Dalgalanması testleri ile ölçülen genç Saccharomyces cerevisiae hücrelerinde mutasyon oranları farklı Replikatif yaştan annesi hücrelerinin mutasyon frekansları tahmin etmek için kullanılır. Manyetik ayırma ve akım sitometri sonra tahmin mutasyon sıklıkları sapmaları tespit etmek, gerçek mutasyon frekansları ve anne hücrelerin yaşını ölçmek için kullanılır.
Saccharomyces cerevisiae mekanizmaları ve genom istikrarsızlık sonuçlarını incelemek için mükemmel bir model sistem olmuştur. DNA onarımı ve DNA tamir faktörler tam olarak çeşitli türlerin boyunca korunduğu için, bu maya modelden elde edilen bilgiler, insanlar dahil olmak üzere bir çok organizmada, ile ilgilidir. Bununla birlikte S. cerevisiae henüz tam olmadığını yaş artan Replikatif (mitoz) ile mutasyonlar değişiklikleri biriken oranı teknik zorlamalar nedeniyle hitap kullanılan olmamıştır. Örneğin, mikromanipülasyon yoluyla maya Replikatif ömrü ölçümleri nadir mutasyonları tespit yasaklayan hücrelerinin çok küçük nüfus kapsayabilir. Kızı hücrelerinin ölümünü uyararak toplumlarda anne hücreleri zenginleştirmek üzere genetik yöntemler geliştirilmiştir, ancak nüfus büyüklükleri yine seçim sistemleri tehlikeye rastgele mutasyonların meydana geldiği ile frekansı ile sınırlıdır. Geçerli protokol manyetik Sorti yararlanıryüzey-etiketli maya anne hücreleri ng fenotipik seçimleri arasında nadir mutasyonları ölçmek için anne hücreleri yaşlanma yeterince büyük popülasyonları elde etmek. Dalgalanması testleri ile ölçülen mutasyon oranları, ve mutasyon frekansları ilk genç hücreler için kurulan ve çeşitli Replikatif yaş annesi hücrelerinde mutasyonların sıklığını tahmin etmek için kullanılır. Mutasyon frekanslar sıralanmış bir ana hücreler için belirlenir, ve ana hücrelerin yaş hücre bölünmesi esnasında, hücre yüzeyleri üzerinde oluşturulan tomurcuk izleri tespit eden bir flüoresan tepkime maddesi, ile boyama ile akış sitometrisi kullanılarak belirlenir. Deneysel olarak, belirli bir replikatif yaş ana hücrelerde gözlemlenen frekanslara hücre bölünmesini sayısına göre tahmin mutasyon frekansın karşılaştırılması daha sonra biriken değişim oranından yaşa bağlı değişiklik olup olmadığını belirleyebilir. Bu temel protokolün Varyasyonları özgü gen işlevlerinde değişikliklerin etkisini araştırmak için araçları sağlamak veyamutasyon birikimi belirli çevresel koşullar Replikatif yaşlanma sırasında mekanizmalar yatan genom istikrarsızlığı gidermek için.
Bu tür maya Saccharomyces cerevisiae gibi mikroorganizmalar, mutasyon hızı incelemek için mükemmel bir model olan, ancak tam olarak bu modeller, hücrelerin mitotik yaşlanma sırasında mutasyonların birikimine araştırmak için kullanılan edilmemiştir. Nükleer genomu içerisinde, mutasyon birikimi gen fonksiyonlarının 1 (veya varyasyonun) ilerleyen kaybıyla sonuçlanan yaşlanma katkıda sürülmüştür. Büyük ölçüde çünkü uyduruk genetik sistemlerin bu süreci etkileyen genetik ve çevresel faktörlerin belirlenmesi ve mikroorganizmalar nadir fenotipik değişiklikleri nicel kolaylığı hızlandırabilir yaşlanma sırasında mekanizmaları ve mutasyon birikimi sonuçlarını incelemek için bir mikrobiyal sistemi kullanmak için yeteneği. DNA onarım faktörler ve DNA hasar cevabı proteinler de farklı türlerin 2 boyunca korunduğu, ve organizma yaşlanma temel benzerlikler S. gibi çeşitli organizmaların tespit edilmiştir cerevisiae birmuhtemelen bu hale d memeliler 3, maya çalışmalardan elde edilen sonuçlar, birçok organizmada yaşlanma ile ilgili olacaktır.
