Abstract
Under spermatogenese hos pattedyr og i Drosophila melanogaster udvikle mandlige kimceller i en række væsentlige udviklingsmæssige processer. Dette omfatter differentiering fra en stamcelle befolkning, mitotisk forstærkning, og meiose. Desuden, efter meiotiske kimceller undergår en dramatisk morfologisk omformning proces samt en global epigenetisk omkonfigurering af kønsceller kromatin-histon-til-protamin afbryder.
Studere den rolle, et protein i post-meiotisk spermatogenese hjælp mutagenese eller andre genetiske værktøjer er ofte hæmmet af væsentlig embryonale, præ-meiotisk eller meiotiske funktioner i proteinet under undersøgelsen. Den post-meiotisk fænotype af en mutant af et sådant protein kan skjules ved hjælp af en tidligere udviklingsmæssige blok eller fortolkningen af fænotypen kan være kompliceret. Modellen organisme Drosophila melanogaster tilbyder en omfartsvej til dette problem: intakte testikler ogendda cyster af kønsceller dissekeret fra tidlig pupper er i stand til at udvikle ex vivo i dyrkningsmedium. Udnyttelse af sådanne kulturer tillader mikroskopisk billeddannelse af levende kønsceller i testiklerne og kim-line cyster. Vigtigere er det, de dyrkede testiklerne og kimceller også bliver tilgængelige for farmakologiske hæmmere, hvilket tillader manipulation af enzymatiske funktioner under spermatogenesen, herunder post-meiotiske stadier.
Protokollen forelægges beskriver, hvordan man dissekere og dyrke puppe testikler og kim-line cyster. Oplysninger om udvikling af puppe testikler og dyrkningsbetingelser leveres sammen med mikroskop billeddata af levende testikler og kim-line cyster i kultur. Vi beskriver også en farmakologisk assay at undersøge post-meiotisk spermatogenese, eksemplificeret ved et assay målrettet histon-til-protamin afbryder hjælp af histonacetyltransferase inhibitoren anacardic syre. I princippet kunne denne dyrkningsmetode tilpasses for at imødekomme mange other forskningsspørgsmål i præ-og post-meiotisk spermatogenesen.
Introduction
Udviklingen af mandlige kimceller mange arter er en sekventiel proces. Det er kendetegnet ved en række afgørende begivenheder, der kulminerer i dannelsen af morfologisk og epigenetisk højt specialiserede spermatozoer. I Drosophila melanogaster, kim-line stamceller på spidsen af testiklerne kløft asymmetrisk at give anledning til en ny stamcelle og spermatogonium, dvs datter celle, der er forpligtet til at differentiering (se figur 1 for en oversigt) 1,2 . Den spermatogonium gennemgår fire runder af mitotiske divisioner, og med debut af meiose, en fase med en imponerende vækst og transskriptionsaktivitet kaldes spermatocyte scenen. Cellerne stammer fra en spermatogonium forblive forbundet til hinanden og udvikle sig som en synkroniseret bundt indpakket to somatiske celler-en struktur, der er nævnt som en cyste. Efter afslutning af meiose, morfologi af de mandlige kimceller er heltomstruktureret (vist skematisk i figur 1). Indledningsvis runde spermatider langstrakte for at danne den hydrodynamiske hovedkonstruktion og flagel udvikler sig. Til sidst er de sædceller adskilt fra hinanden af et komplekst, apoptose-relaterede mekanisme kaldet individualisering 3 - 5.
I mange arter, herunder Drosophila melanogaster og pattedyrarter, de morfologiske ændringer af kønsceller er ledsaget af en bemærkelsesværdig epigenetisk omlægning af det haploide mandlige kim-line kromatin, kaldet histon-til-protamin afbryder (HP switch) 6. - 9.. Eventuelt næsten alle kanoniske histon og mange histon-variantmolekyler strippet fra DNA og erstattes af små grundlæggende proteiner, protaminerne, hvilket resulterer i meget kompakt nucleoprotamine struktur specifikke kromatin modne sædceller. Generelle egenskaber af HP-kontakten er than udskiftning af kanoniske histoner først ved histon varianter, derefter ved overgangs- proteiner, og endelig af protaminer. Alt dette er ledsaget af flere ændringer i epigenetiske mærker, såsom en stigning i acetyleringsniveauer af histon H4 lige før histon fjernelse 7,10 - 12.
