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Biology

माँ कोशिकाओं और अस्थिरता टेस्ट के चुंबकीय छंटनी के संयोजन में mitotic सेल उम्र बढ़ने के दौरान जीनोम अस्थिरता का विश्लेषण करने के लिए Published: October 16, 2014 doi: 10.3791/51850
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Rensselaer Polytechnic Institute

Summary

अस्थिरता परीक्षण के माध्यम से मापा युवा Saccharomyces cerevisiae कोशिकाओं में उत्परिवर्तन दर अलग replicative उम्र की मां की कोशिकाओं के लिए उत्परिवर्तन आवृत्तियों की भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. चुंबकीय छंटनी और प्रवाह cytometry तो भविष्यवाणी उत्परिवर्तन आवृत्तियों से किसी भी विचलन की पहचान करने के लिए वास्तविक उत्परिवर्तन आवृत्तियों और मां कोशिकाओं की उम्र को मापने के लिए उपयोग किया जाता है.

Abstract

Saccharomyces cerevisiae तंत्र और जीनोम अस्थिरता के परिणामों की जांच के लिए एक शानदार मॉडल प्रणाली की गई है. डीएनए की मरम्मत और डीएनए की क्षति की प्रतिक्रिया कारकों अच्छी तरह से विविध प्रजातियों भर में संरक्षित कर रहे हैं के बाद से यह खमीर मॉडल से प्राप्त सूचना, मानव सहित कई जीवों के लिए प्रासंगिक है. हालांकि, एस cerevisiae अभी तक पूरी तरह से है कि क्या बढ़ती उम्र के replicative (mitotic) के साथ म्यूटेशन परिवर्तन जमते की दर की वजह से तकनीकी बाधाओं को संबोधित करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया. उदाहरण के लिए, micromanipulation के माध्यम से खमीर replicative उम्र की माप दुर्लभ उत्परिवर्तन का पता लगाने के निषेध जो कोशिकाओं की बहुत छोटी आबादी, शामिल है. बेटी कोशिकाओं की मौत उत्प्रेरण द्वारा आबादी में मां की कोशिकाओं के लिए समृद्ध करने के लिए जेनेटिक तरीके विकसित किया गया है, लेकिन जनसंख्या आकार अभी भी चयन प्रणाली समझौता है कि यादृच्छिक म्यूटेशनों होते हैं जिसके साथ आवृत्ति द्वारा सीमित हैं. मौजूदा प्रोटोकॉल चुंबकीय sorti का लाभ लेता हैसतह लेबल खमीर माँ कोशिकाओं की एनजी प्ररूपी चयन के माध्यम से दुर्लभ उत्परिवर्तन यों मां कोशिकाओं की उम्र बढ़ने की काफी बड़ी आबादी प्राप्त करने के लिए. अस्थिरता परीक्षण के माध्यम से मापा उत्परिवर्तन दरों,, और उत्परिवर्तन आवृत्तियों पहले युवा कोशिकाओं के लिए स्थापित किया गया और विभिन्न replicative उम्र की मां की कोशिकाओं में उत्परिवर्तन की आवृत्ति की भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. उत्परिवर्तन आवृत्तियों तो हल मां की कोशिकाओं के लिए निर्धारित कर रहे हैं, और मां कोशिकाओं की उम्र कोशिका विभाजन के दौरान उनके सेल सतहों पर गठित कली निशान का पता लगाता है कि एक फ्लोरोसेंट अभिकर्मक साथ धुंधला द्वारा प्रवाह cytometry का उपयोग निर्धारित किया जाता है. प्रयोगात्मक एक दिया replicative उम्र की मां की कोशिकाओं के लिए मनाया आवृत्तियों के लिए कोशिका विभाजन की संख्या के आधार पर भविष्यवाणी की उत्परिवर्तन आवृत्तियों की तुलना करें तो जमते म्यूटेशन की दर में उम्र से संबंधित परिवर्तन कर रहे हैं कि क्या की पहचान कर सकते हैं. इस बुनियादी प्रोटोकॉल के बदलाव विशिष्ट जीन कार्यों में परिवर्तन के प्रभाव की जांच के लिए साधन उपलब्ध कराने याउत्परिवर्तन संचय पर विशेष पर्यावरण की स्थिति replicative उम्र बढ़ने के दौरान अंतर्निहित तंत्र जीनोम अस्थिरता को संबोधित करने के लिए.

Introduction

ऐसे खमीर के रूप में सूक्ष्मजीवों, उत्परिवर्तन दरों की जांच के लिए उत्कृष्ट मॉडल हैं, लेकिन इन मॉडलों को पूरी तरह से कोशिकाओं की mitotic उम्र बढ़ने के दौरान म्यूटेशन के संचय की जांच करने के लिए उपयोग नहीं किया गया है. परमाणु जीनोम में उत्परिवर्तन संचय जीन कार्यों 1 (में या भिन्नता) प्रगतिशील के नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप से उम्र बढ़ने के लिए योगदान करने की धारणा रही है. बहुत क्योंकि सतही आनुवंशिक प्रणालियों की इस प्रक्रिया को प्रभावित करने आनुवांशिक और पर्यावरणीय कारकों की पहचान और सूक्ष्मजीवों में दुर्लभ प्ररूपी परिवर्तन बढ़ाता की आसानी तेजी लाने सकता उम्र बढ़ने के दौरान तंत्र और उत्परिवर्तन संचय के परिणामों का अध्ययन करने के लिए एक सूक्ष्म प्रणाली का उपयोग करने की क्षमता. डीएनए की मरम्मत कारकों और डीएनए की क्षति प्रतिक्रिया प्रोटीन अच्छी तरह से विविध प्रजातियों 2 भर में संरक्षित कर रहे हैं, और जीवधारी बुढ़ापे में मौलिक समानता एस के रूप में विविध जीवों के लिए पहचान की गई है cerevisiae एकयह संभावना है कि बनाने डी स्तनधारियों 3, खमीर में अध्ययन से प्राप्त परिणामों कई जीवों में उम्र बढ़ने के लिए प्रासंगिक हो जाएगा.

एस में उम्र बढ़ने के अध्ययन cerevisiae कालानुक्रमिक उम्र बढ़ने या कोशिकाओं के replicative उम्र बढ़ने उपाय है कि दो उम्र बढ़ने के मॉडल का इस्तेमाल करते हैं. कालानुक्रमिक उम्र बढ़ने की वजह से पोषक तत्व की कमी से 3 एक गैर विभाजित राज्य (स्थिर चरण) में हैं कि खमीर सेल आबादी में व्यवहार्यता के प्रगतिशील नुकसान की विशेषता है. कालानुक्रमिक उम्र बढ़ने मॉडल बड़े सेल आबादी आसानी से उत्परिवर्ती कोशिकाओं के लिए प्ररूपी चयन करने के लिए इस मॉडल में प्राप्त कर रहे हैं के बाद से म्यूटेशन, 4 साल की उम्र बढ़ाने के साथ जमा दिखाना है कि इस्तेमाल किया गया है. इस मामले में, उत्परिवर्तन संचय विकास संकेत दे रास्ते और oxidative तनाव 5 से प्रभावित हो गया लगता है, और इन कारकों में से प्रत्येक बहुकोशिकीय यूकैर्योसाइटों 3 में उम्र बढ़ने की समझ के लिए प्रासंगिक है. replicative उम्र बढ़ने मॉडल असममित divisi कारनामेएस के बीच पर लगातार सेल पीढ़ियों 3 के साथ होता है कि उम्र बढ़ने की जांच के लिए cerevisiae मां और बेटी की कोशिकाओं. खमीर replicative उम्र बढ़ने अक्सर microfluidic उपकरणों 6,7 में खमीर कोशिकाओं के छोटे आबादी के वीडियो माइक्रोस्कोपी के माध्यम से मां और बेटी की कोशिकाओं, या अभी हाल ही में की छोटी आबादी के micromanipulation के माध्यम से मापा गया है. सीमित जनसंख्या आकार पूरे जीनोम जानकारी एकल कक्षों से प्राप्त होता है या बहुत ही उच्च आवृत्ति आनुवंशिक परिवर्तन 8 मापा जाता है जब तक कि mitotic उम्र बढ़ने के दौरान उत्परिवर्तन संचय की जांच के लिए इन तरीकों खराब अनुकूल बनाते हैं. एकल कक्षों के पूरे जीनोम अनुक्रमण उत्परिवर्तन संचय की जांच के लिए पर्याप्त डेटा सेट प्रदान करता है, लेकिन प्ररूपी चयन प्रणाली तंत्र अंतर्निहित उत्परिवर्तन संचय का अध्ययन करने के उत्परिवर्तन दर को मापने का एक साधन उपलब्ध कराने के महत्वपूर्ण लाभ है. अध्ययन haploi में प्ररूपी चयन के माध्यम से उत्परिवर्तन आवृत्तियों और दरों की जांच करने के लिएreplicative उम्र बढ़ने के दौरान डी खमीर उपभेदों अभी तक रिपोर्ट नहीं किया गया है.

उत्परिवर्तन दरों सामान्यतः अस्थिरता परीक्षण 9 का उपयोग कर मापा जाता है. उत्परिवर्तन आवृत्ति मूल्यों एक जनसंख्या में एक जीन अनुक्रम में एक उत्परिवर्तन शरण कोशिकाओं की कुल संख्या दर्शाते हैं. यह स्वतंत्र म्यूटेशन होते हैं जिसमें कोशिकाओं और बस पहले से मौजूद म्यूटेशनों वारिस कि उन कोशिकाओं के किसी भी संतान भी शामिल है. इसके विपरीत, अस्थिरता परीक्षण के माध्यम से मापा उत्परिवर्तन दरों नव प्रत्येक कोशिका पीढ़ी के साथ उठता है कि स्वतंत्र म्यूटेशन की संख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं. इन परीक्षणों को आम तौर पर, एक लक्ष्य अनुक्रम में पहले से मौजूद म्यूटेशनों के साथ कोशिकाओं को जोड़ने के पास संतृप्ति संस्कृतियों बढ़ रही है, और चयनात्मक माध्यम पर विकास द्वारा उत्परिवर्ती कोशिकाओं की पहचान करने की संभावना को कम करने के लिए कम सेल घनत्व में कई दोहराने संस्कृतियों inoculating शामिल है. दोहराने की आबादी में पहचान उत्परिवर्ती कोशिकाओं की संख्या तो मैं की संख्या का अनुमान लगाने के लिए कई गणितीय मॉडलों में से एक में इस्तेमाल किया जाता हैविकास 9 के दौरान पैदा हुई कि ndependent म्यूटेशन. औसत जनसंख्या आकार के लिए स्वतंत्र म्यूटेशन की संख्या की तुलना उत्परिवर्तन दर का एक उपाय प्रदान करता है. एस में इन जीनों में नुकसान के समारोह म्यूटेशनों चयन phenotypes उत्पादन के बाद से cerevisiae, उत्परिवर्तन आवृत्तियों और दरों अक्सर, URA3 और CAN1 जीन का उपयोग कर मापा जाता है. URA3 द्वारा इनकोडिंग प्रोटीन एक जहरीले अणु 10 में 5 FOA धर्मान्तरित के बाद URA3 समारोह की हानि, 5 fluoroorotic एसिड (5 FOA) के लिए प्रतिरोधी कोशिकाओं प्रदान करता है. CAN1 द्वारा इनकोडिंग प्रोटीन कोशिकाओं 11 में arginine और canavanine transports के बाद CAN1 के समारोह की हानि, कोशिकाओं canavanine, एक जहरीले arginine अनुरूप करने के लिए प्रतिरोधी बनने के लिए अनुमति देता है.