S. yaşlanma Çalışmaları cerevisiae kronolojik yaşlanma veya hücre kopyelenebilir yaşlanmasını ölçen iki yaşlanma modelleri faydalanmak. Kronolojik yaşlanma nedeniyle besin tüketme 3'e bölünmeyen durumu (sabit faz) olan maya hücre popülasyonlarında canlılığının ilerleyen kaybıyla karakterize edilir. Kronolojik yaşlanma modeli, büyük hücre popülasyonları kolayca mutant hücrelerin fenotipik seçim yapmak için bu modelde elde edildiğinden mutasyonlar, yaş arttıkça 4 birikir olduğunu göstermek için kullanılmıştır. Bu durumda, mutasyon birikimi büyüme sinyal yolları ve oksidatif stres 5 tarafından etkilenmiş gibi görünüyor, ve bu faktörlerin her biri çok hücreli ökaryotlarda 3 yaşlanma anlaşılması için uygun olduğu. Replikatif yaşlanma modeli kullanan asimetrik DiViSiS. ile ilgili ardışık hücre nesiller 3 ile oluşur yaşlanmayı araştıran cerevisiae anne ve kızı hücreler. Maya Replikatif yaşlanma sık microfluidic cihazlar 6,7 maya hücreleri küçük popülasyonlar video mikroskobu ile anne ve kızı hücreleri, ya da daha yakın zamanda, küçük popülasyonlarının mikromanipülasyon ile ölçülmüştür. Sınırlı popülasyon boyutları tam genom bilgileri tek hücre elde edilen ya da çok yüksek frekanslı genetik değişiklikler 8 ölçülür sürece mitotik yaşlanmada mutasyon birikimi araştırılması için, bu yaklaşımlar kötü uygun hale gelir. Tek tek hücrelerin tam genom sekanslama gibi sahalarda mutasyon birikimi araştırmak için büyük ölçüde veri setleri sağlar, ancak fenotipik seçim sistemleri, altta yatan mutasyonun birikimi incelemek için mutasyon oranlarını ölçmek için bir araç sağlayan büyük avantajlara sahiptir. Çalışmalar haploi fenotipik seçimleri yoluyla mutasyon frekansları ve oranlarını incelemek içinReplikatif yaşlanma sırasında d maya suşları henüz rapor edilmemiştir.
Mutasyon oranları yaygın dalgalanma testleri 9 kullanılarak ölçülür. Mutasyon frekans değerleri bir popülasyonda bir gen sekansı içerisinde bir mutasyon taşıyan hücrelerin toplam sayısını yansıtmaktadır. Bu bağımsız mutasyonların meydana geleceği hücreler ve sadece önceden mevcut olan mutasyonları taşıyan bu hücrelerin herhangi bir soyunu kapsar. Bunun aksine, dalgalanma testleri vasıtasıyla ölçülen bir mutasyon oranı, yeni nesil her bir hücre ile ortaya çıkan mutasyonlar bağımsız sayısını temsil eder. Bu testler tipik olarak, bir hedef dizisi daha önceden var olan mutasyonlar ile hücrelerin ilave yakın doyması kültürlerinin yetiştirilmesine ve seçici ortam üzerinde büyüme mutant hücreler tanımlama olasılığını azaltmak için, düşük hücre yoğunluklarında kültür aşılamak çok tekrarlanan içerir. Suret popülasyonunda tespit mutant hücrelerin sayısı daha sonra i sayısını tahmin etmek için çeşitli matematiksel modeller biri kullanılırbüyüme 9 sırasında ortaya ndependent mutasyonlar. Ortalama nüfus büyüklüğü bağımsız mutasyonların sayısını karşılaştırarak mutasyon oranı bir ölçü sağlar. S., Bu genlerin kaybı fonksiyon-mutasyonlar seçilebilir fenotiplerini üretmek beri cerevisiae, mutasyon frekansları ve oranları sık sık, URA3 ve CAN1 genleri kullanarak ölçülür. URA3 tarafından kodlanan protein molekülü toksik 10 içine 5-FOA dönüştürür yana bir URA3 fonksiyon kaybı, 5-fluoroorotik asit (5-FOA) dirençli hücre oluşturur. CAN1 şifrelediği protein, hücrelere 11 içine arginin ve kanavanin taşıma yana CAN1 fonksiyon kaybı, hücreler canavanine, toksik bir arginin analogunun dirençli olmayı sağlar.
