines Teils der Streifen geben etwa 10 8 Zellen. Festzustellen, genaue Zelldichte mit einer Zählkammer.
- Etikett 10 8 Zellen pro Stamm (oder Behandlungsbedingungen) pro Sammelpunkt, an dem Mutationsfrequenz ermittelt werden, bzw. eine Populationsgröße ausreicht, um mindestens 5-10 Mutantenkolonien pro Abtastung auf selektivem Medium zu erhalten (bezogen auf Mutationsfrequenz von Schritt 2.2). Eine zusätzliche 10 8 Zellen für die Baseline-Messungen pro Stamm / Zustand.
- Biotin-Markierung nach Standardverfahren vom Hersteller, außer mit einem 5 mm Biotinreagens Lager und während der Inkubation sanft schaukeln. Spin für 5 min bei 4 ° C bei 3.000 xg für alle Zentrifugationsschritte, seit Spinnen bei Temperaturen von mehr als 4 ° C kann zu einem erhöhten Zellverlust führen. Nach dem letzten Waschschritt auszusetzen Zellen bis zu einer Konzentration von 10 8 markierten Zellen / ml in Wasser.
- Überprüfen Lebensfähigkeit der Zellen unter Verwendung von Trypanblau-Färbung. Verdünnen 10 ul der Zellen mit 23 ul Wasser und 67 ul von 0,4% Trypanblau in 1x PBS. Inkubation für mindestens 40 min bei RT erzielte Live (ungefärbten) und toten (gebeizt) Zellen mit einer Zählkammer.
- Messen Sie die Ausgangswerte für die Genominstabilität, Zell Alter und anderen relevanten Eigenschaften (siehe Abschnitte 5, 6 und 7).
- Übertragen Biotin-markierten Zellen zu 20 ml YPD-Medium pro 10 8 Zellen in einen Erlenmeyerkolben (etwa 5 x 10 6 Zellen / ml). Kultur wachsen (s) 16-18 h bei 20 ° C bis zu einer Dichte von etwa 10 8 Zellen / ml (vier vor fünf Zellgenerationen), aber nicht zulassen, Zellen die stationäre Phase erreichen. Verwenden Sie einen kürzeren Inkubationszeit für Wachstum bei 30 ° C. Halten Biotin-markierten cEllen bei 4 ° C für mehrere Stunden vor der Zugabe zum Medium, falls erforderlich, um die Zeit der Wachstumsperiode und Sammlung zu optimieren.
4. Bead Kennzeichnung und magnetische Sortierung
- Nach der Wachstumsphase Ein Aliquot der Kultur die Zelldichte zu bestimmen, mit einer Zählkammer. Pellet-Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 4 ° C bei 3000 x g. Überstand abgießen.
- Waschen Sie die Zellen durch Vortexen zu Pellet in 30 ml Wulst-Markierungspuffer suspendieren, dann Zentrifugieren und Abgießen Überstand, wie in Abschnitt 4.1. Waschen wiederholen.
- Voll Zellen in 50 ul Wulst-Markierungspuffer pro 10 8 Zellen insgesamt durch Wirbeln. Add 2 ul magnetische Perlen pro 10 8 Zellen insgesamt und Wirbel kurz zu mischen. Inkubieren auf Eis für 10 min, Invertierung regelmäßig zu mischen (aus einer Online-Protokoll auf veränderte http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf </ A>).
- Mit 30 ml Kügelchen-Markierungspuffer waschen Zellen dreimal.
- 0,5 ml Wulst-Markierungspuffer pro 10 8 Zellen insgesamt und kurz Wirbel Pellets auf mittlere Einstellung nur, bis die Zellen werden suspendiert. Gießen durch ein 40 um Zellsieb in ein 50 ml-Röhrchen, um alle verbleibenden Zellklumpen zu entfernen. Bei Bedarf lassen Zellen auf Eis für 1-2 Stunden vor dem Laden auf die Säule.
- Folgen Sie der vom Hersteller empfohlenen Protokoll für die magnetischen Spalten zu binden, zu waschen und zu eluieren die magnetischen Kügelchen markiert Mutterzellen. Für eine erhöhte Rückgewinnung von markierten Zellen, verwenden Sie mindestens eine Spalte pro 2 x 10 9 Zellen insgesamt.
- Entfernen Sie alle Blasen, die beim Laden von Spalten, wie sie Fluss blockieren auftreten. Entfernen und ersetzen Sie die Spalte auf der Trennlinie zwischen wäscht, um Zellen aus immer zwischen den Perlen (von einem Online-Protokoll geändert am eingeschlossen werden http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf).
- Speichern Durchfluß von Bindung und Waschschritte zu jungen Zellen von den Mutterzellen produziert analysieren, falls gewünscht. Konzentrat-Zellen, wie in Schritt 4.7 beschrieben.
- Verwenden Sie Multi-Spalten-Separatoren für die Verarbeitung mehrerer Proben auf einmal. Eluat in mehreren Spalten der gleichen Probe in der gleichen Sammelröhrchen zu reduzieren und die Bearbeitungszeit zu verringern Verlust von Zellen.
- Konzentriert eluiert Mutterzellen durch Zentrifugieren bei 3000 × g für 5 min bei 4 ° C ist. Saugen Sie alle, aber 1 ml pro 10 8 Original-Biotin-markierte Zellen zu puffern. Wirbel kurz, um Zellen in Restpuffer auszusetzen.
- Einen aliquoten von Zellen und färben mit Trypanblau, um die Zelldichte und die Lebensfähigkeit der Zellen mit einer Zählkammer bestimmen (siehe Schritt 3.5). Berechnen der Gesamtzahl der Zellen gewonnen.
- Wenn die Anzahl der Zellen wesentlich höher ist als erwartet, passieren die Probe durch Elution einer anderen Spalte zu versuchen, verunreinigende jungen Zellen.Wenn die Anzahl der Zellen ist wesentlich geringer als erwartet, übergeben Sie die gespeicherte Fluss durch Probe durch eine andere Spalte, um zu versuchen, um die Ausbeute Mutterzellen zu verbessern.
- Verwenden Zellen für weitere Analysen, wie in den Abschnitten 5 und 6. Alternativ beschrieben, die Zellen in YPD-Brühe wieder wachsen, um ihre replikativen Alter (Schritt 3.7) zu erhöhen, und folgen Sie durch Wulst Kennzeichnung und Sortierung (Schritte 4.1-4.8.1), ohne die müssen die Biotin-Markierung zu wiederholen.