दोनों आनुवंशिक और भौतिक छँटाई रणनीतियों को सफलतापूर्वक एस की बड़ी आबादी को प्राप्त करने के लिए नियोजित किया गया है cerevisiae मां कोशिकाओं replicative उम्र बढ़ने के जांच की सुविधा के लिए. जेनेटिक रणनीतियों एक जनसंख्या में बेटी सेल अस्तित्व के खिलाफ चयन कि चालाक दृष्टिकोण शामिल हैं. मां संवर्धन कार्यक्रम (एमईपी) loxP साइटों 12 को शामिल करने के लिए इंजीनियर थे कि दो आवश्यक जीन की बेटी विशिष्ट विघटन के लिए अग्रणी, केवल बेटी कोशिकाओं में Cre recombinase अभिव्यक्ति की बीटा एस्ट्राडियोल प्रेरण शामिल है. एमईपी उपभेदों inducer के अभाव में सामान्य रूप से उगाया जा सकता है, लेकिन केवल माँ कोशिकाओं बेटी कोशिकाओं सेल चक्र 12 के माध्यम से अपनी पहली प्रगति के दौरान आम तौर पर एम चरण में गिरफ्तार करेगी, जबकि प्रेरण निम्नलिखित विभाजित करने के लिए जारी रहेगा. इस प्रणाली को मोटे तौर पर उम्र बढ़ने के दौरान उत्परिवर्तन संचय अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया है, यह उम्र बढ़ने माता कोशिकाओं 13,14 में heterozygosity की हानि, द्विगुणित खमीर उपभेदों में जीनोम अस्थिरता का एक अपेक्षाकृत लगातार फार्म, साथ ही जैव रासायनिक परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इसी तरह, बेटी बन्दी प्रणाली एस की बेटी विशिष्ट अभिव्यक्ति शामिल cereviSIAE URA3 जीन 15. 5 FOA जिस पर URA3 व्यक्त बिंदु बेटी कोशिकाओं मर जाएगा, माध्यम से जोड़ा गया है जब तक माँ कोशिकाओं 15 बढ़ती रहेगी, जबकि बेटी बन्दी उपभेदों, सामान्य रूप से हो जाना. ये मां की कोशिकाओं के लिए समृद्ध करने के लिए उपयोगी व्यवस्था कर रहे हैं, लेकिन वे चयन प्रणाली का गठन कि जीन कार्यों के रखरखाव पर निर्भर करते हैं. चयन प्रणाली की एक या अधिक घटकों में यादृच्छिक म्यूटेशनों चयन बचने के लिए और तेजी से पैदा करना है कि बेटी कोशिकाओं में हो सकता है. एमईपी उपभेदों के विकास के दौरान, उचित जनसंख्या आकार चयन 12 से बच सकता है कि उत्परिवर्ती बेटी कोशिकाओं की उपस्थिति से बचने के लिए निर्धारित किया गया. हालांकि, जनसंख्या के आकार में इस सीमा replicative उम्र बढ़ने के दौरान जीनोम अस्थिरता के दुर्लभ रूपों का पता लगाने समझौता. जनसंख्या के आकार पर यह प्रतिबंध आंशिक रूप से प्रत्येक जीन की दो प्रतियां अधिकांश के बाद से, चयन प्रणाली में योगदान करने के साथ द्विगुणित खमीर उपभेदों का उपयोग करके दूर किया जा सकता हैम्यूटेशन की संभावना 12 हटने का होगा. हालांकि, द्विगुणित उपभेदों का उपयोग आसानी से आसानी से अगुणित खमीर कोशिकाओं में पता लगाया जा सकता है कि उन लोगों की तुलना से पता लगाया जा सकता है कि mutational घटनाओं के प्रकार constrains.

शारीरिक छँटाई रणनीतियों मां कोशिकाओं की बड़ी आबादी के लिए समृद्ध करने के लिए unlabeled बेटी कोशिकाओं से एक लेबल कोशिका की सतह के साथ मां की कोशिकाओं का अलगाव शामिल हैं. एस की कोशिका की सतह प्रोटीन कि अवलोकन (सेल दीवार प्रोटीन) cerevisiae बेटी कोशिकाओं नव वे 16 उपज कि बेटी कोशिकाओं लेबलिंग के बिना मां कोशिकाओं लेबल दोहन किया गया है नवोदित दौरान संश्लेषित कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, बायोटिन के साथ उनकी सतह पर लेबल खमीर कोशिकाओं की एक शुरुआती जनसंख्या उगाया जा सकता है और उसके बाद प्रारंभिक आबादी से उत्पन्न बेटी कोशिकाओं उनकी सतह पर बायोटिन शामिल नहीं होंगे क्योंकि 16 छँटाई विरोधी बायोटिन microbeads और चुंबकीय उपयोग कर अपनी बेटी की कोशिकाओं से अलग . सीरियल विकास औरछंटनी मां कोशिकाओं की उत्तरोत्तर बड़ी आबादी प्राप्त की और विश्लेषण किया जा सकता है. यह प्रक्रिया खमीर 13,14,17,18 के replicative उम्र बढ़ने के दौरान सेल शरीर विज्ञान और जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन की जांच करने के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है. वर्तमान विधि संभावित दुर्लभ उत्परिवर्तन या प्ररूपी चयन के माध्यम से assayed जीनोम अस्थिरता के अन्य रूपों के संचय को मापने के उद्देश्य के साथ मां की कोशिकाओं के लिए समृद्ध करने के लिए इस बायोटिन लेबलिंग और चुंबकीय छँटाई तकनीक adapts. सीरियल विकास और भौतिक छँटाई उत्तरोत्तर पुराने माँ कोशिकाओं में उत्परिवर्तन संचय का विश्लेषण, साथ ही साथ में उनकी बेटी सेल आबादी अनुमति देते हैं. पीढ़ी प्रति उत्परिवर्तन दरों का निर्धारण एक भविष्यवाणी उत्परिवर्तन आवृत्ति कोशिका विभाजन की एक विशेष नंबर आया है कि मां की कोशिकाओं के लिए गणना करने के लिए अनुमति देता है. भविष्यवाणी की आवृत्ति मूल्यों की वजह से मनाया mutati में कोशिका विभाजन के अतिरिक्त फेरे, पर्याप्त विचलन के लिए वृद्धि की संभावना के आधार पर कर रहे हैंभविष्यवाणी मूल्यों की तुलना आवृत्तियों पर जमते म्यूटेशन की दर में उम्र विशेष परिवर्तन के लिए सबूत प्रदान करते हैं. इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, फ्लो द्वारा विश्लेषण के साथ मिलकर मां की कोशिकाओं पर सेल डिवीजनों की साइटों के लिए संगत कली निशान की फ्लोरोसेंट धुंधला जल्दी हल और unsorted आबादी की उम्र वितरण निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ऐसे प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया उन लोगों के रूप में अतिरिक्त फ्लोरोसेंट अभिकर्मकों,, भी इस प्रोटोकॉल के दौरान उपयोग किया जा सकता है. कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल उम्र बढ़ने से संबंधित जीनोम अस्थिरता को प्रभावित है कि आनुवांशिक और पर्यावरणीय कारकों का अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल एक मॉडल जीव में उम्र से संबंधित सेल शारीरिक परिवर्तन के लिए सहसंबंध के लिए क्षमता के साथ जीनोम अस्थिरता में उम्र पर निर्भर परिवर्तन के कुशल विश्लेषण में सक्षम बनाता है.

Protocol

मीडिया और समाधान के 1 तैयारी

  1. खमीर निकालने-peptone ग्लूकोज (YPD) मानक प्रोटोकॉल के लिए अमीर माध्यम का उपयोग कोशिकाओं को विकसित. एक 2% bacto-peptone, 1% खमीर निकालने, YPD माध्यम के लिए 2% ग्लूकोज समाधान तैयार है और ठोस मध्यम 19 के लिए 2% bacto-अगर जोड़ें. बाँझ आटोक्लेव. एक विशेष विकास हालत या उत्परिवर्ती खमीर तनाव परीक्षण करने के लिए, अगर जरूरत है, एक विकल्प के माध्यम का उपयोग.
  2. Canavanine प्रतिरोधी म्यूटेंट के लिए चयन करने के लिए 60 मिलीग्राम / एल canavanine (अनुसूचित ARG + canavanine) के साथ arginine कमी ठोस सिंथेटिक पूरा मध्यम बनाओ. Arginine (ख़ारिज मिक्स) बिना अमीनो एसिड, 2% ग्लूकोज, 0.2% पूर्ण पूरक मिश्रण के बिना 0.67% bacto-खमीर नाइट्रोजन आधार है, और 2% bacto, अगर 19 है कि एक समाधान तैयार है. आटोक्लेव और एक 20 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान से canavanine जोड़ने के लिए शांत पूर्व 19 (4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत, फिल्टर निष्फल).
    1. 5 fluoroorotic एसिड (5 FOA) युक्त ठोस सिंथेटिक पूरा मध्यम बनाओ. 500 तैयारअमीनो एसिड के बिना 1.34% bacto-खमीर नाइट्रोजन बेस के साथ, 4% ग्लूकोज, 0.4% पूर्ण पूरक मिश्रण, और 0.2% 5 FOA और है कि एक समाधान के मिलीलीटर 19 फिल्टर बाँझ. तो आटोक्लेव 500 4% bacto-अगर समाधान के मिलीलीटर, शांत संक्षेप में, और 500 मिलीलीटर फिल्टर निष्फल पोषक तत्व समाधान के साथ मिश्रण. अन्य उत्परिवर्तन assays के लिए उपयुक्त वैकल्पिक मीडिया का प्रयोग करें.
  3. बायोटिन लेबलिंग के लिए, 500 मिलीलीटर 1x फॉस्फेट 137 मिमी सोडियम क्लोराइड, 2.7 मिमी पोटेशियम क्लोराइड, 10.14 मिमी सोडियम फास्फेट द्विक्षारकीय, और 1.77 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट द्विक्षारकीय, पीएच युक्त बफर खारा (पीबीएस) समाधान 8 स्टोर में 4 डिग्री सेल्सियस बनाने और पर रखना प्रयोग के दौरान बर्फ.
  4. बाँझ, ultrapure पानी में एक ताजा 5 मिमी बायोटिन शेयर करें.
  5. , बायोटिन लेबलिंग बुझाने 1x पीबीएस के 500 मिलीलीटर, 100 मिमी ग्लाइसिन करना. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर और उपयोग के दौरान बर्फ पर रहते हैं.
  6. इस्तेमाल कोशिकाओं और प्रयोग की अवधि की संख्या पर निर्भर करता है, 1x पीबीएस, 2 मिमी EDTA, 0.5% BOVI युक्त मनका लेबलिंग बफर के 1-2 एल बनानापूर्वोत्तर सीरम albumin. बाँझ फ़िल्टर और de-गैस बफर. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर और उपयोग के दौरान बर्फ पर रहते हैं.
  7. सेल व्यवहार्यता माप में प्रयोग के लिए आरटी पर एक 1x पीबीएस में 0.4% trypan नीले समाधान, बाँझ फ़िल्टर, और दुकान तैयार करें.
  8. एक गेहूं के बीज agglutinin (WGA) फ्लोरोसेंट एकत्रित की विभाज्य छोटे संस्करणों (~ 100 μl) सेल उम्र का निर्धारण करने के लिए उपयोग में लिपटे पन्नी (या अपारदर्शी) microcentrifuge ट्यूबों में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए.

