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Biology

La combinaison de tri magnétique des cellules mères et Tests de fluctuation à Analyser instabilité du génome cours mitotique vieillissement cellulaire dans doi: 10.3791/51850 Published: October 16, 2014

Summary

Les taux de mutation chez les jeunes Saccharomyces cerevisiae cellules mesurées par des tests de fluctuation sont utilisés pour prédire la fréquence des mutations de cellules mères de différents âges de réplication. Tri magnétique et la cytométrie en flux est ensuite utilisé pour mesurer la fréquence des mutations réelles et l'âge des cellules mères afin d'identifier les écarts par rapport à la fréquence des mutations prévues.

Abstract

Saccharomyces cerevisiae a été un excellent modèle pour les mécanismes et les conséquences de l'instabilité du génome d'instruction. Les informations obtenues à partir de ce modèle de levure est pertinente pour de nombreux organismes, dont les humains, puisque les facteurs de réparation de l'ADN et réponse aux lésions de l'ADN sont bien conservées entre espèces différentes. Cependant, S. cerevisiae n'a pas encore été utilisé pour répondre pleinement si le taux d'accumulation des mutations changements avec l'augmentation réplicative (mitotique) l'âge en raison de contraintes techniques. Par exemple, les mesures de levure durée de vie réplicative par micromanipulation impliquent de très petites populations de cellules, qui interdisent la détection des mutations rares. Les méthodes génétiques pour enrichir de cellules mères dans les populations en induisant la mort des cellules filles ont été développés, mais la taille de la population sont encore limitées par la fréquence avec laquelle des mutations aléatoires qui compromettent les systèmes de sélection se produisent. Le protocole actuel profite de Sorti magnétiqueng de cellules de levure mère surface marquée d'obtenir une population suffisamment large du vieillissement des cellules mères de quantifier mutations rares dans les sélections phénotypiques. Les taux de mutation, mesurées par des tests de fluctuation, et la fréquence des mutations sont d'abord établis pour les jeunes cellules et utilisés pour prédire la fréquence des mutations dans les cellules mères de différents âges de réplication. les fréquences de mutation sont ensuite déterminés pour les cellules-mères triées, et de l'âge des cellules mères est déterminé par cytométrie de flux par coloration avec un réactif fluorescent qui détecte les cicatrices de bourgeons formés sur les surfaces des cellules pendant la division cellulaire. Comparaison de la fréquence des mutations prévues en fonction du nombre de divisions cellulaires aux fréquences observées expérimentalement pour cellules mères d'un âge donné réplicatif peut alors identifier s'il ya des changements liés à l'âge du taux de mutations qui s'accumulent. Des variantes de ce protocole de base fournissent les moyens d'étudier l'influence des altérations des fonctions spécifiques de gènes oudes conditions environnementales spécifiques sur l'accumulation de mutation à traitent des mécanismes de l'instabilité du génome sous-jacente au cours du vieillissement réplicatif.

Introduction

Les micro-organismes, tels que la levure Saccharomyces cerevisiae, sont d'excellents modèles pour enquêter sur les taux de mutation, mais ces modèles n'ont pas été pleinement utilisés pour étudier l'accumulation de mutations au cours du vieillissement mitotique des cellules. l'accumulation de mutations dans le génome nucléaire a émis l'hypothèse de contribuer à un vieillissement en entraînant une perte progressive de la (ou variation) dans une des fonctions des gènes. La possibilité d'utiliser un système microbien d'étudier les mécanismes et les conséquences de l'accumulation des mutations au cours du vieillissement pourrait grandement accélérer l'identification de facteurs génétiques et environnementaux qui influent sur ce processus, car des systèmes génétiques faciles et la facilité de quantifier les changements phénotypiques rares dans les micro-organismes. Facteurs de réparation d'ADN et de protéines de réponse de lésion de l'ADN sont bien conservées entre les espèces diverses 2, et les similitudes fondamentales dans le vieillissement organismal ont été identifiés pour des organismes aussi divers que S. cerevisiae unemammifères d 3, ce qui rend probable que les résultats obtenus à partir des études chez la levure seront pertinents au vieillissement dans de nombreux organismes.

Les études de vieillissement en S. cerevisiae faire usage de deux modèles de vieillissement qui mesurent le vieillissement chronologique ou vieillissement réplicatif des cellules. Vieillissement chronologique est caractérisée par la perte progressive de la viabilité des populations de cellules de levure qui sont dans un état ​​(phase stationnaire) ne se divisant pas en raison de l'épuisement des nutriments 3. Le modèle de vieillissement chronologique a été utilisée pour démontrer que les mutations s'accumulent avec l'âge 4, puisque de grandes populations de cellules peuvent être facilement obtenus dans ce modèle pour effectuer des sélections phénotypiques de cellules mutantes. Dans ce cas, l'accumulation de mutation semble être influencée par des voies de signalisation de la croissance et du stress oxydatif 5, et chacun de ces facteurs sont pertinents à la compréhension du vieillissement chez les eucaryotes pluricellulaires 3. Le modèle de vieillissement réplicatif exploite la divisi asymétriquesur entre S. cellules, mère et fille cerevisiae pour enquêter sur le vieillissement qui se produit avec les générations cellulaires successives 3. Levure vieillissement réplicatif a souvent été mesurée par micromanipulation de petites populations de la mère et cellules filles, ou, plus récemment, par vidéo-microscopie de petites populations de cellules de levure dans des dispositifs microfluidiques 6,7. Taille de la population étant limitées, ces approches mal adaptée à l'étude accumulation des mutations au cours du vieillissement mitotique moins que des informations sur le génome entier est obtenu à partir de cellules individuelles ou de modification génétique à très haute fréquence sont mesurées 8. Séquençage complet du génome de cellules individuelles à fournir des ensembles de données importantes pour enquêter sur l'accumulation des mutations, mais les systèmes de sélection phénotypiques ont le grand avantage de fournir un moyen de mesurer les taux de mutation d'étudier les mécanismes d'accumulation de mutation sous-jacente. Des études pour examiner les fréquences et les taux de mutation à travers les sélections phénotypiques dans haploid souches de levure au cours du vieillissement réplicatif n'ont pas encore été rapporté.

Les taux de mutation sont généralement mesurés en utilisant des tests de fluctuation 9. des valeurs de fréquence de mutation indiquent le nombre total de cellules présentant une mutation dans une séquence de gène dans une population. Cela comprend des cellules dans lesquelles se produisent des mutations indépendantes et toute la descendance de ces cellules qui héritent simplement mutations préexistantes. En revanche, les taux de mutation mesurées par des tests de fluctuation représentent le nombre de mutations indépendantes qui se posent à chaque nouvelle génération de cellules. Ces essais impliquent typiquement l'inoculation de cultures répétées à des densités cellulaires faibles pour réduire la possibilité d'ajouter des cellules ayant des mutations préexistantes dans une séquence cible, les cultures en croissance à proximité de la saturation, et l'identification des cellules mutantes par croissance sur un milieu sélectif. Le nombre de cellules mutantes identifiés dans les populations répétés sont ensuite utilisés dans l'un des nombreux modèles mathématiques pour estimer le nombre de imutations ndependent qui ont surgi pendant la croissance 9. En comparant le nombre de mutations indépendantes de la taille moyenne de la population est une mesure du taux de mutation. Dans S. cerevisiae, les fréquences et les taux de mutation sont fréquemment mesurée en utilisant les gènes URA3 et CAN1, puisque des mutations perte de fonction de ces gènes produisent des phénotypes sélectionnables. La perte de fonction URA3 rend les cellules résistantes à l'acide 5-fluoroorotique (5-FOA), étant donné que la protéine codée par URA3 convertit 5-FOA en une molécule toxique 10. La perte de fonction de CAN1 permet aux cellules deviennent résistantes à la canavanine, un analogue de l'arginine toxique, car la protéine codée par l'arginine et la transporte CAN1 canavanine dans des cellules 11.