5. Bestimmung der Replikative Alter
- Spin-Zellen für 2 min bei 5.000 × g bei RT für alle Schritte in diesem Abschnitt. Setz 25 ul gewonnenen Zellen (~ 10 8 Zellen / ml) in ein 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen und wasche zweimal mit 1 ml 1 × PBS. Überstand absaugen.
- Tauwetter ein Aliquot der WGA-Konjugat, Vortex mischen und Spin kurz auf Proteinaggregate zu beseitigen. Aussetzen Zellen in 180 ul 1x PBS und 20 ul WGA einem fluoreszierenden Molekül konjugiert Sprossnarben auf der Oberfläche des Etikett-tenE-Zellen. Decken Sie die 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen mit Folie und Inkubation unter leichtem Schütteln bei 30 ° C für 30 min.
- Dreimal mit 1 ml 1X PBS waschen.
- Für Fluoreszenz-Mikroskopie, Etiketten Rutschen und montieren pro Standard-Protokoll mit einem Anti-Fade-Agent. Folien in der Dunkelheit (bis zu ein paar Tagen) vollständig aushärten, bevor Dichtungsdeckglas, um die Zellbewegung während der Bildgebung zu vermeiden. Graf Knospe Narben auf mindestens 50 Zellen pro Probe, um eine repräsentative Messung der Zellalter zu erhalten. Speicher Folien für bis zu 1 Monat für die Anzeige Knospe Narben, wenn nötig.
- Alternativ bestimmt die Intensität des Fluoreszenzsignals von der WGA-Konjugat durch Ausführen der Durchflusszytometrie auf die Zellen in 1 ml 1 × PBS nach Schritt 5.1.2 suspendiert. Verwenden Sie ein 405 nm Anregungslaser und 530/30 nm Emissionsfilter mit einem 505 nm Langpassfilter für WGA-Alexa 488. Fügen Sie eine ungefärbte Kontrolle für jede Sammelstelle.
- Graph Knospe Narben auf junge Zellen und gealterten Zellen mikroskopisch auf die gezähltey-Achse gegen die normalisierten geometrischen Mittelwert (Bunt geometrischen Mittelwert / ungefärbten geometrischen Mittelwert) der WGA-Fluoreszenz-Konjugat aus der gleichen Zellpopulationen auf der x-Achse. Erhalten die Gleichung einer linearen Trendlinie für diese Beziehung. Für nachfolgende Experimente, ersetzen die normalisierten geometrischen Mittels der WGA-Konjugat Fluoreszenzintensität einer Zellpopulation für x in der Gleichung zu lösen und für y die durchschnittliche Zell Alter einer Probe zu bestimmen.
6. Mutationsfrequenz
- Verbreitung sortiert Mutterzellen in Puffer von Schritt 4.7 auf YPD-Medium und selektive Medium resuspendiert, wie in Schritt 2.1.1 beschrieben. Verwenden Sie 1 ml resuspendiert Mutterzellen zur selektiven Medium und Spin-Zellen bei 5.000 g für 1 min.
HINWEIS: Verbreiten Sie größere Mengen verdünnten Zellen auf YPD-Medium, wie Zellen zu erhöhen, um in Alter für immer mehr nicht-lebensfähige und seneszenten Zellen in älteren Bevölkerungsgruppen auszugleichen.- Inkubieren YPD-Medium und selektive Medium-Platten ausSchritt 6.1 bei 30 ° C für 3 und 4 Tagen. Erhöhen Inkubationszeit bis zu einer Woche für sehr alte Zellen oder langsam wachsende Sorten. Berechnen Mutationsfrequenz wie in Schritt 2.2 beschrieben.
7. Berechnung vorhergesagte Mutationsfrequenz für eine gegebene Replikative Alter
- Berechnung der durchschnittlichen Erhöhung der replikativen Alter der Biotin-markierten Zellen über den Verlauf des Experiments durch Subtrahieren des Durchschnittsalters der ersten Zellpopulation von dem Durchschnittsalter der sortierten Mutterzellen für die jeweilige Sorte. Verwenden Sie die Zelle Alter in Schritt 5.2 berechnet oder Schritt 5.2.2.
- Multiplizieren die Mutationsrate in Schritt 2.1.3 durch die Zunahme der durchschnittlichen Zellalter in Schritt 7.1 berechnet erhalten. Fügen diesen Wert auf die Basislinie Mutationsfrequenz für das in Schritt 2.2 berechnet die vorhergesagte Mutationsfrequenz für Zellen des betreffenden replikativen Alter zu bestimmen Anfangspopulation.
Representative Results
Ein Flussdiagramm in Figur 1 zeigt die Gesamtschritte des Verfahrens, einschließlich der Punkte, an denen Mutationsraten, Frequenzen und Alter der Zellen gemessen werden. Präzise Bestimmung der Frequenz und der Geschwindigkeit der Mutationen (oder eine andere Form von Genominstabilität) bei jungen Zellpopulationen ist ein erster wichtiger Schritt, da es für die Auswahl eines geeigneten Populationsgröße zur Kennzeichnung und magnetische Sortierung erforderlich ist. Bewerten Werte können mit Fluktuation Tests 9 festgelegt werden. B. Ergebnisse für Hefestämme im BY4741 genetischen Hintergrund 20 auf Mutationen in dem CAN1-Gen, das Resistenz Canavanin oder Mutationen in dem URA3-Gen, das Resistenz gegen 5-FOA verleihen verleihen, ausgewählt werden in Abbildung 2 dargestellt. Die Zellen wurden bei 20 ° C für repräsentative gezüchtet Rate Experimenten und bei 20 ° C und 30 ° C für repräsentative Frequenz Experimenten. Diese Temperaturen wurden verwendet, weil anfängliche Zellpopulationen gewachsenbei 30 ° C wurden dann bei 20 ° C für die nachfolgenden repräsentativen Sortierexperimente gezüchtet. Rate-Werte von unabhängigen Studien waren für die erste Zellpopulation und Zellen nach Biotin-Markierung für einen Stamm, der das CAN1-Gen auf Chromosom V bei normaler Lage vergleichbar, etwa 32 Kilobasenpaare aus dem linken Arm Telomer ( www.yeastgenome.com ) ( 2A, Lavendel Spalten). Die Mutationsrate CAN1 war anfänglichen Populationen von einem zweiten Hefe-Stamm, der eine Deletion des CAN1-Gen von seinem normalen Ort auf Chromosom V und eine Insertion von CAN1 auf dem rechten Arm des Chromosoms VIII etwa 25 Kilobasenpaaren vom Telomer eine wesentlich höhere 21 (2B). CAN1-Gen-Mutation Frequenzen wurden auch für die anfängliche Zellpopulationen und Biotin markierten Zellen entweder Wachstumstemperatur vergleichbar (Figurieren 2A, blaue Säulen). Bei 20 ° C jedoch erhalten Mutationshäufigkeiten wurde gefunden, höher als Mutationshäufigkeiten bei 30 ° C sein. Um zu testen, ob diese Temperatureffekt wurde dem CAN1-Gen beschränkt, maßen wir Mutationen in URA3 durch Selektion auf Resistenz gegen 5-FOA unter Verwendung der Hefe-Stamm, CAN1 auf Chromosom VIII eingesetzt ist. Dieser Stamm hat auch eine Deletion der URA3 von seinem normalen Ort auf Chromosom V und eine Insertion des URA3 auf den rechten Arm des Chromosoms VIII etwa 40 Kilobasenpaaren vom Telomer 21. Mutationsfrequenzen waren höher bei 20 ° C für URA3 in diesem chromosomalen Stelle (Abbildung 2C). Insgesamt zeigt dies, dass der Wachstumstemperatur kann die Häufigkeit der Mutationen beeinflussen, aber Biotinmarkierung erscheint nicht Mutationsfrequenz beeinflussen. Daher Mutationsraten und Frequenzen für die erste Bevölkerung müssen mit der gleichen Wachstums Tempe bestimmt werdenratur, die für Runden Wachstum und Sortierung verwendet wird. Es ist ratsam, dass die Markierung mit Biotin überprüfen nicht vor der Verwendung des Protokolls auf andere Arten von Mutationen oder Umlagerungen Genom untersuchen beeinflussen Genominstabilität.