उत्परिवर्तन दर और आवृत्ति के 2 निर्धारण

  1. मानक संस्कृति परिस्थितियों में विकसित कोशिकाओं के लिए अस्थिरता परीक्षण का उपयोग सेल पीढ़ी प्रति एक आधारभूत उत्परिवर्तन दर स्थापित करना. ग्यारह जल्दी स्थिर चरण (~ 10 8 सेल / एमएल) के लिए 1,000-5,000 कोशिकाओं / एमएल की एक शुरुआती घनत्व से 1 मिलीलीटर संस्कृतियों को दोहराने के लिए सात बड़े हो जाओ.
    1. 2,000 और कॉलोनी के गठन इकाइयों / मिलीलीटर निर्धारित करने के लिए गैर चयनात्मक मध्यम (YPD) पर 1-4 μl फैल: प्रत्येक दोहराने संस्कृति के लिए, कोशिकाओं 1 पतला. गोली ~ 2400 X पर कोशिकाओं शेष100 μl पानी में एक microcentrifuge और resuspend में 1 मिनट के लिए जी म्यूटेंट की पहचान करने में चयनात्मक माध्यम पर प्रसार करने के लिए. कालोनियों की गिनती करने से पहले 30 डिग्री सेल्सियस से कम तीन दिनों (कोशिकाओं की वृद्धि दर के आधार पर जरूरत के रूप में ऊष्मायन समय समायोजित) के लिए प्लेटें सेते हैं.
    2. चयनात्मक माध्यम पर प्राप्त उत्परिवर्ती कालोनियों (आर) की संख्या के आधार पर परीक्षण में हुई है कि स्वतंत्र म्यूटेशन (एम) की संख्या निर्धारित करते हैं. 9 नीचे सूत्र में अनुसंधान के लिए उत्परिवर्ती कालोनियों की औसत संख्या प्रतिस्थापन द्वारा मीटर लगाने के लिए घास का मैदान-Coulson मंझला अनुमानक का उपयोग करें. समीकरण के बाईं ओर लगभग शून्य है तो जब तक मीटर के लिए मूल्यों स्थानापन्न.
      समीकरण 1
    3. उत्परिवर्तन दर निर्धारित करने के लिए, पहली बार दोहराने संस्कृतियों और मात्रा की औसत कॉलोनी के गठन इकाइयों / मिलीलीटर गुणा करके चयनात्मक माध्यम पर फैल व्यवहार्य कोशिकाओं की औसत संख्या की गणनाचयनात्मक माध्यम पर मिलीलीटर प्रसार में संस्कृति की. सेल पीढ़ी प्रति उत्परिवर्तन दर प्राप्त करने के लिए व्यवहार्य कोशिकाओं की इस औसत संख्या से कदम 2.1.2 से एम मूल्य फूट डालो.
  2. कदम 2.1.3 में वर्णित के रूप में व्यक्तिगत रूप से एक परीक्षण में प्रत्येक को दोहराने संस्कृति के लिए चयनात्मक माध्यम पर फैल व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या की गणना. उत्परिवर्तन आवृत्ति प्राप्त करने के लिए चयनात्मक माध्यम पर फैल व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या से एक संस्कृति के लिए प्राप्त उत्परिवर्ती कालोनियों (आर) की संख्या फूट डालो. एक आधारभूत उत्परिवर्तन आवृत्ति के रूप में 2.1 कदम में दोहराने संस्कृतियों से व्यक्ति उत्परिवर्तन आवृत्तियों का औसत या मंझला का प्रयोग करें.
  3. उत्परिवर्तन संचय में उम्र विशेष बदलाव के लिए जब परीक्षण की आवश्यकता होगी कि म्यूटेशन की आवृत्ति में कोई बदलाव में लेबलिंग कदम परिणामों पर विचार किया जाना निर्धारित करने के लिए बायोटिन लेबलिंग कोशिकाओं (3.2 और 3.4 कदम) से पहले और बाद आवृत्ति माप करना.

3 बायोटिन लेबल

  1. सेंटReak एस cerevisiae YPD माध्यम पर -80 डिग्री सेल्सियस पर एक ग्लिसरॉल शेयर से और 1-3 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  2. एक बाँझ पिपेट टिप का उपयोग, पानी रखने के 1 मिलीलीटर (या अधिक) के लिए लकीर थाली से स्थानांतरण कोशिकाओं मन में लकीर के एक घनी हो गई हिस्से की 1-1.5 सेमी लगभग 10 8 कोशिकाओं देंगे. एक hemocytometer का उपयोग सटीक सेल घनत्व का निर्धारण करते हैं.
  3. तनाव (या उपचार हालत) संग्रह बिंदु प्रति उत्परिवर्तन आवृत्ति निर्धारित किया जाएगा, जिस पर या चयनात्मक माध्यम पर नमूने के अनुसार कम से कम 5-10 उत्परिवर्ती कालोनियों प्राप्त करने के लिए पर्याप्त आबादी के आकार के अनुसार 10 8 कोशिकाओं लेबल (2.2 कदम से उत्परिवर्तन आवृत्ति के आधार पर). तनाव / हालत प्रति आधारभूत माप के लिए एक अतिरिक्त 10 8 कोशिकाओं में शामिल हैं.
  4. निर्माता से, एक 5 मिमी बायोटिन अभिकर्मक स्टॉक का उपयोग करें और धीरे ऊष्मायन के दौरान रॉक छोड़कर मानक प्रक्रिया के अनुसार बायोटिन लेबल. सभी centrifugation कदम के लिए 3000 XG में 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए स्पिन, एस4 डिग्री सेल्सियस से अधिक तापमान पर कताई ince वृद्धि हुई सेल हानि हो सकती है. अंतिम धोने के बाद पानी में 10 8 लेबल कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता के लिए कोशिकाओं को निलंबित.
  5. Trypan नीले रंग धुंधला का उपयोग कोशिकाओं की व्यवहार्यता की जांच करें. पानी के 23 μl और 1x पीबीएस में 0.4% trypan नीले रंग के 67 μl के साथ कोशिकाओं के 10 μl पतला. एक hemocytometer का उपयोग लाइव (बेदाग) और मृत (दाग) कोशिकाओं स्कोरिंग से पहले आरटी पर कम से कम 40 मिनट के लिए सेते हैं.
  6. जीनोम अस्थिरता, सेल उम्र, और अन्य प्रासंगिक विशेषताओं के लिए आधारभूत मूल्यों उपाय (5 वर्गों, 6 देखते हैं, और 7).
  7. एक Erlenmeyer कुप्पी (लगभग 5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल) में 10 8 कोशिकाओं प्रति YPD माध्यम के 20 मिलीलीटर बायोटिन लेबल कोशिकाओं स्थानांतरण. 10 8 कोशिकाओं / एमएल (4-5 सेल पीढ़ियों) की एक अनुमानित घनत्व को संस्कृति (एस) 20 डिग्री सेल्सियस पर 16-18 घंटे के लिए आगे बढ़ें, लेकिन कोशिकाओं स्थिर चरण तक पहुंचने के लिए अनुमति नहीं देते हैं. 30 डिग्री सेल्सियस पर विकास के लिए एक छोटी ऊष्मायन समय का उपयोग करें. बायोटिन लेबल ग रखेंके लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एल्स ऊपर कई घंटे पूर्व मध्यम के अलावा करने के लिए, विकास अवधि और संग्रह के समय का अनुकूलन करने के लिए यदि आवश्यक हो तो.

4 मनका लेबल और चुंबकीय छंटनी

  1. विकास के चरण के बाद, एक hemocytometer का उपयोग सेल घनत्व निर्धारित करने के लिए संस्कृति का एक विभाज्य पतला. 3000 x जी पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं. सतह पर तैरनेवाला बंद डालो.
  2. तो, मनका लेबलिंग बफर के 30 मिलीलीटर में गोली निलंबित करने vortexing centrifuging और धारा 4.1 में के रूप में सतह पर तैरनेवाला बंद गिरने से कोशिकाओं को धो लें. दोहराएँ धोने.
  3. पूरी तरह से vortexing द्वारा 10 8 कुल कोशिकाओं प्रति 50 μl मनका लेबलिंग बफर में कोशिकाओं resuspend. मिश्रण को संक्षेप में 10 8 कुल कोशिकाओं और भंवर प्रति 2 μl चुंबकीय मोती जोड़ें. पर एक ऑनलाइन प्रोटोकॉल से संशोधित (मिश्रण करने के लिए समय समय पर inverting, 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेते http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf </ A>).
  4. मनका लेबलिंग बफर के 30 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को तीन बार धोएं.
  5. कोशिकाओं resuspended कर रहे हैं अभी तक मध्यम सेटिंग पर 10 8 कुल कोशिकाओं प्रति 0.5 मिलीग्राम मनका लेबलिंग बफर और संक्षेप में भंवर गोली जोड़ें. किसी भी शेष सेल clumps को दूर करने के लिए एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में एक 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से डालो. यदि आवश्यक हो, पूर्व स्तंभ पर लोड हो रहा है 1-2 घंटे के लिए बर्फ पर कोशिकाओं छोड़ दें.
  6. चुंबकीय कॉलम, बाँध धोने, और चुंबकीय मनका लेबल मां कोशिकाओं elute करने के लिए निर्माता की सिफारिश प्रोटोकॉल का पालन करें. लेबल की कोशिकाओं की वृद्धि की वसूली के लिए, 2 एक्स 10 9 कुल कोशिकाओं के अनुसार कम से कम एक स्तंभ का उपयोग करें.
    1. वे प्रवाह रोकेंगे के रूप में, कॉलम लोड करते पाए जाते हैं कि किसी भी बुलबुले निकालें. निकालें और पर एक ऑनलाइन प्रोटोकॉल से संशोधित मोती (बीच में फंस बनने से कोशिकाओं को रोकने के लिए washes के बीच विभाजक पर कॉलम की जगह http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf).
    2. अगर वांछित, मां कोशिकाओं द्वारा उत्पादित युवा कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए बाध्यकारी और धोने कदम से प्रवाह के माध्यम से बचाने के लिए. कदम 4.7 में वर्णित के रूप में कोशिकाओं ध्यान लगाओ.
    3. एक ही बार में कई नमूने के प्रसंस्करण के लिए बहु स्तंभ विभाजकों का प्रयोग करें. एक ही संग्रह ट्यूब में ही नमूने के Elute एकाधिक स्तंभों समय से निपटने को कम करने और कोशिकाओं के नुकसान को कम करने के लिए.
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 3000 XG पर centrifuging द्वारा eluted मां कोशिकाओं ध्यान लगाओ. महाप्राण 1 लेकिन सभी 10 8 मूल बायोटिन लेबल कोशिकाओं प्रति बफर एमएल. भंवर संक्षिप्त बफर शेष में कोशिकाओं को निलंबित करने के लिए.
  8. कोशिकाओं के एक विभाज्य पतला और सेल घनत्व और एक hemocytometer का उपयोग सेल व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए trypan नीले रंग के साथ दाग (3.5 कदम देखें). बरामद कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना.
    1. कोशिकाओं की संख्या अपेक्षा से काफी अधिक है, तो युवा कोशिकाओं contaminating दूर करने के लिए प्रयास करने के लिए एक और स्तंभ के माध्यम से क्षालन नमूना गुजरती हैं.कोशिकाओं की संख्या अपेक्षा से काफी कम है, तो मां कोशिकाओं की उपज में सुधार करने के लिए प्रयास करने के लिए एक और स्तंभ के माध्यम से नमूना के माध्यम से बचाया प्रवाह गुजरती हैं.
  9. 5 वर्गों और वैकल्पिक रूप से 6 में वर्णित के रूप में बिना, फिर उनके replicative उम्र (कदम 3.7) को बढ़ाने और मनका लेबलिंग और (चरणों 4.1-4.8.1) छँटाई द्वारा पालन करने के लिए YPD शोरबा में कोशिकाओं को विकसित, आगे के विश्लेषण के लिए कोशिकाओं का प्रयोग करें बायोटिन लेबलिंग दोहराने की जरूरत है.

