Мутация ставки в молодые Saccharomyces CEREVISIAE клеток измеренных через флуктуации испытаний используются для прогнозирования частоты мутаций для материнских клетках различных репликативных возрастов. Магнитная сортировка и проточной цитометрии затем используются для измерения фактических частот мутаций и возраст материнских клеток для выявления любых отклонений от прогнозируемых частот мутаций.
Saccharomyces CEREVISIAE был превосходным модельной системой для изучения механизмов и последствий нестабильности генома. Информация, полученная из этого дрожжевого модели уместна для многих организмов, включая человека, так как репарации ДНК и реагирования повреждение ДНК факторы хорошо сохраняется в самых разнообразных видов. Тем не менее, С. CEREVISIAE еще не используется в полной мере решать, является ли скорость накопления мутаций изменения с увеличением репликативной (митотических) возраста в связи с техническими ограничениями. Например, измерения дрожжей репликативной продолжительности жизни через микроманипуляций привлечь очень маленькие популяции клеток, которые запрещают обнаружение редких мутаций. Генетические методы для обогащения материнских клеток в популяциях, вызывая гибель дочерних клеток были разработаны, но размеры населения по-прежнему ограничен частотой, с которой случайные мутации что подвергает риску системы отбора произойти. Текущий протокол использует преимущества магнитного Sortiнг поверхностных меченных дрожжи материнских клетках, чтобы получить достаточно большие популяции пожилая мать клетки количественно редкие мутации через фенотипических выборов. Мутация ставки, измеренные через флуктуации испытаний, и частоты мутаций устанавливаются сначала для молодых клеток и используется для прогнозирования частоты мутаций в материнских клетках различных репликативных возрастов. Частоты мутаций затем определяются для отсортированных материнских клеток, и возраст материнских клеток определяется с помощью проточной цитометрии при окрашивании флуоресцентным реагентом, который обнаруживает бутон шрамы, сформированные на их поверхности клеток во время деления клетки. Сравнение прогнозных частот мутаций в зависимости от количества клеточных делений в частотах экспериментально наблюдаемых для материнских клетках данного репликативного возрасте может определить, есть ли возрастные изменения в скорости накапливающихся мутаций. Вариации этого базового протокола предоставляют средства для изучения влияния изменений в конкретных генных функций иликонкретные экологические условия на накопления мутаций обратиться механизмы, лежащие нестабильность генома в ходе репликативного старения.
Микроорганизмы, такие как дрожжи Saccharomyces CEREVISIAE, являются отличным примером для исследования частота мутаций, но эти модели не были полностью использованы для расследования накопление мутаций во время митотического старения клеток. Накопление мутаций в ядерном геноме была выдвинута гипотеза, внести свой вклад в старение по в результате прогрессирующей потерей (или изменения) генов функций 1. Возможность использования микробной системы для изучения механизмов и последствий накопления мутаций в процессе старения может значительно ускорить идентификацию генетических и экологических факторов, влияющих на этот процесс, потому что в легковесных генетических систем и легкость количественного редкие фенотипические изменения в микроорганизмов. Факторы репарации ДНК и белки реакции на повреждения ДНК хорошо сохраняется по разнообразным видам 2, и фундаментальные сходства в организменном старения были определены для организмов, как разнообразны, как S. CEREVISIAEд млекопитающие 3, что делает его, вероятно, что результаты, полученные при изучении в дрожжах будут иметь отношение к старению во многих организмов.