Wie erwartet, sind die in 2A gezeigt Mutationsrate Werte Faches niedriger als die entsprechenden Frequenzmessungen. Dieser Unterschied tritt auf, da die Mutationsrate misst das Auftreten von Zellen, die mit neuen Mutationen, die mit jeder Runde der Zellteilung, während Mutationsfrequenz mißt die Gesamtzahl der mutierten Zellen in der Population am Ende der Wachstumsphase. Die Preise und 95% Vertrauensintervalle für diese Studien zeigen, dass reproduzierbare Ergebnisse können mit sieben Replika-Kulturen pro Studie, die die minimale Anzahl von Wiederholungen vorgeschlagen, für dieses Protokoll erhalten werden.
Sobald die ersten Frequenz und Geschwindigkeitswerte ermittelt werden, sollte ein Populationsgröße ch seinOsen, die gewährleistet, dass ausreichend Zellen nach mehreren Runden der Sortierung von Mutation Frequenzen zuverlässig zu bestimmen, vorhanden sind. Markieren einer Population von 10 8 Zellen pro Zeitpunkt, der während der Alterung analysiert werden soll, ist geeignet, wenn Frequenzen und Kosten, die denen in Figur 2A gezeigt sind. Diese Entscheidung hängt auch davon ab, wie effizient markiert Mutterzellen werden nach jeder Runde der Sortier erholt. Die Effizienz der Gewinnung markierten Mutterzellen können schnell und einfach mit Hilfe einer Zählkammer, die Anzahl der Zellen, die aus den Spalten für jede Art eluiert bestimmen und Zellmorphologie untersuchen ausgewertet werden. Zwei Hauptpunkte werden durch das Beispiel Gewinnungseffizienz Daten (3A) veranschaulicht: die gewonnenen Zellzahlen höher als nach der ersten Art erwartet erscheint, und einer kleinen fortschreitenden Verlust von Zellen mit fortSortier erwartet. Die höher als erwartete Anzahl von Zellen, die in einigen Experimenten nach der ersten Art konnte resULT von der Kennzeichnungspflicht Knospen auf Zellen in der Anfangspopulation. Eine Hefezelle, die mit einer Knospe würde typischerweise als eine einzelne Zelle bei der Bestimmung der Anzahl von Zellen mit Biotin markieren erzielt werden. Kennzeichnung von in der Anfangspopulation vorhanden Knospen, obwohl, würde es den Zellen, die aus diesen Knospen zu entwickeln, um auch auf Säulen beim Sortieren beibehalten werden. Der Einfluss dieses Ereignisses auf der Bestimmung der Wiedergewinnungseffizienz hängt von dem Anteil an Knospen Zellen in der ersten Zellpopulation. Ein zweiter möglicher Grund für die höhere Zellzahl nach Art ist, dass es tendenziell mehr große Knospen Zellen zu diesem Zeitpunkt, die werden Zellteilung Abschluss kann bei der Sortierung sein. Als ein Ergebnis können große Knospen noch ihre Mutterzellen angebracht sortiert werden, aber dann wie verschiedene Zellen, wenn die eluierten Zellen untersucht. Während ein gewisser Verlust von Zellen mit jeder Runde des Wachstums und Sortierung beobachtet wird, kann das Protokoll in sichere Rückhaltung von 80-90% der Zellen nach jeder Runde der n Ergebnislisteorting. Es ist der Mühe wert, um das Verfahren zu praktizieren, um sicherzustellen, dass 80% oder mehr der markierten Zellen werden isoliert, um die Notwendigkeit, eine unnötig große anfängliche Zellenpopulation kenn vermeiden. Behandlung der Zellen mit einer leichten Stress nach der ersten Art (1 mM Wasserstoffperoxid in YPD-Medium für 30 min) nicht verhindern, dass eine effiziente Rückgewinnung der Zellen mit fort Runden des Wachstums und der Sortierung, obwohl es eine gewisse Variabilität bei der Wiederherstellung der ersten Art nach die Spannung (3A).
Prüfung der Zellmorphologie und der Lebensfähigkeit sind auch nützlich sowohl für die Bestätigung der erfolgreichen Isolierung von Mutterzellen und für die Anpassung verwendet wird, wenn Streu Zellen auf nicht-selektivem Medium, um die Dichte der koloniebildenden Einheiten zu bestimmen Verdünnungen / Volumen. Mutterzellen werden immer größer und unregelmäßig geformt, da sie alt, im Vergleich zu Tochterzellen (3B). Die Mutterzellproben sollte daher in erster Linie von großen, irr bestehenegularly förmige Zellen, wie das Experiment verläuft in jeder Runde der Sortierung. Die Anwesenheit von vielen kleinen ovalen Zellen von regelmäßiger Form könnte darauf hindeuten, dass die Mutterzellen werden nicht ausreichend von Tochterzellen getrennt. Lebensfähigkeit der Zellen Mutter sollte auch schrittweise sinken mit jeder Runde wächst und Sortierung, obwohl es viel Veränderung in den ersten fünf Minuten vor zehn Zellgenerationen nicht sein. Die Anzahl der Zellen, die Kolonien bilden können viel dramatischer als die Anzahl der Zellen, die bestimmt sind lebensfähig durch eine Form der direkten Färbung von Zellintegrität, aufgrund der Bildung von seneszenten Zellen zu verringern. Wenn die Lebensfähigkeit durch eine direkte Färbung Verfahren beginnt zuerst zu sinken (etwa 80% oder weniger), kann es notwendig sein, Verdünnungen und Volumina verwendet werden, um zu messen koloniebildende Einheit Dichten in Erwartung einer dramatischen Abnahme der Fähigkeit der lebensfähigen Zellen zu justieren Kolonien bilden (a zwei bis zu mehreren fache Abnahme).