Replicative आयु के 5 निर्धारण

  1. इस खंड में सभी चरणों के लिए आरटी पर 5000 XG पर 2 मिनट के लिए कोशिकाओं स्पिन. एक 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में बरामद कोशिकाओं (~ 10 8 कोशिकाओं / एमएल) की 25 μl रखो और पीबीएस 1x 1 मिलीलीटर के साथ दो बार धो लें. सतह पर तैरनेवाला बंद aspirate.
    1. WGA-एकत्रित की एक विभाज्य पिघलना, भंवर मिश्रण है, और प्रोटीन समुच्चय को खत्म करने के लिए संक्षेप में स्पिन करने के लिए. वीं की सतह पर कली निशान लेबल करने के लिए पीबीएस 1x 180 μl और एक फ्लोरोसेंट अणु संयुग्मित WGA के 20 μl में कोशिकाओं निलंबितई कोशिकाओं. पन्नी के साथ 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब कवर और कोमल 30 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर कमाल के साथ सेते हैं.
    2. 1 मिलीलीटर 1X पीबीएस के साथ तीन बार धोएं.
  2. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी, लेबल स्लाइड और के लिए एक विरोधी फीका एजेंट का उपयोग कर मानक प्रोटोकॉल के अनुसार माउंट. पूरी तरह इमेजिंग के दौरान सेल आंदोलन से बचने के लिए coverslip सील से पहले अंधेरे में (कुछ दिनों के लिए) स्लाइड इलाज. सेल उम्र के एक प्रतिनिधि के उपाय प्राप्त करने के लिए नमूना के अनुसार कम से कम 50 कोशिकाओं पर कली निशान गणना. ऊपर अगर जरूरत, कली निशान को देखने के लिए महीने 1 के लिए स्टोर स्लाइड.
    1. वैकल्पिक रूप से, कदम 5.1.2 के बाद पीबीएस 1x 1 मिलीलीटर में निलंबित कोशिकाओं पर प्रवाह cytometry प्रदर्शन से WGA-साधना से फ्लोरोसेंट संकेत की तीव्रता का निर्धारण. WGA-एलेक्सा 488. के ​​लिए एक 505 एनएम लंबी पास फिल्टर के साथ एक 405 एनएम उत्तेजना लेजर और 530/30 एनएम उत्सर्जन फिल्टर का प्रयोग करें प्रत्येक संग्रह बिंदु के लिए एक बेदाग नियंत्रण शामिल हैं.
  3. पर माइक्रोस्कोपी द्वारा गिना युवा कोशिकाओं और वृद्ध कोशिकाओं पर इस्तेमाल किया जा सकता कली निशानएक्स अक्ष पर एक ही सेल आबादी से WGA-एकत्रित प्रतिदीप्ति की सामान्यीकृत ज्यामितीय मतलब खिलाफ वाई अक्ष (दाग ज्यामितीय मतलब / बेदाग ज्यामितीय मतलब है). इस रिश्ते के लिए एक रेखीय प्रवृत्ति लाइन का समीकरण प्राप्त करते हैं. बाद के प्रयोगों के लिए, समीकरण में एक्स के लिए एक सेल की आबादी के WGA-एकत्रित प्रतिदीप्ति तीव्रता का सामान्यीकृत ज्यामितीय मतलब विकल्प और एक नमूना की औसत सेल उम्र निर्धारित करने के लिए y के लिए हल.

6 उत्परिवर्तन आवृत्ति

  1. कदम 2.1.1 में वर्णित के रूप में फैल YPD मध्यम और चयनात्मक माध्यम पर कदम 4.7 से बफर में resuspended मां कोशिकाओं को हल. 1 मिनट के लिए 5000 XG पर चयनात्मक मध्यम और स्पिन कोशिकाओं के लिए resuspended मां कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर का उपयोग करें.
    नोट: कोशिकाओं बड़ी आबादी में अलाभकारी और वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि के लिए क्षतिपूर्ति की उम्र में वृद्धि के रूप में YPD माध्यम पर पतला कोशिकाओं की बड़ी मात्रा में बिखरा हुआ है.
    1. YPD मध्यम और से चयनात्मक मध्यम प्लेटें सेतेक्रमशः, 3 और 4 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर 6.1 कदम. बहुत पुरानी कोशिकाओं या धीरे धीरे बढ़ रही उपभेदों के लिए एक सप्ताह के लिए ऊष्मायन समय तक बढ़ाएँ. कदम 2.2 में वर्णित के रूप में उत्परिवर्तन आवृत्ति की गणना.

7 एक दिया replicative आयु के लिए भविष्यवाणी की उत्परिवर्तन आवृत्ति की गणना

  1. प्रासंगिक प्रकार के लिए क्रमबद्ध मां कोशिकाओं की औसत आयु से प्रारंभिक सेल की आबादी की औसत उम्र घटा कर प्रयोग के पाठ्यक्रम पर बायोटिन लेबल की कोशिकाओं के replicative उम्र में औसत वृद्धि की गणना. कदम 5.2 में गणना की सेल उम्र का प्रयोग करें या 5.2.2 कदम.
  2. कदम 7.1 में गणना की औसत सेल उम्र में वृद्धि से कदम 2.1.3 में प्राप्त उत्परिवर्तन दर गुणा. प्रासंगिक replicative उम्र की कोशिकाओं के लिए भविष्यवाणी की उत्परिवर्तन आवृत्ति निर्धारित करने के लिए कदम 2.2 में गणना की प्रारंभिक आबादी के लिए आधारभूत उत्परिवर्तन आवृत्ति के लिए इस मान जोड़ें.

Representative Results

चित्रा 1 में एक प्रवाह आरेख उत्परिवर्तन दरों, आवृत्तियों, और सेल उम्र मापा जाता है, जिस पर अंक सहित प्रक्रिया के समग्र चरणों को दिखाती है. यह लेबलिंग और चुंबकीय छँटाई के लिए एक उपयुक्त जनसंख्या के आकार को चुनने के लिए आवश्यक है, क्योंकि सही रूप आवृत्ति और युवा सेल आबादी में म्यूटेशन (या जीनोम अस्थिरता का अन्य रूप) की दर का निर्धारण, एक महत्वपूर्ण पहला कदम है. दर मूल्यों अस्थिरता परीक्षण 9 का उपयोग कर स्थापित किया जा सकता है. 5 FOA करने के लिए प्रतिरोध प्रदान कि URA3 जीन में canavanine प्रतिरोध या म्यूटेशन प्रदान कि CAN1 जीन में म्यूटेशन के लिए चयनित BY4741 आनुवंशिक पृष्ठभूमि 20 में खमीर उपभेदों के लिए उदाहरण परिणाम चित्रा 2 में दिखाया गया है. प्रकोष्ठों के प्रतिनिधि के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर बड़े हो रहे थे प्रतिनिधि आवृत्ति प्रयोगों के लिए दर प्रयोगों, और 20 डिग्री सेल्सियस और 30 डिग्री सेल्सियस पर. ये तापमान प्रारंभिक सेल आबादी हो गई है क्योंकि इस्तेमाल किया गया30 डिग्री सेल्सियस पर फिर बाद में प्रतिनिधि छँटाई प्रयोगों के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर बड़े हो रहे थे. स्वतंत्र परीक्षणों से दर मूल्यों गुणसूत्र वी पर अपने सामान्य स्थान पर CAN1 जीन है जो किसी तनाव के लिए बायोटिन लेबलिंग के बाद प्रारंभिक सेल आबादी और कोशिकाओं के लिए तुलनीय थे, बाएं हाथ telomere से लगभग 32 kilobase जोड़े ( www.yeastgenome.com ) ( चित्रा 2A, लैवेंडर कॉलम). CAN1 का उत्परिवर्तन दर गुणसूत्र वी पर अपने सामान्य स्थान से CAN1 जीन के विलोपन और लगभग 25 kilobase जोड़े telomere से गुणसूत्र आठवीं के दाहिने हाथ पर CAN1 की एक प्रविष्टि है कि एक दूसरे खमीर तनाव की प्रारंभिक आबादी में काफी अधिक था 21 (चित्रा 2B). CAN1 जीन उत्परिवर्तन आवृत्तियों भी या तो विकास के तापमान पर प्रारंभिक सेल आबादी और बायोटिन लेबल की कोशिकाओं के लिए तुलनीय थे (फाईgure 2A, नीले कॉलम). हालांकि, उत्परिवर्तन आवृत्तियों 20 डिग्री सेल्सियस पर प्राप्त 30 डिग्री सेल्सियस पर उत्परिवर्तन आवृत्तियों से अधिक होना पाया गया. इस तापमान प्रभाव CAN1 जीन तक ही सीमित था कि क्या परीक्षण करने के लिए, हम गुणसूत्र आठवीं पर डाला CAN1 है कि खमीर तनाव का उपयोग 5 FOA के प्रतिरोध के लिए चयन करके URA3 में परिवर्तन मापा. यह तनाव भी गुणसूत्र वी पर अपनी सामान्य साइट से URA3 के विलोपन और गुणसूत्र आठवीं telomere 21 से लगभग 40 kilobase जोड़े के दाहिने हाथ पर URA3 की एक प्रविष्टि है. उत्परिवर्तन आवृत्तियों इस गुणसूत्र स्थान (चित्रा -2) पर भी URA3 के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर अधिक थे. कुल मिलाकर, इस विकास तापमान म्यूटेशन की आवृत्ति को प्रभावित कर सकते हैं कि यह दर्शाता है, लेकिन बायोटिन लेबलिंग उत्परिवर्तन आवृत्ति को प्रभावित करने के लिए प्रकट नहीं होता है. इसलिए, उत्परिवर्तन दर और प्रारंभिक आबादी के लिए आवृत्तियों एक ही विकास Tempe पर निर्धारित करने की आवश्यकता हैविकास और छंटनी के दौर के लिए उपयोग किया जाएगा कि rature. यह पूर्व म्यूटेशन या जीनोम rearrangements के अन्य प्रकार की जांच के लिए प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए जीनोम अस्थिरता को प्रभावित नहीं करता है कि बायोटिन लेबलिंग सत्यापित करने के लिए सलाह दी जाती है.

