Mutationsraten bei jungen Saccharomyces cerevisiae Zellen durch Fluktuation Tests gemessen werden zur Mutationshäufigkeiten für Mutterzellen der verschiedenen replikativen Alter vorherzusagen. Magnetische Sortierung und Durchflusszytometrie werden dann verwendet, um tatsächliche Mutationshäufigkeiten und Alter der Mutter Zellen zu messen, um Abweichungen von der erwarteten Mutationsfrequenzen zu ermitteln.
Saccharomyces cerevisiae wurde für die Prüfung Mechanismen und Folgen der Genominstabilität ein ausgezeichneter Modellsystem. Informationen aus diesem Hefemodell gewonnen hat für viele Organismen, einschließlich Menschen, da die DNA-Reparatur von DNA-Schäden und Antwortfaktoren sind in verschiedenen Spezies konserviert. Allerdings S. cerevisiae ist noch nicht verwendet worden, um voll anzugehen, ob die Rate der Akkumulation von Mutationen Veränderungen mit zunehmendem replikativen (Mitose) Alter aufgrund technischer Einschränkungen. Zum Beispiel Messungen der Hefe replikativen Lebensdauer durch Mikromanipulation in geringer Zellpopulationen, die die Detektion von seltenen Mutationen zu verhindern. Genetische Methoden, die zur Mutterzellen in der Bevölkerung durch Induktion Tod von Tochterzellen zu bereichern entwickelt worden, aber Populationsgrößen werden noch von der Häufigkeit, mit der zufälligen Mutationen, die die Selektionssysteme gefährden auftreten begrenzt. Das aktuelle Protokoll nutzt magnetische Sorting von Oberflächen-markierten Hefe Mutterzellen groß genug Populationen von Zellen alternde Mutter, um seltene Mutationen durch phänotypische Auswahl quantifizieren zu erhalten. Mutationsraten, durch Fluktuation Tests gemessen, und Mutationsfrequenzen werden zuerst für junge Zellen festgelegt und verwendet, um die Häufigkeit von Mutationen in den Mutterzellen verschiedener replikativen Alters vorherzusagen. Mutation Frequenzen werden dann für sortierte Mutterzellen bestimmt, und das Alter der Mutter Zellen mittels Durchflusszytometrie durch Färbung mit einem fluoreszierenden Reagenz, das Knospe Narben auf ihren Zelloberflächen während der Zellteilung gebildet erkennt bestimmt. Vergleich der vorausgesagten Mutationsfrequenzen auf Grundlage der Anzahl der Zellteilungen zu den Frequenzen experimentell für Mutterzellen einer bestimmten Alters replikativen beobachtet kann dann ermitteln, ob es altersbedingte Veränderungen in der Rate der Akkumulation von Mutationen. Variationen dieses Grundprotokoll die Mittel, um den Einfluss von Veränderungen der spezifischen Genfunktionen untersuchen oderspezifischen Umweltbedingungen auf die Mutation, Mechanismen Akkumulation während replikative Alterung Rechnung zugrunde liegenden Genom-Instabilität.
Mikroorganismen wie der Hefe Saccharomyces cerevisiae, sind hervorragende Modelle zur Untersuchung der Mutationsraten, aber diese Modelle nicht voll ausgenutzt worden, um die Akkumulation von Mutationen im mitotischen Alterung von Zellen zu untersuchen. Mutation Akkumulation im Zellkerngenom wurde die Hypothese aufgestellt, um die Alterung von was zu fortschreitenden Verlust (oder Variation) Genfunktionen 1 beitragen. Die Fähigkeit, ein mikrobielles System, um die Mechanismen und Folgen der Mutation Akkumulation während der Alterung kann die Identifizierung von genetischen und Umweltfaktoren diesen Prozess zu beeinflussen, da der einfache genetische Systeme und die einfache Quantifizierung von seltenen phänotypischen Veränderungen in Mikroorganismen stark beschleunigen studieren. DNA-Reparaturfaktoren und DNA-Schadensantwort-Proteine werden auch über verschiedene Arten 2 konserviert und Grund Ähnlichkeiten in Organismen Alterung sind für Organismen so vielfältig wie S. identifiziert cerevisiae eind Säugetiere 3, was es wahrscheinlich macht, dass die Ergebnisse aus Studien in Hefe erhalten wird relevant für Alterung in vielen Organismen sein.