Hem genetik hem de fiziksel sıralama stratejileri başarıyla S. geniş popülasyonları elde etmek için istihdam edilmiştir cerevisiae anne hücreleri Replikatif yaşlanma soruşturmaları kolaylaştırmak için. Genetik stratejileri bir popülasyonda kızı hücre hayatta karşı seçim zeki yaklaşımları içermektedir. Annesi zenginleştirme programı (MEP) loxp siteleri 12 içerecek şekilde tasarlanmıştır edilen iki temel genlerin kızı özgü bozulmasına yol açan, sadece kız hücrelerde Cre yeniden ifade beta-östradiol indüklenmesini içerir. MEP suşlar, uyarıcının yokluğunda normal olarak yetiştirilebilir, ancak anne kız hücreler hücreler, hücre siklüsü boyunca 12 ilk ilerlemesi sırasında tipik olarak, M-fazında tutuklama olurken, indüksiyonundan sonra bölünmeye devam edecektir. Bu sistem, genel olarak yaşlanma sırasında mutasyon birikimi incelemek için kullanılmış olsa da, bu yaşlanma ana hücrelerinde 13,14 heterozigosite kaybı, diploit maya suşlarında genom istikrarsızlık nispeten sık bir formu, hem de biyokimyasal değişiklikler incelemek için kullanılmıştır. Benzer şekilde, kızı-deşarj sistemi S. kızı özgü ifadesini içerir cereviSIAE URA3 geninin 15. 5-FOA hangi URA3 ifade noktası yavru hücre ölür, ortamına ilave edilene kadar ana hücreler 15 büyümeye devam eder kızı-deşarj suşları, normal büyümeyi sürdürmüştür. Bu ana hücreler için kullanışlı ettirecek sistemleri, ancak seçim sistemi oluşturan gen fonksiyonlarının korunması bağlıdır. Seçim sistemi bir ya da daha çok bileşen olarak rastgele mutasyonların seçimi kaçış ve katlanarak çoğalmasına kız hücrelerde neden olabilir. MEP suşların gelişimi sırasında, uygun nüfus büyüklükleri seçimi 12 kaçış olabilir mutant kızı hücrelerin görünümünü önlemek için kararlı idi. Ancak, nüfus büyüklüğü bu sınır Replikatif yaşlanma sırasında genom istikrarsızlık nadir formları algılama ödün. Nüfus büyüklüğüne Bu kısıtlama kısmen her genin iki kopyası çünkü çoğu, seçim sistemi katkıda diploid maya suşları kullanılarak üstesinden gelinebilirmutasyonlar büyük olasılıkla 12 çekinik olacaktır. Bununla birlikte, Diploid suşların kullanımı kolay uygulanabilen, haploit maya hücrelerinde tespit edilebilir kıyasla tespit edilebilir mutasyon olayları türlerini kısıtlar.
Fiziksel sıralama stratejileri ana hücrelerinde büyük nüfuslu zenginleştirmek için etiketsiz kızı hücrelerden etiketli bir hücre yüzeyi ile anne hücrelerin izolasyonu bulunmaktadır. S. hücre yüzeyi proteinleri olduğu şeklindeki gözlem, (hücre duvarı) cerevisiae kızı hücreler yeni onlar 16 üretmek kızı hücrelerin etiketlenmesi olmadan anne hücreleri etiketlemek için istismar edilmiştir tomurcuklanma sırasında sentezlenir. Örneğin, biyotin ile etiketlenmiş yüzey üzerinde maya hücrelerinin bir ilk popülasyon yetiştirilebilir ve daha sonra, başlangıç popülasyonu tarafından üretilen yavru hücre yüzeyinde biyotin içermez, çünkü 16 sıralama, anti-biyotin ve manyetik mikro-boncuklar kullanılarak kız hücrelerde izole . Seri büyüme veayırma ana hücrelerin giderek daha büyük popülasyonları elde edilmiş ve analiz edilmesini sağlar. Bu prosedür maya 13,14,17,18 kopyelenebilir yaşlanma sırasında hücre fizyolojisi ve gen ekspresyon değişiklikleri incelemek için başarıyla kullanılmaktadır. Mevcut yöntem, potansiyel olarak nadir mutasyonlar veya fenotipik tahlil seçimleri arasında genom istikrarsızlık diğer formları birikiminin