Исследования старения в S. CEREVISIAE использование двух стареющих моделей, которые измеряют хронологического старения или репликативной старение клеток. Хронологического старения характеризуется прогрессирующей потерей жизнеспособности популяций дрожжевых клеток, которые в не-деления государственной (неподвижной фазы) в связи с питательной истощения 3. Хронологическое старение модель была использована, чтобы продемонстрировать, что мутации накапливаются с возрастом 4, так как крупные клеточные популяции легко получить в этой модели для выполнения выбора фенотипических для мутантных клеток. В этом случае, появляется накопление мутаций под влиянием роста-сигнальных путей и окислительного стресса 5, и каждый из этих факторов имеет отношение к пониманию старения в многоклеточных эукариот 3. Репликативная модель старения использует асимметричную DIVISIна между S. CEREVISIAE мать и дочь клетки для исследования старения, которое происходит с последовательными клеточных поколений 3. Дрожжи репликативная старение часто измеряется через микроманипуляций малых популяций матери и дочерних клеток, или совсем недавно, через видеомикроскопии малых популяций дрожжевых клеток в микрофлюидных устройств 6,7. Ограниченные размеры населения делают эти подходы плохо подходит для исследования накопления мутаций во время митотического старения, если информация целого генома, полученного от отдельных клеток или генетические изменения очень высокой частоты измеряются 8. Всего-секвенирование генома отдельных клеток обеспечивает существенные наборы данных для исследования накопления мутации, но фенотипические системы селекции имеют важное преимущество, обеспечивая средства измерения частота мутаций изучать механизмы, лежащие накопления мутаций. Исследования изучить мутации частоты и цены через фенотипических выборов в haploiд штаммы дрожжей во время репликативного старения еще не поступало.
Частота мутаций обычно измеряется с помощью флуктуационных испытания 9. Значения частоты мутаций отражают общее число клеток, несущих мутацию в последовательности гена в популяции. Это включает в себя клетки, в которых происходят независимые мутации и любое потомство этих клеток, что просто наследуют уже существующие мутации. В отличие от этого, уровень мутаций, измеренные с помощью флуктуационных испытаний представляют число независимых мутаций, которые вновь возникают при каждом поколении клеток. Эти тесты обычно включают прививки много культур репликации при низких плотностях клеток, чтобы уменьшить вероятность добавления клетки с уже существующими мутаций в последовательности-мишени, выращивание культур почти до насыщения, и идентификации мутантных клеток ростом на селективной среде. Цифры из мутантных клеток, выявленных в повторных населения используются затем в одном из нескольких математических моделей для оценки количества Independent мутации, возникшие в процессе роста 9. Сравнение число независимых мутаций, чтобы средний размер популяции обеспечивает измерение частоты мутаций. В S. CEREVISIAE, мутация частоты и цены часто измеряется с помощью URA3 и CAN1 гены, так как с потерей функции мутации в этих генах производят выбираемые фенотипы. Потеря функции URA3 оказывает клеток, устойчивых к 5-fluoroorotic кислоты (5-FOA), так как белок, кодируемый URA3 преобразует к 5-FOA в молекуле токсичного 10. Потеря функции CAN1 позволяет клеткам, чтобы стать устойчивым к канаванин, токсичного аналога аргинин, так как белок, кодируемый CAN1 транспортирует аргинина и канаванин в клетки 11.