Les deux stratégies de tri génétiques et physiques ont été utilisées avec succès pour obtenir de plus grandes populations de S. cellules mères cerevisiae pour faciliter les enquêtes du vieillissement réplicatif. Stratégies génétiques comprennent des approches intelligentes qui sélectionnent contre la survie des cellules de fille dans une population. Le programme d'enrichissement de la mère (MEP) implique bêta-estradiol induction de la recombinase Cre expression que dans les cellules filles, ce qui conduit à des perturbations spécifiques fille de deux gènes essentiels qui ont été modifiées pour contenir des sites loxP 12. MEP souches peuvent être cultivées normalement en l'absence de l'inducteur, mais seules les cellules mères vont continuer à se diviser après l'induction, alors que les cellules filles vont arrêter à la phase M typiquement au cours de leur première progression à travers le cycle cellulaire 12. Bien que ce système n'a pas été utilisé pour étudier globalement l'accumulation de mutations au cours du vieillissement, il a été utilisé pour étudier la perte d'hétérozygotie, une forme relativement fréquente de l'instabilité du génome des souches de levure diploïde, ainsi que des modifications biochimiques dans les cellules de vieillissement mères 13,14. De même, le système pare-fille implique l'expression spécifique-fille de la S. cerevigène siae URA3 15. Souches fille-parafoudre se développent normalement jusqu'à 5-FOA est ajouté au milieu, à laquelle les cellules exprimant le point de fille URA3 mourront, tandis que les cellules mères continuent de croître 15. Ce sont des systèmes utiles pour enrichir les cellules-mères, mais elles dépendent de maintien des fonctions des gènes qui constituent le système de sélection. Des mutations aléatoires dans un ou plusieurs composants du système de sélection peut conduire à des cellules filles qui échappent à la sélection et prolifèrent de façon exponentielle. Au cours du développement des souches de MEP, importance de la population étaient déterminés à éviter l'apparition de cellules filles mutantes qui pourraient échapper à la sélection 12. Toutefois, cette limite de taille de la population compromet la détection des formes rares de l'instabilité du génome au cours du vieillissement réplicatif. Cette limitation de la taille de la population peut être partiellement résolu en utilisant des souches de levure diploïde avec deux copies de chaque gène qui contribue au système de sélection, car la plupartmutations seraient probablement récessive 12. Cependant, l'utilisation de souches diploïdes limite les types d'événements de mutation qui peuvent être facilement détectés par rapport à celles qui peuvent être facilement détectés dans les cellules haploïdes de levure.

Stratégies de tri physiques comprennent l'isolement des cellules mères avec une surface cellulaire marqué de cellules filles non marqués pour enrichir en grandes populations de cellules mères. L'observation que les protéines de surface cellulaire (protéines de la paroi cellulaire) de S. cerevisiae cellules filles sont nouvellement synthétisés au cours de bourgeonnement a été exploitée pour marquer les cellules-mères, sans marquage des cellules filles qu'elles produisent 16. Par exemple, une population initiale de cellules de levure marqués sur leur surface avec de la biotine peut être cultivé et ensuite isolé à partir de leurs cellules filles à l'aide des microbilles anti-biotine et magnétique de tri 16, parce que les cellules filles produites par la population initiale ne contiendront pas de la biotine sur leur surface . Croissance de série ettri permet aux populations progressivement âgés de cellules mères à être obtenues et analysées. Cette procédure a été utilisée avec succès pour étudier les changements dans la physiologie cellulaire et l'expression des gènes au cours du vieillissement réplicatif de levure 13,14,17,18. La méthode actuelle adapte cette marquage à la biotine et technique de tri magnétique pour enrichir les cellules mères dans le but de mesurer l'accumulation de mutations potentiellement rares ou d'autres formes de l'instabilité du génome analysés dans les sélections phénotypiques. Croissance de série et le tri physique permettent une analyse de l'accumulation de mutations dans les cellules-mères progressivement âgées, ainsi que dans les populations de cellules filles. Détermination du taux de mutation par génération permet une fréquence de mutation prévu pour être calculée pour les cellules mères qui ont subi un nombre particulier de divisions cellulaires. Comme les valeurs de fréquences prévues sont basées sur l'augmentation prévue en raison de cycles supplémentaires de la division cellulaire, des écarts importants dans les Mutati observéssur les fréquences par rapport aux valeurs prédites fournir des preuves des changements selon l'âge du taux de mutations qui s'accumulent. En utilisant ce protocole, fluorescence des cicatrices de bourgeons qui correspondent à des sites de divisions cellulaires sur des cellules-mères couplés avec l'analyse par cytométrie en flux peut être utilisé pour déterminer rapidement la répartition par âge des populations triées et non triées. Réactifs fluorescents supplémentaires, tels que ceux qui sont utilisés pour détecter des espèces réactives de l'oxygène, peuvent également être utilisées au cours de ce protocole. Dans l'ensemble, ce protocole permet une analyse efficace des changements dépendant de l'âge de l'instabilité du génome ayant le potentiel pour la corrélation de cellules changements physiologiques liés à l'âge dans un organisme modèle bien adapté à l'étude des facteurs génétiques et environnementaux qui influent sur l'instabilité du génome liées au vieillissement.

Protocol

1 Préparation des milieux et solutions

  1. Cultiver des cellules à l'aide de l'extrait de levure-peptone-glucose (YPD) de milieu riche pour le protocole standard. Préparer une Bacto-peptone à 2%, 1% d'extrait de levure, une solution de glucose à 2% de milieu YPD et ajouter Bacto-agar à 2% de milieu solide 19. Autoclave pour stériliser. Utiliser un autre milieu, si nécessaire, pour tester une condition particulière de croissance ou de la souche de levure mutante.
  2. Faites un milieu complet synthétique solide manque arginine 60 mg / L canavanine (SC-arg + canavanine) pour sélectionner pour canavanine mutants résistants. Préparer une solution qui est de 0,67% bacto-base azotée de levure sans acides aminés, 2% de glucose, mélange de supplément complet de 0,2% sans l'arginine (abandon mix), et 2% bacto-agar 19. Autoclave et refroidir avant d'ajouter d'un canavanine / ml solution stock de 20 mg (stérilisée par filtration, stockée à 4 ° C) 19.
    1. Faites un milieu complet synthétique solide contenant de l'acide 5-fluoro-(5-FOA). Préparer 500ml d'une solution 1,34% de Bacto-base azotée de levure sans acides aminés, glucose 4%, mélange de complément complet de 0,4%, et 0,2% de 5-FOA et stériliser par filtration 19. Autoclave de 500 ml d'une solution de bacto-agar à 4%, brièvement refroidir, puis mélanger avec la solution nutritive stérilisée par filtration de 500 ml. Utiliser les médias alternative appropriée pour d'autres essais de mutation.
  3. Pour le marquage à la biotine, faire 500 ml 1x solution saline tamponnée phosphate (PBS) contenant du chlorure 137 mM de sodium, 2,7 mM de chlorure de potassium, 10,14 mM de phosphate de sodium dibasique, et 1,77 mM de phosphate de potassium dibasique, pH 8 Conserver à 4 ° C et continuer glace pendant l'utilisation.
  4. Prenez un nouveau 5 mM biotine actions dans de l'eau ultra-pure stérile.
  5. Pour étancher marquage à la biotine, faire 500 ml de PBS 1x, glycine 100 mM. Stocker à 4 ° C et garder sur la glace pendant l'utilisation.
  6. En fonction du nombre de cellules utilisées et de la durée de l'expérience, faire 1-2 L de tampon de marquage contenant bourrelet PBS 1x, 2 mM EDTA, 0,5% Bovialbumine sérique ne. Stériliser par filtration et le tampon de gaz. Stocker à 4 ° C et garder sur la glace pendant l'utilisation.
  7. Préparer une solution à 0,4% de bleu trypan dans PBS 1x, stériliser par filtration, et conserver à la température ambiante pour une utilisation dans des mesures de viabilité cellulaire.
  8. Aliquotes de petits volumes (~ 100 pi) d'une agglutinine de germe de blé (WGA) conjugué fluorescent de stocker à -20 ° C dans du papier enroulé (ou opaque) microtubes pour une utilisation dans la détermination de l'âge de la cellule.

