Les taux de mutation chez les jeunes Saccharomyces cerevisiae cellules mesurées par des tests de fluctuation sont utilisés pour prédire la fréquence des mutations de cellules mères de différents âges de réplication. Tri magnétique et la cytométrie en flux est ensuite utilisé pour mesurer la fréquence des mutations réelles et l'âge des cellules mères afin d'identifier les écarts par rapport à la fréquence des mutations prévues.
Saccharomyces cerevisiae a été un excellent modèle pour les mécanismes et les conséquences de l'instabilité du génome d'instruction. Les informations obtenues à partir de ce modèle de levure est pertinente pour de nombreux organismes, dont les humains, puisque les facteurs de réparation de l'ADN et réponse aux lésions de l'ADN sont bien conservées entre espèces différentes. Cependant, S. cerevisiae n'a pas encore été utilisé pour répondre pleinement si le taux d'accumulation des mutations changements avec l'augmentation réplicative (mitotique) l'âge en raison de contraintes techniques. Par exemple, les mesures de levure durée de vie réplicative par micromanipulation impliquent de très petites populations de cellules, qui interdisent la détection des mutations rares. Les méthodes génétiques pour enrichir de cellules mères dans les populations en induisant la mort des cellules filles ont été développés, mais la taille de la population sont encore limitées par la fréquence avec laquelle des mutations aléatoires qui compromettent les systèmes de sélection se produisent. Le protocole actuel profite de Sorti magnétiqueng de cellules de levure mère surface marquée d'obtenir une population suffisamment large du vieillissement des cellules mères de quantifier mutations rares dans les sélections phénotypiques. Les taux de mutation, mesurées par des tests de fluctuation, et la fréquence des mutations sont d'abord établis pour les jeunes cellules et utilisés pour prédire la fréquence des mutations dans les cellules mères de différents âges de réplication. les fréquences de mutation sont ensuite déterminés pour les cellules-mères triées, et de l'âge des cellules mères est déterminé par cytométrie de flux par coloration avec un réactif fluorescent qui détecte les cicatrices de bourgeons formés sur les surfaces des cellules pendant la division cellulaire. Comparaison de la fréquence des mutations prévues en fonction du nombre de divisions cellulaires aux fréquences observées expérimentalement pour cellules mères d'un âge donné réplicatif peut alors identifier s'il ya des changements liés à l'âge du taux de mutations qui s'accumulent. Des variantes de ce protocole de base fournissent les moyens d'étudier l'influence des altérations des fonctions spécifiques de gènes oudes conditions environnementales spécifiques sur l'accumulation de mutation à traitent des mécanismes de l'instabilité du génome sous-jacente au cours du vieillissement réplicatif.
Les micro-organismes, tels que la levure Saccharomyces cerevisiae, sont d'excellents modèles pour enquêter sur les taux de mutation, mais ces modèles n'ont pas été pleinement utilisés pour étudier l'accumulation de mutations au cours du vieillissement mitotique des cellules. l'accumulation de mutations dans le génome nucléaire a émis l'hypothèse de contribuer à un vieillissement en entraînant une perte progressive de la (ou variation) dans une des fonctions des gènes. La possibilité d'utiliser un système microbien d'étudier les mécanismes et les conséquences de l'accumulation des mutations au cours du vieillissement pourrait grandement accélérer l'identification de facteurs génétiques et environnementaux qui influent sur ce processus, car des systèmes génétiques faciles et la facilité de quantifier les changements phénotypiques rares dans les micro-organismes. Facteurs de réparation d'ADN et de protéines de réponse de lésion de l'ADN sont bien conservées entre les espèces diverses 2, et les similitudes fondamentales dans le vieillissement organismal ont été identifiés pour des organismes aussi divers que S. cerevisiae unemammifères d 3, ce qui rend probable que les résultats obtenus à partir des études chez la levure seront pertinents au vieillissement dans de nombreux organismes.