जैसी कि उम्मीद थी, चित्रा 2A में दिखाया उत्परिवर्तन दर मूल्यों इसी आवृत्ति माप की तुलना में कई गुना कम कर रहे हैं. उत्परिवर्तन दर वृद्धि की अवधि के अंत में उत्परिवर्तन आवृत्ति उपाय है, जबकि आबादी में उत्परिवर्ती कोशिकाओं की संचयी संख्या कोशिका विभाजन के प्रत्येक दौर के साथ नए परिवर्तन के साथ कोशिकाओं की उपस्थिति उपाय है क्योंकि यह अंतर होता है. इन परीक्षणों के लिए दरों में और 95% विश्वास अंतराल प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम replicates की न्यूनतम संख्या इस प्रोटोकॉल के लिए सुझाव दिया है जो परीक्षण प्रति सात दोहराने संस्कृतियों का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है.

प्रारंभिक आवृत्ति और दर मूल्यों निर्धारित कर रहे हैं एक बार, एक जनसंख्या आकार चर्चा होनी चाहिएपर्याप्त कोशिकाओं मज़बूती उत्परिवर्तन आवृत्तियों का निर्धारण करने के लिए छँटाई के कई दौर के बाद मौजूद हैं जो यह सुनिश्चित करता है कि Osen. आवृत्तियों और दरों चित्रा 2A में दिखाया गया है उन लोगों के लिए समान हैं जब उम्र बढ़ने के दौरान विश्लेषण किया जा रहा है कि समय बिंदु प्रति 10 8 कोशिकाओं की आबादी लेबल उपयुक्त है. यह निर्णय भी छँटाई के प्रत्येक दौर के बाद बरामद कर रहे हैं कि कैसे कुशलतापूर्वक लेबल मां कोशिकाओं पर निर्भर करता है. लेबल मां कोशिकाओं उबरने की दक्षता जल्दी और आसानी से हर तरह के लिए कॉलम से eluted कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए और सेल आकारिकी की जांच के लिए एक hemocytometer का उपयोग द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. दो मुख्य बिंदु उदाहरण वसूली दक्षता डेटा (चित्रा 3A) द्वारा सचित्र हैं: कोशिकाओं की बरामद संख्या पहले क्रमबद्ध के बाद उम्मीद की तुलना में अधिक दिखाई दे सकता है, और कोशिकाओं के एक छोटे प्रगतिशील नुकसान निरंतर छंटनी साथ की उम्मीद है. पहले क्रमबद्ध के बाद कुछ प्रयोगों में कोशिकाओं की उम्मीद की तुलना में अधिक संख्या सका जोड़करप्रारंभिक आबादी में कोशिकाओं पर कलियों की लेबलिंग से ULT. बायोटिन साथ लेबल करने के लिए कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करते समय एक कली के साथ एक खमीर सेल आम तौर पर एक एकल कक्ष के रूप में बना दिया जाएगा. प्रारंभिक आबादी में मौजूद कलियों की लेबलिंग, हालांकि, अनुमति होगी उन कलियों से है कि विकसित कोशिकाओं को भी छँटाई के दौरान स्तंभों पर बनाए रखा जाएगा. वसूली दक्षता के दृढ़ संकल्प पर इस घटना का प्रभाव प्रारंभिक सेल की आबादी में अंकुरित कोशिकाओं के अंश पर निर्भर करता है. उच्च सेल नंबर के लिए एक दूसरा संभावित कारण के बाद क्रमबद्ध एक छंटाई के दौरान कोशिका विभाजन को पूरा किया जा सकता है कि इस समय बिंदु पर अधिक बड़े अंकुरित कोशिकाओं हो जाता है. नतीजतन, अभी भी उनकी मां कोशिकाओं से जुड़ी बड़ी कलियों क्रमबद्ध लेकिन eluted कोशिकाओं की जांच कर रहे हैं तो के रूप में विशिष्ट कोशिकाओं को प्रकट किया जा सकता है. कोशिकाओं के कुछ नुकसान वृद्धि और छंटनी के प्रत्येक दौर के साथ मनाया जाता है, प्रोटोकॉल एस के प्रत्येक दौर के बाद कोशिकाओं के 80-90% के विश्वसनीय प्रतिधारण में परिणाम कर सकते हैंorting. यह लेबल की कोशिकाओं के 80% या उससे अधिक एक अनावश्यक रूप से बड़े प्रारंभिक सेल आबादी लेबल करने के लिए जरूरत से बचने के लिए अलग किया जा रहा है कि यह सुनिश्चित करने के लिए प्रक्रिया का अभ्यास करने के प्रयास के लायक है. पहले क्रमबद्ध बाद के लिए वसूली में कुछ परिवर्तनशीलता वहां गया था हालांकि पहले क्रमबद्ध (30 मिनट के लिए YPD मध्यम में 1 मिमी हाइड्रोजन पेरोक्साइड) के बाद एक हल्के तनाव के साथ कोशिकाओं के उपचार, विकास और छँटाई के जारी दौर के साथ कोशिकाओं के कुशल वसूली रोकने नहीं किया तनाव (चित्रा 3A).

सेल आकारिकी और व्यवहार्यता का निरीक्षण भी माँ कोशिकाओं के सफल अलगाव की पुष्टि के लिए और गैर चयनात्मक माध्यम पर कोशिकाओं के प्रसार जब कॉलोनी बनाने इकाइयों के घनत्व का निर्धारण किया dilutions / संस्करणों को एडजस्ट करने के लिए दोनों उपयोगी होते हैं. माँ कोशिकाओं बेटी कोशिकाओं (3B चित्रा) की तुलना में तेजी से बड़ा है और वे उम्र के रूप में अधिक अनियमित आकार के हो जाते हैं. माँ सेल के नमूने इसलिए मुख्य रूप से बड़े, IRR से मिलकर चाहिएप्रयोग छँटाई के प्रत्येक दौर के माध्यम से प्रगति के रूप में egularly कोशिकाओं के आकार का. नियमित रूप से आकार के कई छोटे अंडाकार कोशिकाओं की उपस्थिति है कि मां की कोशिकाओं को पर्याप्त रूप से बेटी की कोशिकाओं से अलग नहीं किया जा रहा का संकेत मिलता है. पहले 09:55 सेल पीढ़ियों के दौरान ज्यादा परिवर्तन नहीं हो सकता, हालांकि माँ कक्षों की व्यवहार्यता भी उत्तरोत्तर बढ़ रही है, और छँटाई के प्रत्येक दौर के साथ गिरावट चाहिए. बनाने कालोनियों में सक्षम कोशिकाओं की संख्या की वजह से वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं के गठन के लिए, सेल अखंडता के लिए प्रत्यक्ष धुंधला के कुछ फार्म से व्यवहार्य होना निर्धारित है कि कोशिकाओं की संख्या की तुलना में बहुत अधिक नाटकीय रूप से कम कर सकते हैं. एक प्रत्यक्ष धुंधला विधि द्वारा व्यवहार्यता पहले (लगभग 80% या उससे कम) में गिरावट शुरू होता है, यह कॉलोनी व्यवहार्य कोशिकाओं की क्षमता में एक अधिक नाटकीय कमी की प्रत्याशा में इकाई घनत्व के गठन को मापने के लिए इस्तेमाल किया dilutions और मात्रा को समायोजित करने के लिए आवश्यक हो सकता है फार्म कालोनियों (एक दो कई गुना कमी करने के लिए).

क्रमबद्ध आबादी और नियंत्रण आबादी के replicative उम्र मां कोशिकाओं से उत्परिवर्तन आवृत्ति डेटा जमते म्यूटेशन की दर में उम्र विशेष परिवर्तन के लिए विश्लेषण किया जा सकता से पहले निर्धारित करने की आवश्यकता है. यह कली निशान का पता लगाने अभिकर्मक (चित्रा 5) के लिए संकेत यों मां कोशिकाओं पर कली निशान के मैनुअल गिनती (चित्रा 4) या फ्लो के माध्यम से के माध्यम से पूरा किया जा सकता है. बड निशान अपेक्षाकृत कम पृष्ठभूमि संकेत WGA फ्लोरोसेंट conjugates (चित्रा 4C) का उपयोग कर के साथ लेबल किया जा सकता है. चित्रा -4 ए छँटाई प्रक्रिया के नमूने के माध्यम से प्रवाह से सबसे कोशिकाओं शून्य या एक कली निशान है कि पता चलता है. स्तंभों से eluted कोशिकाओं ज्यादातर वृद्ध मां कोशिकाओं (आंकड़े 4 बी और 5) हैं. आमतौर पर,> eluted कोशिकाओं के 90% चित्रा 5 में परिणाम प्रवाह cytometry से अधिक आसानी से देखा जा सकता है जो मां कोशिकाओं, कर रहे हैं. अपेक्षाकृत कुछ कली निशान के साथ कोशिकाओं (<6) OBTained बायोटिन बहुत धीरे से विभाजित कर रहे हैं कि मां की कोशिकाओं के लिए विरोध के रूप में, विकास के प्रासंगिक दौर के दौरान कोशिका विभाजन के कुछ राउंड लिया कि लेबल नहीं थे कि contaminating कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व कर सकता छँटाई के अधिक से अधिक दो राउंड के बाद. सेल उम्र में भिन्नता आबादी में नहीं सभी कोशिकाओं को समान रूप से बढ़ रहे हैं छँटाई के बाद के दौर के साथ वृद्धि हो सकती है.

एक रैखिक संबंध WGA प्रतिदीप्ति संकेत तीव्रता और सेल प्रति कली निशान की संख्या के बीच स्थापित है अगर एक बड़ा सेल आबादी सेल उम्र का मूल्यांकन करने के लिए और अधिक तेजी से किया जा सकता है. इस विश्लेषण के लिए, सभी WGA प्रतिदीप्ति संकेत तीव्रता का सामान्यीकरण. पुराने कोशिकाओं में वृद्धि की पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के लिए खाते में उपयुक्त बेदाग सेल आबादी (बेटी या माँ) के लिए प्राप्त संकेत से दाग कोशिकाओं का संकेत विभाजित करके पूरा किया 4 आंकड़े है और एक ही प्रतिनिधि सेल आबादी के 5 शो विश्लेषण.मैनुअल गिनती क्रमशः, बेटी सेल (चित्रा -4 ए) और मां सेल आबादी (चित्रा 4 बी) के लिए 0.95 और 11.4 की औसत replicative उम्र की स्थापना की. इन दो आबादी और तीन अतिरिक्त आबादी के लिए सामान्यीकृत WGA-संकेत (3.0, 6.9, और 14.4 की औसत उम्र) प्रत्येक जनसंख्या (चित्रा 5 ब) के लिए कली निशान की औसत संख्या के खिलाफ साजिश रची गया. इस रैखिक संबंध तो सेल उम्र की त्वरित और सटीक दृढ़ संकल्प की अनुमति, प्रवाह cytometry के माध्यम से प्राप्त की सामान्यीकृत WGA संकेत से औसत सेल उम्र निर्धारित करने के लिए भविष्य प्रयोगों में एक ही तनाव और अभिकर्मकों के साथ प्रयोग किया जा सकता है. नियंत्रण आबादी अभी भी परीक्षणों के बीच इसी तरह धुंधला क्षमता को सत्यापित करने के लिए शामिल किया जाना चाहिए.