2 Détermination de mutation taux et la fréquence

  1. Établir un taux de mutation de base par la génération de cellule en utilisant des tests de fluctuation pour les cellules cultivées dans des conditions de culture standard. Cultiver sept à onze répliquent cultures de 1 ml à partir d'une densité initiale de 1.000-5.000 cellules / ml au début de la phase stationnaire (~ 10 8 cellules / ml).
    1. Pour chaque culture répliqué, diluer les cellules 1: 2000 et répandre 1-4 pi sur un milieu non sélectif (YPD) pour déterminer formant colonie unités / ml. Culot restant cellules à ~ 2400 xg pendant 1 min dans une microcentrifugeuse et remettre en suspension dans 100 ul d'eau étalé sur un milieu sélectif pour identifier des mutants. Incuber les plaques pendant trois jours à 30 ° C avant de comptage des colonies (ajuster le temps d'incubation nécessaire en fonction du taux de cellules de croissance).
    2. Déterminer le nombre de mutations indépendantes (m) qui ont eu lieu dans le procès sur la base du nombre de colonies mutantes (r) obtenus sur un milieu sélectif. Utilisez l'estimateur médian Lea-Coulson à trouver m en remplaçant le nombre médian de colonies mutantes pour r dans la formule ci-dessous 9. Puis, pour remplacer des valeurs m jusqu'à ce que le côté gauche de l'équation est quasiment nul.
      L'équation 1
    3. Pour déterminer le taux de mutation, d'abord calculer le nombre moyen de cellules viables, réparties sur un milieu sélectif en multipliant la moyenne formant colonie unités / ml des cultures répliquées et le volumede la culture dans la propagation ml sur un milieu sélectif. Diviser la valeur de m à l'étape 2.1.2 par ce nombre moyen de cellules viables pour obtenir le taux de mutation par génération cellulaire.
  2. Calculer individuellement le nombre de cellules viables répartis sur un milieu sélectif pour chaque culture répliqué dans un essai tel que décrit à l'étape 2.1.3. Diviser le nombre de colonies mutantes (r) obtenues pour une culture par le nombre de cellules viables répartis sur un milieu sélectif pour obtenir la fréquence de la mutation. Utilisation de la moyenne ou de la médiane des fréquences individuelles de mutation de la culture dans l'étape de rééchantillonnage de 2,1 en tant que fréquence de mutation de base.
  3. Faire des mesures de fréquence avant et après que les cellules de l'étiquetage de la biotine (étapes 3.2 et 3.4) pour déterminer si les résultats de l'étape d'étiquetage dans tout changement dans la fréquence des mutations qui devront être pris en considération lors de l'essai des changements selon l'âge de l'accumulation de mutations.

3. biotine étiquetage

  1. Streak S. cerevisiae à partir d'un stock de glycérol à -80 ° C sur un milieu YPD et incuber à 30 ° C pendant 1-3 jours.
  2. En utilisant une pointe de pipette stérile, les cellules de transfert de la plaque de série de 1 ml (ou plus) de la tenue de l'eau à l'esprit que de 1-1,5 cm d'une partie très développés de la série donneront environ 10 8 cellules. Déterminer la densité de cellule exacte à l'aide d'un hémocytomètre.
  3. Étiquette 10 8 cellules par la souche (ou une condition de traitement) par point de collecte à laquelle la fréquence de mutation est déterminée ou une taille de population suffisante pour obtenir au moins 5 à 10 colonies mutantes par prélèvement sur ​​un milieu sélectif (par rapport à la fréquence de mutation de l'étape 2.2). Inclure un 10 8 cellules supplémentaires pour les mesures de base par souche / état.
  4. étiquette de biotine selon la procédure standard du fabricant, sauf utiliser un 5 mM réactif de biotine stock et secouez-la délicatement pendant l'incubation. Spin pendant 5 min à 4 ° C à 3000 g pendant toutes les étapes de centrifugation, sepuis tournant à des températures supérieures à 4 ° C peut entraîner une augmentation de la perte de cellules. Après le lavage final, suspendre les cellules à une concentration de 10 8 cellules / ml marqués dans l'eau.
  5. Vérifiez la viabilité des cellules à l'aide de la coloration au bleu trypan. Diluer 10 pi de cellules avec 23 pi d'eau et 67 pi de 0,4% au bleu trypan en 1x PBS. Incuber pendant au moins 40 minutes à température ambiante avant de marquer cellules vivantes (non colorées) et mortes (colorées) en utilisant un hématimètre.
  6. Mesurer les valeurs de référence pour l'instabilité du génome, l'âge de la cellule, et d'autres caractéristiques pertinentes (voir les sections 5, 6 et 7).
  7. Transfert des cellules marquées à la biotine pour 20 ml de milieu YPD pour 10 8 cellules dans une fiole d'Erlenmeyer (environ 5 x 10 6 cellules / ml). Développer la culture (s) 16-18 h à 20 ° C à une densité d'environ 10 8 cellules / ml (quatre à cinq générations de portables), mais ne permettent pas de cellules pour atteindre la phase stationnaire. Utilisez un temps d'incubation plus courte pour la croissance à 30 ° C. Gardez marqué à la biotine caunes à 4 ° C pendant plusieurs heures avant l'addition au milieu, si nécessaire pour optimiser le moment de la période de croissance et de la collecte.

4. Perle étiquetage et le stockage magnétique

  1. Après la phase de croissance, dilué une partie aliquote de la culture pour déterminer la densité de cellules en utilisant un hématimètre. cellules de pellets par centrifugation pendant 5 min à 4 ° C à 3000 x g. Verser le surnageant.
  2. Laver les cellules par vortex de suspendre le culot dans 30 ml de tampon cordon d'étiquetage, puis centrifugation et verser le surnageant de l'article 4.1. Répéter lavage.
  3. Cellules complètement remettre en suspension dans un tampon cordon d'étiquetage 50 pi par 10 8 cellules totales au vortex. Ajouter 2 ul billes magnétiques par 10 8 cellules totales et vortex brièvement pour mélanger. Incuber sur de la glace pendant 10 min, en inversant périodiquement à mélanger (modifié à partir d'un protocole en ligne à http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf </ A>).
  4. Laver les cellules trois fois avec 30 ml de tampon de marquage bourrelet.
  5. Ajouter 0,5 ml de tampon cordon d'étiquetage pour 10 8 cellules totales et vortex brièvement pastille sur le réglage moyen jusqu'à ce que les cellules sont remises en suspension. Verser à travers un tamis cellulaire de 40 um dans un tube de 50 ml pour éliminer les grumeaux de cellules restantes. Si nécessaire, laisser les cellules sur de la glace pendant 1-2 heures avant le chargement sur la colonne.
  6. Suivez le protocole recommandé par le fabricant pour les colonnes magnétiques se lient, se laver, et sont élues les cellules mères de perles marqué magnétiques. Pour accroître la récupération de cellules marquées, utiliser au moins une colonne par 2 x 10 9 cellules totales.
    1. Retirer les bulles qui se produisent lors du chargement de colonnes, comme ils bloquer la circulation. Retirer et remplacer la colonne de séparation entre les lavages à empêcher les cellules de coincement entre les billes (modifiés à partir d'un protocole en ligne à http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf).
    2. Sauf s'écouler à travers de la liaison et des étapes de lavage à analyser les jeunes cellules produites par les cellules-mères, le cas échéant. Concentrer les cellules comme décrit dans l'étape 4.7.
    3. Utilisez des séparateurs multi-colonnes pour le traitement de plusieurs échantillons à la fois. Éluer plusieurs colonnes d'un même échantillon dans le même tube de collecte afin de réduire le temps de traitement et diminuer la perte de cellules.
  7. Concentré cellules mères éluées par centrifugation à 3000 g pendant 5 min à 4 ° C. Aspirer tout mais 1 ml de tampon par 10 8 cellules marquées à la biotine originaux. Vortex brièvement à suspendre les cellules dans du tampon restant.
  8. Diluer une aliquote de cellules et colorer au bleu trypan pour déterminer la densité de cellules et la viabilité des cellules en utilisant un hémocytomètre (voir étape 3.5). Calculer le nombre total de cellules récupérées.
    1. Si le nombre de cellules est sensiblement plus élevé que prévu, passer l'échantillon d'élution à travers une autre colonne pour essayer d'enlever la contamination des cellules jeunes.Si le nombre de cellules est sensiblement plus faible que prévu, passer le flux sauvé par échantillon à travers une autre colonne pour essayer d'améliorer le rendement des cellules mères.
  9. Utiliser des cellules pour d'autres analyses, comme décrit dans les sections 5 et 6 Alternativement, cultiver les cellules dans un bouillon YPD à nouveau pour accroître leur âge réplicative (étape 3.7) et de suivre par l'étiquetage de perles et de tri (étapes 4.1-4.8.1), sans la besoin de répéter le marquage à la biotine.