Diereplikativen Alter der sortierten Populationen und Kontrollpopulationen müssen bestimmt werden, bevor Mutationshäufigkeit von Daten aus Mutterzellen für altersspezifische Veränderungen in der Rate der Anhäufung Mutationen analysiert werden. Dies kann durch manuelle Zählung der Knospe Narben auf Mutterzellen (Abbildung 4) oder durch Durchflusszytometrie durchgeführt werden, um das Signal für die Knospe Narbe Detektionsreagens (Abbildung 5) zu quantifizieren. Knospe Narben können mit relativ geringen Hintergrundsignals mit WGA-Fluoreszenz-Konjugate (4C) markiert werden. 4A zeigt, dass die meisten Zellen, die von der Strömung durch Proben des Sortierverfahrens null oder eine Knospe Narbe. Die von Säulen eluiert Zellen sind meist im Alter von Mutterzellen (4B und 5). Typischerweise> 90% des eluierten Zellen Mutterzellen, die leichter aus der Durchflusszytometrie Ergebnis in Figur 5 zu sehen ist. Zellen mit relativ wenigen Narben Knospe (<6) OBTained nach mehr als zwei Runden konnte Sortier verunreinigenden Zellen, die nicht Biotin markiert waren, dass ein paar Runden der Zellteilung während der betreffenden Runde des Wachstums unterzogen, im Gegensatz zu Mutterzellen, die sehr langsam sich teilen zu vertreten. Die Variation in der Zellalter kann mit den folgenden Runden der Sortierung, wenn nicht alle Zellen in der Population gleichmäßig wachsen zu erhöhen.
Eine größere Zellpopulation kann schneller verwendet werden, um Zellalter zu bewerten, wenn eine lineare Beziehung zwischen WGA-Fluoreszenzsignalintensität und die Anzahl der Knospe Narben pro Zelle hergestellt. Für diese Analyse wird eine Normalisierung aller WGA-Fluoreszenzsignalintensitäten durch Dividieren des Signals der gefärbten Zellen von der für die entsprechenden ungefärbten Zellpopulation (Tochter oder Mutter), um eine erhöhte Hintergrundfluoreszenz in den älteren Zellen ausmachen erhaltenen Signals durchgeführt. 4 und 5 zeigen Analyse der gleichen repräsentativen Zellpopulationen.Manuellen Zählung ermittelten durchschnittlichen replikativen Alter von 0,95 und 11,4 für die Tochterzelle (4A) und Mutterzellpopulationen (4B) sind. Normalisierten WGA-Signale für diese beiden Populationen und der drei zusätzlichen Populationen (Durchschnittsalter von 3,0, 6,9 und 14,4) wurden mit der durchschnittlichen Anzahl der Keim für jede Population Narben (5B) dargestellt. Diese lineare Beziehung kann dann mit der gleichen Belastung und Reagenzien, die in zukünftigen Experimenten zur durchschnittlichen Zellalter von der normalisierten WGA-Signal durch Durchflusszytometrie erhalten, so dass eine schnelle und genaue Bestimmung der Zellalter bestimmen. Kontrollpopulationen sollten noch aufgenommen werden, um eine ähnliche Verfärbung Wirkungsgrade zwischen Studien zu überprüfen.
Der Einfluss des Alters auf die Akkumulation von Mutationen, sobald die vorhergehenden Schritte des Erhaltens Mutationsrate Werte effizient Sortieren von Zellen und Bestimmung der Zellalter erreicht adressiert werden. Die number der Zeitpunkte, an denen die Frequenz bestimmt werden kann, hängt von der Größe des Biotin-markierten Zellpopulation und der Anzahl der Zellen, die auf selektivem Medium verteilt werden müssen, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten. Wenn Mutationsrate mit dem Alter ändert, dann die beobachteten Mutation Frequenzen für alternde Mutter Zellen sollten von den erwarteten ausschließlich auf eine zusätzliche Runden der Zellteilung auf der Basis unterscheiden. Vergleich des beobachteten Mutationsfrequenz auf die vorhergesagte Mutationsfrequenz kann altersbedingte Unterschiede in der Rate der Anhäufung Mutationen zu identifizieren. Wie in Abschnitt 7 des Protokolls beschrieben, kann die vorhergesagte Frequenz von dem Produkt der Ausgangsmutationsrate für die erste Zellpopulation und der Zunahme der replikativen Alter der Mutterzellen zu der Mutationsfrequenz für die Ausgangspopulation hinzugefügt erhalten werden. Steigerungen CAN1 Mutationsfrequenz mit einem erhöhten durchschnittlichen Zell Alter in einem Stamm mit CAN1 mit seiner normalen Lage auf Chromosom V beobachtet(6A) und in einem Stamm mit CAN1 auf dem rechten Arm des Chromosoms VIII (6B). Da die beobachteten Mutation Frequenzen für Mutterzellen in 6A ähnlich oder knapp unter den vorhergesagten Frequenzen sind, werden die Daten keine Beweise für eine altersspezifischen Veränderungen in Mutationsrate. Im Gegensatz dazu Mutationshäufigkeiten für Mutterzellen des Stammes mit CAN1 auf Chromosom VIII waren höher als die vorhergesagten Frequenzen (6B). Beachten Sie, dass die vorhergesagten Frequenzen in dem Graphen scheinen nicht sehr gut, da ein Log-Skala hat, um die y-Achse verwendet werden kann aufgrund der großen Zunahme der beobachteten Mutationsfrequenz zu erhöhen. Daher zeigen die Ergebnisse in Figur 6B nicht Nachweise für eine altersspezifische Zunahme der Rate der Akkumulation Mutationen. Der Unterschied in den Ergebnissen für die Datensätze in der 6A und 6B ist wahrscheinlich auf die verschie mieten genomischen Standorte CAN1. Diese Arten von Beobachtungen liefern einen Ausgangspunkt für die Entwicklung von Hypothesen zu Mechanismen, die Mutationsraten als Zellen Alter beeinflussen zu untersuchen und Modelle zur Mutation Akkumulation mit replikativen Alter erklären zu entwickeln.