Оба генетические и физические стратегии сортировки были успешно использованы для получения более крупных популяций S. CEREVISIAE материнские клетки для облегчения расследования репликативного старения. Генетические стратегии включают умные подходы, которые выбирают против выживания дочь клеток в популяции. Программа мать обогащение (МООС) включает бета-эстрадиол индукцию экспрессии рекомбиназы Cre только в дочерних клеток, что приводит к дочери конкретных нарушению двух важных генов, которые были спроектированы, чтобы содержать LoxP сайтов 12. Штаммы MEP можно выращивать как правило, в отсутствие индуктора, но только мать клетки будут продолжать разделить после индукции, в то время как дочерние клетки будут задержать в М-фазе, как правило, в течение первого прохождения по клеточного цикла 12. Хотя эта система не использовалась в широко изучать накопление мутаций во время старения, он был использован для изучения потерю гетерозиготности, относительно частой формой нестабильности генома в диплоидных дрожжевых штаммов, а также биохимические изменения в старение материнских клеток 13,14. Аналогично, система дочь-разрядник включает дочь конкретных экспрессии S. cereviГен SIAE URA3 15. Штаммы дочери-разрядника нормально расти до тех пор, 5-FOA не будет добавлен к среде, после чего дочерние клетки, экспрессирующие URA3 умрет, в то время как материнские клетки продолжают расти 15. Эти полезные системы для обогащения материнских клеток, но они зависят от поддержания функций генов, которые составляют систему отбора. Случайные мутации в одном или нескольких компонентов системы отбора может привести к дочерним клеткам, которые ускользают от выбора и пролиферируют в геометрической прогрессии. Во время развития штаммов MEP, соответствующие размеры населения были полны решимости избежать появления мутантных дочерних клеток, которые могли бы спастись выбор 12. Однако этот предел численности населения ставит под угрозу обнаружение редких форм нестабильности генома в ходе репликативного старения. Это ограничение на численность населения может быть частично преодолена за счет использования диплоидных штаммов дрожжей с две копии каждого гена вклад в систему отбора, так как большинствомутации, вероятно, будет рецессивным 12. Тем не менее, использование диплоидных штаммов ограничивает типы мутационных событий, которые могут быть легко обнаружены по сравнению с теми, которые могут быть легко обнаружены в гаплоидных дрожжевых клеток.
Физические стратегии сортировки включают выделение материнских клеток с меченым поверхности клетки от немеченых дочерних клеток для обогащения крупных популяций материнских клеток. Тот факт, что на поверхности клеток белков (протеины клеточной оболочки) из S. CEREVISIAE дочь клетки вновь синтезированный во время бутонизации эксплуатируется маркировать материнские клетки без маркировки дочерние клетки, которые они производят 16. Например, начальная популяция дрожжевых клеток, меченных на их поверхности с биотином могут быть выращены и затем выделены из их дочерних клеток с использованием анти-биотин микрошарики и магнитной сортировки 16, потому что дочерние клетки, полученные от начальной популяции не будет содержать биотин на их поверхности . Серийный рост исортировка позволяет постепенно старшего популяции материнских клеток, которые будут получены и проанализированы. Эта процедура успешно используется для изучения изменений в физиологии клетки и экспрессии генов в ходе репликативного старения дрожжей 13,14,17,18. Текущий метод адаптируется этот биотин маркировку и методом магнитной сортировки для обогащения материнских клеток с целью измерения накопления потенциально редких мутаций или других форм нестабильности генома анализировали через фенотипических выборов. Серийный рост и физическое сортировка позволяют анализ накопления мутаций в постепенно старых материнских клеток, а также в их популяции дочерних клеток. Определение мутаций ставок на поколение позволяет предсказать частота мутаций рассчитываться для материнских клеток, которые подверглись определенное количество клеточных делений. Поскольку прогнозируемые значения частоты основаны на ожидаемом росте за счет дополнительных раундов деления клеток, существенных отклонений в наблюдаемых mutatiна частотах по сравнению с прогнозируемыми значениями предоставить доказательства для возрастных изменений в размере накапливающихся мутаций. Используя этот протокол, люминесцентные окрашивание почек шрамов, которые соответствуют сайтах клеточных делений на материнских клетках в сочетании с анализом методом проточной цитометрии могут быть использованы, чтобы быстро определить возрастное распределение отсортированных и неотсортированных населения. Дополнительные реактивы флуоресцентные, такие как те, которые используются для обнаружения активных форм кислорода, также могут быть использованы в течение этого протокола. В целом, этот протокол позволяет эффективно анализ возрастных изменений в нестабильности генома с потенциалом для корреляции с возрастными клеточных физиологических изменений в качестве модельного организма хорошо подходит для изучения генетических и экологических факторов, которые влияют, связанные со старением нестабильность генома.
