Las tasas de mutación en células de Saccharomyces cerevisiae jóvenes medidos a través de pruebas de fluctuación se utilizan para predecir las frecuencias de mutación de células madre de diferentes edades replicativa. Clasificación magnética y citometría de flujo sirven entonces para medir las frecuencias de mutación real y la edad de las células madre para identificar cualquier desviación de las frecuencias de mutación predichos.
Saccharomyces cerevisiae ha sido un excelente sistema modelo para examinar los mecanismos y consecuencias de la inestabilidad del genoma. La información obtenida de este modelo de levadura es relevante para muchos organismos, incluyendo los seres humanos, ya que los factores de respuesta de reparación del ADN y daño en el ADN son bien conservadas a través de diversas especies. Sin embargo, S. cerevisiae aún no se ha utilizado para tratar completamente si la tasa de acumulación de mutaciones cambios con el aumento de replicativa (mitótica) edad debido a limitaciones técnicas. Por ejemplo, las mediciones de la levadura vida replicativa mediante micromanipulación implican muy pequeñas poblaciones de células, las cuales prohíben la detección de mutaciones raras. Métodos genéticos para enriquecer a las células madre en las poblaciones mediante la inducción de la muerte de las células hijas se han desarrollado, pero los tamaños de población todavía están limitados por la frecuencia con que se producen las mutaciones al azar que comprometen los sistemas de selección. El protocolo actual se aprovecha de sorti magnéticang de células madre de levadura marcada con la superficie para obtener grandes poblaciones suficientes de envejecimiento de las células madre para cuantificar mutaciones raras mediante selecciones fenotípicas. Las tasas de mutación, medidos a través de pruebas de fluctuación, y las frecuencias de mutación se establecieron por primera vez para las células jóvenes y se utilizan para predecir la frecuencia de mutaciones en las células madre de varias edades replicativa. Frecuencias de mutación se determinan entonces para las células madre ordenados, y la edad de las células madre se determina mediante citometría de flujo por tinción con un reactivo fluorescente que detecta cicatrices brote formadas en sus superficies celulares durante la división celular. Comparación de las frecuencias de mutación predichos basándose en el número de divisiones celulares a las frecuencias observadas experimentalmente para las células madre de una edad replicativa dada a continuación, puede identificar si hay cambios relacionados con la edad en la tasa de acumulación de mutaciones. Las variaciones de este protocolo básico proporcionan los medios para investigar la influencia de las alteraciones en las funciones de genes específicos ocondiciones ambientales específicas sobre acumulación de mutaciones para hacer frente a los mecanismos de inestabilidad del genoma subyacente durante el envejecimiento replicativo.
Microorganismos, tales como la levadura Saccharomyces cerevisiae, son excelentes modelos para la investigación de las tasas de mutación, pero estos modelos no se han utilizado plenamente para investigar la acumulación de mutaciones durante el envejecimiento mitótico de las células. La acumulación de mutaciones en el genoma nuclear ha planteado la hipótesis de contribuir al envejecimiento por lo que resulta en pérdida progresiva de la (o variación) en funciones de los genes 1. La capacidad de utilizar un sistema microbiano para estudiar los mecanismos y consecuencias de la acumulación de mutaciones durante el envejecimiento podría acelerar en gran medida la identificación de factores genéticos y ambientales que influyen en este proceso, debido a los sistemas genéticos fáciles y la facilidad de la cuantificación de los cambios fenotípicos raras en microorganismos. Factores de reparación del ADN y proteínas de respuesta al daño de ADN están bien conservadas a través de especies diversa 2, y las similitudes fundamentales en el envejecimiento del organismo se han identificado para organismos tan diversos como S. cerevisiae und mamíferos 3, por lo que es probable que los resultados obtenidos a partir de estudios en levaduras serán relevantes para el envejecimiento en muchos organismos.