De fleste, hvis ikke alle, af de ovenfor nævnte processer er afgørende for udviklingen af modne, fuldt fertile sperm. Dette gælder ikke kun i Drosophila, men også i mennesker, som pattedyr spermatogenese deler en betydelig mængde af lighed med det hvirvelløse systemet 1,8,9. Studere mandlig udvikling kim-celle lettes i høj grad i Drosophila modelsystem. Fluer er genetisk meget tilgængelig. Frembringelsen af mutanter samt etablering af flyve-stammer, der udtrykker fusion gener eller RNA-interferens konstruktioner tager lidt indsats. Men i studiet af post-meiotisk spermatogenese anvendelse af mutanter end simple genetiske værktøjer kan nå en grænse. I Drosophila spermatogenesen, transskription ophører næsten helt med indrejse i meiotiske divisioner. Således er post-meiotisk spermatogenese hovedsagelig baseret på translatorisk undertrykt og gemt mRNA syntetiseret i en udvidet meiotiske profase 13-16. Derfor værktøjer som RNA-interferens eller brug af ikke-betingede mutanter er ikke egnet til at studere specielt post-meiotiske roller genprodukter, der også opfylder væsentlige funktioner i præ-meiotiske eller meiotisk udvikling kim celle.
En fordel ved Drosophila, der kan udnyttes i sådanne tilfælde er muligheden for dissekerede intakte testikler og endda cyster i kimceller at udvikle ex vivo i dyrkningsmedium 4,12,17 - 20. Dissektion og dyrkning af testikler eller kim-line cyster ikke kun tillader mikroskopisk observation af kim-celle udvikling i levende celler, men enLSO brugen af farmakologiske assays med f.eks hæmmere af enzym-komplekser, såsom histon acetyltransferaser (HATS), HDACi (HDAC), topoisomeraser eller proteasomet. Således er det muligt at manipulere enzymatiske funktioner under post-meiotisk spermatogenese og overvåge de udviklingsmæssige udfald uanset embryonale, præ-meiotiske eller meiotiske funktioner 4,12.
I farmakologiske assays vi tidligere analyserede acetyleringen-afhængige lokalisering af en bromodomain proteinet under meiotisk profase samt relevansen af histonacetylering niveauer for epigenetiske HP-kontakten i post-meiotisk spermatogenese ved hjælp af specifikke inhibitorer rettet Hatte og HDAC'er 12,21. Målretning af HP-kontakten i disse analyser blev muliggjort ved hjælp af en flue stamme, der udtrykker fusion generne histone2AvD-RFP og protamineB-eGFP 12,22 i de endogene mønstre, og den iagttagelse, atde første spermatider i puppe testikler passere gennem HP skifte mellem 24 og 48 timer APF 12.
Protokollen præsenteres beskriver dissektion af testikler og cyster fra Drosophila pupper, dyrkningsbetingelserne, og en farmakologisk assay med intakte puppe testikler. Til dette formål er puppe testikler ved omkring 24 timer efter puparium dannelse (APF) dissekeret (se figur 1 og 2). På dette tidspunkt har testiklerne ikke foretaget tilslutninger til andre væv og er omgivet af en tynd ydre kappe, som giver bedre indtrængning af inhibitorforbindelser 23,24. Testiklerne er bean- eller pæreformet organer, der let kan tages i kulturen. Disse testiklerne dissekeres, dyrket og behandlet med specifikke inhibitorer. Efterfølgende virkningerne af inhibitorer overvåges ved hjælp af immunofluorescens-analyser og fluorescensmikroskopi fusionsprotein udtryk, og ved sammenligning af den nukleare morpholnologi af de behandlede kimceller med ubehandlet kønsceller. De betingelser, der præsenteres i denne protokol tillader også levende billeddannelse udvikle testikler og kim-line cyster i kultur.
Protocol
Etik erklæring:
De eksperimentelle procedurer, der beskrives i denne protokol indebærer udelukkende arbejde med Drosophila melanogaster og er ikke underlagt dyrevelfærd love i Tyskland.