म्यूटेशन का संचय पर उम्र के प्रभाव को कुशलतापूर्वक, उत्परिवर्तन दर मूल्यों प्राप्त कोशिकाओं छँटाई, और सेल उम्र पूरा कर रहे हैं निर्धारित करने की पूर्व कदम एक बार संबोधित किया जा सकता है. परमाणुसमय बिंदुओं के mber जिस पर निर्धारित किया जा सकता आवृत्ति बायोटिन लेबल सेल आबादी के आकार और विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए चयनात्मक माध्यम पर फैल जाने की जरूरत है कि कोशिकाओं की संख्या पर निर्भर करता है. उम्र के साथ उत्परिवर्तन दर में परिवर्तन, तो मां कोशिकाओं की उम्र बढ़ने के लिए मनाया उत्परिवर्तन आवृत्तियों केवल कोशिका विभाजन के अतिरिक्त राउंड पर आधारित होने की उम्मीद है उन लोगों से अलग करना चाहिए. भविष्यवाणी उत्परिवर्तन आवृत्ति को मनाया उत्परिवर्तन आवृत्ति की तुलना जमते म्यूटेशन की दर में उम्र से संबंधित मतभेदों की पहचान कर सकते हैं. प्रोटोकॉल की धारा 7 में वर्णित है, भविष्यवाणी की आवृत्ति प्रारंभिक सेल की आबादी के लिए आधारभूत उत्परिवर्तन दर और प्रारंभिक आबादी के लिए उत्परिवर्तन आवृत्ति में जोड़ा मां कोशिकाओं की replicative उम्र में वृद्धि के उत्पाद से प्राप्त किया जा सकता है. CAN1 उत्परिवर्तन आवृत्ति में वृद्धि गुणसूत्र वी पर अपने सामान्य स्थान पर CAN1 साथ एक तनाव में वृद्धि की औसत सेल उम्र के साथ मनाया गया है(चित्रा 6A) और गुणसूत्र आठवीं (चित्रा 6B) के दाहिने हाथ पर CAN1 साथ एक तनाव में. चित्रा 6A में मां की कोशिकाओं के लिए मनाया उत्परिवर्तन आवृत्तियों के लिए या सिर्फ भविष्यवाणी की आवृत्तियों नीचे समान हैं, डेटा उत्परिवर्तन दर में एक उम्र विशेष बदलाव के लिए कोई सबूत नहीं प्रदान करते हैं. इसके विपरीत, गुणसूत्र आठवीं पर CAN1 के साथ तनाव की मां की कोशिकाओं के लिए उत्परिवर्तन आवृत्तियों की भविष्यवाणी की आवृत्तियों (चित्रा 6B) की तुलना में अधिक थे. ग्राफ में भविष्यवाणी की आवृत्तियों की वजह से मनाया उत्परिवर्तन आवृत्ति में बड़ी वृद्धि करने के लिए एक लॉग पैमाने वाई अक्ष के लिए इस्तेमाल किया जा सकता था क्योंकि बहुत ज्यादा वृद्धि नहीं दिखाई देते हैं ध्यान दें. इसलिए, चित्रा 6B में परिणाम जमते म्यूटेशन की दर में एक उम्र विशेष वृद्धि का समर्थन सबूत प्रदान करते हैं. चित्रा 6A और 6B में डेटा सेट के लिए परिणामों में अंतर के कारण diffe की संभावना है CAN1 के जीनोमिक स्थानों किराया. टिप्पणियों के इन प्रकार की कोशिकाओं उम्र के रूप में उत्परिवर्तन दरों को प्रभावित करने वाले तंत्र का अध्ययन करने के लिए और replicative उम्र के साथ उत्परिवर्तन संचय समझाने के लिए मॉडल विकसित करने की परिकल्पना को विकसित करने के लिए एक प्रारंभिक बिंदु प्रदान करते हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1 फ्लो खमीर replicative उम्र बढ़ने के दौरान उत्परिवर्तन संचय की जांच के लिए समग्र प्रक्रिया का चित्र. काले पाठ और तीर प्रक्रिया में बड़े कदम से संकेत मिलता है. घुमावदार तीर regrowth और एक ही कोशिकाओं की छंटनी की अतिरिक्त फेरे उत्तरोत्तर पुराने कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए उपयोग किया जाता है को दर्शाता है. बैंगनी तीर और पाठ कहा माप बना रहे हैं, जिस पर कदम से संकेत मिलता है. Freq - आवृत्ति.

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युवा सेल आबादी में उत्परिवर्तन आवृत्ति और दर का 2 निर्धारण चित्रा. (ए) उत्परिवर्ती कालोनियों आवृत्तियों / दरों की गणना करने के लिए चयनात्मक माध्यम पर फैल व्यवहार्य कोशिकाओं की कुल संख्या की तुलना में CAN1 जीन में नुकसान के समारोह म्यूटेशन के लिए चयन करने के लिए SC-ARG + canavanine माध्यम पर कोशिकाओं के प्रसार के द्वारा चयन किया गया था. बायोटिन लेबलिंग (आईपी) या बायोटिन लेबलिंग (पंजाब) के बाद से पहले प्रारंभिक आबादी से कोशिकाओं के निकट संतृप्ति के लिए 5,000 कोशिकाओं / एमएल की एक शुरुआती घनत्व से YPD माध्यम का उपयोग कर बड़े हो रहे थे. लैवेंडर कॉलम दर माप से संकेत मिलता है और नीले कॉलम संकेत तापमान (20 डिग्री सेल्सियस और 30 डिग्री सेल्सियस) पर बनाया आवृत्ति माप का प्रतिनिधित्व करते हैं. सात दोहराने संस्कृतियों का सेट एक परीक्षण के लिए बड़े हो रहे थे और दो पांच स्वतंत्र परीक्षणों प्रदर्शन किया गया. स्वतंत्र परीक्षण के लिए गणना की व्यक्तिगत दर मूल्यों दिखाए जाते हैं, और इन परीक्षणों के लिए त्रुटि सलाखों के 95% विश्वास अंतराल निर्धारित प्रतिनिधित्वएक ऑनलाइन कैलकुलेटर 22 का उपयोग होगी. आवृत्तियों का मतलब है और मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं. का उपयोग कर भाग 5-FOA पर उत्परिवर्ती कालोनियों के लिए चयन निम्नलिखित प्राप्त एक गुणसूत्र आठवीं के दाहिने हाथ पर CAN1 साथ एक तनाव का उपयोग. (सी) उत्परिवर्तन आवृत्तियों के रूप में वर्णित (बी) CAN1 उत्परिवर्तन दरों प्राप्त और प्रतिनिधित्व गुणसूत्र आठवीं के दाहिने हाथ पर स्थित URA3 जीन के साथ एक तनाव. तरीके अन्यथा भाग एक के लिए के रूप में थे, और इसका मतलब है और तीन या चार स्वतंत्र परीक्षण के लिए मानक विचलन दिखाए जाते हैं.

चित्रा 3
छँटाई के प्रत्येक दौर के बाद eluted कोशिकाओं की संख्या की गणना के द्वारा निर्धारित दक्षता छँटाई 3 उदाहरण चित्रा. (ए) बायोटिन लेबलिंग एक करने के लिए स्थापित किया गया था के बाद प्रत्येक शुरू करने जनसंख्या में कोशिकाओं की कुल संख्या, और टी चुंबकीय सेल छँटाई के प्रत्येक दौर से eluted नमूनों में मौजूद कोशिकाओं के otal संख्या लेबल की कोशिकाओं के अंश प्राप्त करने के लिए उन प्रारंभिक मूल्यों से विभाजित किया गया था. कुल सेल नंबर एक hemocytometer का उपयोग प्राप्त कोशिकाओं की गिनती से निर्धारित किया गया है. ऑरेंज कॉलम मतलब है और मानक प्रोटोकॉल के बाद तीन स्वतंत्र परीक्षण के लिए मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं. ब्लू कॉलम कोशिकाओं तुरंत पहले क्रमबद्ध के बाद 30 मिनट के लिए 1 मिमी हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ इलाज किया गया, जिसमें दो स्वतंत्र परीक्षण के लिए मतलब है और मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं. (बी) का आकार और बायोटिन लेबलिंग (के बाद बायोटिन) और मां की कोशिकाओं के बाद कोशिकाओं की आकारिकी मानक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी और एक 20x उद्देश्य का उपयोग कर दिखाया चुंबकीय छँटाई के तीसरे दौर (तरह 3 माँ कोशिकाओं) के बाद बरामद किया. पृष्ठभूमि में सफेद लाइनें एक मानक hemocytometer पर दिखाई सबसे छोटे वर्गों के लिए बाध्य है कि लाइनें हैं.कश्मीर "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
पुस्तिका कली निशान गिनती का उपयोग replicative उम्र के 4 चित्र निर्धारण. Confocal माइक्रोस्कोपी 488 एनएम और पहचान 458/543 एनएम बैंड पास से और 505 एनएम लंबे पास पर (उत्तेजना एक WGA फ्लोरोसेंट साधना के साथ लेबल व्यक्ति की कोशिकाओं पर कली निशान गिनती करने के लिए इस्तेमाल किया गया था फिल्टर संयोजन). चुंबकीय छँटाई (n = 62) के तीसरे दौर निम्नलिखित (ए) (बेटी कोशिकाओं के माध्यम से प्रवाह से कोशिकाओं के मैनुअल कली निशान मायने रखता है). (बी) eluted कोशिकाओं के मैनुअल कली निशान मायने रखता है (मां कोशिकाओं) निम्नलिखित चुंबकीय छँटाई (n = 54) के तीसरे दौर. (सी) माँ कोशिकाओं को बनाए रखा बुद्धि धुंधला के बाद 3X जूम के साथ एक 63X तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग कर फोटो खिंचवाने चुंबकीय छँटाई के तीसरे दौर निम्नलिखितहा WGA फ्लोरोसेंट संयुग्म. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
प्रवाह cytometry का उपयोग replicative उम्र के 5 चित्रा निर्धारण. एक WGA फ्लोरोसेंट साधना के साथ दाग 10,000 कोशिकाओं के नमूने 488 एनएम और पहचान एक 530/30 बैंड पास से और 505 लंबी पास फिल्टर सेट पर उत्तेजना का उपयोग प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया. (ए एक बेटी सेल आबादी या चुंबकीय छँटाई के तीन दौर के बाद eluate (मां कोशिकाओं) के लिए विशिष्ट WGA प्रतिदीप्ति तीव्रता के साथ कोशिकाओं की संख्या चित्रण) Histograms. जनसंख्या चित्रा 4 में विश्लेषण उन के अनुरूप हैं. ब्लू खड़ी रेखा Dau के बहुमत के लिए इसी स्थिति का संकेतमां सेल हिस्टोग्राम पर ghter कोशिकाओं. (ख) प्रत्येक एक में दिखाया जनसंख्या और कोशिकाओं के तीन अतिरिक्त आबादी (औसत उम्र 3.0, 6.9, और 14.4) के प्रतिदीप्ति संकेत के लिए सामान्यीकृत ज्यामितीय मतलब का ज्यामितीय मतलब के अनुपात के रूप में गणना की गई दाग कोशिकाओं और उचित बेदाग सेल आबादी के ज्यामितीय मतलब. ये मान (चित्रा 4 और नहीं दिखाया डेटा) प्रत्येक कुल आबादी के लिए कली निशान की औसत संख्या की तुलना में प्लॉट किए जाते हैं. इस तुलना की प्रवृत्ति लाइन के लिए आर 2 मूल्य ग्राफ पर दिया जाता है.