Les études de vieillissement en S. cerevisiae faire usage de deux modèles de vieillissement qui mesurent le vieillissement chronologique ou vieillissement réplicatif des cellules. Vieillissement chronologique est caractérisée par la perte progressive de la viabilité des populations de cellules de levure qui sont dans un état (phase stationnaire) ne se divisant pas en raison de l'épuisement des nutriments 3. Le modèle de vieillissement chronologique a été utilisée pour démontrer que les mutations s'accumulent avec l'âge 4, puisque de grandes populations de cellules peuvent être facilement obtenus dans ce modèle pour effectuer des sélections phénotypiques de cellules mutantes. Dans ce cas, l'accumulation de mutation semble être influencée par des voies de signalisation de la croissance et du stress oxydatif 5, et chacun de ces facteurs sont pertinents à la compréhension du vieillissement chez les eucaryotes pluricellulaires 3. Le modèle de vieillissement réplicatif exploite la divisi asymétriquesur entre S. cellules, mère et fille cerevisiae pour enquêter sur le vieillissement qui se produit avec les générations cellulaires successives 3. Levure vieillissement réplicatif a souvent été mesurée par micromanipulation de petites populations de la mère et cellules filles, ou, plus récemment, par vidéo-microscopie de petites populations de cellules de levure dans des dispositifs microfluidiques 6,7. Taille de la population étant limitées, ces approches mal adaptée à l'étude accumulation des mutations au cours du vieillissement mitotique moins que des informations sur le génome entier est obtenu à partir de cellules individuelles ou de modification génétique à très haute fréquence sont mesurées 8. Séquençage complet du génome de cellules individuelles à fournir des ensembles de données importantes pour enquêter sur l'accumulation des mutations, mais les systèmes de sélection phénotypiques ont le grand avantage de fournir un moyen de mesurer les taux de mutation d'étudier les mécanismes d'accumulation de mutation sous-jacente. Des études pour examiner les fréquences et les taux de mutation à travers les sélections phénotypiques dans haploid souches de levure au cours du vieillissement réplicatif n'ont pas encore été rapporté.
Les taux de mutation sont généralement mesurés en utilisant des tests de fluctuation 9. des valeurs de fréquence de mutation indiquent le nombre total de cellules présentant une mutation dans une séquence de gène dans une population. Cela comprend des cellules dans lesquelles se produisent des mutations indépendantes et toute la descendance de ces cellules qui héritent simplement mutations préexistantes. En revanche, les taux de mutation mesurées par des tests de fluctuation représentent le nombre de mutations indépendantes qui se posent à chaque nouvelle génération de cellules. Ces essais impliquent typiquement l'inoculation de cultures répétées à des densités cellulaires faibles pour réduire la possibilité d'ajouter des cellules ayant des mutations préexistantes dans une séquence cible, les cultures en croissance à proximité de la saturation, et l'identification des cellules mutantes par croissance sur un milieu sélectif. Le nombre de cellules mutantes identifiés dans les populations répétés sont ensuite utilisés dans l'un des nombreux modèles mathématiques pour estimer le nombre de imutations ndependent qui ont surgi pendant la croissance 9. En comparant le nombre de mutations indépendantes de la taille moyenne de la population est une mesure du taux de mutation. Dans S. cerevisiae, les fréquences et les taux de mutation sont fréquemment mesurée en utilisant les gènes URA3 et CAN1, puisque des mutations perte de fonction de ces gènes produisent des phénotypes sélectionnables. La perte de fonction URA3 rend les cellules résistantes à l'acide 5-fluoroorotique (5-FOA), étant donné que la protéine codée par URA3 convertit 5-FOA en une molécule toxique 10. La perte de fonction de CAN1 permet aux cellules deviennent résistantes à la canavanine, un analogue de l'arginine toxique, car la protéine codée par l'arginine et la transporte CAN1 canavanine dans des cellules 11.