5 Détermination de réplicative Âge

  1. Spin cellules pendant 2 min à 5000 g à la température ambiante pendant toutes les étapes de cette section. Mettez 25 pi de cellules récupérées (~ 10 8 cellules / ml) dans un tube de 1,5 ml de la centrifugeuse et laver deux fois avec 1 ml de PBS 1X. Aspirer le surnageant.
    1. Décongeler une aliquote de WGA-conjugué, vortex pour mélanger, et tourner brièvement pour éliminer les agrégats de protéines. Suspendre les cellules dans 180 ul de 1 x PBS et 20 ul de WGA conjugué à une molécule fluorescente pour marquer cicatrices bourgeon sur la surface de thcellules de e. Couvrir le tube de 1,5 ml centrifugeuse avec une feuille et incuber avec doux balancement à 30 ° C pendant 30 min.
    2. Laver trois fois avec 1 ml de PBS 1X.
  2. Pour la microscopie à fluorescence, diapositives sur l'étiquette et monter selon le protocole standard utilisant un agent anti-fade. Durcir complètement les diapositives dans le noir (jusqu'à quelques jours) avant la lamelle d'étanchéité pour éviter les mouvements de la cellule lors de l'imagerie. Comptez cicatrices bourgeon sur au moins 50 cellules par échantillon pour obtenir une mesure représentative de l'âge de la cellule. Stocker les lames pour un maximum de 1 mois pour la visualisation des cicatrices de bourgeons, si nécessaire.
    1. En variante, déterminer l'intensité du signal fluorescent provenant de la WGA conjugué en effectuant cytométrie en flux sur des cellules en suspension dans 1 ml de PBS 1x, après l'étape 5.1.2. Utilisez un laser d'excitation de 405 nm et 530/30 nm filtre d'émission d'un filtre longue passe de 505 nm pour WGA-Alexa 488 Inclure un témoin non coloré pour chaque point de collecte.
  3. Graphique cicatrices de bourgeons sur les jeunes et les cellules âgées comptés par microscopie sur laaxe des ordonnées à l'encontre de la moyenne géométrique normalisée (moyenne géométrique coloré / moyenne géométrique non coloré) de la fluorescence de WGA conjugué à partir des mêmes populations de cellules sur l'axe des x. Obtenir l'équation d'une ligne de tendance linéaire de cette relation. Pour les expériences ultérieures, substituer la moyenne géométrique normalisée de WGA conjugué intensité de fluorescence d'une population de cellules de x dans l'équation pour résoudre et y afin de déterminer l'âge moyen des cellules d'un échantillon.

6. Mutation Fréquence

  1. Propagation triée cellules mères remises en suspension dans le tampon de l'étape 4.7 sur milieu YPD et milieu sélectif tel que décrit à l'étape 2.1.1. Utiliser 1 ml de cellules remises en suspension mère de cellules dérivées de moyennes et sélectives à 5000 g pendant 1 min.
    REMARQUE: Propagation des volumes plus importants de cellules diluées dans du milieu YPD comme cellules augmentent en âge de compenser l'augmentation du nombre de cellules viables et non-sénescentes dans les populations âgées.
    1. Incuber le milieu YPD et moyennes de plaques sélectivesl'étape 6.1, à 30 ° C pendant 3 à 4 jours, respectivement. Augmenter la durée d'incubation jusqu'à une semaine pour les cellules souches très anciennes ou à croissance lente. Calculez la fréquence de mutation tel que décrit à l'étape 2.2.

7 Calcul prévue fréquence de mutation pour un âge donné réplicative

  1. Calculer l'augmentation de l'âge moyen réplicative des cellules marquées à la biotine au cours de l'essai en soustrayant la moyenne d'âge de la population initiale de cellules à partir de la moyenne d'âge des cellules mères triés pour le tri correspondante. Utilisez les âges de cellules calculées à l'étape 5.2 ou 5.2.2 étape.
  2. Multipliez le taux de mutation obtenue à l'étape 2.1.3 par l'augmentation de l'âge de la cellule moyenne calculée à l'étape 7.1. Ajouter cette valeur à la fréquence de mutation de base de la population initiale calculée à l'étape 2.2 pour déterminer la fréquence de la mutation prévue pour les cellules de l'âge réplicative pertinent.

Representative Results

Un schéma de la figure 1 montre les étapes générales de la procédure, y compris les points où les taux de mutation, les fréquences et l'âge de la cellule sont mesurées. Déterminer avec précision la fréquence et le taux de mutations (ou autre forme de l'instabilité du génome) dans des populations de cellules jeunes est une première étape importante, car il est nécessaire de choisir une taille appropriée de la population pour l'étiquetage et le tri magnétique. valeurs de taux peuvent être établis au moyen de tests de fluctuation 9. Exemples de résultats pour les souches de levure dans le BY4741 fond génétique 20 sélectionnés pour des mutations dans le gène CAN1 qui confèrent une résistance à la canavanine ou des mutations dans le gène URA3 qui confèrent une résistance au 5-FOA sont présentés sur la figure 2. cellules ont été cultivées à 20 ° C pendant représentant expériences de taux, et à 20 ° C et 30 ° C pour les expériences de fréquences représentatives. Ces températures ont été utilisés parce que les populations cellulaires initiales cultivéesà 30 ° C ont ensuite été cultivées à 20 ° C pour les expériences de tri représentatifs suivants. valeurs de débit dans des essais indépendants ont été comparables pour la population et les cellules de la cellule initiale après marquage à la biotine pour une souche qui a le gène CAN1 à son emplacement normal sur le chromosome V, environ 32 kilobases paires du télomère du bras gauche ( www.yeastgenome.com ) ( Figure 2A, les colonnes de lavande). Le taux de CAN1 de mutation était sensiblement plus élevé dans la population initiale d'une deuxième souche de levure qui a une deletion du gène CAN1 de sa position normale sur le chromosome V et une insertion de CAN1 sur le bras droit du chromosome VIII environ 25 paires de bases à partir du télomère 21 (figure 2B). CAN1 fréquence des mutations du gène étaient également comparables pour des populations de cellules initiales et des cellules marquées à la biotine, soit la température de croissance (Figure 2A, colonnes bleues). Cependant, la fréquence des mutations obtenues à 20 ° C se sont révélées être plus élevée que la fréquence des mutations à 30 ° C. Pour tester si cette influence de la température a été limitée au gène CAN1, nous avons mesuré les mutations dans URA3 en sélectionnant pour la résistance au 5-FOA en utilisant la souche de levure qui a CAN1 inséré sur le chromosome VIII. Cette souche a également une délétion de URA3 de son site normal sur le chromosome V et une insertion de URA3 sur le bras droit du chromosome VIII d'environ 40 kilobases de paires 21 du télomère. la fréquence des mutations étaient également plus élevées à 20 ° C pendant URA3 à cette localisation chromosomique (figure 2C). Dans l'ensemble, cela démontre que la température de croissance peut affecter la fréquence de mutations, marquage à la biotine, mais ne semble pas affecter la fréquence de la mutation. Par conséquent, les taux et les fréquences pour les populations initiales mutation doivent être déterminées en même tempe de croissancerature qui sera utilisé pour les tours de la croissance et de tri. Il est conseillé de vérifier que l'étiquetage de la biotine n'influence pas l'instabilité du génome avant d'utiliser le protocole d'étudier d'autres types de mutations ou de réarrangements génomiques.