Этот протокол объединяет несколько методов для того, чтобы ресурсы и подходы доступны в Saccharomyces CEREVISIAE модель системы, которые будут эффективно применяться для изучения нестабильности генома во время митотического клеточного старения. Широкий спектр анализов для количественного различные формы нестабильности генома через фенотипической селекции могут быть объединены с магнитной сортировки изучить возможные изменения повозрастные в накопления тех или иных форм мутаций или хромосомных перестроек. В то время как вся-секвенирования генома подходы могут предоставить больше информации о общих типов изменений, происходящих в геноме с возрастом, способность использовать фенотипические системы отбора для получения измерения скорости мутации и преимущественно изолировать определенные типы генетических изменений являются важными преимуществами для изучения механистический аспекты, связанные со старением нестабильности генома. Упорядочение определение клеточной возраста и потенциал, чтобы сделать параллельные измерения physiologiческие изменения через проточной цитометрии обеспечить эффективные средства коррелируют нестабильность генома с другими клеточными изменениями во конкретных возрастных. Определение потенциальных возрастных изменений в темпах накопления мутаций требуется: 1) осторожны определение ставок в молодых клеточных популяций, 2) точное определение клеточной возраста, и 3) способность надежно обогатить достаточно большие популяции материнских клеток воспроизводимо измерять нестабильность генома в старости. Такой подход позволяет дрожжи модель системы внести свой вклад в определение основных механизмов, ответственных за возрастных изменений в ставок и / или частот нестабильности генома в митотически активных клеток. Кроме того, генетические и экологические факторы могут быть быстро оценил за вклад в возраст-зависимой нестабильности генома. В конечном счете, эти характеристики могут привести к разработке моделей, на которые приходится образом, мутации в которых накапливаются во репликативного старения.
Этот способ зависит от способности для обнаружения мутации или другие типы нестабильности генома через внешний вид выбираемых фенотипов для измерения скорости таких событий. Тем не менее, творчество в дизайне анализа может разрешить многие аспекты нестабильности генома быть исследованы. Например, URA3 и CAN1 гены могут быть размещены на различных сайтах генома, чтобы проверить любые влияния геномной месте на результатах. Возврат конкретных нефункциональных аллелей генов в функциональных аллелей генов может проверить конкретные мутационные процессы. Кроме того, введение нескольких неактивных аллелей гена или фланговые ген с повторяющихся последовательностей может быть использован для изучения событий рекомбинации посредством восстановления или потери функции гена, соответственно. Флуктуационные тесты стандартный подход для определения цены этих различных мероприятий нестабильности генома 9. Протокол написан с использованием хорошо принята и относительно простой Lea-Коулсон средний оценщик для определения МутаСкорость ния, чтобы сделать его более доступным для различных исследователей, несмотря на то, MSS-метод максимального правдоподобия считается лучшим подходом для определения мутации ставки 9. MSS-оценка максимального правдоподобия была ранее подробно рассмотрены 9, и может быть использован в качестве альтернативного метода, но требует более сложных вычислений. Кроме того, бесплатное программное обеспечение для расчета частота мутаций с помощью этого метода был предоставлен 22. Получение воспроизводимых меры частоты мутаций требуется внимание на несколько аспектов эксперимента, в том числе с использованием достаточных культур дублирующие, прививки культур при малых плотностях достаточно начальных клеток, что численность населения увеличивается на 10 000 раз и более, и выбора соответствующих объемов культуры так, чтобы вся популяция клеток может быть распространен на селективной среде. Для последней точки, описанные выше формулу можно использовать, чтобы настроить частоту мутаций на основе фракции культуры Testeд 9. Изменение темпов роста культур может усложнить определение воспроизводимым частоты мутаций, и модифицированной срединной основе оценщик, которые могут дать более воспроизводимые результаты в таких ситуациях был недавно описанных 23.