Les deux stratégies de tri génétiques et physiques ont été utilisées avec succès pour obtenir de plus grandes populations de S. cellules mères cerevisiae pour faciliter les enquêtes du vieillissement réplicatif. Stratégies génétiques comprennent des approches intelligentes qui sélectionnent contre la survie des cellules de fille dans une population. Le programme d'enrichissement de la mère (MEP) implique bêta-estradiol induction de la recombinase Cre expression que dans les cellules filles, ce qui conduit à des perturbations spécifiques fille de deux gènes essentiels qui ont été modifiées pour contenir des sites loxP 12. MEP souches peuvent être cultivées normalement en l'absence de l'inducteur, mais seules les cellules mères vont continuer à se diviser après l'induction, alors que les cellules filles vont arrêter à la phase M typiquement au cours de leur première progression à travers le cycle cellulaire 12. Bien que ce système n'a pas été utilisé pour étudier globalement l'accumulation de mutations au cours du vieillissement, il a été utilisé pour étudier la perte d'hétérozygotie, une forme relativement fréquente de l'instabilité du génome des souches de levure diploïde, ainsi que des modifications biochimiques dans les cellules de vieillissement mères 13,14. De même, le système pare-fille implique l'expression spécifique-fille de la S. cerevigène siae URA3 15. Souches fille-parafoudre se développent normalement jusqu'à 5-FOA est ajouté au milieu, à laquelle les cellules exprimant le point de fille URA3 mourront, tandis que les cellules mères continuent de croître 15. Ce sont des systèmes utiles pour enrichir les cellules-mères, mais elles dépendent de maintien des fonctions des gènes qui constituent le système de sélection. Des mutations aléatoires dans un ou plusieurs composants du système de sélection peut conduire à des cellules filles qui échappent à la sélection et prolifèrent de façon exponentielle. Au cours du développement des souches de MEP, importance de la population étaient déterminés à éviter l'apparition de cellules filles mutantes qui pourraient échapper à la sélection 12. Toutefois, cette limite de taille de la population compromet la détection des formes rares de l'instabilité du génome au cours du vieillissement réplicatif. Cette limitation de la taille de la population peut être partiellement résolu en utilisant des souches de levure diploïde avec deux copies de chaque gène qui contribue au système de sélection, car la plupartmutations seraient probablement récessive 12. Cependant, l'utilisation de souches diploïdes limite les types d'événements de mutation qui peuvent être facilement détectés par rapport à celles qui peuvent être facilement détectés dans les cellules haploïdes de levure.
Stratégies de tri physiques comprennent l'isolement des cellules mères avec une surface cellulaire marqué de cellules filles non marqués pour enrichir en grandes populations de cellules mères. L'observation que les protéines de surface cellulaire (protéines de la paroi cellulaire) de S. cerevisiae cellules filles sont nouvellement synthétisés au cours de bourgeonnement a été exploitée pour marquer les cellules-mères, sans marquage des cellules filles qu'elles produisent 16. Par exemple, une population initiale de cellules de levure marqués sur leur surface avec de la biotine peut être cultivé et ensuite isolé à partir de leurs cellules filles à l'aide des microbilles anti-biotine et magnétique de tri 16, parce que les cellules filles produites par la population initiale ne contiendront pas de la biotine sur leur surface . Croissance de série ettri permet aux populations progressivement âgés de cellules mères à être obtenues et analysées. Cette procédure a été utilisée avec succès pour étudier les changements dans la physiologie cellulaire et l'expression des gènes au cours du vieillissement réplicatif de levure 13,14,17,18. La méthode actuelle adapte cette marquage à la biotine et technique de tri magnétique pour enrichir les cellules mères dans le but de mesurer l'accumulation de mutations potentiellement rares ou d'autres formes de l'instabilité du génome analysés dans les sélections phénotypiques. Croissance de série et le tri physique permettent une analyse de l'accumulation de mutations dans les cellules-mères progressivement âgées, ainsi que dans les populations de cellules filles. Détermination du taux de mutation par génération permet une fréquence de mutation prévu pour être calculée pour les cellules mères qui ont subi un nombre particulier de divisions cellulaires. Comme les valeurs de fréquences prévues sont basées sur l'augmentation prévue en raison de cycles supplémentaires de la division cellulaire, des écarts importants dans les Mutati observéssur les fréquences par rapport aux valeurs prédites fournir des preuves des changements selon l'âge du taux de mutations qui s'accumulent. En utilisant ce protocole, fluorescence des cicatrices de bourgeons qui correspondent à des sites de divisions cellulaires sur des cellules-mères couplés avec l'analyse par cytométrie en flux peut être utilisé pour déterminer rapidement la répartition par âge des populations triées et non triées. Réactifs fluorescents supplémentaires, tels que ceux qui sont utilisés pour détecter des espèces réactives de l'oxygène, peuvent également être utilisées au cours de ce protocole. Dans l'ensemble, ce protocole permet une analyse efficace des changements dépendant de l'âge de l'instabilité du génome ayant le potentiel pour la corrélation de cellules changements physiologiques liés à l'âge dans un organisme modèle bien adapté à l'étude des facteurs génétiques et environnementaux qui influent sur l'instabilité du génome liées au vieillissement.