Abbildung 1. Flussdiagramm der Gesamt Verfahren zur Prüfung Mutation Akkumulation während Hefe replikative Alterung. Schwarzer Text und Pfeile zeigen wichtige Schritte in der Prozedur. Der gebogene Pfeil zeigt, dass zusätzliche Runden Nachwachsen und Sortierung von den gleichen Zellen verwendet werden, um schrittweise älteren Zellen zu erhalten. Lila Pfeile und Text weisen Schritte, bei denen die genannten Messungen durchgeführt werden. Frequenz - Frequenz.
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Abbildung 2. Bestimmung der Mutationsfrequenz und die Geschwindigkeit bei jungen Zellpopulationen. (A) Mutantenkolonien wurden durch Verteilen Zellen auf SC-Arg + Canavanin Medium für Verlust der Funktionsmutationen in dem CAN1-Gen ausgewählt und verglichen mit der Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen auf einem selektiven Medium ausplattiert, um Frequenzen / Raten zu berechnen, ausgewählt. Zellen von Anfangspopulationen vor Biotinmarkierung (IP) oder nach Markierung mit Biotin (PB) unter Verwendung YPD-Medium von einer anfänglichen Dichte von 5000 Zellen / ml in der Nähe der Sättigung gezüchtet. Lavendel Spalten zeigen Ratenmessungen und blauen Säulen stellen Frequenzmessungen bei angegebenen Temperaturen (20 ° C und 30 ° C). Sätze von sieben Replika-Kulturen wurden für jeden Versuch gewachsen und zwei bis fünf unabhängige Versuche durchgeführt. Für unabhängige Studien ermittelten Einzelfrequenz-Werte angezeigt, und die Fehlerbalken für diese Versuche repräsentieren 95% Vertrauensintervalle bestimmend mit einem Online-Rechner 22. Frequenzen stellen Mittelwerte und Standardabweichungen. (B) CAN1 Mutationsraten erhalten und dargestellt, wie für einen Teil A mit einem Stamm mit CAN1 auf dem rechten Arm von Chromosom VIII. (C) Mutation Frequenzen folgende Auswahl für Mutantenkolonien auf 5-FOA unter Verwendung beschrieben ein Stamm mit dem URA3-Gen auf dem rechten Arm des Chromosoms VIII entfernt. Verfahren waren ansonsten wie für Teil A, und die Mittelwerte und Standardabweichungen für drei oder vier unabhängigen Versuchen gezeigt.
Abbildung 3. Beispiel Sortiereffizienz, indem die Anzahl der eluierten Zellen nach jeder Runde der Sortierung bestimmt. (A) Die Gesamtzahl der Zellen in jeder Ausgangspopulation nach Biotinmarkierung wurde auf eins gesetzt, und die t esamtanzahl in den eluierten Proben aus jeder Runde der magnetischen Zellsortierung vorhandenen Zellen wurde durch diese Anfangswerte geteilt, um den Anteil markierter Zellen zu erhalten. Gesamtzellzahlen wurden aus Zellzahlen mit einer Zählkammer erhalten wird. Orange Säulen stellen den Mittelwert und Standardabweichung für drei unabhängige Studien nach dem Standardprotokoll. Blaue Balken stellen den Mittelwert und die Standardabweichung für zwei unabhängige Versuche, bei denen Zellen mit 1 mM Wasserstoffperoxid für 30 Minuten unmittelbar nach der ersten Art behandelt. (B) Größe und Morphologie der Zellen nach Markierung mit Biotin (post-Biotin) und Mutterzellen nach der dritten Runde der magnetischen Sortierung (Art 3 Mutterzellen) mit Standard-Hellfeldmikroskopie und ein 20x-Objektiv gezeigt erholt. Weiße Linien in den Hintergründen sind die Zeilen, die die kleinsten Quadrate auf einem Standard-Hämozytometers sichtbar gebunden.k "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Bestimmung der replikativen Alter mit manuellen Knospe Narbe Zählen. Konfokale Mikroskopie wurde verwendet, um Knospe Narben auf einzelne Zellen mit einer WGA-fluoreszierendes Konjugat markiert (Anregung bei 488 nm und 458/543 nm-Detektion mit Bandpass-und 505 nm langen Pass zählen Filter-Kombination). (A) Hand Knospe Narbe Grafen von Zellen, die von der Strömung durch (Tochterzellen) nach der dritten Runde der magnetische Sortierung (n = 62). (B) Manuelle Knospe Narbe Grafen von eluiert Zellen (Mutterzellen) nach der dritte Runde der magnetische Sortierung (n = 54). (C) Mutter Zellen gehalten nach der dritten Runde der magnetische Sortierung nach Färbung Witz fotografiert mit einer 63X Ölimmersionsobjektiv mit 3fach-Zoomha WGA-fluoreszierendes Konjugat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 5. Bestimmung der replikativen Alter mittels Durchflusszytometrie. Proben von 10.000 Zellen mit einer WGA-gefärbten fluoreszierenden Konjugat wurden durch Durchflusszytometrie unter Verwendung einer Anregung bei 488 nm und Nachweis mit einem 530/30 Bandpass-und Langpassfilter 505 Satz analysiert. (A ) Histogramme der Darstellung der Anzahl von Zellen mit spezifischen WGA-Fluoreszenzintensitäten für eine Tochterzelle Bevölkerung oder die Eluat (Mutterzellen) nach drei Runden von Magnetsortierung. Populationen entsprechen denen in Figur 4 analysiert. Blau vertikalen Linien die entsprechende Position für die Mehrzahl der Daughter Zellen auf der Mutterzelle Histogramm. (B) Die normalisierte mittlere geometrische für Fluoreszenzsignal jedes in A gezeigt Bevölkerung und drei zusätzliche Population von Zellen (Durchschnittsalter 3,0, 6,9 und 14,4) wurde als das Verhältnis der geometrischen Mittel der berechneten Die gefärbten Zellen und der geometrische Mittelwert der entsprechenden ungefärbten Zellpopulation. Diese Werte sind im Vergleich zu der durchschnittlichen Anzahl der Knospe Narben für jede Gesamtpopulation aufgetragen (Figur 4 und Daten nicht gezeigt). Die R 2-Wert für die Trendlinie dieses Vergleichs wird in der Grafik angegeben.