Comme prévu, les valeurs des taux de mutation présentés dans la figure 2A sont plusieurs fois plus faible que les mesures de fréquence correspondantes. Cette différence se produit parce que le taux de mutation de mesurer l'apparition de cellules avec de nouvelles mutations à chaque cycle de la division cellulaire, tandis que les mesures de fréquence de mutation du nombre cumulé des cellules mutantes dans la population à la fin de la période de croissance. Les taux et les intervalles de confiance à 95% pour ces essais montrent que des résultats reproductibles peuvent être obtenus en utilisant sept cultures répétés par essai, qui est le nombre minimum de répétitions suggéré pour ce protocole.

Une fois les valeurs de fréquence et taux initiaux sont déterminés, une taille de la population devrait être chosen qui garantit que les cellules adéquates sont présents après plusieurs tours de tri pour déterminer de façon fiable la fréquence des mutations. Étiquetage une population de 10 8 cellules par point de temps qui doit être analysé au cours du vieillissement est appropriée lorsque les fréquences et les taux sont similaires à ceux de la figure 2A. Cette décision dépend aussi de l'efficacité a marqué des cellules mère sont récupérés après chaque tour de tri. L'efficacité de la récupération de cellules mères marqués peut être rapidement et simplement évaluée à l'aide d'un hématimètre pour déterminer le nombre de cellules éluées des colonnes pour chaque espèce et pour étudier la morphologie des cellules. Deux points principaux sont illustrés par les données d'efficacité exemple de récupération (Figure 3A): le nombre de cellules récupérées peuvent apparaître plus élevé que prévu après la première sorte, et une petite perte progressive des cellules, on prévoit que le tri continue. Le nombre plus élevé que prévu des cellules dans certaines expériences après le premier tri pourrait result de l'étiquetage des bourgeons sur les cellules de la population initiale. Une cellule de levure avec un bourgeon sera généralement reçu comme une seule cellule au moment de déterminer le nombre de cellules à étiqueter avec la biotine. L'étiquetage des bourgeons présents dans la population initiale, cependant, permettrait aux cellules qui se développent à partir de ces bourgeons également être conservé sur des colonnes lors du tri. L'influence de cet événement sur la détermination de l'efficacité de récupération dépend de la fraction de cellules greffés à la population initiale de cellules. Une deuxième raison possible pour le nombre de cellules plus élevée après un tri, c'est qu'il semble être plus grandes cellules greffés à ce point de temps qui peut être de terminer la division cellulaire lors du tri. Par conséquent, les gros bourgeons encore attachés à leurs cellules mères peuvent être triés mais apparaissent comme des cellules distinctes lorsque les cellules éluées sont examinés. Alors que certains perte de cellules est observée avec chaque cycle de croissance et de tri, le protocole peut entraîner une rétention fiable de 80 à 90% des cellules après chaque cycle de sOrting. Il vaut la peine de pratiquer la procédure pour s'assurer que 80% ou plus des cellules marquées sont isolés pour éviter la nécessité d'étiqueter inutilement grande population de cellules initiale. Le traitement des cellules avec un stress léger après la première sorte (1 mM de peroxyde d'hydrogène dans un milieu YPD pendant 30 minutes) n'a pas empêché la récupération efficace de cellules présentant des cycles continus de croissance et de tri, mais il y avait une certaine variabilité dans la récupération de la première sorte, après la contrainte (figure 3A).

L'inspection de la morphologie des cellules et la viabilité sont également utiles à la fois pour confirmer la réussite de l'isolement des cellules mères et de réglage de dilutions / volumes utilisés lors de l'épandage des cellules sur milieu non sélectif pour déterminer la densité d'unités formant des colonies. Cellules mères deviennent de plus en plus grand et plus de forme irrégulière à mesure qu'ils vieillissent, par rapport à des cellules filles (figure 3B). Les échantillons de cellules de la mère devraient donc principalement se composer de grand, irregularly cellules en forme de l'expérience progresse dans chaque tour de tri. La présence de nombreuses petites cellules ovales de forme régulière pourrait indiquer que les cellules mères ne sont pas convenablement séparés de cellules filles. La viabilité des cellules mères devrait également décliner progressivement à chaque tour de plus en plus et de tri, mais il ne peut y avoir beaucoup de changement au cours des cinq à dix premières générations de cellules. Le nombre de cellules formant des colonies capables peut diminuer considérablement plus élevé que le nombre de cellules qui sont déterminées pour être viable par une certaine forme de coloration directe de l'intégrité des cellules, due à la formation de cellules sénescentes. Lorsque la viabilité par un procédé de coloration directe commence d'abord à diminuer (d'environ 80% ou moins), il peut être nécessaire d'ajuster les dilutions et les volumes utilisés pour mesurer la formation de colonies densités unitaires en anticipation d'une diminution plus spectaculaire de l'aptitude des cellules viables à forment des colonies (deux à plusieurs fois diminution).

Leâges de réplication des populations triées et les populations de contrôle doivent être déterminées avant que les données de fréquence de mutation de cellules mères peuvent être analysées pour les changements selon l'âge du taux de mutations qui s'accumulent. Ceci peut être réalisé grâce à un comptage manuel des cicatrices de bourgeons sur des cellules mères (figure 4) ou par cytométrie en flux pour mesurer le signal pour le réactif de détection bourgeon de cicatrice (Figure 5). Bud cicatrices peuvent être étiquetés avec relativement faible signal de fond en utilisant WGA fluorescent conjugués (figure 4C). Figure 4A montre que la plupart des cellules de l'écoulement à travers des échantillons de la procédure de tri ont zéro ou un bourgeon cicatrice. Les cellules éluées des colonnes sont pour la plupart des cellules mères âgées (figures 4B et 5). Typiquement,> 90% des cellules éluées sont des cellules mères, qui peut être vu plus facilement de la cytométrie de flux suite à la Figure 5. Cellules avec relativement peu de cicatrices de bourgeon (<6) obtained après plus de deux tours de tri pourrait représenter cellules contaminantes qui n'ont pas été marqué à la biotine qui a subi quelques cycles de division cellulaire au cours de la ronde pertinentes de la croissance, par opposition aux cellules-mères qui se divisent très lentement. La variation de l'âge de la cellule peut augmenter avec les cycles suivants de tri, sinon la totalité des cellules dans la population sont de plus uniformément.