Ce protocole combine plusieurs procédés pour activer les ressources disponibles et les approches dans les Saccharomyces cerevisiae système modèle pour être efficacement appliquée à l'étude du génome de l'instabilité au cours du vieillissement cellulaire mitotique. Une grande variété de dosages pour quantifier les différentes formes d'instabilité du génome par sélection phénotypique peut être combiné avec le tri magnétique pour étudier les changements possibles en fonction de l'âge de l'accumulation des formes particulières de mutations ou de remaniements chromosomiques. Bien que les approches de séquençage entier du génome pourraient fournir plus d'informations sur les types d'ensemble de changements qui se produisent dans un génome avec l'âge, la capacité d'utiliser des systèmes de sélection phénotypique pour obtenir des mesures de taux de mutation et d'isoler préférentiellement certains types de modifications génétiques sont des atouts importants pour l'étude mécaniste aspects de liées au vieillissement instabilité du génome. La rationalisation de la détermination de l'âge de la cellule et le potentiel de faire des mesures parallèles de physiologiques modifications au moyen des flux fournissent cytométrie moyens efficaces pour corréler l'instabilité du génome avec d'autres modifications cellulaires au cours de gammes spécifiques d'âge. Détermination des changements potentiels dépendant de l'âge dans les taux de mutations qui s'accumulent, il faut: 1) la détermination minutieuse des taux dans les populations de cellules jeunes, 2) la détermination précise de l'âge de la cellule, et 3) la capacité d'enrichir de manière fiable des populations suffisamment importantes de cellules mères pour mesurer de manière reproductible l'instabilité du génome dans la vieillesse. Cette approche permet au système de modèle de levure de contribuer à la définition des mécanismes sous-jacents responsables des changements dépendant de l'âge du taux et / ou des fréquences de l'instabilité du génome dans les cellules activité mitotique. En outre, les facteurs génétiques et environnementaux peuvent être évalués rapidement des contributions au dépend de l'âge de l'instabilité génomique. En fin de compte, ces caractérisations pourraient conduire au développement de modèles qui tiennent compte de la manière dont les mutations s'accumulent au cours du vieillissement réplicatif.
Cette méthode repose sur la capacité à détecter des mutations ou d'autres types de l'instabilité du génome par l'apparition de phénotypes sélectionnables pour mesurer les taux de ces événements. Cependant, la créativité dans la conception de l'essai peut permettre de nombreux aspects de l'instabilité du génome à étudier. Par exemple, les gènes URA3 et CAN1 peuvent être placés à des endroits différents du génome de tester toute influence de la localisation génomique de résultats. Réversion des allèles de gènes spécifiques non fonctionnels à des allèles de gènes fonctionnels pourrait tester certains processus de mutation. En outre, l'introduction de plusieurs allèles d'un gène inactif ou flanquant un gène avec des séquences répétées peut être utilisée pour étudier des événements de recombinaison par la restauration ou la perte de la fonction du gène, respectivement. des tests de fluctuation sont l'approche standard pour déterminer les taux de ces divers événements génome d'instabilité 9. Le protocole est écrit en utilisant l'estimateur médian Lea-Coulson bien accepté et relativement simple de déterminer mutataux de tion pour le rendre plus accessible aux divers chercheurs, même si la méthode d'estimation de la probabilité MSS-maxi est considéré comme la meilleure approche pour déterminer les taux de mutation 9. L'estimateur du maximum de vraisemblance MSS-a déjà été examinée en détail 9, et peut être utilisé comme une méthode alternative, mais nécessite des calculs plus sophistiqués. Sinon, le logiciel libre pour calculer les taux de mutation de cette méthode a été mis à la disposition 22. Obtenir des mesures reproductibles des taux de mutation exige une attention à quelques aspects de la conception expérimentale, y compris en utilisant des cultures de répliques suffisantes, l'inoculation de cultures à suffisamment de densités cellulaires initiales faibles que la taille de la population augmente de volume de culture appropriées 10.000 fois ou plus, et le choix de telle sorte que l'ensemble du population de cellules peut être étalé sur un milieu sélectif. Pour ce dernier point, une formule décrite précédemment peut être utilisée pour ajuster le taux de mutation sur la base de la fraction de culture tested 9. Variation du taux de croissance des cultures peut compliquer la détermination d'un taux de mutation reproductible, et un estimateur basé médiane-modifié qui peut donner des résultats plus reproductibles dans de telles situations, ont été décrites récemment 23.