ölçülmesi amacı ile ana hücreleri zenginleştirmek üzere bu biotin ile etiketlenmesinde ve manyetik ayırma tekniği uyarlar. Seri büyüme ve fiziksel ayrıştırma giderek daha büyük hücrelerinde de mutasyon birikimi analizi, hem de kendi kızı hücre popülasyonu sağlar. Nesil başına mutasyon oranlarının belirlenmesi öngörülen mutasyon frekans hücre bölünmeleri belli bir sayıda uğramıştır anne hücreleri için hesaplanacak izin verir. Tahmin frekans değerleri nedeniyle gözlenen Mutati hücre bölünmesinin ek mermi, önemli sapmalar beklenen artış dayalı olduğundantahmin edilen değerlerle karşılaştırıldığında frekanslar üzerinde biriken değişim oranından yaşa özel değişiklikler kanıtlarıdır. Bu protokolü kullanarak, akış sitometri analizi ile birleştiğinde anne hücreleri üzerinde hücre bölünmeleri sitelerine karşılık tomurcuk izleri floresan boyama hızla sıralı ve sıralanmamış nüfusun yaş dağılımını belirlemek için kullanılabilir. Bu tür reaktif oksijen türlerini tespit etmek için kullanılanlar gibi floresan ilave reaktifler, aynı zamanda Bu protokol uygulamasında kullanılabilir. Genel olarak, bu protokol yaşlanma ile ilgili genom istikrarsızlık etkileyen genetik ve çevresel faktörleri araştırmak için uygun bir model organizma yaşa bağlı hücre fizyolojik değişikliklere korelasyon potansiyeli ile genom istikrarsızlık yaşa bağlı değişikliklerin etkili analiz sağlar.
Bu protokol, kaynak için birden çok yöntem ve verimli bir şekilde bir araya mitotik hücre yaşlanmada genom istikrarsızlık çalışma uygulanacak olan S. cerevisiae, Saccharomyces model sistemi kullanılabilir yaklaşımlar. Deneylerinin çok çeşitli fenotipik seçim ile genom istikrarsızlık farklı formları ölçmek için mutasyonlar ya da kromozom yeniden düzenleme biçimlerine birikimi mümkün yaşa özel değişiklikleri incelemek için manyetik sıralama ile birleştirilebilir. Bütün-genom dizileme yaklaşımlar yaş ile bir genom içinde meydana gelen değişikliklerin genel türleri hakkında daha fazla bilgi sağlayabilir ederken, mutasyon hızı ölçümleri elde etmek için fenotipik seçim sistemlerini kullanmak ve tercihen genetik değişikliklerin belirli türleri izole etmek yeteneği mekanik eğitimi için önemli avantajları yaşlanma ile ilgili genom istikrarsızlık yönleri. Hücre yaş belirlenmesi ve potansiyelini düzene physiologi paralel ölçümler yapmak içinakışı ile cal değişiklikler sitometri belirli yaş aralıklarında sırasında diğer hücresel değişiklikler ile genom istikrarsızlık korelasyon etkili bir yoldur. Biriken mutasyonlar oranlarında potansiyel yaşa bağlı değişikliklerin belirlenmesi için gereken: 1) dikkatli genç hücre popülasyonlarında oranlarının belirlenmesi, hücre yaş 2) doğru belirlenmesi, ve 3) güvenilir bir şekilde ölçmek için yeniden üretilebilir ana hücrelerin yeterince büyük popülasyonlarının zenginleştirilmesi için yeteneği Yaşlılıkta genom istikrarsızlık. Bu yaklaşım, maya model sistem oranları ve / veya mitotik aktivite gösteren hücrelerde genom istikrarsızlık frekanslarında yaşa bağlı değişikliklerden sorumlu altında yatan mekanizmaların tanımlanması katkıda bulunmaya olanak sağlamaktadır. Ayrıca, genetik ve çevresel etkenler hızla yaşa bağımlı genom istikrarsızlık katkıları için değerlendirilebilir. Sonuçta, bu karakterizasyonlar mutasyonlar Replikatif yaşlanma sırasında birikir hangi şekilde hesap modellerinin gelişmesine neden olabilir.