Los estudios sobre el envejecimiento en S. cerevisiae hacer uso de dos tipos de envejecimiento que miden el envejecimiento cronológico o envejecimiento replicativo de las células. Envejecimiento cronológico se caracteriza por la pérdida progresiva de la viabilidad de las poblaciones de células de levadura que se encuentran en un (fase estacionaria) que no se dividen estado debido a agotamiento de los nutrientes 3. El modelo de envejecimiento cronológico se ha utilizado para demostrar que las mutaciones se acumulan con el aumento de la edad de 4, ya que las poblaciones de células grandes se obtienen fácilmente en este modelo para realizar selecciones fenotípicos para células mutantes. En este caso, la acumulación de mutación parece estar influenciada por las vías de señalización de crecimiento y estrés oxidativo 5, y cada uno de estos factores es relevante para la comprensión de envejecimiento en eucariotas multicelulares 3. El modelo de envejecimiento replicativo explota la divisi asimétricaen entre S. madre e hija células cerevisiae para la investigación de envejecimiento que se produce con sucesivas generaciones de células 3. Levadura envejecimiento replicativo menudo se ha medido a través de micromanipulación de las pequeñas poblaciones de la madre y las células hijas, o, más recientemente, a través de la microscopía de vídeo de las pequeñas poblaciones de células de levadura en dispositivos de microfluidos 6,7. Tamaño de las poblaciones limitadas hacen que estos enfoques poco adecuados para la investigación de la acumulación de mutaciones durante el envejecimiento mitótico menos que la información de todo el genoma se obtiene a partir de células individuales o cambios genéticos muy alta frecuencia se miden 8. Secuenciación de todo el genoma de las células individuales proporciona conjuntos de datos sustanciales para investigar la acumulación de mutaciones, pero los sistemas de selección fenotípicos tienen la importante ventaja de proporcionar un medio de medición de las tasas de mutación para estudiar los mecanismos de la acumulación de mutaciones subyacente. Los estudios para examinar las frecuencias de mutación y tarifas a través de selecciones fenotípicos en haploiaún no se han reportado d cepas de levadura durante el envejecimiento replicativo.
Las tasas de mutación se miden comúnmente mediante pruebas de fluctuación 9. Los valores de la frecuencia de mutación reflejan el número total de células que albergan una mutación en una secuencia de gen en una población. Esto incluye células en las que se producen mutaciones independientes y cualquier progenie de las células que heredan las mutaciones simplemente pre-existentes. Por el contrario, las tasas de mutación medidos a través de pruebas de fluctuación representan el número de mutaciones independientes que recién surgen con cada generación celular. Estas pruebas implican típicamente la inoculación de muchos cultivos replicados en bajas densidades celulares para reducir la probabilidad de que la adición de células con mutaciones preexistentes en una secuencia diana, el cultivo de las culturas a cerca de la saturación, y la identificación de células mutantes por crecimiento en medio selectivo. Los números de células mutantes identificados en las poblaciones replicadas se utilizan entonces en uno de varios modelos matemáticos para estimar el número de imutaciones ndependent que surgieron durante el crecimiento 9. Comparando el número de mutaciones independientes para el tamaño promedio de la población proporciona una medida de la tasa de mutación. En S. cerevisiae, las frecuencias de mutación y las tasas se miden con frecuencia utilizando los genes URA3 y CAN1, ya que la pérdida de función de las mutaciones en estos genes producen fenotipos seleccionables. Pérdida de la función URA3 hace que las células resistentes a 5-fluoroorótico ácido (5-FOA), ya que la proteína codificada por URA3 convierte 5-FOA en una molécula tóxica 10. La pérdida de función de CAN1 permite que las células se vuelven resistentes a canavanina, un análogo de arginina tóxico, ya que la proteína codificada por CAN1 transporta arginina y canavanina en las células 11.