Abbildung 6. Vergleich zwischen vorhergesagten und beobachteten Mutationshäufigkeiten während replikative Alterung. Zellen mit Mutationen in dem CAN1-Gens wurden ausgewählt, wie für Figur 2 beschrieben using Stämme mit CAN1 mit seiner normalen Position auf Chromosom V (A) oder auf dem rechten Arm des Chromosoms VIII (B). Zellen wurden auf einem festen Medium bei 30 ° C vor der Markierung mit Biotin und bei 20 ° C danach gezüchtet. Beobachteten Frequenzwerte mit Orangenspalten (OBS) und vorhergesagten Frequenzen für gealterte Zellen mit braunen Säulen (Pre) gezeigt. Die erste Spalte für jede Kurve zeigt den Mittelwert und die Standardabweichung des ersten Mutationsfrequenz nach Markierung mit Biotin vier unabhängigen Versuchen (PB). Zahlen unter den Spalten zeigen die durchschnittliche Anzahl der Knospe Narben für jede Population (Cell Age). Unabhängige Vorhersagewerte wurden wie in Abschnitt 7 des Protokolls unter Verwendung jedes der in 2A (IP Spalten) und 2B dargestellten Ausgangsfrequenz-Werte beschrieben, bestimmt. Diese unabhängigen Werte wurden dann gemittelt. Beobachteten Werte sind Mittelwerte aus drei Versuchen. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung.
Discussion
Dieses Protokoll verbindet mehrere Methoden, um Ressourcen zu ermöglichen und Ansätze in den Saccharomyces cerevisiae Modellsystem zur Verfügung, um während der mitotischen Zellalterung effizient auf das Studium der Genominstabilität angewendet werden. Eine große Vielzahl von Assays auf unterschiedliche Formen der Genominstabilität durch phänotypische Selektion quantifizieren kann mit Magnetsortierung kombiniert werden, um mögliche altersspezifische Veränderungen Anreicherung bestimmter Formen von Mutationen oder Chromosomenveränderungen untersucht werden. Während des gesamten Genoms Sequenzierung Ansätze könnten mehr Informationen über die Gesamt Arten von Änderungen in einem Genom mit dem Alter auftreten, zu schaffen, sind die Fähigkeit, phänotypischen Selektionssysteme verwenden, um Mutationsrate Messungen zu erhalten und zu isolieren, bevorzugt bestimmte Arten von genetischen Veränderungen wichtige Vorteile für das Studium mechanistische Aspekte des Alterns bezogene Genominstabilität. Straffung der Bestimmung der Zell Alter und das Potenzial parallelen Messungen von physiologi zu machencal Veränderungen durch Durchflusszytometrie effiziente Mittel, um Genominstabilität mit anderen zellulären Veränderungen in bestimmten Altersklassen korrelieren. Festlegung der möglichen altersabhängigen Veränderungen in der Akkumulation von Mutationen Raten erfordert: 1) vorsichtig Bestimmung bei jungen Zellpopulationen, 2) eine genaue Bestimmung der Zellalter, und 3) die Fähigkeit, zuverlässig zu bereichern ausreichend große Populationen von Mutterzellen reproduzierbar messen Genominstabilität im Alter. Dieser Ansatz ermöglicht die Hefe Modellsystem, um die Definition zu Grunde liegenden Mechanismen für altersabhängige Veränderungen der Zinssätze und / oder Frequenzen der Genominstabilität in mitotisch aktiven Zellen verantwortlich beitragen. Weiterhin können genetische und Umweltfaktoren schnell für Beiträge zu altersabhängigen Genominstabilität zu beurteilen. Letztlich könnten diese Charakterisierungen, die Entwicklung von Modellen, die für die Art und Weise, in der Mutationen während der replikativen Alterung akkumulieren Konto führen.
Dieses Verfahren hängt von der Fähigkeit, Mutationen oder andere Arten von Genominstabilität durch das Auftreten von Selektionsphänotypen erfassen Raten solcher Ereignisse zu messen. Allerdings kann Kreativität in Assay-Design erlauben viele Aspekte der Genominstabilität untersucht werden. Zum Beispiel kann das URA3 und CAN1 Gene an verschiedenen Genomorte platziert werden, um jegliche Einflüsse der genomischen Position auf die Testergebnisse. Reversion von spezifischen nicht-funktionalen Gen-Allele zu funktionellen Gen-Allele könnte insbesondere Mutationsprozesse zu testen. Auch Einführung mehrerer inaktiver Allele eines Gens oder eines Gens mit flankierenden Wiederholungssequenzen verwendet werden, um Rekombinationsereignisse durch Wiederherstellung oder Verlust der Genfunktion zu untersuchen bzw. werden. Fluktuation Tests sind die Standard-Ansatz zur Bestimmung Raten der verschiedenen Genominstabilität Ereignisse 9. Das Protokoll wird mit Hilfe der gut angenommen und relativ einfach Lea-Coulson Median-Schätzer zu bestimmen muta geschriebentionsrate es zugänglicher zu verschiedenen Forscher zu machen, auch wenn die MSS-Maximum-Likelihood-Schätzer Methode gilt als der beste Ansatz für die Bestimmung Mutationsraten 9. Die MSS-Maximum-Likelihood-Schätzer zuvor detailliert 9 überprüft, und kann als ein alternatives Verfahren verwendet werden, erfordert jedoch komplexere Berechnungen. Alternativ wurde die kostenlose Software, Mutationsraten mit dieser Methode berechnen worden verfügbaren 22 gemacht. Reproduzierbare Maßnahmen der Mutationsraten erfordert Aufmerksamkeit auf einige Aspekte der Versuchsplanung, einschließlich der Verwendung von genügend Parallel Kulturen, Impfen Kulturen niedrig genug Anfangszelldichten, die Populationsgröße steigt um 10.000-fach oder mehr, und die Auswahl geeigneter Kulturvolumina, so dass der gesamte Population von Zellen kann auf selektiven Medium verbreitet werden. Für den letzteren Punkt kann eine zuvor beschriebene Formel verwendet, um die Mutationsrate einzustellen, basierend auf dem Anteil der Kultur Teste werdend 9. Veränderung der Wachstumsrate der Kulturen kann die Bestimmung eines reproduzierbaren Mutationsrate und eine modifizierte Median-basierte Schätzer, die mehr reproduzierbare Ergebnisse in solchen Situationen wurde kürzlich beschrieben 23 ergeben kann erschweren.