1. Fremstilling af Media, værktøjer og Fluer
- Forbered modificeret kommercielt tilgængelig pulveriseret vækst i M3-medium uden kaliumbicarbonat 17. ADVARSEL: Irriterer øjne og hud. Suppler medium med 10% føtalt bovint serum, 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin. Varmeinaktiverede og insekt-kultur-testet oksefosterserum for de bedste resultater. Filtreres komplette medium (herefter refereret til som medium) gennem en 0,2 um flaske-top filterenhed og opbevares i portioner ved -20 ° C. Før brug filter (0,2 um sprøjtefilter spids) mediet igen for at fjerne bundfald.
- Forbered inhibitor stamopløsninger til de farmakologiske assays. Dissolve kemikalierne i passende opløsningsmiddel og butik i portioner. For eksempel forberede en stamopløsning af 28,69 mM anacardic syre (ADVARSEL: Irriterer øjnene og huden) i dimethylsulfoxid.
- Forbered værktøjer til afbrydelse af dissekerede puppe testikler og dissektion af enkelte cyster. Brug to skarpe og stive nåle, snarere end en pincet. Den kapillære kraft, der udvikler sig mellem de to grene af en pincet gør dissektion af enkelte cyster i små mængder medium meget vanskeligt. For eksempel kan du bruge spidsen af en rustfri stål insekt pin indsat i en podning løkke holder.
- For at opnå passende alderen pupper, frø ca. 10 store kultur hætteglas (rør med diameter på 4 cm) med et tilstrækkeligt antal af voksne fluer (ca. 40-60 fluer). At analysere HP kontakten, skal du bruge fluer udtrykker H2AvD-RFP og ProtamineB-eGFP i deres endogene mønster 12,16,22. Inkubér hætteglassene under standardbetingelser ved 25, ° C i ca 4-5 dage, indtil tredje stadie larver kravle op og begynde forpupningen på væggene i hætteglas 25.
2. Mærkning eller Indsamling Hvid Pre-pupper får du 24-timers-gammel Pupper til Dissection
- For at teste indflydelsen af visse kemikalier på HP switch, dissekere puppe testikler ved ca 24 timers APF 12. For at få iscenesat pupper, tage den forberedte flyve kultur hætteglas med pupating larver (se afsnit 1.4) og identificere så mange hvide præ-pupper som muligt. Pre-pupper i løbet af det allerførste skridt i pupation vises som ubevægelig, ikke-fodring, snarere forkortet larver med krænget Spirakler og hvid-farvet puparium. Den puparium bliver tan-brun inden for 30 til 60 minutter, hvilket indikerer den næste fase af puppe udvikling 26.
- Markere holdninger præ-pupper med en permanent markør på ydersiden af hætteglassene. Inkuber hætteglas ved 25 ° C i ca 24 timer.
- Alternativtgå forud for pupper fra siden af hætteglassene med en lille børste fugtet med PBS-buffer. Derefter overfører den præ-pupper til siden af en frisk 50 ml reagensglas og inkuberes ved 25 ° C i ca 24 timer.
3. Dissektion af puppe testikler ved ca 24 timer efter Puparium Formation
- Fordel flere dråber (ca. 80 ul hver) medium på en 10 cm plast cellekultur eller en petriskål. Ved hjælp af en bred pincet eller en pensel fugtet med medium, pluk pupper på 24 timers APF etape fra de inkuberede hætteglas (se afsnit 2). Overfør en puppe til hver dråbe medium på fad.
- For dissektion, bruge et stereo-mikroskop udstyret med en fiberoptisk lampe. Må ikke opvarmes testiklerne ovenfor RT under dissektion, da dette kan forhindre korrekt udvikling i kultur.
- Dissekere pupper med to par nr 5 pincet. Med et par, tag fat i puppe på dens mest bagestedel (de bageste Spirakler), og hold den på plads.
- Grib de forreste Spirakler med det andet par pincet og åbn puppe Laag ved dens forreste ende. Skrælle puppe tilfælde indtil mindst en del af thorax er udsat for.
- Fortsæt med at holde puppe i stilling ved dens mest bageste ende. For at frigøre det indre tryk i puppe, indsætte begge arme af en pincet ind i hovedet region puppe.
- Rip puppe åben ved at åbne tangen og bevæge tangen i den forreste retning. Sikre, at åbningen frembragt med denne bevægelse er så stort som muligt i første forsøg. Undgå at beskadige puppe ved sin bageste ende, inden trykket er blevet frigivet som dette kan resultere i testiklerne blive skubbet direkte gennem den lille åbning og oftest bliver forstyrret.