Studien des Alterns in S. cerevisiae nutzen zwei Alterungsmodelle, die chronologische Alterung oder replikative Alterung von Zellen zu messen. Chronologischer Alterung wird durch den progressiven Verlust der Lebensfähigkeit der Hefe-Zellpopulationen, die in einer nicht-teilenden Zustand (stationäre Phase) sind durch Nährstoffverarmung 3 gekennzeichnet. Die chronologische Alterung Modell wurde verwendet, um zu zeigen, dass Mutationen akkumulieren mit zunehmendem Alter 4, da große Zellpopulationen sind leicht in diesem Modell erhalten, um phänotypische Auswahl für mutierten Zellen durchzuführen. In diesem Fall erscheint Mutation Akkumulation von wachstumsSignalWege und oxidativer Stress 5 beeinflußt werden, und jeder dieser Faktoren für das Verständnis Alterung in vielzelligen Eukaryoten 3. Die replikative Alterung Modell nutzt die asymmetrische divisiauf zwischen S. cerevisiae Mutter und Tochter Zellen für die Untersuchung von Hautalterung, die mit aufeinanderfolgenden Zellgenerationen 3 auftritt. Hefe replikative Alterung wurde oft durch Mikromanipulation von kleinen Populationen von Mutter und Tochter Zellen, oder in jüngerer Zeit durch Videomikroskopie von kleinen Populationen von Hefezellen in mikrofluidischen Bauteilen 6,7 gemessen worden. Begrenzte Populationsgrößen machen diese Ansätze wenig geeignet für die Untersuchung von Mutation Akkumulation während der mitotischen Alterung, es sei denn gesamten Genoms Information wird aus einzelnen Zellen erhalten oder sehr hohe Frequenz genetischen Veränderungen werden gemessen 8. Gesamtgenom-Sequenzierung von Einzelzellen bietet erhebliche Datenmengen für die Untersuchung Mutation Akkumulation, aber phänotypische Selektion Systeme haben den wichtigen Vorteil, dass sie ein Mittel zur Messung Mutationsraten zu Grunde liegenden Mechanismen zu studieren Mutation Akkumulation. Studien zur Mutationshäufigkeiten und Preise durch phänotypische Auswahl in haploi prüfend Hefestämme während replikative Alterung noch nicht berichtet worden.
Mutationsraten werden häufig mit Tests Fluktuation 9 gemessen. Mutationshäufigkeit Werte spiegeln die Gesamtzahl der Zellen, die eine Mutation in einem Gen-Sequenz in einer Population. Dies umfasst Zellen, in denen unabhängige Mutationen auftreten und alle Nachkommen dieser Zellen, die einfach erben bereits vorhandenen Mutationen. Im Gegensatz dazu Mutationsraten durch Fluktuation Tests gemessen entsprechen der Anzahl der unabhängigen Mutationen, die neu mit jeder Zelle Generation auftreten. Diese Prüfungen umfassen typischerweise viele Impfen Replika-Kulturen bei niedriger Zelldichte, um die Wahrscheinlichkeit des Hinzufügens von Zellen mit vorbestehenden Mutation in einer Zielsequenz, Züchten der Kulturen in der Nähe der Sättigung, und Identifizieren mutanten Zellen durch Wachstum auf Selektivmedium zu reduzieren. Die Anzahl der mutierten Zellen in den Wiederholungspopulationen identifiziert werden dann in einer von mehreren mathematischen Modelle verwendet, um die Anzahl von i zu schätzenndependent Mutationen, die während des Wachstums 9 entstand. Vergleichen der Anzahl von unabhängigen Mutationen auf die durchschnittliche Bevölkerungszahl stellt ein Maß für die Mutationsrate. In S. cerevisiae Mutationshäufigkeiten und Preise werden häufig gemessen mit den URA3 und CAN1 Gene, da loss-of-function Mutationen in diesen Genen produzieren Selektionsphänotypen. Verlust des URA3-Funktion macht Zellen resistent gegen 5-Fluororotsäure (5-FOA), da das Protein codiert URA3 konvertiert 5-FOA in einem toxischen Molekül 10. Verlust der Funktion der Zellen ermöglicht CAN1 beständig Canavanin, einer toxischen Arginin Analog zu werden, da das Protein durch CAN1 codiert transportiert Arginin und Canavanin in Zellen 11.