Bu yöntem, bu tür olayların oranını ölçmek için seçilebilir fenotip görünümüyle mutasyonları ya da genom istikrarsızlık diğer tür tespit etme yeteneğine bağlıdır. Ancak, deney tasarımı yaratıcılık genom istikrarsızlık birçok yönleri incelenecek izin verebilir. Örneğin, URA3 genlerinin ve CAN1 sonuçlarına genomik konumu hakkında herhangi bir etkilerini test etmek için farklı bir genomik bölgelere yerleştirilmiş olabilir. Fonksiyonel gen allelleri özgü işlevsel olmayan gen allel Reversiyon belirli mutasyon süreçleri test edebilir. Aynı zamanda, bir gen ya da tekrar sıraları ile bir gen eteklenen çoklu aktif olmayan allel giriş sırasıyla restorasyon ya da gen fonksiyon kaybı ile rekombinasyon olayları incelemek için kullanılabilir. Dalgalanma testleri bu çeşitli genom istikrarsızlık olayları 9 oranlarını belirlemek için standart yaklaşım vardır. Protokol muta belirlemek için iyi kabul ve nispeten basit Lea-Coulson medyan tahmincisi kullanılarak yazılıryon oranı MSS-maksimum olabilirlik tahmin yöntemi mutasyon oranları 9 belirlemek için en iyi yaklaşım olarak kabul edilir olsa da, farklı araştırmacılar için daha erişilebilir hale getirmek için. MSS-maksimum olabilirlik tahmincisi önce detaylı 9 gözden geçirilmiştir ve alternatif bir yöntem olarak kullanılabilir, ancak daha sofistike hesaplamalar gerektirir. Alternatif olarak, bu yöntem ile mutasyon oranlarını hesaplamak için ücretsiz yazılım 22 elde edilmiştir. Mutasyon oranları tekrarlanabilir tedbirleri alması, yeterli suret kültürleri kullanılarak yeterince düşük başlangıç hücre yoğunluklarında kültürleri aşılamak dahil deneysel tasarım, birkaç yönlerine dikkat gerektirdiğini 10.000 kat veya daha fazla, ve seçilmesinin uygun kültür hacimleri ile nüfus büyüklüğü artar tüm böylece hücre popülasyonları seçici ortam üzerine yayılır. İkinci nokta için, daha önce tarif edilen formül kültür teste fraksiyonuna dayanan mutasyon oranını ayarlamak için kullanılabilend 9. Kültürlerin büyüme oranında varyasyon tekrarlanabilir bir mutasyon oranı belirlenmesi ve son zamanlarda 23 tarif edilmiştir böyle durumlarda daha fazla tekrarlanabilir sonuçlar doğurabilir değiştirilmiş medyan tabanlı tahmincisi karmaşık hale getirebilir.
Doğru hücre yaşı ölçmek için yeteneği eski hücrelerin genomu dengesizlik nedeniyle genç hücrelere Frekanslar olayların oranı beklenen değerlerle farklı olup olmadığı kurulması için önemli olan diğer bir faktördür. WGA farklı floresan moleküllerine konjuge kullanılabilir beri, arka plan ve esneklik açısından hem de beyaz lekeleme Kalkofluor kıyasla tercih edilir olarak WGA, lekeleme bulduk. Bu esneklik floresan reaktif ile diğer hücre özelliklerinin ölçümleri için daha fazla fırsat sağlayabilir. Ilk iş sonra daha fazla yol açabilir sinyal WGA boyama için yoğunluğu ve hücrelerin tomurcuk izleri tekabül sayısı arasında bir ilişki kurmak içinakış sitometrisi yoluyla hücre yaşı hızlı belirlenmesi. Bu yaklaşım, aynı zamanda, tipik olarak ölçümlerin daha iyi bir reprodüksiyon için mikroskopla incelenmiş göre daha büyük nüfus büyüklüklerinin kullanımına izin vermektedir. Tüm yaş tayinleri hücrelerin mikroskobik muayene ile yapılabilir olabilir iken, biz yaklaşımı sitometri akış yaşa bağlı genom istikrarsızlık etkileyen faktörlerin hızlı tarama kolaylaştırır hissediyorum.