Une plus grande population de cellules peut être utilisé afin d'évaluer plus rapidement l'âge de la cellule si une relation linéaire est établie entre la WGA-fluorescence des intensités de signal et le nombre de cicatrices de bourgeons par cellule. Pour cette analyse, la normalisation de toutes les intensités de signal WGA-fluorescence est accomplie en divisant le signal de cellules colorées par le signal obtenu pour la population appropriée tache cellulaire (fille ou mère) pour tenir compte de l'augmentation de fluorescence de fond dans les cellules âgées. Figures 4 et analyse de 5 montrent les mêmes populations de cellules représentatives.Comptage manuel établi âge moyen des réplicatives 0,95 et 11,4 pour la cellule de mémoire (figure 4A) et des populations de cellules mère (figure 4B), respectivement. WGA-signaux normalisés pour ces deux populations et les trois autres populations (moyenne de 3,0 ans, 6,9 et 14,4) ont été tracées en fonction du nombre moyen de cicatrices de bourgeon pour chaque population (figure 5B). Cette relation linéaire peut être utilisée avec la même souche et de réactifs dans les futures expériences pour déterminer l'âge moyen des cellules de la WGA-signal normalisé obtenu par cytométrie de flux, ce qui permet une détermination rapide et précise de l'âge de la cellule. populations de contrôle doivent encore être incluses pour vérifier l'efficacité de coloration similaires entre les essais.

L'influence du vieillissement sur l'accumulation de mutations peut être traité une fois les étapes précédentes de l'obtention de valeurs de taux de mutation, de manière efficace le tri des cellules, et la détermination de l'âge de la cellule sont réalisées. Le numbre de points dans le temps au cours de laquelle la fréquence peut être déterminée dépend de la taille de la population cellulaire marquée à la biotine et le nombre de cellules qui doivent être étalés sur un milieu sélectif pour obtenir des résultats fiables. Si des changements de taux de mutation avec l'âge, les fréquences de mutation observés pour le vieillissement de cellules mères devraient différer de ceux attendus sur la seule base des tours supplémentaires de la division cellulaire. La comparaison de la fréquence des mutations observées à la fréquence de mutation prédite peut identifier des différences liées à l'âge du taux de mutations qui s'accumulent. Comme décrit dans la section 7 du protocole, la fréquence prédite peut être obtenue à partir du produit du taux de mutation de base de la population initiale de cellules et l'augmentation de l'âge réplicative des cellules ajoutées à la fréquence de mutation de la population initiale mères. L'augmentation de la fréquence de mutation CAN1 ont été observés avec augmentation de l'âge moyen des cellules dans une souche avec CAN1 à sa position normale sur le chromosome V(Figure 6A) et d'une souche de CAN1 sur le bras droit du chromosome VIII (figure 6B). Depuis les fréquences de mutation observés pour les cellules maternelles dans la figure 6A sont similaires ou juste en dessous des fréquences prévues, les données ne fournissent aucune preuve d'un changement spécifique de l'âge du taux de mutation. En revanche, les fréquences de mutation de cellules de la souche mère avec CAN1 sur le chromosome VIII étaient plus élevées que les fréquences prédites (Figure 6B). On notera que les fréquences prédites dans le graphe ne semblent pas augmenter beaucoup car une échelle logarithmique a dû être utilisée pour l'axe y en raison de la forte augmentation de la fréquence des mutations observées. Par conséquent, les résultats de la figure 6B ne fournissent les éléments probants justifiant une augmentation spécifique de l'âge du taux de mutations qui s'accumulent. La différence dans les résultats pour les jeux de données de la Figure 6A et 6B est probablement due à la diffé louer des emplacements génomiques de CAN1. Ces types d'observations fournissent un point de départ pour élaborer des hypothèses à étudier les mécanismes qui influent sur les taux de mutation que les cellules âge et de développer des modèles pour expliquer l'accumulation des mutations avec l'âge réplicative.

Figure 1
Figure 1: Schéma du la procédure générale pour examiner l'accumulation des mutations au cours de levure vieillissement réplicatif. Texte noir et flèches indiquent les principales étapes de la procédure. La flèche courbe reflète que des tours supplémentaires de repousse et le tri de ces mêmes cellules sont utilisées pour obtenir des cellules progressivement plus âgés. Flèches et le texte pourpres indiquent les étapes à laquelle les mesures indiquées sont faits. La fréquence - fréquence.

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Figure 2: Détermination de la fréquence de mutation et la vitesse dans les populations de cellules jeunes. (A) des colonies mutantes ont été sélectionnés par étalement des cellules sur SC-arg + milieu la canavanine pour sélectionner des mutations perte de fonction dans le gène CAN1, et par rapport au nombre total de cellules viables, réparties sur un milieu sélectif pour le calcul de fréquences / tarifs. Les cellules provenant de populations initiales avant marquage à la biotine (IP) ou après marquage à la biotine (PB) ont été cultivées en utilisant un milieu YPD à partir d'une densité initiale de 5 000 cellules / ml à proximité de la saturation. colonnes de lavande indiquent les mesures de vitesse et de colonnes bleues représentent des mesures de fréquences faites à des températures indiquées (20 ° C et 30 ° C). Séries de sept cultures répétées ont été cultivées pour chaque essai et de deux à cinq soumis aux essais indépendants ont été effectués. Valeurs de taux individuels calculés pour les essais indépendants sont présentés, et les barres d'erreur pour ces essais représentent 95% des intervalles de confiance de déterminerD en utilisant un calculateur en ligne 22. Les fréquences représentent moyens et les écarts-types. Taux (B) de mutation CAN1 obtenus et représentés comme décrit pour la partie A en utilisant une souche avec CAN1 sur le bras droit du chromosome VIII. Fréquences (C) Mutation obtenus suite à une sélection pour les colonies mutantes sur 5-FOA aide une souche ayant le gène URA3 situé sur le bras droit du chromosome VIII. Méthodes étaient par ailleurs que pour la partie A, et les moyens et les écarts types pour trois ou quatre essais indépendants sont présentés.

Figure 3
Figure 3 Exemple efficacité du tri déterminé en calculant le nombre de cellules éluées après chaque tour de tri. (A) Le nombre total de cellules dans chaque population de départ après marquage à la biotine a été fixée à une, et le t otal nombre de cellules présentes dans les échantillons élues à partir de chaque série de tri cellulaire magnétique a été divisée par les valeurs initiales pour obtenir la fraction de cellules marquées. Le nombre total de cellules ont été déterminées à partir du nombre de cellules obtenues à l'aide d'un hémocytomètre. Colonnes oranges représentent la moyenne et l'écart type de trois essais indépendants en suivant le protocole standard. Colonnes bleues représentent la moyenne et l'écart type de deux essais indépendants, dans lequel les cellules ont été traitées avec 1 mM de peroxyde d'hydrogène pendant 30 minutes immédiatement après le premier type (B). Taille et morphologie des cellules après marquage à la biotine (post-biotine) et des cellules mères récupéré après le troisième tour de tri magnétique (tri 3 cellules mères) montre en utilisant la microscopie en champ clair standard et un objectif 20X. Des lignes blanches dans les arrière-plans sont les lignes qui délimitent les plus petits carrés visibles sur un hémocytomètre standard.k "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4 Détermination de l'âge de réplication à l'aide manuel bourgeon cicatrice comptage. D'microscopie confocale a été utilisée pour compter les cicatrices bourgeon sur des cellules individuelles marquées avec un conjugué WGA fluorescente (excitation à 488 nm et la détection de passe-bande 458/543 nm et 505 nm passe longue combinaison de filtres). (A) Manuel bourgeon cicatrices des chiffres de cellules de l'écoulement à travers (cellules filles) après la troisième ronde de tri magnétique (n = 62). bourgeon Manuel cicatrice chiffres de cellules éluées (cellules mères (B)) après la troisième tour de tri magnétique (n = 54). (C) des cellules mères maintenus après le troisième tour de tri magnétique photographié en utilisant un objectif à immersion d'huile 63X avec zoom 3X après coloration espritha conjugué WGA-fluorescent. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5 Détermination de l'âge de replication en utilisant la cytométrie en flux. Des échantillons de 10 000 cellules colorées avec un conjugué WGA-fluorescent ont été analysées par cytométrie de flux en utilisant une excitation à 488 nm et la détection avec un passe-bande de 530/30 et 505 de long jeu de filtres passe-bas. (A ) histogrammes représentant le nombre de cellules avec des intensités WGA-fluorescence spécifiques pour une population de cellules de fille ou de l'éluat (cellules mères) après trois tours de tri magnétique. Les populations analysées correspondent à ceux de la figure 4. Lignes verticales bleues indiquent la position correspondant à la majorité de la daucellules ghter sur l'histogramme de la cellule mère. (B) La moyenne géométrique normalisée de signal de fluorescence de chaque population représenté par A et trois population supplémentaire de cellules (moyenne d'âge 3,0, 6,9 et 14,4) a été calculée comme le rapport de la moyenne géométrique de les cellules colorées et la moyenne géométrique de la population de cellules non colorées approprié. Ces valeurs sont représentées graphiquement par rapport au nombre moyen de cicatrices de bourgeon de chaque population totale (figure 4 et données non présentées). La valeur R 2 de la ligne de tendance de cette comparaison est donnée sur le graphe.