Ambas estrategias de clasificación genéticos y físicos se han empleado con éxito para obtener poblaciones más grandes de S. células madre cerevisiae para facilitar las investigaciones del envejecimiento replicativo. Estrategias genéticas incluyen enfoques inteligentes que seleccionan contra la supervivencia celular hija en una población. El programa de enriquecimiento de la madre (MEP) implica-beta estradiol inducción de la expresión de la recombinasa Cre sólo en células hijas, lo que lleva a la interrupción-hija específica de dos genes esenciales que fueron diseñados para contener sitios loxP 12. MEP cepas pueden cultivarse normalmente en la ausencia del inductor, pero sólo las células madre continúan dividiéndose después de la inducción, mientras que las células hijas se arresto en la fase M típicamente durante su primera progresión a través del ciclo celular 12. Aunque este sistema no se ha utilizado ampliamente para estudiar la acumulación de mutaciones durante el envejecimiento, se ha utilizado para estudiar la pérdida de heterocigosidad, una forma relativamente frecuente de inestabilidad del genoma en las cepas de levadura diploides, así como cambios bioquímicos en las células madre envejecimiento 13,14. Del mismo modo, el sistema hija-descargador implica la expresión-hija específica de la S. cerevigen siae URA3 15. Cepas Hija-pararrayos crecen normalmente hasta 5-FOA se añade al medio, en el que las células que expresan el punto hija URA3 morirán, mientras que las células madre continúan creciendo 15. Estos son sistemas útiles para enriquecer en células madre, pero dependen de mantenimiento de las funciones de los genes que constituyen el sistema de selección. Mutaciones al azar en uno o más componentes del sistema de selección podrían dar lugar a células hijas que escapan a la selección y proliferan exponencialmente. Durante el desarrollo de las cepas del MEP, tamaños apropiados de población estaban decididos a evitar la aparición de células hijas mutantes que podrían escapar de la selección 12. Sin embargo, este límite de tamaño de la población pone en peligro la detección de formas raras de la inestabilidad del genoma durante el envejecimiento replicativo. Esta restricción en el tamaño de la población podría ser parcialmente superada por la utilización de cepas de levadura diploide con dos copias de cada gen que contribuye al sistema de selección, ya que la mayoríamutaciones serían probablemente recesiva 12. Sin embargo, el uso de cepas diploides limita los tipos de eventos mutacionales que se pueden detectar fácilmente en comparación con aquellos que pueden detectarse fácilmente en células de levadura haploides.
Las estrategias de clasificación físicas incluyen el aislamiento de células madre con una superficie de la célula marcada de las células hijas no marcados para enriquecer para grandes poblaciones de células madre. La observación de que las proteínas de la superficie celular (proteínas de la pared celular) de S. células hijas cerevisiae están recién sintetizados en ciernes ha sido explotada para marcar las células madre sin etiquetar las células hijas que producen 16. Por ejemplo, una población inicial de células de levadura en su superficie marcadas con biotina se puede cultivar y luego aislado a partir de sus células hijas usando microperlas anti-biotina y clasificación magnética 16 porque las células hijas generadas por la población inicial no contienen biotina en su superficie . Crecimiento de serie yclasificación permite que las poblaciones progresivamente mayores de las células madre que se obtienen y analizan. Este procedimiento ha sido utilizado con éxito para examinar los cambios en la fisiología celular y la expresión génica durante el envejecimiento replicativo de levadura 13,14,17,18. El método actual se adapta este marcaje con biotina y la técnica de clasificación magnética para enriquecer en células madre con el propósito de medir la acumulación de mutaciones potencialmente raras u otras formas de inestabilidad del genoma ensayadas a través de selecciones fenotípicas. El crecimiento de serie y la clasificación física permiten el análisis de la acumulación de mutaciones en células madre progresivamente mayores, así como en sus poblaciones de células hijas. Determinación de las tasas de mutación por generación permite una frecuencia de mutación predicha que se calcula para las células madre que han sido sometidos a un número determinado de divisiones celulares. Dado que los valores de frecuencia previstas se basan en el aumento esperado debido a rondas adicionales de la división celular, las desviaciones sustanciales en los Mutati observadosen las frecuencias en comparación con los valores previstos proporcionar evidencia de cambios específicos de la edad en la tasa de mutaciones que se acumulan. Usando este protocolo, la tinción fluorescente de las cicatrices del brote que corresponden a los sitios de divisiones celulares en las células madre, junto con el análisis por citometría de flujo se puede utilizar para determinar rápidamente la distribución de edad de las poblaciones clasificadas y sin clasificar. Reactivos fluorescentes adicionales, tales como los utilizados para la detección de especies reactivas del oxígeno, también se pueden utilizar durante este protocolo. En general, este protocolo permite el análisis eficiente de los cambios dependientes de la edad en la inestabilidad del genoma con el potencial de correlación con los teléfonos cambios fisiológicos relacionados con la edad en un organismo modelo muy adecuado para el estudio de los factores genéticos y ambientales que influyen en la inestabilidad del genoma relacionadas con el envejecimiento.