Güvenilir bir hücre yaşı ölçülmesine ek olarak, değerlendirme ana hücre büyümesi ve hücre sıralama her bir ardışık yuvarlak geçmesi için izin verilen hücre bölünmesini sayısına dikkat etmek gerekmektedir. Hücreleri istenen hücre yoğunluğu ulaşmadan önce daha fazla hücre bölünmesi geçmesi olanak sağlayan bir küçük başlangıç popülasyon boyutu ya da daha büyük bir kültür hacminin kullanın. Örneğin, diğer araştırmacılar daha az experime eski hücrelerini elde bariz bir avantaja sahiptir çok eski maya hücreleri 16, elde etmek için sıralama sadece iki mermi kullanmışntal adım. Hücreler sıralama öncesinde daha fazla hücre bölünmeleri tamamlamak için izin kültür hacmini artırmak olmadığını düşünürken, aklında tek bir sütunda işlenebilir hücrelerinin toplam sayısı sınırı tutmak. Bir hücre popülasyonu sıralamak için birden çok sütun kullanılmasını gerektirebilen daha büyük bir kültür hacminin kullanın. Hücre çeşitleri / toplama noktaları arasındaki hücre bölünmesinin az mermi geçmesi Ayrıca, eğer, daha sonra ömrü boyunca farklı zaman noktalarında beklenen mutasyon frekansları sapmaları gözlemlemek için daha fazla fırsat vardır. Örneğin, ömrü boyunca sadece erken örnekleme ve geç zaman noktalarında veri mutasyon sıklığı sürekli bir artış gösteren, ama çabuk ve daha sonra yaylalar bu mutasyon sıklığı artar gösterebilir ömrü boyunca ek ara zamanlarda örnekleme üretebilir. Bu protokol yaşlı anne hücreleri izolatları Ancak, yaşla birlikte mutasyon oranlarındaki değişimlerin daha doğrudan bir ölçümünü elde etmek için bir fırsat var. Dalgalanma testleri olabilir be mutasyon oranı, genç hücreler kullanılarak elde edilen orandan farklı olup olmadığını belirlemek için farklı yaşlarda annesi hücreleri kullanılarak gerçekleştirildi. Büyüdükçe bu dalgalanmaları deney kültürleri yaşlı ve genç hücrelerin bir karışımı olacak olsa da, genç hücreler ile başlanarak elde oranlarından herhangi bir sapma eski bir başlangıç popülasyonunun kullanımı ile bağlanabilir.
Tekrarlanabilir doğru genom istikrarsızlık ölçmek için yaşlı anne hücreleri yeterince büyük bir nüfus elde etmek için yeteneği, bu yaklaşımın başarısı için kritik öneme sahiptir. Protokol, bu amaç için özel bir manyetik ayırma sisteminin kullanımını tarif etmekle beraber, başka gruplar da alternatif sistemler 14,18 (Malzeme Tabloya bakınız) maya hücreleri ana kriteri var. Üreticilerin bazı protokoller optimizasyon gerekli olabilir ama böyle bir alternatif sistemleri de, bu yöntem ile çalışması gerekir. Ne olursa olsun kullanılan özel sistem, nüfus büyüklüğü gerektirirÇalışma için seçilen bir mutasyon ya da genom yeniden düzenleme tipinin frekansına bağlı olarak d farklıdır. En azından, yeterli ana hücreler, mutasyon frekansı hesaplamak için kişi başına en azından bir mutant koloni elde etmek için olmalıdır. Sadece sıfır ila beş koloni, mutant nüfusta ve popülasyon boyutu daha küçük bir artış beklenmektedir eğer 5-10 mutan koloniler tahmin edilen, büyük ölçüde tekrarlanabilirliği artırabilir böylece uygulamada, sonuçlar oldukça değişken olabilir. Biotin bir başlangıç nüfusu etiketleme, her tür için kurtarma verimlilik yaşındaki annesi hücrelerde mutasyon frekansını ölçmek için gerekli uygun nüfus büyüklüğü belirlemenize yardımcı olmak için dikkate alınması gerekiyor. Her sıralama sonra ana hücrelerinde% 90 iyileşme ile, orijinal nüfusun sadece% 59 büyüme ve sıralama beş tur sonra kurtarıldı olacaktır. Bu ~% 33 büyüme beş turdan sonra asıl nüfusun geri kazanımı ve etiketli anne hücrelerin sadece% 80'i geri eğer sıralama düşerHer çeşit sırasında ed. Nüfus büyüklüğü iki üç kat azalma kolayca nüfus başına mutant kolonilerin güvenilmez numaraları neden olabilir, çünkü düşük frekanslı olayları ölçerken Ölçme ve kurtarma maksimize önemlidir.