Beide genetische und physikalische Sortierung Strategien wurden erfolgreich eingesetzt, um größere Populationen von S. erhalten cerevisiae Mutterzellen, Untersuchungen der replikativen Altern erleichtern. Genetische Strategien umfassen clevere Ansätze, die gegen die Tochter des Zellüberlebens in einer Population aus. Die Mutter Anreicherungsprogramm (MEP) beinhaltet Beta-Estradiol Induktion von Cre-Rekombinase-Expression nur in Tochterzellen, was zu Tochter-spezifischen Störung der zwei Gene, welche entwickelt wurden, um loxP 12 enthalten. MEP-Stämme können in der Regel in Abwesenheit des Induktors kultiviert werden, sondern nur die Mutterzellen teilen sich weiter nach Induktion, während Tochterzellen in M-Phase in der Regel während der ersten Progression durch den Zellzyklus 12 zu verhaften. Während dieses System nicht verwendet worden, um allgemein zu studieren Mutation Akkumulation während der Alterung wurde verwendet, um den Verlust der Heterozygotie, eine relativ häufige Form von Genominstabilität in diploiden Hefestämme sowie biochemische Veränderungen Alterung Mutterzellen 13,14 studieren. Ebenso beinhaltet die Tochter-Ableiter System Tochter-spezifische Expression des S. cereviSIAE URA3 Gen 15. Tochter-Ableiter Stämme wachsen in der Regel bis 5-FOA wird zum Medium gegeben, an welcher Stelle Tochterzellen exprimieren URA3 sterben wird, während Mutter Zellen weiter wachsen 15. Diese sind nützlich, Systeme für Mutterzellen zu bereichern, aber sie sind auf die Wartung der Gen-Funktionen, die das Auswahlsystem bilden abhängen. Zufallsmutationen in einer oder mehreren Komponenten des Selektionssystems kann in Tochterzellen, die die Auswahl entweichen und sich vermehren exponentiell führen. Bei der Entwicklung der MEP-Stämme, wurden entsprechende Populationsgrößen bestimmt das Aussehen der Mutante Tochterzellen, die die Auswahl 12 entweichen könnten. Doch diese Grenze in Bevölkerungsgröße beeinträchtigt die Erkennung von seltenen Formen der Genom-Instabilität während der replikativen Alterung. Diese Beschränkung auf die Bevölkerungsgröße konnte teilweise durch die Verwendung diploiden Hefestämme mit zwei Kopien von jedem Gen, die zur Auswahlsystem, da die meisten überwunden werdenMutationen wahrscheinlich rezessiv 12 sein. Verwendung von diploiden Stämme beschränkt jedoch die Arten von Mutationsereignisse, die im Vergleich zu denen, die sich leicht in haploiden Hefezellen detektiert werden kann leicht nachgewiesen werden kann.
Physikalische Sortierung Strategien umfassen Isolierung von Mutterzellen mit einem markierten Zelloberfläche von unmarkierten Tochterzellen für große Populationen von Mutterzellen zu bereichern. Die Beobachtung, dass die Zelloberflächenproteine (Zellwandproteine) von S. cerevisiae Tochterzellen sind neu bei angeh wurde genutzt, um Zellen zu markieren, ohne Mutter Kennzeichnung der Tochterzellen, die sie produzieren 16 synthetisiert. Zum Beispiel kann eine anfängliche Population von Hefezellen, die auf ihrer Oberfläche mit Biotin markiert gezüchtet werden und dann von ihrer Tochterzellen mit Anti-Biotin-Mikrokugeln und 16 magnetische Sortierung, da die Tochterzellen nach der Anfangspopulation erzeugt nicht Biotin enthalten auf ihrer Oberfläche isoliert . Serien Wachstum undSortierung ermöglicht schrittweise älteren Bevölkerung von Mutterzellen zu erhalten und analysiert werden. Dieses Verfahren wurde erfolgreich eingesetzt, um Veränderungen in der Zellphysiologie und Genexpression während replikative Alterung Hefe 13,14,17,18 untersuchen. Die aktuelle Methode passt sich diese Biotin-Markierung und magnetische Sortiertechnik für Mutterzellen mit dem Ziel der Messung der Anreicherung potenziell seltene Mutationen oder andere Formen der