La capacité de mesurer avec précision l'âge de la cellule est un autre facteur qui est important pour établir si les fréquences génome d'instabilité dans les vieilles cellules sont différentes des valeurs attendues en raison du taux d'événements dans les jeunes cellules. Nous avons trouvé WGA coloration préférable à calcofluor coloration blanche, à la fois en termes de fond et de flexibilité, car WGA est disponible conjugué à différentes molécules fluorescentes. Cette flexibilité peut fournir plus de possibilités pour des mesures simultanées des autres caractéristiques des cellules avec des réactifs fluorescents. Le travail initial d'établir une relation entre l'intensité du signal pour la coloration WGA et le nombre correspondant de cicatrices de bourgeons sur les cellules peut alors conduire à une plusdétermination rapide de l'âge de la cellule par cytométrie de flux. Cette approche permet aussi d'utiliser de plus grandes tailles de population seraient généralement examinées au microscope pour une meilleure reproductibilité des mesures. Alors que toutes les déterminations d'âge pourraient être faites par l'examen microscopique des cellules, nous pensons que la cytométrie en flux approche facilite le dépistage rapide des facteurs qui influencent dépendant de l'âge de l'instabilité génomique.
En plus de la mesure de l'âge de la cellule de façon fiable, il convient de tenir compte du nombre de divisions cellulaires des cellules mères sont autorisés à subir à chaque cycle successif de la croissance et le tri des cellules. Utilisez une taille de population initiale plus faible ou un volume de grande culture pourrait permettre aux cellules de se soumettre à plusieurs divisions cellulaires avant d'atteindre la densité cellulaire désirée. Par exemple, d'autres chercheurs ont utilisé seulement deux cycles de tri d'obtenir de très anciennes cellules de levure 16, ce qui a l'avantage évident d'obtenir des cellules âgées de moins experimeétapes NTAL. Pour déterminer si pour augmenter le volume de la culture pour permettre aux cellules de compléter plusieurs divisions cellulaires avant le tri, garder à l'esprit la limite sur le nombre total de cellules qui peuvent être traités dans une seule colonne. L'utilisation d'un plus grand volume de culture peut nécessiter l'utilisation de plusieurs colonnes pour trier un population de cellules. En outre, si les cellules subissent moins de cycles de division cellulaire entre les points sortes / de collecte, alors il ya plus d'occasions d'observer des écarts de fréquence des mutations attendues à des moments distincts pendant la durée de vie. Par exemple, l'échantillonnage seulement au début et les points de temps pendant la durée de vie peut fin de produire des données indiquant une augmentation constante de la fréquence des mutations, mais d'échantillonnage à temps intermédiaires supplémentaires au cours de la durée de vie peut montrer rapidement, puis les plateaux que la fréquence de mutation augmente. Cependant, depuis ce protocole isole cellules mères anciennes, il est possible d'obtenir une mesure plus directe de l'évolution des taux de mutation avec l'âge. des tests de fluctuation pourrait be effectuée à l'aide de cellules mères d'âges différents afin de déterminer si le taux de mutation sera différent de celui obtenu en utilisant des cellules jeunes. Alors que les cultures de ces tests de fluctuation seront un mélange de cellules jeunes et vieux à mesure qu'ils grandissent, les écarts de taux obtenus à partir de cellules jeunes pouvaient être attribués à l'utilisation d'une population de départ plus.
La capacité à obtenir de façon reproductible une grande population assez de cellules mères âgées de mesurer avec précision l'instabilité du génome est essentiel à la réussite de cette approche. Alors que le protocole décrit l'utilisation d'un système de tri magnétique particulier à cette fin, d'autres groupes ont trié les cellules-mères de levure avec d'autres systèmes 14,18 (voir le tableau des matériaux). Ces systèmes alternatifs devraient également travailler avec cette méthode, bien que certains l'optimisation des protocoles des fabricants pourrait être nécessaire. Quel que soit le système particulier utilisé, la taille de la population nécessitentd varie en fonction de la fréquence de la mutation ou le type de réarrangement du génome choisie pour l'étude. Au minimum, il doit y avoir suffisamment de cellules mères pour obtenir au moins une colonie de mutants par population pour calculer une fréquence de mutation. Dans la pratique, les résultats peuvent être très variables si ce n'est que de zéro à cinq colonies mutantes sont attendus à partir de la taille de la population, et même une petite augmentation de la taille de la population, de sorte que cinq à dix colonies mutantes sont attendus, peut grandement améliorer la reproductibilité. Lorsque la biotine, l'identification d'une population de départ, le rendement de récupération pour chaque type doit être pris en compte pour aider à identifier la taille appropriée de la population nécessaire pour mesurer la fréquence de mutation dans les cellules mères âgées. Avec 90% de récupération de cellules mères après chaque sorte, seulement 59% de la population d'origine serait récupéré après cinq tours de la croissance et de tri. Cette chute à ~ récupération de 33% de la population d'origine après cinq tours de la croissance et de tri si seulement 80% des cellules mères sont étiquetés récupéreré au cours de chaque sorte. Mesurer et optimiser la récupération est crucial lors de la mesure des événements de faible fréquence, depuis deux à trois fois diminution de la taille de la population pourrait facilement conduire à des chiffres fiables de colonies mutantes par la population.