Genişletilmesi veya mitotik hücre yaşlanma sırasında genom istikrarsızlık daha geniş bir anlayış elde etmek için bu protokolü değiştirerek için çok sayıda seçenek vardır. Basit örnekler gen fonksiyonlarının, ortam değişiklikleri veya diğer çevresel durumu değişiklikleri değişiklikler yaşla birlikte mutasyonların birikimi nasıl değiştirdiğini analiz içerir. Değiştirilmiş gen fonksiyonu ile veya uygun durumda, genç hücreler için Mutasyon oranı ölçülmüş ve kontrol hücre popülasyonlarında daha farklı hızı değerleri ile tahmin ve daha farklı mutasyonların birikmesine olup olmadığını belirlemek için kullanılacaktır. Replikatif yaşlanma sırasında farklı noktalarda Hücre popülasyonları, reaktif oksijen türleri veya DNA hasar verme ajanları gibi özel baskı uygulayıcılar maruz olabilir. Biroksidatif strese geçici ve hafif maruziyet esasen hücre sıralama (Şekil 3) gerçekleştirme yeteneğini değiştirmek değil, ama sert gerilmeler hücrelerin iyileşmesini komplike edebilir. Ön deneyler anne hücreleri hala belirli stresleri sonra bir şekilde geri doğrulamak için gerekli olacaktır. Ayrıca, izole anne hücrelerinin hücresel özellikleri 3 yaşlanma ile ilişkili reaktif oksijen türlerinin, mitokondriyal ve vakuolar morfolojisi ve diğer fizyolojik özelliklerinin düzeyleri dahil olmak üzere, ayrıntılı olarak analiz edilebilir. Ayrıca ana hücreleri bir tedavi ya da bir işlem için bir başlangıç popülasyonu olabilir. Anne ve kızı hücreleri fiziksel işlem sırasında ayrılır yana, kızı hücreleri yine de analiz için mevcuttur. Örneğin, çocuk hücrelere veya maya anne ve ikincil hücreler arasında hasarlı makro moleküllerin asimetrik miras fizyolojik değişiklikleri <s> 24 mutasyon frekansları / oranlarında herhangi bir ilginç değişiklikler zamanlamasına göre olabilir kadar. Kızı hücre popülasyonlarının mutasyon frekansları da Replikatif yaşlanma sırasında mutasyonların asimetrik miras olup olmadığını modellemek için denemek için elde edilebilir. Özet olarak, dalgalanma testleri ile manyetik hücre sıralama yoluyla ana hücrelerin zenginleştirilmesi birleştiren S. avantajlarını mümkün kılmaktadır cerevisiae model sistem verimli mitotik hücre yaşlanma sırasında genetik değişikliklerin birikimi sorumlu mekanizmaların araştırılması için uygulanacak.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, bu makalenin içeriği mutlaka Sağlık Ulusal Enstitüleri resmi görüşlerini yansıtmamaktadır PHM için Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Yaşlanma Enstitüsü hibe R00AG031911 tarafından kısmen desteklenmiştir.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | 100mg |
Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | 2ml MicroBeads conjugated to monoclonal mouse anti-biotin antibodies (isotype: mouse IgG1) |
MACS LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | 25 columns suitable for QuadroMACS separator |
QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | Separator Only |
QuadroMACS Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-091-051 | Includes: QuadroMACS Separator (130-090-976), MACS MultiStand (130-042-303), LS Columns (130-042-401), MACS 15ml Tube Rack (130-091-052), One 2ml unit of MACS MicroBeads. Note: Alternative systems include Dynabeads Biotin Binder and MagnaBind Magnetic Beads |
BD Falcon Cell Strainer, 40 µm | BD Biosciences | 352340 | 40 µm for use with BD Falcon 50 ml Conical Tubes. 50 per pack |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | Powder, filtering after dissolving important to remove particulates |
Wheat germ agglutinin Alexa Fluor488 | Life Technologies | W11261 | Conjugates with different excitation/emission spectra could also be used |
ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36930 | 10 ml, other antifade reagents could also be used |