Figure 6
Figure 6 Comparaison entre les fréquences de mutation prédites et observées au cours du vieillissement réplicatif. Cellules ayant des mutations dans le gène CAN1 ont été sélectionnés comme décrit pour la figure 2 usinsouches de g avec CAN1 à sa position normale sur le chromosome V (A) ou sur le bras droit du chromosome VIII (B). Les cellules ont été cultivées sur un milieu solide à 30 ° C avant le marquage à la biotine et à 20 ° C par la suite. Valeurs de fréquence observés sont présentés avec des colonnes orange (Obs) et des fréquences prévues pour les cellules âgées sont présentés avec des colonnes brunes (PRE). La première colonne de chaque graphique représente l'écart moyen et l'écart de la fréquence de mutation initiale après marquage à la biotine pour quatre essais indépendants (PB). Numéros ci-dessous les colonnes indiquent le nombre moyen de cicatrices de bourgeon pour chaque population (âge cellulaire). Valeurs indépendantes prédites ont été déterminées comme décrit dans l'article 7 du protocole en utilisant chacune des valeurs de taux initiaux présentés dans la figure 2A (Colonnes IP) et 2B. Ces valeurs indépendantes ont ensuite été moyenne. Les valeurs observées sont des moyens de trois essais. Les barres d'erreur indiquent l'écart type.

Discussion

Ce protocole combine plusieurs procédés pour activer les ressources disponibles et les approches dans les Saccharomyces cerevisiae système modèle pour être efficacement appliquée à l'étude du génome de l'instabilité au cours du vieillissement cellulaire mitotique. Une grande variété de dosages pour quantifier les différentes formes d'instabilité du génome par sélection phénotypique peut être combiné avec le tri magnétique pour étudier les changements possibles en fonction de l'âge de l'accumulation des formes particulières de mutations ou de remaniements chromosomiques. Bien que les approches de séquençage entier du génome pourraient fournir plus d'informations sur les types d'ensemble de changements qui se produisent dans un génome avec l'âge, la capacité d'utiliser des systèmes de sélection phénotypique pour obtenir des mesures de taux de mutation et d'isoler préférentiellement certains types de modifications génétiques sont des atouts importants pour l'étude mécaniste aspects de liées au vieillissement instabilité du génome. La rationalisation de la détermination de l'âge de la cellule et le potentiel de faire des mesures parallèles de physiologiques modifications au moyen des flux fournissent cytométrie moyens efficaces pour corréler l'instabilité du génome avec d'autres modifications cellulaires au cours de gammes spécifiques d'âge. Détermination des changements potentiels dépendant de l'âge dans les taux de mutations qui s'accumulent, il faut: 1) la détermination minutieuse des taux dans les populations de cellules jeunes, 2) la détermination précise de l'âge de la cellule, et 3) la capacité d'enrichir de manière fiable des populations suffisamment importantes de cellules mères pour mesurer de manière reproductible l'instabilité du génome dans la vieillesse. Cette approche permet au système de modèle de levure de contribuer à la définition des mécanismes sous-jacents responsables des changements dépendant de l'âge du taux et / ou des fréquences de l'instabilité du génome dans les cellules activité mitotique. En outre, les facteurs génétiques et environnementaux peuvent être évalués rapidement des contributions au dépend de l'âge de l'instabilité génomique. En fin de compte, ces caractérisations pourraient conduire au développement de modèles qui tiennent compte de la manière dont les mutations s'accumulent au cours du vieillissement réplicatif.

Cette méthode repose sur la capacité à détecter des mutations ou d'autres types de l'instabilité du génome par l'apparition de phénotypes sélectionnables pour mesurer les taux de ces événements. Cependant, la créativité dans la conception de l'essai peut permettre de nombreux aspects de l'instabilité du génome à étudier. Par exemple, les gènes URA3 et CAN1 peuvent être placés à des endroits différents du génome de tester toute influence de la localisation génomique de résultats. Réversion des allèles de gènes spécifiques non fonctionnels à des allèles de gènes fonctionnels pourrait tester certains processus de mutation. En outre, l'introduction de plusieurs allèles d'un gène inactif ou flanquant un gène avec des séquences répétées peut être utilisée pour étudier des événements de recombinaison par la restauration ou la perte de la fonction du gène, respectivement. des tests de fluctuation sont l'approche standard pour déterminer les taux de ces divers événements génome d'instabilité 9. Le protocole est écrit en utilisant l'estimateur médian Lea-Coulson bien accepté et relativement simple de déterminer mutataux de tion pour le rendre plus accessible aux divers chercheurs, même si la méthode d'estimation de la probabilité MSS-maxi est considéré comme la meilleure approche pour déterminer les taux de mutation 9. L'estimateur du maximum de vraisemblance MSS-a déjà été examinée en détail 9, et peut être utilisé comme une méthode alternative, mais nécessite des calculs plus sophistiqués. Sinon, le logiciel libre pour calculer les taux de mutation de cette méthode a été mis à la disposition 22. Obtenir des mesures reproductibles des taux de mutation exige une attention à quelques aspects de la conception expérimentale, y compris en utilisant des cultures de répliques suffisantes, l'inoculation de cultures à suffisamment de densités cellulaires initiales faibles que la taille de la population augmente de volume de culture appropriées 10.000 fois ou plus, et le choix de telle sorte que l'ensemble du population de cellules peut être étalé sur un milieu sélectif. Pour ce dernier point, une formule décrite précédemment peut être utilisée pour ajuster le taux de mutation sur la base de la fraction de culture tested 9. Variation du taux de croissance des cultures peut compliquer la détermination d'un taux de mutation reproductible, et un estimateur basé médiane-modifié qui peut donner des résultats plus reproductibles dans de telles situations, ont été décrites récemment 23.

La capacité de mesurer avec précision l'âge de la cellule est un autre facteur qui est important pour établir si les fréquences génome d'instabilité dans les vieilles cellules sont différentes des valeurs attendues en raison du taux d'événements dans les jeunes cellules. Nous avons trouvé WGA coloration préférable à calcofluor coloration blanche, à la fois en termes de fond et de flexibilité, car WGA est disponible conjugué à différentes molécules fluorescentes. Cette flexibilité peut fournir plus de possibilités pour des mesures simultanées des autres caractéristiques des cellules avec des réactifs fluorescents. Le travail initial d'établir une relation entre l'intensité du signal pour la coloration WGA et le nombre correspondant de cicatrices de bourgeons sur les cellules peut alors conduire à une plusdétermination rapide de l'âge de la cellule par cytométrie de flux. Cette approche permet aussi d'utiliser de plus grandes tailles de population seraient généralement examinées au microscope pour une meilleure reproductibilité des mesures. Alors que toutes les déterminations d'âge pourraient être faites par l'examen microscopique des cellules, nous pensons que la cytométrie en flux approche facilite le dépistage rapide des facteurs qui influencent dépendant de l'âge de l'instabilité génomique.