Genom-Instabilität durch phänotypische Auswahl untersucht zu bereichern. Serien Wachstum und physikalische Sortierung die eine Analyse der Mutation Akkumulation in zunehmend älteren Mutterzellen, als auch in ihrer Tochter Zellpopulationen. Bestimmung des Mutationsraten pro Generation ermöglicht eine vorhergesagte Mutationsfrequenz für Mutterzellen, die eine bestimmte Anzahl von Zellteilungen durchlaufen haben, berechnet werden. Seit vorhergesagt Frequenzwerte auf den erwarteten Anstieg durch zusätzliche Runden der Zellteilung, erhebliche Abweichungen in den beobachteten Mutati basierendauf Frequenzen im Vergleich zu den vorhergesagten Werten belegen altersspezifische Veränderungen in der Rate der Akkumulation von Mutationen. Über dieses Protokoll können Fluoreszenzfärbung von Narben, die Knospe zu Websites von Zellteilungen auf Mutter-Zellen mit der Durchflusszytometrie gekoppelt entsprechen verwendet werden, um schnell festzustellen, die Altersverteilung der Bevölkerung sortierte und unsortierte werden. Zusätzliche fluoreszierende Reagenzien, wie sie zum Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies verwendet werden, können auch in diesem Protokoll verwendet werden. Insgesamt ist dieses Protokoll ermöglicht eine effiziente Analyse der altersabhängigen Veränderungen in der Genominstabilität mit dem Potenzial für Korrelation zu altersbedingten physiologischen Veränderungen Zelle in einem Modellorganismus gut geeignet für die Untersuchung der genetischen und umweltbedingten Faktoren, die alterungsbedingte Genominstabilität beeinflussen.
Dieses Protokoll verbindet mehrere Methoden, um Ressourcen zu ermöglichen und Ansätze in den Saccharomyces cerevisiae Modellsystem zur Verfügung, um während der mitotischen Zellalterung effizient auf das Studium der Genominstabilität angewendet werden. Eine große Vielzahl von Assays auf unterschiedliche Formen der Genominstabilität durch phänotypische Selektion quantifizieren kann mit Magnetsortierung kombiniert werden, um mögliche altersspezifische Veränderungen Anreicherung bestimmter Formen von Mutationen oder Chromosomenveränderungen untersucht werden. Während des gesamten Genoms Sequenzierung Ansätze könnten mehr Informationen über die Gesamt Arten von Änderungen in einem Genom mit dem Alter auftreten, zu schaffen, sind die Fähigkeit, phänotypischen Selektionssysteme verwenden, um Mutationsrate Messungen zu erhalten und zu isolieren, bevorzugt bestimmte Arten von genetischen Veränderungen wichtige Vorteile für das Studium mechanistische Aspekte des Alterns bezogene Genominstabilität. Straffung der Bestimmung der Zell Alter und das Potenzial parallelen Messungen von physiologi zu machencal Veränderungen durch Durchflusszytometrie effiziente Mittel, um Genominstabilität mit anderen zellulären Veränderungen in bestimmten Altersklassen korrelieren. Festlegung der möglichen altersabhängigen Veränderungen in der Akkumulation von Mutationen Raten erfordert: 1) vorsichtig Bestimmung bei jungen Zellpopulationen, 2) eine genaue Bestimmung der Zellalter, und 3) die Fähigkeit, zuverlässig zu bereichern ausreichend große Populationen von Mutterzellen reproduzierbar messen Genominstabilität im Alter. Dieser Ansatz ermöglicht die Hefe Modellsystem, um die Definition zu Grunde liegenden Mechanismen für altersabhängige Veränderungen der Zinssätze und / oder Frequenzen der Genominstabilität in mitotisch aktiven Zellen verantwortlich beitragen. Weiterhin können genetische und Umweltfaktoren schnell für Beiträge zu altersabhängigen Genominstabilität zu beurteilen. Letztlich könnten diese Charakterisierungen, die Entwicklung von Modellen, die für die Art und Weise, in der Mutationen während der replikativen Alterung akkumulieren Konto führen.