Este protocolo combina múltiples métodos para permitir que los recursos y enfoques disponibles en los Saccharomyces cerevisiae sistema modelo para ser aplicado de manera eficiente para el estudio de la inestabilidad del genoma durante el envejecimiento celular mitótico. Una amplia variedad de ensayos para cuantificar las diferentes formas de inestabilidad del genoma a través de la selección fenotípica se podría combinar con clasificación magnética para estudiar posibles cambios específicos de la edad en la acumulación de formas particulares de mutaciones o reordenamientos cromosómicos. Mientras que los enfoques de secuenciación de todo el genoma podrían proporcionar más información acerca de los tipos generales de cambios que se producen en un genoma con la edad, la capacidad de utilizar sistemas de selección fenotípicos para obtener mediciones de la tasa de mutación y para aislar preferencialmente tipos específicos de cambios genéticos son ventajas importantes para estudiar mecanicista aspectos de la inestabilidad del genoma relacionado con el envejecimiento. Racionalizar la determinación de la edad celular y el potencial para hacer las mediciones paralelas de physiologicambios Cal por medio de citometría de flujo proporcionan medios eficaces para correlacionar la inestabilidad del genoma con otros cambios celulares durante los intervalos de edad. Determinación de los posibles cambios dependientes de la edad en las tasas de acumulación de mutaciones requiere: 1) la determinación de las tasas de cuidado en poblaciones de células jóvenes, 2) la determinación precisa de la edad celular, y 3) la capacidad para enriquecer de forma fiable suficientemente grandes poblaciones de células madre para medir de forma reproducible la inestabilidad del genoma en la vejez. Este enfoque permite que el sistema modelo de levadura de contribuir a la definición de los mecanismos subyacentes responsables de los cambios dependientes de la edad en los tipos y / o frecuencias de la inestabilidad del genoma en células en mitosis. Por otra parte, los factores genéticos y ambientales pueden ser evaluados rápidamente para las contribuciones a la inestabilidad del genoma dependiente de la edad. En última instancia, estas caracterizaciones podrían conducir al desarrollo de modelos que dan cuenta de la manera en que las mutaciones se acumulan durante el envejecimiento replicativo.
Este método depende de la capacidad para detectar mutaciones o otros tipos de inestabilidad del genoma a través de la aparición de fenotipos seleccionables para medir las tasas de tales eventos. Sin embargo, la creatividad en el diseño del ensayo puede permitir que muchos aspectos de la inestabilidad del genoma para ser investigados. Por ejemplo, el URA3 y genes CAN1 se pueden colocar en diferentes sitios genómicos para probar cualquier influencia de la localización genómica en los resultados. Reversión de alelos de genes no funcionales específicas para funcionales alelos de genes podría probar particulares procesos de mutación. Además, la introducción de múltiples alelos inactivos de un gen o que flanquean un gen con secuencias de repetición podría ser utilizado para examinar los eventos de recombinación mediante la restauración o la pérdida de la función del gen, respectivamente. Pruebas de fluctuación son el enfoque estándar para la determinación de las tasas de estos diversos eventos de inestabilidad del genoma 9. El protocolo está escrito utilizando el Lea-Coulson estimador de la mediana bien aceptada y relativamente sencillo determinar mutatasa ción para hacerla más accesible a los diversos investigadores, a pesar de que el método MSS-máximo estimador de probabilidad se considera el mejor método para la determinación de las tasas de mutación 9. El estimador de máxima verosimilitud MSS-ha sido revisado anteriormente en detalle 9, y se puede utilizar como un método alternativo, pero requiere cálculos más sofisticados. Como alternativa, el software libre para el cálculo de las tasas de mutación con este método se ha puesto a disposición 22. La obtención de medidas reproducibles de las tasas de mutación requiere la atención sobre algunos aspectos del diseño experimental, incluyendo el uso de cultivos replicados suficientes, la inoculación de cultivos a suficientes densidades celulares iniciales bajos que tamaño de la población se incrementa en volúmenes de cultivo de 10.000 veces o más, y que eligen adecuadas para que la totalidad población de células se puede propagar en un medio selectivo. Para el último punto, la fórmula descrita anteriormente se puede utilizar para ajustar la tasa de mutación basado en la fracción de la cultura tested 9. La variación en la tasa de crecimiento de cultivos puede complicar la determinación de una tasa de mutación reproducible, y un estimador basado en el medio modificado que puede producir resultados más reproducibles en tales situaciones Recientemente se ha descrito 23.