En plus de la mesure de l'âge de la cellule de façon fiable, il convient de tenir compte du nombre de divisions cellulaires des cellules mères sont autorisés à subir à chaque cycle successif de la croissance et le tri des cellules. Utilisez une taille de population initiale plus faible ou un volume de grande culture pourrait permettre aux cellules de se soumettre à plusieurs divisions cellulaires avant d'atteindre la densité cellulaire désirée. Par exemple, d'autres chercheurs ont utilisé seulement deux cycles de tri d'obtenir de très anciennes cellules de levure 16, ce qui a l'avantage évident d'obtenir des cellules âgées de moins experimeétapes NTAL. Pour déterminer si pour augmenter le volume de la culture pour permettre aux cellules de compléter plusieurs divisions cellulaires avant le tri, garder à l'esprit la limite sur le nombre total de cellules qui peuvent être traités dans une seule colonne. L'utilisation d'un plus grand volume de culture peut nécessiter l'utilisation de plusieurs colonnes pour trier un population de cellules. En outre, si les cellules subissent moins de cycles de division cellulaire entre les points sortes / de collecte, alors il ya plus d'occasions d'observer des écarts de fréquence des mutations attendues à des moments distincts pendant la durée de vie. Par exemple, l'échantillonnage seulement au début et les points de temps pendant la durée de vie peut fin de produire des données indiquant une augmentation constante de la fréquence des mutations, mais d'échantillonnage à temps intermédiaires supplémentaires au cours de la durée de vie peut montrer rapidement, puis les plateaux que la fréquence de mutation augmente. Cependant, depuis ce protocole isole cellules mères anciennes, il est possible d'obtenir une mesure plus directe de l'évolution des taux de mutation avec l'âge. des tests de fluctuation pourrait be effectuée à l'aide de cellules mères d'âges différents afin de déterminer si le taux de mutation sera différent de celui obtenu en utilisant des cellules jeunes. Alors que les cultures de ces tests de fluctuation seront un mélange de cellules jeunes et vieux à mesure qu'ils grandissent, les écarts de taux obtenus à partir de cellules jeunes pouvaient être attribués à l'utilisation d'une population de départ plus.

La capacité à obtenir de façon reproductible une grande population assez de cellules mères âgées de mesurer avec précision l'instabilité du génome est essentiel à la réussite de cette approche. Alors que le protocole décrit l'utilisation d'un système de tri magnétique particulier à cette fin, d'autres groupes ont trié les cellules-mères de levure avec d'autres systèmes 14,18 (voir le tableau des matériaux). Ces systèmes alternatifs devraient également travailler avec cette méthode, bien que certains l'optimisation des protocoles des fabricants pourrait être nécessaire. Quel que soit le système particulier utilisé, la taille de la population nécessitentd varie en fonction de la fréquence de la mutation ou le type de réarrangement du génome choisie pour l'étude. Au minimum, il doit y avoir suffisamment de cellules mères pour obtenir au moins une colonie de mutants par population pour calculer une fréquence de mutation. Dans la pratique, les résultats peuvent être très variables si ce n'est que de zéro à cinq colonies mutantes sont attendus à partir de la taille de la population, et même une petite augmentation de la taille de la population, de sorte que cinq à dix colonies mutantes sont attendus, peut grandement améliorer la reproductibilité. Lorsque la biotine, l'identification d'une population de départ, le rendement de récupération pour chaque type doit être pris en compte pour aider à identifier la taille appropriée de la population nécessaire pour mesurer la fréquence de mutation dans les cellules mères âgées. Avec 90% de récupération de cellules mères après chaque sorte, seulement 59% de la population d'origine serait récupéré après cinq tours de la croissance et de tri. Cette chute à ~ récupération de 33% de la population d'origine après cinq tours de la croissance et de tri si seulement 80% des cellules mères sont étiquetés récupéreré au cours de chaque sorte. Mesurer et optimiser la récupération est crucial lors de la mesure des événements de faible fréquence, depuis deux à trois fois diminution de la taille de la population pourrait facilement conduire à des chiffres fiables de colonies mutantes par la population.

Il existe de nombreuses options pour se développer ou modifier ce protocole pour obtenir une meilleure compréhension de l'instabilité du génome au cours du vieillissement cellulaire mitotique. Voici quelques exemples simples d'analyser comment des altérations de la fonction des gènes, les changements de médias, ou d'autres changements de conditions environnementales modifient l'accumulation de mutations avec l'âge. Les taux de mutation de cellules jeunes ayant une fonction de gène altérée ou à l'état approprié seraient mesurés et utilisés pour déterminer si les mutations s'accumulent différente de celle prédite par les valeurs de débit et différemment que dans les populations de cellules de contrôle. Les populations de cellules à différents moments au cours du vieillissement réplicatif pourraient être exposés à des facteurs de stress spécifiques, telles que les espèces réactives de l'oxygène ou des agents endommageant l'ADN. Aexposition transitoire et d'intensité légère à un stress oxydatif ne modifie pas sensiblement la capacité d'effectuer le tri cellulaire (Figure 3), mais les contraintes plus sévères peut compliquer la récupération des cellules. Des expériences préliminaires seraient nécessaires pour vérifier que les cellules mères peuvent encore être récupérées de manière efficace après des contraintes spécifiques. En outre, les caractéristiques cellulaires de cellules mères isolées ont pu être analysés en détail, y compris les niveaux d'espèces réactives de l'oxygène, de la morphologie mitochondriale et vacuolaire, et d'autres caractéristiques physiologiques associés au vieillissement 3. En outre, les cellules-mères peuvent être une population de départ pour un autre traitement ou manipulation. Comme les cellules mères et filles sont physiquement séparés au cours de la procédure, les cellules filles sont également toujours disponibles pour l'analyse. Par exemple, des changements dans les caractéristiques physiologiques de cellules filles ou l'héritage asymétrique des macromolécules endommagées entre la mère de la levure et des cellules filles S. système modèle cerevisiae pour être efficacement appliquée à des mécanismes responsables de l'accumulation de changements génétiques au cours du vieillissement cellulaire mitotique enquête.

Disclosures

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été financé en partie par la subvention R00AG031911 de l'Institut national sur le vieillissement des Instituts nationaux de la santé pour PHM Le contenu de cet article ne reflètent pas nécessairement la position officielle de la National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Thermo Scientific 21335 100 mg
Anti-Biotin Microbeads Miltenyi Biotec 130-090-485 2 ml MicroBeads conjugated to monoclonal mouse anti-biotin antibodies (isotype: mouse IgG1)
MACS LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401 25 columns suitable for QuadroMACS separator
QuadroMACS separator Miltenyi Biotec 130-090-976 Separator Only
QuadroMACS Starting Kit Miltenyi Biotec 130-091-051 Includes: QuadroMACS Separator (130-090-976), MACS MultiStand (130-042-303), LS Columns (130-042-401), MACS 15 ml Tube Rack (130-091-052), One 2 ml unit of MACS MicroBeads. Note: Alternative systems include Dynabeads Biotin Binder and MagnaBind Magnetic Beads
BD Falcon Cell Strainer, 40 µm BD Biosciences 352340 40 µm for use with BD Falcon 50 ml Conical Tubes. 50 per pack
Trypan Blue Sigma-Aldrich T6146 Powder, filtering after dissolving important to remove particulates
Wheat germ agglutinin Alexa Fluor488 Life Technologies W11261 Conjugates with different excitation/emission spectra could also be used
ProLong Gold antifade reagent Life Technologies P36930 10 ml, other antifade reagents could also be used

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References

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La combinaison de tri magnétique des cellules mères et Tests de fluctuation à Analyser instabilité du génome cours mitotique vieillissement cellulaire dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em
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Patterson, M. N., Maxwell, P. H. Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (92), e51850, doi:10.3791/51850 (2014).More

Patterson, M. N., Maxwell, P. H. Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (92), e51850, doi:10.3791/51850 (2014).

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