- Bemærk, at når puppe åbnes, frigives indre tryk i puppe presser agglomerater af fedt kroppens celler og væv gennem laRGE åbning i hovedet regionen. Kontroller, om puppe testikler allerede er blevet skubbet ud af puppe med dette materiale; dette sker i nogle tilfælde. Testiklerne er ikke forbundet til noget andet væv ved 24 timers APF, og derfor kan blive bortvist let fra puppe 23.
- Undgå at klemme puppe med pincet da det kan beskadige testiklerne, hvis de forbliver i puppe. Forøg størrelsen af åbningen ved hjælp af en pincet.
- Hold derefter puppe på sit mest bageste ende. Luk det andet par pincet og forsigtigt stribe ud indholdet af puppe fra posterior til anterior frigive testiklerne fra puppe.
- Saml testiklerne ved at trække dem ind i en pre-cut 200 ul pipettespids. Forsøger at overføre kun en meget lille mængde af mediet for at reducere antallet af fedt kroppens celler overført med testiklerne. Placer testiklerne til medium i en frisk kultur fad. Vask testiklerne flere gange med medium indtil kun få fedt kroppen celler tilbage.
- For levende billedbehandling, overføre testiklerne til en glas-bund dyrkningsskål med medium og bruge en omvendt billedbehandling mikroskop. For farmakologiske assays fortsætte med trin 5.
4. Dissektion af Male Kim-line cyster og Live-Imaging
- Overfør en eller flere puppe testikler til en glas-bund kultur fad.
- Brug et stereomikroskop med fiberoptisk belysning og to rustfrit stål nåle (se afsnit 1.3) for dissektion af mandlige kim-line cyster.
- Med en nål, omhyggeligt forsøge at pin ned én testikel ved dens forreste eller bageste ende. Hold den på plads. Sæt den anden nål ind i testiklen og forstyrre testiklerne kappe ved at flytte nålen sidelæns. Mange af cyster vil blive frigivet fra testiklerne af denne bevægelse.
- Fortsæt med at holde testiklerne på plads med en nål. Forsigtigt stribe de resterende cyster fra testiklerne med den anden nål.
- Separate aggregerede cyster enten ved gently flytte en nål sidelæns gennem klynge af cyster eller ved at overføre de cyster til en frisk dyrkningsskål med medium ved anvendelse af en 200 ul pipettespids.
- Flyt dyrkningsskålen til et omvendt imaging mikroskop for levende billeddannelse af enkelte cyster. Disperse cyster igen med en nål, hvis nødvendigt.
- Identificer den fase af cyster ved hjælp af fasekontrast og fluorescens mikroskopi.
- Fokus på en cyste på den ønskede scene. Bekræft fokus og position cyste hyppigt under længere billeddannelse eksperimenter, da cyster ikke holde sig til bunden af dyrkningsskålen, og derfor har en tendens til at flyde ud af fokus.
BEMÆRK: Coating fadet med poly-L-lysin til immobilisering er til skade for udviklingen af tidlige kim-line cyster. I stedet kan de enkelte cyster isoleres. Med lidt øvelse, er det muligt at pege på en bestemt cyste ved meget forsigtigt at skubbe det med nålen. Dette vil gøre det muligt at overføre enkelte cyster til særskilt kultUre retter med en glas Pasteur-pipette med en langtrukken spids, der passer ind i synsfeltet for mikroskopet. De isolerede cyster så let kan flyttes i dyrkningsskålene selv efter langvarig inkubation.
5. Farmakologisk Assay med intakt puppe Testikler
- Fyld hver brønd af en 24-brønds celledyrkningsplade med 500 pi medium til et eksperiment af 12 gentagelser. Overfør en puppe testis til hver brønd, ved hjælp af en pre-cut 200 ul pipettespids.
- Kontroller tilstedeværelsen af protaminer i de isolerede testiklerne anvendelse af et omvendt fluorescens mikroskop. Testiklerne skal være fri for ProtamineB-eGFP signal, som angiver, at HP kontakten ikke har fundet sted i nogen af cyster. Udskift testikler, der allerede viser ProtamineB-eGFP-positive cyster.