Die Fähigkeit zur genauen Messung der Zellalter ist ein weiterer Faktor, der wichtig für die Feststellung, ob Genominstabilität Frequenzen in alten Zellen von den Werten erwartet werden aufgrund der Ereignisrate in jungen Zellen. Wir haben gefunden, WGA-Färbung bevorzugt, weiße Färbung Calcofluor zu sein, sowohl in Bezug auf Hintergrund und Flexibilität, da WGA ist konjugiert mit verschiedenen fluoreszierenden Molekülen. Diese Flexibilität kann mehr Möglichkeiten zur gleichzeitigen Messung von anderen Zelleigenschaften mit fluoreszierenden Reagenzien bereitzustellen. Erste Arbeiten, um eine Beziehung zwischen der Signalintensität für die WGA-Färbung und der entsprechenden Zahl der Knospe Narben auf Zellen herstellen kann dann zu einem mehr führenschnelle Bestimmung von Zellalter durch Durchflusszytometrie. Dieser Ansatz ermöglicht auch die Verwendung von größeren Populationsgrößen, als es in der Regel durch Mikroskopie für eine verbesserte Reproduzierbarkeit der Messungen untersucht werden. Während alle Altersbestimmungen konnte durch mikroskopische Untersuchung der Zellen gemacht werden, fühlen wir, dass die Durchflusszytometrie Ansatz erleichtert das schnelle Screening von Faktoren, die altersabhängigen Genominstabilität beeinflussen.
Neben der Messung der Zellalter zuverlässig ist zu überlegen, auf die Anzahl der Zellteilungen Mutter Zellen werden mit jeder Runde wächst und Sortieren von Zellen unterziehen sollen. Verwendung einer geringeren Anfangspopulationsgröße oder eine größere Kulturvolumen könnte es Zellen, mehr Zellteilungen vor Erreichen der gewünschten Zelldichte zu unterziehen. Zum Beispiel haben andere Forscher nur zwei Runden der Sortierung sehr alte Hefe-Zellen 16, die den offensichtlichen Vorteil des Erhaltens alten Zellen mit weniger Experime hat zu erhaltenNTAL Schritten. Bei der Prüfung, ob die Kulturvolumen zu erhöhen, um damit die Zellen mehr Zellteilungen vor der Sortierung abgeschlossen haben, denken Sie daran, die Grenze für die Gesamtzahl der Zellen, die in einer einzelnen Spalte bearbeitet werden können. Verwendung einer größeren Kulturvolumen kann die Verwendung von mehreren Spalten erfordern, um eine Zellpopulation zu sortieren. Auch, wenn Zellen durchlaufen weniger Runden der Zellteilung zwischen Arten / Sammlung Punkte, dann gibt es mehr Möglichkeiten, um Abweichungen von erwarteten Mutation Frequenzen an bestimmten Zeitpunkten während Lebensdauer zu beobachten. Zum Beispiel, Probenahme nur bei frühen und späten Zeitpunkten während Lebensdauer kann Daten, die einen stetigen Anstieg der Mutationsfrequenz, aber Abtastung mit zusätzlichen Zwischenzeiten während Lebensdauer kann schnell und dann zeigen, dass die Hochebenen Mutationsfrequenz erhöht produzieren. Da dieses Protokoll isoliert alte Mutterzellen, gibt es eine Möglichkeit, um eine direkte Messung der Veränderungen im Mutationsraten mit dem Alter zu erhalten. Fluktuation Tests könnten be unter Verwendung von Mutterzellen unterschiedlichen Alters, um zu bestimmen, ob die Mutationsrate wird von der mit jungen Zellen erhalten Satz abweichen. Während die Kulturen für diese Fluktuation Tests wird eine Mischung aus alten und jungen Zellen werden, wie sie wachsen, könnten etwaige Abweichungen von Raten erhalten, beginnend mit jungen Zellen auf die Verwendung einer älteren Ausgangspopulation zurückzuführen.
Die Fähigkeit, reproduzierbar erhalten eine ausreichend große Population von Zellen alte Mutter, genau zu messen Genominstabilität ist entscheidend für den Erfolg dieses Ansatzes. Während das Protokoll beschreibt die Verwendung einer bestimmten magnetischen Sortiersystem für diesen Zweck, haben andere Gruppen Hefe Mutterzellen mit alternativen Systemen 14,18 (siehe Tabelle der Materialien) sortiert. Solche alternativen Systeme sollte auch mit dieser Methode zu arbeiten, auch wenn einige Optimierung der Protokolle der Hersteller erforderlich werden könnte. Unabhängig von der konkreten System verwendet werden, die Populationsgröße erfordernd unterscheidet sich in Abhängigkeit von der Frequenz von der Art der Mutation oder Genom Umlagerung zur Untersuchung ausgewählt. Zumindest muß es genügend Mutterzellen mit mindestens einem mutierten Kolonie pro Population zu erhalten, um eine Mutationsfrequenz zu berechnen. In der Praxis können die Ergebnisse ziemlich variabel sein, wenn nur null bis fünf Mutantenkolonien aus der Populationsgröße und auch eine geringe Zunahme der Populationsgröße erwartet, so dass fünf bis zehn Mutantenkolonien zu erwarten sind, kann erheblich die Reproduzierbarkeit zu verbessern. Biotin-Markierung, wenn eine Ausgangspopulation, die Rückgewinnungseffizienz für jede Art muss berücksichtigt werden, um zu identifizieren die entsprechende Bevölkerungsgröße notwendig, Mutationsfrequenz in alten Mutterzellen zu messen. Mit 90% Erstattung der Mutterzellen nach jeder Art würden nur 59% der ursprünglichen Bevölkerung nach fünf Runden des Wachstums und der Sortierung wiederhergestellt werden. Diese sinkt auf ~ 33% Wiederherstellung der ursprünglichen Bevölkerung nach fünf Runden des Wachstums und Sortier, wenn nur 80% der markierten Zellen Mutter erholenbei jeder Art ed. Messung und Maximierung der Wiederherstellung ist von entscheidender Bedeutung bei der Messung niedriger Frequenz Veranstaltungen, seit zwei bis dreifache Abnahme der Populationsgröße könnte leicht zu unzuverlässigen Zahlen von mutierten Kolonien pro Bevölkerung führen.