Dieses Verfahren hängt von der Fähigkeit, Mutationen oder andere Arten von Genominstabilität durch das Auftreten von Selektionsphänotypen erfassen Raten solcher Ereignisse zu messen. Allerdings kann Kreativität in Assay-Design erlauben viele Aspekte der Genominstabilität untersucht werden. Zum Beispiel kann das URA3 und CAN1 Gene an verschiedenen Genomorte platziert werden, um jegliche Einflüsse der genomischen Position auf die Testergebnisse. Reversion von spezifischen nicht-funktionalen Gen-Allele zu funktionellen Gen-Allele könnte insbesondere Mutationsprozesse zu testen. Auch Einführung mehrerer inaktiver Allele eines Gens oder eines Gens mit flankierenden Wiederholungssequenzen verwendet werden, um Rekombinationsereignisse durch Wiederherstellung oder Verlust der Genfunktion zu untersuchen bzw. werden. Fluktuation Tests sind die Standard-Ansatz zur Bestimmung Raten der verschiedenen Genominstabilität Ereignisse 9. Das Protokoll wird mit Hilfe der gut angenommen und relativ einfach Lea-Coulson Median-Schätzer zu bestimmen muta geschriebentionsrate es zugänglicher zu verschiedenen Forscher zu machen, auch wenn die MSS-Maximum-Likelihood-Schätzer Methode gilt als der beste Ansatz für die Bestimmung Mutationsraten 9. Die MSS-Maximum-Likelihood-Schätzer zuvor detailliert 9 überprüft, und kann als ein alternatives Verfahren verwendet werden, erfordert jedoch komplexere Berechnungen. Alternativ wurde die kostenlose Software, Mutationsraten mit dieser Methode berechnen worden verfügbaren 22 gemacht. Reproduzierbare Maßnahmen der Mutationsraten erfordert Aufmerksamkeit auf einige Aspekte der Versuchsplanung, einschließlich der Verwendung von genügend Parallel Kulturen, Impfen Kulturen niedrig genug Anfangszelldichten, die Populationsgröße steigt um 10.000-fach oder mehr, und die Auswahl geeigneter Kulturvolumina, so dass der gesamte Population von Zellen kann auf selektiven Medium verbreitet werden. Für den letzteren Punkt kann eine zuvor beschriebene Formel verwendet, um die Mutationsrate einzustellen, basierend auf dem Anteil der Kultur Teste werdend 9. Veränderung der Wachstumsrate der Kulturen kann die Bestimmung eines reproduzierbaren Mutationsrate und eine modifizierte Median-basierte Schätzer, die mehr reproduzierbare Ergebnisse in solchen Situationen wurde kürzlich beschrieben 23 ergeben kann erschweren.
Die Fähigkeit zur genauen Messung der Zellalter ist ein weiterer Faktor, der wichtig für die Feststellung, ob Genominstabilität Frequenzen in alten Zellen von den Werten erwartet werden aufgrund der Ereignisrate in jungen Zellen. Wir haben gefunden, WGA-Färbung bevorzugt, weiße Färbung Calcofluor zu sein, sowohl in Bezug auf Hintergrund und Flexibilität, da WGA ist konjugiert mit verschiedenen fluoreszierenden Molekülen. Diese Flexibilität kann mehr Möglichkeiten zur gleichzeitigen Messung von anderen Zelleigenschaften mit fluoreszierenden Reagenzien bereitzustellen. Erste Arbeiten, um eine Beziehung zwischen der Signalintensität für die WGA-Färbung und der entsprechenden Zahl der Knospe Narben auf Zellen herstellen kann dann zu einem mehr führenschnelle Bestimmung von Zellalter durch Durchflusszytometrie. Dieser Ansatz ermöglicht auch die Verwendung von größeren Populationsgrößen, als es in der Regel durch Mikroskopie für eine verbesserte Reproduzierbarkeit der Messungen untersucht werden. Während alle Altersbestimmungen konnte durch mikroskopische Untersuchung der Zellen gemacht werden, fühlen wir, dass die Durchflusszytometrie Ansatz erleichtert das schnelle Screening von Faktoren, die altersabhängigen Genominstabilität beeinflussen.