La capacidad de medir con precisión la edad celular es otro factor que es importante para establecer si las frecuencias de la inestabilidad del genoma en las células viejas son diferentes de los valores esperados debido a la tasa de eventos en células jóvenes. Hemos encontrado tinción WGA ser preferible calcoflúor tinción blanco, tanto en términos de fondo y la flexibilidad, ya que WGA está disponible conjugado a diferentes moléculas fluorescentes. Esta flexibilidad puede proporcionar más oportunidades para las mediciones simultáneas de otras características de las células con reactivos fluorescentes. El trabajo inicial de establecer una relación entre la intensidad de la señal para la tinción de Ventajas de Windows Original y el número correspondiente de las cicatrices del brote en las células puede entonces conducir a una másdeterminación rápida de la edad celular a través de citometría de flujo. Este enfoque también permite el uso de tamaños de las poblaciones más grandes de lo que sería normalmente examinadas por microscopía para mejorar la reproducibilidad de las mediciones. Mientras que todas las determinaciones de edad se podrían hacer a través del examen microscópico de las células, que sentimos que la citometría de flujo enfoque facilita la rápida detección de los factores que influyen en la inestabilidad del genoma dependiente de la edad.
Además de medir la edad de células de forma fiable, la consideración debe darse a la cantidad de divisiones celulares células madre se les permite someterse con cada ronda sucesiva de crecer y clasificación de células. El uso de un tamaño de la población inicial más pequeña o un volumen de cultivo más grande podría permitir que las células se someten a más divisiones celulares antes de llegar a la densidad celular deseada. Por ejemplo, los investigadores han utilizado sólo dos rondas de clasificación para obtener muy viejas células de levadura 16, que tiene la ventaja evidente de la obtención de las células viejas con menos Experimepasos NTAL. Al considerar la posibilidad de aumentar el volumen de cultura para permitir que las células se completan más divisiones celulares antes de la clasificación, tenga en cuenta el límite del número total de células que se pueden procesar en una sola columna. El uso de un volumen de cultivo más grande puede requerir el uso de múltiples columnas para ordenar una población celular. Además, si las células se someten a un menor número de rondas de división celular entre los puntos de clase / colección, entonces hay más oportunidades de observar las desviaciones de las frecuencias de mutación que se espera en los puntos de tiempo distintos durante la vida útil. Por ejemplo, el muestreo sólo en principios y finales de los puntos de tiempo durante la vida puede producir datos que indican un aumento constante en la frecuencia de mutación, pero el muestreo en los momentos intermedios adicionales durante la vida pueden mostrar que aumenta la frecuencia de mutación rápida y luego estancarse. Sin embargo, ya que este protocolo aísla las células madre viejas, hay una oportunidad de obtener una medida más directa de los cambios en las tasas de mutación con la edad. Pruebas de fluctuación podría abe realizó usando células madre de diferentes edades para determinar si la tasa de mutación será diferente de la tasa obtenida usando células jóvenes. Mientras que las culturas de estas pruebas de fluctuación se convertirán en una mezcla de células viejas y jóvenes a medida que crecen, cualquier desviación de las tasas obtenidas a partir de células jóvenes podrían atribuirse a la utilización de una población de partida más.
La capacidad para obtener de forma reproducible una gran población suficiente de células madre de edad para medir con precisión la inestabilidad del genoma es esencial para el éxito de este enfoque. Aunque el protocolo describe el uso de un sistema de clasificación magnética particular, para este propósito, otros grupos han clasificado las células madre de levadura con sistemas alternativos 14,18 (véase la Tabla de Materiales). Tales sistemas alternativos también deben trabajar con este método, aunque algunos optimización de los protocolos de los fabricantes podría ser requerida. Independientemente del sistema específico utilizado, el tamaño de la población requiered difiere dependiendo de la frecuencia del tipo de mutación o reordenamiento del genoma elegido para el estudio. Como mínimo, debe haber suficientes células madre para obtener al menos una colonia mutante por población para calcular una frecuencia de mutación. En la práctica, los resultados pueden ser bastante variables si se espera que sólo cero a cinco colonias mutantes del tamaño de la población, e incluso un pequeño aumento en el tamaño de la población, por lo que se espera de cinco a diez colonias mutantes, puede mejorar mucho la reproducibilidad. Cuando biotina etiquetado de una población de partida, la eficiencia de recuperación para cada especie necesita ser tenido en cuenta para ayudar a identificar el tamaño de la población apropiada necesario medir la frecuencia de mutación en las células madre de edad. Con un 90% de recuperación de células madre después de cada especie, sólo el 59% de la población original se recuperó después de cinco rondas de crecimiento y la clasificación. Esto se reduce a ~ 33% de recuperación de la población original después de cinco rondas de crecimiento y la clasificación si sólo el 80% de las células madre marcadas se recuperecado durante cada clase. La medición y maximizar la recuperación es crucial cuando se mide acontecimientos de baja frecuencia, ya que de dos a tres veces disminución en tamaño de la población podría conducir fácilmente a los números de poco fiables de colonias mutantes por población.