चित्रा 6
चित्रा 2 usin के लिए वर्णित के रूप में replicative उम्र बढ़ने के दौरान भविष्यवाणी की है और मनाया उत्परिवर्तन आवृत्तियों के बीच 6 चित्रा तुलना करें. CAN1 जीन में परिवर्तन के साथ कोशिकाओं चयन किया गया थागुणसूत्र वी (ए) पर अपने सामान्य स्थान पर या गुणसूत्र आठवीं (बी) के दाहिने हाथ पर CAN1 साथ जी उपभेदों. प्रकोष्ठों पूर्व बायोटिन लेबलिंग के लिए और उसके बाद 20 डिग्री सेल्सियस पर 30 डिग्री सेल्सियस पर ठोस माध्यम पर बड़े हो रहे थे. मनाया आवृत्ति मूल्यों नारंगी कॉलम (OBS) और भूरे रंग के कॉलम (पूर्व) के साथ दिखाया जाता है वृद्ध कोशिकाओं के लिए भविष्यवाणी की आवृत्तियों के साथ दिखाया जाता है. प्रत्येक ग्राफ के लिए प्रथम स्तंभ चार स्वतंत्र परीक्षणों (पंजाब) के लिए बायोटिन लेबलिंग के बाद प्रारंभिक उत्परिवर्तन आवृत्ति का मतलब है और मानक विचलन से पता चलता है. कॉलम नीचे संख्या एक जनसंख्या (सेल आयु) के लिए कली निशान की औसत संख्या का संकेत मिलता है. चित्रा 2A (आईपी कॉलम) और 2 बी में दिखाया प्रारंभिक दर प्रत्येक मान का उपयोग प्रोटोकॉल की धारा 7 में वर्णित के रूप में स्वतंत्र भविष्यवाणी मूल्यों निर्धारित किया गया है. ये स्वतंत्र मानों तो औसतन थे. मनाया मूल्यों तीन परीक्षणों के साधन हैं. त्रुटि सलाखों मानक विचलन का संकेत मिलता है.

Discussion

इस प्रोटोकॉल संसाधनों को सक्षम करने के लिए कई तरीकों को जोड़ती है और कुशलता से mitotic सेल उम्र बढ़ने के दौरान जीनोम अस्थिरता का अध्ययन करने के लिए लागू किया जाना cerevisiae मॉडल प्रणाली Saccharomyces में उपलब्ध दृष्टिकोण. Assays के एक व्यापक विविधता प्ररूपी चयन के माध्यम से जीनोम अस्थिरता के विभिन्न रूपों यों म्यूटेशन या गुणसूत्र rearrangements के विशेष रूपों के संचय में संभव उम्र विशेष परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए चुंबकीय छँटाई के साथ जोड़ा जा सकता है. पूरे जीनोम अनुक्रमण दृष्टिकोण उम्र के साथ एक जीनोम में होने वाली परिवर्तन के समग्र प्रकार के बारे में अधिक जानकारी प्रदान कर सकता है, उत्परिवर्तन दर माप प्राप्त करने के लिए प्ररूपी चयन प्रणाली का उपयोग करने के लिए और रियायत के आनुवंशिक परिवर्तन के विशिष्ट प्रकार को अलग करने की क्षमता यंत्रवत अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण लाभ कर रहे हैं उम्र बढ़ने से संबंधित जीनोम अस्थिरता के पहलुओं. सेल उम्र के निर्धारण और संभावित व्यवस्थित बनाने physiologi के समानांतर माप बनाने के लिएप्रवाह के माध्यम से काल परिवर्तन cytometry विशिष्ट उम्र पर्वतमाला के दौरान अन्य सेलुलर परिवर्तन के साथ जीनोम अस्थिरता सहसंबंधी कारगर साधन उपलब्ध कराते हैं. जमते म्यूटेशन की दरों में संभावित उम्र पर निर्भर परिवर्तन के निर्धारण की आवश्यकता है: 1) सावधान युवा सेल आबादी में दरों का निर्धारण करने, सेल उम्र के 2) सही निर्धारण, और 3) मज़बूती reproducibly को मापने के लिए मां कोशिकाओं की पर्याप्त बड़ी आबादी को समृद्ध करने की क्षमता बुढ़ापे में जीनोम अस्थिरता. यह दृष्टिकोण खमीर मॉडल प्रणाली दरों और / या mitotically सक्रिय कोशिकाओं में जीनोम अस्थिरता की आवृत्तियों में उम्र पर निर्भर परिवर्तन के लिए जिम्मेदार अंतर्निहित तंत्र को परिभाषित करने के लिए योगदान करने के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, आनुवांशिक और पर्यावरणीय कारकों तेजी से उम्र पर निर्भर जीनोम अस्थिरता के लिए योगदान के लिए मूल्यांकन किया जा सकता. अंत में, इन अभिलक्षण म्यूटेशन replicative उम्र बढ़ने के दौरान जमा जिस तरीके के लिए खाते में है कि मॉडल का विकास करने के लिए ले जा सकता है.

इस विधि इस तरह की घटनाओं की दर को मापने के लिए चयन phenotypes की उपस्थिति के माध्यम से म्यूटेशन या जीनोम अस्थिरता के अन्य प्रकार का पता लगाने की क्षमता पर निर्भर करता है. हालांकि, परख डिजाइन में रचनात्मकता जीनोम अस्थिरता के कई पहलुओं की जांच किए जाने की अनुमति कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, URA3 और CAN1 जीन परिणामों पर जीनोमिक स्थान से किसी के प्रभावों का परीक्षण करने के लिए विभिन्न जीनोमिक साइटों पर रखा जा सकता है. कार्यात्मक जीन alleles के लिए विशिष्ट गैर कार्यात्मक जीन alleles के प्रत्यावर्तन विशेष mutational प्रक्रियाओं का परीक्षण कर सकता है. इसके अलावा, एक जीन या दोहराने दृश्यों के साथ एक जीन flanking के कई निष्क्रिय alleles की शुरूआत क्रमशः, बहाली या जीन समारोह के नुकसान के माध्यम से पुनर्संयोजन घटनाओं की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अस्थिरता परीक्षण इन विभिन्न जीनोम अस्थिरता घटनाओं 9 की दरों का निर्धारण करने के लिए मानक दृष्टिकोण हैं. प्रोटोकॉल Muta निर्धारित करने के लिए अच्छी तरह से स्वीकार कर लिया और अपेक्षाकृत सरल घास का मैदान-Coulson मंझला अनुमानक का उपयोग कर लिखा हैtion दर एमएसएस-अधिकतम संभावना अनुमानक विधि उत्परिवर्तन दरों 9 का निर्धारण करने के लिए सबसे अच्छा तरीका माना जाता है, भले ही विविध शोधकर्ताओं के लिए इसे और अधिक सुलभ बनाने के लिए. एमएसएस-अधिकतम संभावना अनुमानक पहले से विस्तार से 9 में समीक्षा की गई है, और एक वैकल्पिक विधि के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन और अधिक परिष्कृत गणना की आवश्यकता है. वैकल्पिक रूप से, इस विधि के साथ उत्परिवर्तन दरों की गणना करने के लिए स्वतंत्र सॉफ्टवेयर 22 से उपलब्ध कराया गया है. उत्परिवर्तन दरों की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने के उपाय प्राप्त करने, पर्याप्त दोहराने संस्कृतियों का उपयोग काफी कम प्रारंभिक सेल घनत्व पर संस्कृतियों inoculating सहित प्रयोगात्मक डिजाइन के कुछ पहलुओं को ध्यान देने की आवश्यकता है कि 10,000 गुना या अधिक, और चुनने उपयुक्त संस्कृति संस्करणों से जनसंख्या का आकार बढ़ता पूरे इतना है कि कोशिकाओं की आबादी चयनात्मक माध्यम पर फैल सकता है. उत्तरार्द्ध बिंदु के लिए, एक पहले से वर्णित सूत्र संस्कृति teste के अंश पर आधारित उत्परिवर्तन दर को समायोजित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैडी 9. संस्कृतियों के विकास दर में घटबढ़ एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य उत्परिवर्तन दर के निर्धारण, और हाल ही में 23 में वर्णित किया गया है इस प्रकार की स्थिति में अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम हो सकता है कि एक संशोधित मंझला आधारित आकलनकर्ता जटिल हो सकता है.

सही रूप में सेल उम्र को मापने की क्षमता पुरानी कोशिकाओं में जीनोम अस्थिरता आवृत्तियों के कारण युवा कोशिकाओं में घटनाओं की दर की उम्मीद मूल्यों से अलग कर रहे हैं कि क्या स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि एक और पहलू है. WGA अलग फ्लोरोसेंट अणुओं को संयुग्मित उपलब्ध है के बाद से हम, पृष्ठभूमि और लचीलेपन के मामले में दोनों, सफेद धुंधला calcofluor के लिए बेहतर होने की WGA धुंधला पाया है. यह लचीलापन फ्लोरोसेंट अभिकर्मकों के साथ अन्य सेल विशेषताओं का एक साथ माप के लिए और अधिक अवसर प्रदान कर सकते हैं. प्रारंभिक काम तो एक और अधिक करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं संकेत WGA धुंधला के लिए तीव्रता और कोशिकाओं पर कली निशान की इसी संख्या के बीच एक संबंध स्थापित करने के लिएफ्लो के माध्यम से सेल उम्र का तेजी से दृढ़ संकल्प. यह दृष्टिकोण भी आम तौर पर माप के बेहतर reproducibility के लिए माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच की जाएगी से बड़ा जनसंख्या आकार के उपयोग की अनुमति देता है. सभी आयु निर्धारण कोशिकाओं के सूक्ष्म परीक्षा के माध्यम से किया जा सकता है, हम दृष्टिकोण प्रवाह cytometry उम्र पर निर्भर जीनोम अस्थिरता को प्रभावित करने वाले कारकों की तेजी से जांच की सुविधा है कि लग रहा है.