Neben der Messung der Zellalter zuverlässig ist zu überlegen, auf die Anzahl der Zellteilungen Mutter Zellen werden mit jeder Runde wächst und Sortieren von Zellen unterziehen sollen. Verwendung einer geringeren Anfangspopulationsgröße oder eine größere Kulturvolumen könnte es Zellen, mehr Zellteilungen vor Erreichen der gewünschten Zelldichte zu unterziehen. Zum Beispiel haben andere Forscher nur zwei Runden der Sortierung sehr alte Hefe-Zellen 16, die den offensichtlichen Vorteil des Erhaltens alten Zellen mit weniger Experime hat zu erhaltenNTAL Schritten. Bei der Prüfung, ob die Kulturvolumen zu erhöhen, um damit die Zellen mehr Zellteilungen vor der Sortierung abgeschlossen haben, denken Sie daran, die Grenze für die Gesamtzahl der Zellen, die in einer einzelnen Spalte bearbeitet werden können. Verwendung einer größeren Kulturvolumen kann die Verwendung von mehreren Spalten erfordern, um eine Zellpopulation zu sortieren. Auch, wenn Zellen durchlaufen weniger Runden der Zellteilung zwischen Arten / Sammlung Punkte, dann gibt es mehr Möglichkeiten, um Abweichungen von erwarteten Mutation Frequenzen an bestimmten Zeitpunkten während Lebensdauer zu beobachten. Zum Beispiel, Probenahme nur bei frühen und späten Zeitpunkten während Lebensdauer kann Daten, die einen stetigen Anstieg der Mutationsfrequenz, aber Abtastung mit zusätzlichen Zwischenzeiten während Lebensdauer kann schnell und dann zeigen, dass die Hochebenen Mutationsfrequenz erhöht produzieren. Da dieses Protokoll isoliert alte Mutterzellen, gibt es eine Möglichkeit, um eine direkte Messung der Veränderungen im Mutationsraten mit dem Alter zu erhalten. Fluktuation Tests könnten be unter Verwendung von Mutterzellen unterschiedlichen Alters, um zu bestimmen, ob die Mutationsrate wird von der mit jungen Zellen erhalten Satz abweichen. Während die Kulturen für diese Fluktuation Tests wird eine Mischung aus alten und jungen Zellen werden, wie sie wachsen, könnten etwaige Abweichungen von Raten erhalten, beginnend mit jungen Zellen auf die Verwendung einer älteren Ausgangspopulation zurückzuführen.
Die Fähigkeit, reproduzierbar erhalten eine ausreichend große Population von Zellen alte Mutter, genau zu messen Genominstabilität ist entscheidend für den Erfolg dieses Ansatzes. Während das Protokoll beschreibt die Verwendung einer bestimmten magnetischen Sortiersystem für diesen Zweck, haben andere Gruppen Hefe Mutterzellen mit alternativen Systemen 14,18 (siehe Tabelle der Materialien) sortiert. Solche alternativen Systeme sollte auch mit dieser Methode zu arbeiten, auch wenn einige Optimierung der Protokolle der Hersteller erforderlich werden könnte. Unabhängig von der konkreten System verwendet werden, die Populationsgröße erfordernd unterscheidet sich in Abhängigkeit von der Frequenz von der Art der Mutation oder Genom Umlagerung zur Untersuchung ausgewählt. Zumindest muß es genügend Mutterzellen mit mindestens einem mutierten Kolonie pro Population zu erhalten, um eine Mutationsfrequenz zu berechnen. In der Praxis können die Ergebnisse ziemlich variabel sein, wenn nur null bis fünf Mutantenkolonien aus der Populationsgröße und auch eine geringe Zunahme der Populationsgröße erwartet, so dass fünf bis zehn Mutantenkolonien zu erwarten sind, kann erheblich die Reproduzierbarkeit zu verbessern. Biotin-Markierung, wenn eine Ausgangspopulation, die Rückgewinnungseffizienz für jede Art muss berücksichtigt werden, um zu identifizieren die entsprechende Bevölkerungsgröße notwendig, Mutationsfrequenz in alten Mutterzellen zu messen. Mit 90% Erstattung der Mutterzellen nach jeder Art würden nur 59% der ursprünglichen Bevölkerung nach fünf Runden des Wachstums und der Sortierung wiederhergestellt werden. Diese sinkt auf ~ 33% Wiederherstellung der ursprünglichen Bevölkerung nach fünf Runden des Wachstums und Sortier, wenn nur 80% der markierten Zellen Mutter erholenbei jeder Art ed. Messung und Maximierung der Wiederherstellung ist von entscheidender Bedeutung bei der Messung niedriger Frequenz Veranstaltungen, seit zwei bis dreifache Abnahme der Populationsgröße könnte leicht zu unzuverlässigen Zahlen von mutierten Kolonien pro Bevölkerung führen.