Возможность точного измерения клеток возраст является еще одним фактором, который важен для установления того, отличаются от ожидаемых значений частоты нестабильности генома в старых клеток за счет скорости событий в молодых клеток. Мы обнаружили, окрашивание WGA, чтобы быть предпочтительным, чтобы Calcofluor белого окрашивания, как с точки зрения фона и гибкость, так как WGA доступен конъюгированного с различными флуоресцентными молекулами. Такая гибкость может обеспечить больше возможностей для одновременного измерения других характеристик клеточных с люминесцентными реагентами. Первоначальная работа, чтобы установить отношения между интенсивностью сигнала для окрашивания WGA и соответствующего количества почек шрамы на клетки затем может привести к болеебыстрое определение возраста клеток с помощью проточной цитометрии. Этот подход также позволяет использовать более крупные размеры популяций, чем будет обычно рассматриваются микроскопии для повышения воспроизводимости измерений. В то время как все определения возраста могут быть сделаны через микроскопическое исследование клеток, мы чувствуем, что поток цитометрии подход способствует быстрому скрининг факторов, влияющих возрастного нестабильность генома.
В дополнение к измерительной ячейкой возраст надежно, внимание должно быть уделено числа клеточных делений материнские клетки разрешено пройти с каждым последующим раундом растет и сортировки клеток. Использование меньшего исходного размера популяции или большего объема культуры клеток может позволить пройти несколько клеточных делений прежде, чем достигнуть желаемой плотности клеток. Например, другие исследователи использовали только два раунда сортировки получить очень старые дрожжевые клетки 16, которая имеет очевидное преимущество получения старые клетки с меньшим experimental шаги. При рассмотрении вопроса, чтобы увеличить громкость культуры, чтобы клетки для завершения больше деления клеток до сортировки, имейте в виду лимит на общее количество клеток, которые могут быть обработаны в одном столбце. Используйте большего объема культуры может потребовать использования нескольких столбцов для сортировки одну популяцию клеток. Кроме того, если клетки подвергаются меньшее количество раундов клеточного деления между точками виды / сбора, то есть больше возможностей для наблюдения отклонения от ожидаемых частот мутаций в различных временных точках в течение жизни. Например, отбор проб только на ранние и поздние моменты времени в течение срока службы может привести данные, указывающие на устойчивый рост частоты мутаций, но отбор проб на дополнительных промежуточных раз в течение срока службы может показать, что частота мутаций увеличивается быстро, а затем плато. Однако, поскольку этот протокол изолирует старые материнские клетки, есть возможность получить более прямой меру изменений в мутации ставок с возрастом. Флуктуационные тесты можно было бе осуществляется с использованием материнских клетках разных возрастов, чтобы определить, будет ли частота мутаций отличается от курса, полученного с помощью молодых клеток. В то время как культуры для этих флуктуаций испытаний станет смеси старых и молодых клеток, как они растут, любые отклонения от ставок, полученных начиная с молодых клеток может быть связано с использованием старой отправной населения.
Возможность воспроизводимо получать достаточно большое население в возрасте материнских клеток, чтобы точно измерить нестабильность генома имеет решающее значение для успеха этого подхода. Хотя протокол описывает использование конкретной магнитной системы сортировки для этой цели, другие группы сортируются материнские клетки дрожжей с альтернативными системами 14,18 (см таблицу материалов). Такие альтернативные системы также должны работать с этим методом, хотя может потребоваться некоторое оптимизация протоколов производителей. Независимо от конкретной используемой системы, размер популяции требуютD различается в зависимости от частоты типа мутации генома или перегруппировки, выбранного для исследования. Как минимум, должна быть достаточно материнские клетки для получения по меньшей мере, один мутантный колонию каждого населения для вычисления частоты мутаций. На практике, результаты могут быть весьма переменная, если только от нуля до пяти мутантные колонии ожидать от численности населения, и даже небольшое увеличение численности населения, так что 9:55 мутантные колонии, как ожидается, может значительно улучшить воспроизводимость. Когда биотин маркировки стартовый населения, эффективность восстановления для каждого сорта должны быть приняты во внимание, чтобы помочь определить соответствующий размер популяции, необходимую для измерения частоты мутаций в старых материнских клеток. С 90% восстановления материнских клеток после каждого рода, только 59% от первоначального населения будут возмещены после пяти туров роста и сортировки. Это падает до ~ 33% восстановление исходной популяции после пяти туров роста и сортировки, если только 80% меченых материнских клеток восстановитьред в течение каждого рода. Измерение и максимальной рекуперации имеет решающее значение при измерении низкие события частоты, так как 2:58 кратное снижение численности населения может легко привести к непредсказуемым числом мутантных колоний в популяции.