Il existe de nombreuses options pour se développer ou modifier ce protocole pour obtenir une meilleure compréhension de l'instabilité du génome au cours du vieillissement cellulaire mitotique. Voici quelques exemples simples d'analyser comment des altérations de la fonction des gènes, les changements de médias, ou d'autres changements de conditions environnementales modifient l'accumulation de mutations avec l'âge. Les taux de mutation de cellules jeunes ayant une fonction de gène altérée ou à l'état approprié seraient mesurés et utilisés pour déterminer si les mutations s'accumulent différente de celle prédite par les valeurs de débit et différemment que dans les populations de cellules de contrôle. Les populations de cellules à différents moments au cours du vieillissement réplicatif pourraient être exposés à des facteurs de stress spécifiques, telles que les espèces réactives de l'oxygène ou des agents endommageant l'ADN. Aexposition transitoire et d'intensité légère à un stress oxydatif ne modifie pas sensiblement la capacité d'effectuer le tri cellulaire (Figure 3), mais les contraintes plus sévères peut compliquer la récupération des cellules. Des expériences préliminaires seraient nécessaires pour vérifier que les cellules mères peuvent encore être récupérées de manière efficace après des contraintes spécifiques. En outre, les caractéristiques cellulaires de cellules mères isolées ont pu être analysés en détail, y compris les niveaux d'espèces réactives de l'oxygène, de la morphologie mitochondriale et vacuolaire, et d'autres caractéristiques physiologiques associés au vieillissement 3. En outre, les cellules-mères peuvent être une population de départ pour un autre traitement ou manipulation. Comme les cellules mères et filles sont physiquement séparés au cours de la procédure, les cellules filles sont également toujours disponibles pour l'analyse. Par exemple, des changements dans les caractéristiques physiologiques de cellules filles ou l'héritage asymétrique des macromolécules endommagées entre la mère de la levure et des cellules filles <sjusqu'à> 24 pourrait être comparé à la synchronisation des changements intéressants dans la mutation des fréquences / taux. fréquences de mutation pour les populations de cellules fille pourraient aussi être obtenus afin d'essayer de modéliser s'il existe héritage asymétrique des mutations au cours du vieillissement réplicatif. En résumé, la combinaison de l'enrichissement de cellules mères à travers le tri cellulaire magnétique avec des tests de fluctuation permet les avantages de la S. système modèle cerevisiae pour être efficacement appliquée à des mécanismes responsables de l'accumulation de changements génétiques au cours du vieillissement cellulaire mitotique enquête.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été financé en partie par la subvention R00AG031911 de l'Institut national sur le vieillissement des Instituts nationaux de la santé pour PHM Le contenu de cet article ne reflètent pas nécessairement la position officielle de la National Institutes of Health.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | 100mg |
Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | 2ml MicroBeads conjugated to monoclonal mouse anti-biotin antibodies (isotype: mouse IgG1) |
MACS LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | 25 columns suitable for QuadroMACS separator |
QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | Separator Only |
QuadroMACS Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-091-051 | Includes: QuadroMACS Separator (130-090-976), MACS MultiStand (130-042-303), LS Columns (130-042-401), MACS 15ml Tube Rack (130-091-052), One 2ml unit of MACS MicroBeads. Note: Alternative systems include Dynabeads Biotin Binder and MagnaBind Magnetic Beads |
BD Falcon Cell Strainer, 40 µm | BD Biosciences | 352340 | 40 µm for use with BD Falcon 50 ml Conical Tubes. 50 per pack |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | Powder, filtering after dissolving important to remove particulates |
Wheat germ agglutinin Alexa Fluor488 | Life Technologies | W11261 | Conjugates with different excitation/emission spectra could also be used |
ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36930 | 10 ml, other antifade reagents could also be used |