Es gibt zahlreiche Möglichkeiten für die Erweiterung oder Änderung auf dieses Protokoll, um ein breiteres Verständnis der Genominstabilität während der mitotischen Zellalterung zu erhalten. Einfache Beispiele sind die Analyse, wie Veränderungen in der Gen-Funktionen, Medienwechsel, oder andere Umweltzustand ändert nichts an der Anhäufung von Mutationen mit dem Alter. Mutationsraten für junge Zellen mit veränderten Gen-Funktion oder in der entsprechenden Bedingung wäre gemessen und verwendet, um zu bestimmen, ob Mutationen ansammeln anders als durch die Frequenzwerte vorhergesagt und anders als in der Kontrollzellpopulationen werden. Zellpopulationen in verschiedenen Punkten während replikative Alterung könnte, spezifische Belastungen, wie reaktive Sauerstoffspezies oder DNA-schädigende Mittel ausgesetzt werden. Einvorübergehend und mild Exposition gegenüber oxidativem Stress im Wesentlichen nicht die Fähigkeit zur Zellsortierung (3) durchführen zu verändern, aber härteren Beanspruchungen kann die Wiederherstellung von Zellen zu erschweren. Vorversuche notwendig wäre, um zu überprüfen, dass Mutterzellen noch effizienter nach spezifischen Belastungen zurückgewonnen werden. Zusätzlich könnte die zelluläre Eigenschaften der isolierten Mutterzellen im Detail analysiert werden, einschließlich der Stufen von reaktiven Sauerstoffspezies, mitochondriale und Vakuolenmorphologie und andere physiologische Eigenschaften, die mit der Alterung 3 zugeordnet sind. Außerdem könnten die Mutterzellen eine Ausgangspopulation für eine weitere Behandlung oder Manipulation. Da Mutter und Tochterzellen physikalisch während des Verfahrens abgetrennt, werden die Tochterzellen auch noch für die Analyse verfügbar. Beispielsweise ändert in physiologischen Eigenschaften der Tochterzellen oder der asymmetrischen Vererbung von Makromolekülen zwischen Hefe beschädigt Mutter und Tochterzellen <sbis> 24 könnte der Zeitpunkt, wann interessante Veränderungen in Mutationsfrequenzen / Raten verglichen werden. Mutation Frequenzen für Tochter Zellpopulationen könnten auch in Ordnung erhalten werden, um zu versuchen zu modellieren, ob es asymmetrischen Vererbung von Mutationen während der replikativen Alterung. Zusammenfassend kombiniert Anreicherung von Mutterzellen durch magnetische Zellsortierung mit Schwankung Tests können die Vorteile der S. cerevisiae Modellsystem, um effizient zu untersuchen Mechanismen zur Akkumulation von genetischen Veränderungen während der mitotischen Zellalterung verantwortlich angewendet werden.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde teilweise durch Gewährung R00AG031911 aus dem National Institute on Aging der National Institutes of Health unterstützt zu PHM Der Inhalt dieses Artikels gibt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | 100mg |
Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | 2ml MicroBeads conjugated to monoclonal mouse anti-biotin antibodies (isotype: mouse IgG1) |
MACS LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | 25 columns suitable for QuadroMACS separator |
QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | Separator Only |
QuadroMACS Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-091-051 | Includes: QuadroMACS Separator (130-090-976), MACS MultiStand (130-042-303), LS Columns (130-042-401), MACS 15ml Tube Rack (130-091-052), One 2ml unit of MACS MicroBeads. Note: Alternative systems include Dynabeads Biotin Binder and MagnaBind Magnetic Beads |
BD Falcon Cell Strainer, 40 µm | BD Biosciences | 352340 | 40 µm for use with BD Falcon 50 ml Conical Tubes. 50 per pack |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | Powder, filtering after dissolving important to remove particulates |
Wheat germ agglutinin Alexa Fluor488 | Life Technologies | W11261 | Conjugates with different excitation/emission spectra could also be used |
ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36930 | 10 ml, other antifade reagents could also be used |