Существуют многочисленные возможности для расширения или изменения этого протокола для получения более глубокого понимания нестабильности генома во время митотического клеточного старения. Простые примеры включают анализа того, как изменения в генных функций, изменения средств массовой информации, или других изменений состояния окружающей среды изменить накопление мутаций с возрастом. Мутация ставки для молодых клеток с измененной генной функции или в надлежащем состоянии будет измеряться и используется для определения того накапливаются мутации по-разному, чем предсказывали значений скорости и по-другому, чем в контрольной популяции клеток. Клеточные популяции в различных точках в течение репликативного старения может подвергаться воздействию определенных факторов стресса, таких как активных форм кислорода или повреждающих ДНК агентов.переходных и мягкий контакт с окислительным стрессом существенно не изменяют способность выполнять сортировки клеток (рисунок 3), но более жесткие напряжения может осложнить восстановление клеток. Предварительные эксперименты необходимо будет убедиться, что материнские клетки могут быть восстановлены эффективно после конкретных напряжений. Кроме того, клеточные характеристики отдельных материнских клеток могут быть проанализированы в деталях, в том числе уровней активных форм кислорода, митохондрии и вакуоли морфологии и других физиологических особенностей, связанных со старением 3. Кроме того, материнские клетки может быть началом населения для дальнейшего лечения или манипуляций. Поскольку мать и дочь клетки физически отделены во время процедуры, дочерние клетки также по-прежнему доступны для анализа. Например, изменения в физиологических особенностей дочерних клеток или асимметричной наследования поврежденных макромолекул между дрожжевой матери и дочерних клеток <sдо> 24 можно сравнить с сроках любых интересных изменений в мутации частот / скоростей. Частота мутаций для населения дочь клеток также может быть получена, чтобы попытаться смоделировать есть ли асимметричный наследования мутаций во репликативного старения. Таким образом, объединение обогащение материнских клеток с помощью магнитной сортировки клеток с колебанием тестов позволяет преимущества S. CEREVISIAE модель системы, которые будут эффективно применяться для исследования механизмов, ответственных за накопление генетических изменений при митотического клеточного старения.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была частично поддержана грантом R00AG031911 из Национального института по проблемам старения из Национального института здоровья в УМХ содержание этой статьи не обязательно отражают официальную точку зрения Национального института здравоохранения.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | 100mg |
Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | 2ml MicroBeads conjugated to monoclonal mouse anti-biotin antibodies (isotype: mouse IgG1) |
MACS LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | 25 columns suitable for QuadroMACS separator |
QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | Separator Only |
QuadroMACS Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-091-051 | Includes: QuadroMACS Separator (130-090-976), MACS MultiStand (130-042-303), LS Columns (130-042-401), MACS 15ml Tube Rack (130-091-052), One 2ml unit of MACS MicroBeads. Note: Alternative systems include Dynabeads Biotin Binder and MagnaBind Magnetic Beads |
BD Falcon Cell Strainer, 40 µm | BD Biosciences | 352340 | 40 µm for use with BD Falcon 50 ml Conical Tubes. 50 per pack |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | Powder, filtering after dissolving important to remove particulates |
Wheat germ agglutinin Alexa Fluor488 | Life Technologies | W11261 | Conjugates with different excitation/emission spectra could also be used |
ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36930 | 10 ml, other antifade reagents could also be used |