Hay numerosas opciones para ampliar o modificar este protocolo para obtener una comprensión más amplia de la inestabilidad del genoma durante el envejecimiento celular mitótico. Ejemplos simples incluyen el análisis de cómo las alteraciones en las funciones de genes, los cambios de medios, u otros cambios de condición ambiental alteran la acumulación de mutaciones con la edad. Las tasas de mutación para las células jóvenes con la función del gen alterado o en la condición apropiada se miden y utilizan para determinar si las mutaciones se acumulan de manera diferente de lo previsto por los valores de frecuencia y de manera diferente que en las poblaciones celulares de control. Las poblaciones de células en diferentes puntos durante el envejecimiento replicativo podrían estar expuestos a factores de estrés específicos, tales como especies reactivas de oxígeno o agentes que dañan el ADN. Aexposición transitoria y leve a estrés oxidativo no alteró sustancialmente a la capacidad para llevar a cabo clasificación de células (Figura 3), pero más severas tensiones puede complicar la recuperación de las células. Experimentos preliminares serían necesarias para verificar que las células madre aún se pueden recuperar de manera eficiente después de tensiones específicas. Además, las características celulares de las células madre aisladas podrían ser analizados en detalle, incluyendo los niveles de especies reactivas de oxígeno, la morfología mitocondrial y vacuolar, y otras características fisiológicas que se asocian con el envejecimiento 3. Además, las células madre pueden ser una población de partida para un tratamiento adicional o manipulación. Dado que las células madre y la hija están separados físicamente durante el procedimiento, las células hijas también están todavía disponibles para el análisis. Por ejemplo, los cambios en las características fisiológicas de las células hijas o la herencia asimétrica de macromoléculas dañadas entre la madre de levadura y células hijas <shasta> 24 se podría comparar con el momento de los cambios interesantes en mutación frecuencias / tarifas. Frecuencias de mutación para poblaciones de células hija también se podrían obtener con el fin de tratar de modelar si hay herencia asimétrica de mutaciones durante el envejecimiento replicativo. En resumen, la combinación de enriquecimiento de células madre a través de clasificación celular magnética con las pruebas de fluctuación permite las ventajas de la S. sistema modelo cerevisiae que se aplicará de manera eficiente a la investigación de los mecanismos responsables de la acumulación de cambios genéticos durante el envejecimiento celular mitótico.
The authors have nothing to disclose.
Esta obra fue financiada en parte por subvención R00AG031911 del Instituto Nacional del Envejecimiento de los Institutos Nacionales de Salud para PHM El contenido de este artículo no reflejan necesariamente la posición oficial de los Institutos Nacionales de Salud.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | 100mg |
Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | 2ml MicroBeads conjugated to monoclonal mouse anti-biotin antibodies (isotype: mouse IgG1) |
MACS LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | 25 columns suitable for QuadroMACS separator |
QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | Separator Only |
QuadroMACS Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-091-051 | Includes: QuadroMACS Separator (130-090-976), MACS MultiStand (130-042-303), LS Columns (130-042-401), MACS 15ml Tube Rack (130-091-052), One 2ml unit of MACS MicroBeads. Note: Alternative systems include Dynabeads Biotin Binder and MagnaBind Magnetic Beads |
BD Falcon Cell Strainer, 40 µm | BD Biosciences | 352340 | 40 µm for use with BD Falcon 50 ml Conical Tubes. 50 per pack |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | Powder, filtering after dissolving important to remove particulates |
Wheat germ agglutinin Alexa Fluor488 | Life Technologies | W11261 | Conjugates with different excitation/emission spectra could also be used |
ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36930 | 10 ml, other antifade reagents could also be used |