मज़बूती से सेल उम्र को मापने के अलावा, ध्यान मां कोशिकाओं बढ़ रही है और कोशिकाओं छँटाई की एक के बाद एक गोल से गुजरना करने के लिए अनुमति दी जाती है कोशिका विभाजन की संख्या को दिए जाने की जरूरत है. कोशिकाओं वांछित सेल घनत्व तक पहुँचने से पहले अधिक सेल डिवीजनों से गुजरना अनुमति दे सकता है एक छोटे प्रारंभिक जनसंख्या आकार या एक बड़ा संस्कृति मात्रा का प्रयोग करें. उदाहरण के लिए, अन्य शोधकर्ताओं कम experime साथ पुरानी कोशिकाओं प्राप्त करने के स्पष्ट लाभ दिया है जो बहुत पुरानी खमीर कोशिकाओं 16, प्राप्त करने के लिए छँटाई के केवल दो दौर का इस्तेमाल किया हैntal कदम. कोशिकाओं छँटाई करने से पहले अधिक कोशिका विभाजन को पूरा करने के लिए अनुमति देने के लिए संस्कृति मात्रा बढ़ाने के लिए है कि क्या विचार कर, मन में एक एकल स्तंभ में कार्रवाई की जा सकती है कि कोशिकाओं की कुल संख्या पर सीमा रखना. एक सेल आबादी सॉर्ट करने के लिए एकाधिक स्तंभों के उपयोग की जरूरत हो सकती है एक बड़ा संस्कृति मात्रा का प्रयोग करें. कोशिकाओं प्रकार / संग्रह अंक के बीच कोशिका विभाजन की कम दौर से गुजरना हैं, तो फिर जीवन काल के दौरान अलग समय बिंदुओं पर उम्मीद की उत्परिवर्तन आवृत्तियों से विचलन निरीक्षण करने के लिए और अधिक अवसर हैं. उदाहरण के लिए, जीवन के दौरान ही में जल्दी नमूने और देर समय बिंदुओं डेटा उत्परिवर्तन आवृत्ति में लगातार वृद्धि का संकेत है, लेकिन जल्दी से और फिर पठारों कि उत्परिवर्तन आवृत्ति बढ़ दिखा सकते हैं जीवन काल के दौरान अतिरिक्त मध्यवर्ती समय पर नमूने उत्पादन हो सकता है. इस प्रोटोकॉल पुराने माँ कोशिकाओं को अलग हालांकि, बाद से, उम्र के साथ उत्परिवर्तन दरों में परिवर्तन का एक और अधिक प्रत्यक्ष उपाय प्राप्त करने के लिए एक अवसर है. अस्थिरता परीक्षण ख सकताई उत्परिवर्तन दर युवा कोशिकाओं का उपयोग कर प्राप्त की दर से अलग होगा या नहीं यह निर्धारित करने के लिए अलग अलग उम्र की मां की कोशिकाओं का उपयोग किया. वे विकास के रूप में इन अस्थिरता परीक्षण के लिए संस्कृतियों पुराने और युवा कोशिकाओं का एक मिश्रण बन जाएँगे, युवा कोशिकाओं के साथ शुरू प्राप्त दरों से किसी भी विचलन एक पुराने शुरुआती जनसंख्या का उपयोग करने के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है.

reproducibly सही रूप जीनोम अस्थिरता को मापने के लिए वृद्ध मां कोशिकाओं का एक बड़ा पर्याप्त जनसंख्या प्राप्त करने की क्षमता इस दृष्टिकोण की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है. प्रोटोकॉल इस उद्देश्य के लिए एक विशेष चुंबकीय छँटाई प्रणाली के उपयोग का वर्णन करता है, जबकि अन्य समूहों वैकल्पिक प्रणालियों 14,18 (सामग्री की तालिका देखें) के साथ खमीर माँ कोशिकाओं को हल किया है. 'निर्माताओं प्रोटोकॉल के कुछ अनुकूलन के लिए आवश्यक हो सकता है, हालांकि इस तरह की वैकल्पिक प्रणाली भी, इस विधि के साथ काम करना चाहिए. भले ही इस्तेमाल किया विशिष्ट प्रणाली की, जनसंख्या आकार की आवश्यकताअध्ययन के लिए चुना उत्परिवर्तन या जीनोम पुनर्व्यवस्था के प्रकार की आवृत्ति के आधार पर डी अलग है. कम से कम, पर्याप्त मां कोशिकाओं एक उत्परिवर्तन आवृत्ति की गणना करने के लिए जनसंख्या के अनुसार कम से कम एक उत्परिवर्ती कॉलोनी प्राप्त करने के लिए होना चाहिए. केवल शून्य से पांच उत्परिवर्ती कालोनियों जनसंख्या आकार, और जनसंख्या के आकार में भी एक छोटे से वृद्धि से उम्मीद कर रहे हैं अगर 5-10 उत्परिवर्ती कालोनियों उम्मीद कर रहे हैं कि, बहुत reproducibility सुधार कर सकते हैं ताकि अभ्यास में, परिणाम काफी चर हो सकता है. बायोटिन एक प्रारंभिक आबादी लेबलिंग, प्रत्येक प्रकार के लिए वसूली दक्षता मां कोशिकाओं में उत्परिवर्तन आवृत्ति को मापने के लिए आवश्यक उचित जनसंख्या आकार की पहचान में मदद करने के लिए ध्यान में रखा जाना चाहिए. प्रत्येक क्रमबद्ध के बाद मां की कोशिकाओं के 90% वसूली के साथ, मूल आबादी का केवल 59% की वृद्धि और छंटनी के पांच दौर के बाद बरामद किया जाएगा. यह ~ 33% की वृद्धि के पांच दौर के बाद मूल आबादी की वसूली और लेबल मां कोशिकाओं का केवल 80% की वसूली कर रहे हैं छँटाई करने के लिए चला जाता हैप्रत्येक क्रमबद्ध दौरान एड. जनसंख्या के आकार में एक दो तीन गुना कमी आसानी से जनसंख्या प्रति उत्परिवर्ती कालोनियों की अविश्वसनीय संख्या को ले जा सकता है, क्योंकि कम आवृत्ति की घटनाओं को मापने जब मापने और वसूली को अधिकतम महत्वपूर्ण है.

पर विस्तार या mitotic सेल उम्र बढ़ने के दौरान जीनोम अस्थिरता का एक व्यापक समझ प्राप्त करने के लिए इस प्रोटोकॉल को संशोधित करने के लिए कई विकल्प हैं. सरल उदाहरण जीन कार्यों, मीडिया परिवर्तन, या अन्य पर्यावरणीय हालत परिवर्तन में परिवर्तन उम्र के साथ परिवर्तन के संचय बदल कैसे विश्लेषण शामिल हैं. बदल जीन समारोह के साथ या उचित हालत में युवा कोशिकाओं के लिए उत्परिवर्तन दरों मापा और नियंत्रण सेल आबादी की तुलना में अलग तरह से दर मूल्यों ने भविष्यवाणी की और से म्यूटेशन अलग ढंग से जमा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. Replicative उम्र बढ़ने के दौरान विभिन्न बिंदुओं पर सेल आबादी ऐसी प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों या डीएनए हानिकारक एजेंटों के रूप में विशिष्ट तनाव, से अवगत कराया जा सकता है. एकoxidative तनाव को क्षणिक और हल्के जोखिम काफी हद तक सेल छँटाई (चित्रा 3) प्रदर्शन करने की क्षमता को बदल नहीं किया था, लेकिन कठोर तनाव कोशिकाओं की वसूली को मुश्किल हो सकती है. प्रारंभिक प्रयोगों मां कोशिकाओं को अभी भी विशिष्ट तनाव के बाद कुशलता से ठीक किया जा सकता है कि सत्यापित करने के लिए आवश्यक होगा. साथ ही, पृथक मां कोशिकाओं के सेलुलर विशेषताओं 3 उम्र बढ़ने के साथ जुड़े रहे हैं कि प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों, mitochondrial और vacuolar आकृति विज्ञान, और अन्य शारीरिक विशेषताओं के स्तर सहित विस्तार से विश्लेषण किया जा सकता है. इसके अलावा, माता कोशिकाओं एक आगे के इलाज या हेरफेर के लिए एक प्रारंभिक आबादी हो सकता है. मां और बेटी की कोशिकाओं शारीरिक रूप से प्रक्रिया के दौरान अलग हो रहे हैं के बाद से, बेटी कोशिकाओं अभी भी विश्लेषण के लिए उपलब्ध हैं. उदाहरण के लिए, बेटी कोशिकाओं या खमीर मां और बेटी की कोशिकाओं के बीच क्षतिग्रस्त अणुओं की विषम विरासत की शारीरिक विशेषताओं में परिवर्तन एस के फायदे सक्षम बनाता है cerevisiae मॉडल प्रणाली कुशलतापूर्वक mitotic सेल उम्र बढ़ने के दौरान आनुवंशिक परिवर्तन के संचय के लिए जिम्मेदार तंत्र की जांच करने के लिए लागू किया जाएगा.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम इस लेख की सामग्री के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के आधिकारिक विचार प्रतिबिंबित नहीं करता PHM को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान की उम्र बढ़ने पर राष्ट्रीय संस्थान से अनुदान R00AG031911 द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Thermo Scientific 21335 100 mg
Anti-Biotin Microbeads Miltenyi Biotec 130-090-485 2 ml MicroBeads conjugated to monoclonal mouse anti-biotin antibodies (isotype: mouse IgG1)
MACS LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401 25 columns suitable for QuadroMACS separator
QuadroMACS separator Miltenyi Biotec 130-090-976 Separator Only
QuadroMACS Starting Kit Miltenyi Biotec 130-091-051 Includes: QuadroMACS Separator (130-090-976), MACS MultiStand (130-042-303), LS Columns (130-042-401), MACS 15 ml Tube Rack (130-091-052), One 2 ml unit of MACS MicroBeads. Note: Alternative systems include Dynabeads Biotin Binder and MagnaBind Magnetic Beads
BD Falcon Cell Strainer, 40 µm BD Biosciences 352340 40 µm for use with BD Falcon 50 ml Conical Tubes. 50 per pack
Trypan Blue Sigma-Aldrich T6146 Powder, filtering after dissolving important to remove particulates
Wheat germ agglutinin Alexa Fluor488 Life Technologies W11261 Conjugates with different excitation/emission spectra could also be used
ProLong Gold antifade reagent Life Technologies P36930 10 ml, other antifade reagents could also be used

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सूक्ष्म जीव विज्ञान अंक 92 उम्र बढ़ने म्यूटेशन जीनोम अस्थिरता, अस्थिरता परीक्षण चुंबकीय छंटाई मां सेल replicative उम्र बढ़ने
माँ कोशिकाओं और अस्थिरता टेस्ट के चुंबकीय छंटनी के संयोजन में mitotic सेल उम्र बढ़ने के दौरान जीनोम अस्थिरता का विश्लेषण करने के लिए<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em
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Patterson, M. N., Maxwell, P. H.… More

Patterson, M. N., Maxwell, P. H. Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (92), e51850, doi:10.3791/51850 (2014).

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