Es gibt zahlreiche Möglichkeiten für die Erweiterung oder Änderung auf dieses Protokoll, um ein breiteres Verständnis der Genominstabilität während der mitotischen Zellalterung zu erhalten. Einfache Beispiele sind die Analyse, wie Veränderungen in der Gen-Funktionen, Medienwechsel, oder andere Umweltzustand ändert nichts an der Anhäufung von Mutationen mit dem Alter. Mutationsraten für junge Zellen mit veränderten Gen-Funktion oder in der entsprechenden Bedingung wäre gemessen und verwendet, um zu bestimmen, ob Mutationen ansammeln anders als durch die Frequenzwerte vorhergesagt und anders als in der Kontrollzellpopulationen werden. Zellpopulationen in verschiedenen Punkten während replikative Alterung könnte, spezifische Belastungen, wie reaktive Sauerstoffspezies oder DNA-schädigende Mittel ausgesetzt werden. Einvorübergehend und mild Exposition gegenüber oxidativem Stress im Wesentlichen nicht die Fähigkeit zur Zellsortierung (3) durchführen zu verändern, aber härteren Beanspruchungen kann die Wiederherstellung von Zellen zu erschweren. Vorversuche notwendig wäre, um zu überprüfen, dass Mutterzellen noch effizienter nach spezifischen Belastungen zurückgewonnen werden. Zusätzlich könnte die zelluläre Eigenschaften der isolierten Mutterzellen im Detail analysiert werden, einschließlich der Stufen von reaktiven Sauerstoffspezies, mitochondriale und Vakuolenmorphologie und andere physiologische Eigenschaften, die mit der Alterung 3 zugeordnet sind. Außerdem könnten die Mutterzellen eine Ausgangspopulation für eine weitere Behandlung oder Manipulation. Da Mutter und Tochterzellen physikalisch während des Verfahrens abgetrennt, werden die Tochterzellen auch noch für die Analyse verfügbar. Beispielsweise ändert in physiologischen Eigenschaften der Tochterzellen oder der asymmetrischen Vererbung von Makromolekülen zwischen Hefe beschädigt Mutter und Tochterzellen
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise durch Gewährung R00AG031911 aus dem National Institute on Aging der National Institutes of Health unterstützt zu PHM Der Inhalt dieses Artikels gibt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | 100 mg |
| Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | 2 ml MicroBeads conjugated to monoclonal mouse anti-biotin antibodies (isotype: mouse IgG1) |
| MACS LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | 25 columns suitable for QuadroMACS separator |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | Separator Only |
| QuadroMACS Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-091-051 | Includes: QuadroMACS Separator (130-090-976), MACS MultiStand (130-042-303), LS Columns (130-042-401), MACS 15 ml Tube Rack (130-091-052), One 2 ml unit of MACS MicroBeads. Note: Alternative systems include Dynabeads Biotin Binder and MagnaBind Magnetic Beads |
| BD Falcon Cell Strainer, 40 µm | BD Biosciences | 352340 | 40 µm for use with BD Falcon 50 ml Conical Tubes. 50 per pack |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | Powder, filtering after dissolving important to remove particulates |
| Wheat germ agglutinin Alexa Fluor488 | Life Technologies | W11261 | Conjugates with different excitation/emission spectra could also be used |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36930 | 10 ml, other antifade reagents could also be used |
References
- Maslov, A. Y., Vijg, J. Genome instability, cancer and aging. Biochim Biophys Acta. 1790, 963-969 (2009).
- Maher, R. L., Branagan, A. M., Morrical, S. W. Coordination of DNA replication and recombination activities in the maintenance of genome stability. J Cell Biochem. 112, 2672-2682 (2011).
- Longo, V. D., Shadel, G. S., Kaeberlein, M., Kennedy, B. Replicative and chronological aging in Saccharomyces cerevisiae. Cell Metab. 16, 18-31 (2012).
- Madia, F., Gattazzo, C., Fabrizio, P., Longo, V. D. A simple model system for age-dependent DNA damage and cancer. Mech Ageing Dev. 128, 45-49 (2007).
- Madia, F., et al. Oncogene homologue Sch9 promotes age-dependent mutations by a superoxide and Rev1/Polzeta-dependent mechanism. J Cell Biol. 186, 509-523 (2009).
- Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 4916-4920 (2012).
- Xie, Z., et al. Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device. Aging Cell. 11, 599-606 (2012).
- McMurray, M. A., Gottschling, D. E. An age-induced switch to a hyper-recombinational state. Science. 301, 1908-1911 (2003).
- Foster, P. L. Methods for determining spontaneous mutation rates. Methods Enzymol. 409, 195-213 (2006).
- Boeke, J. D., LaCroute, F., Fink, G. R. A positive selection for mutants lacking orotidine-5"-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance. Mol Gen Genet. 197, 345-346 (1984).
- Whelan, W. L., Gocke, E., Manney, T. R. The CAN1 locus of Saccharomyces cerevisiae: fine-structure analysis and forward mutation rates. Genetics. 91, 35-51 (1979).
- Lindstrom, D. L., Gottschling, D. E. The mother enrichment program: a genetic system for facile replicative life span analysis in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 183, 413-422 (2009).
- Lindstrom, D. L., Leverich, C. K., Henderson, K. A., Gottschling, D. E. Replicative age induces mitotic recombination in the ribosomal RNA gene cluster of Saccharomyces cerevisiae. PLoS Genet. 7, e1002015 (2011).
- Feser, J., et al. Elevated histone expression promotes life span extension. Mol Cell. 39, 724-735 (2010).
- Afonso, B., Silver, P. A., Ajo-Franklin, C. M. A synthetic circuit for selectively arresting daughter cells to create aging populations. Nucleic Acids Res. 38, 2727-2735 (2010).
- Smeal, T., Claus, J., Kennedy, B., Cole, F., Guarente, L. Loss of transcriptional silencing causes sterility in old mother cells of S. cerevisiae. Cell. 84, 633-642 (1996).
- Lam, Y. T., Aung-Htut, M. T., Lim, Y. L., Yang, H., Dawes, I. W. Changes in reactive oxygen species begin early during replicative aging of Saccharomyces cerevisiae cells. Free Radic Biol Med. 50, 963-970 (2011).
- Dang, W., et al. Histone H4 lysine 16 acetylation regulates cellular lifespan. Nature. 459, 802-807 (2009).
- Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).
- Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14, 115-132 (1998).
- Maxwell, P. H., Burhans, W. C., Curcio, M. J. Retrotransposition is associated with genome instability during chronological aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 20376-20381 (2011).
- Hall, B. M., Ma, C. X., Liang, P., Singh, K. K. Fluctuation analysis CalculatOR: a web tool for the determination of mutation rate using Luria-Delbruck fluctuation analysis. Bioinformatics. 25, 1564-1565 (2009).
- Wu, X., et al. A robust estimator of mutation rates. Mutat Res. 661, 101-109 (2009).
- Aguilaniu, H., Gustafsson, L., Rigoulet, M., Nyström, T. Asymmetric inheritance of oxidatively damaged proteins during cytokinesis. Science. 299, 1751-1753 (2003).