- Til de første 12 brønde tilsættes 500 pi medium indeholdende fortyndet inhibitorforbindelse (anacardic syre) for at opnå den ønskede slutkoncentration(150 uM) i 1 ml medium per brønd. Brug de resterende brønde som ubehandlede kontroller; tilsættes 500 pi medium med den samme mængde opløsningsmiddel, der anvendes som de inhibitorforbindelser. Bemærk: Hvis der anvendes mange forskellige forbindelser og opløsningsmidler, kan det være mere effektivt at anvende medium alene som kontrol og til at teste indflydelsen af stigende koncentrationer af opløsningsmidler i separate eksperimenter.
- Inkubér pladen ved 25 ° C i 24 timer i mørke.
- Kontroller igen for tilstedeværelsen af protaminer i de inkuberede testikler som beskrevet ovenfor. De kontrolforanstaltninger testikler bør nu vise en eller flere ProtamineB-eGFP-positive cyster, hvilket indikerer overgangen via HP switch.
- Ved hjælp af en pipette med en 200 ul spids, overfører testiklerne til poly-L-lysin-coatede objektglas, gør squash præparater og plet med passende fluorescerende antistoffer som beskrevet andetsteds 12,27,28.
Representative Results
Testiklerne i Drosophila hanner er allerede dannet i foster og fortsætter i kroppen hulrum under larvestadier. Tredje stadie larver viser små runde testikler omgivet af et lag af fremtidige pigment celler og indlejret i fedt kropsvæv (figur 2A). Testiklerne hos voksne mandlige fluer er lange, snoede rør, som er dækket af et lag af muskelceller, der stammer fra det genitale disk og en pigment lag 24. Interessant larval testikler indeholder kun kim-linje celler af præ-meiotiske og meiotiske stadier indtil den primære spermatocyte fase, hvilket svarer til meiotisk profase (se også figur 1) 23. De første grupper af mandlige kønsceller passere gennem meiose under puparium dannelse. Ved ca 24 timers APF, har post-meiotiske trin med aflange flageller allerede udviklet, og alle kerner indeholder histon H2AvD-RFP (figur 1 og 2B). Ingen af spermatider har undergået than HP afbryder ikke ProtamineB-eGFP signal kan påvises ved fluorescensmikroskopi (Figur 2C). Ofte testiklerne dissekeret på dette tidspunkt indeholder en auto-fluorescerende struktur af forskellig størrelse, der minder om et agglomerat af fedt kropsceller eller en til flere dråber olie (figur 2C, pilespids). Denne struktur i testiklerne er også synlig med fasekontrast-mikroskopi. Til dato har vi ikke fundet nogen beskrivelse af sin art i litteraturen. Testikler dissekeret på 36 HR APF synes aflange og i nogle tilfælde allerede begynde at krølle (Figur 2D). De har allerede knyttet til væv af kønsorganerne vokser ud fra genital fantasiens skive 23,24. Desuden er de ofte indeholder de første spermatider uden HP kontakten, som indikeret ved ProtamineB-eGFP-signal (figur 1 og 2D, pil). På 48 timer APF, testiklerne har yderligere langstrakt og klart starte curling påproximale ende. Adskillige kim-line cyster med protaminreaktive positive kerner bliver synlige (Figur 2E pil).
Når testikler dissekeret på 24 timer APF holdes i kultur i 24 timer, de ikke langstrakt som i den intakte flue (sammenlign figur 2D og 2E med figur 6A). Dette er muligvis på grund af en mangel på positionelle og vækstsignaler normalt sendes fra udviklingslandene kønsorganer kontakt testiklerne på sit bageste spids 23,29. Endvidere har muskel lag af testiklerne kappe ikke udvikler sig på grund spirende myorør ikke kan migrere fra det genitale disken til testiklerne 24. Testiklerne kappe-i denne situation alene med tynd lag-synes ikke at vokse tilstrækkeligt i kultur til Konvolut det stigende antal udvikle kønsceller indenfor. Imidlertid vokser kønsceller, dividere, og differentiere uafhængigt af testiklerne kappe. Derfor, efter mere end 36 timerr i kultur, vil de tidlige testiklerne ofte brast åben, og videreudvikling ikke overholdes. Men inden for en kortere tidshorisont, er det muligt at optage time-lapse ex vivo levende billeder af hele testikler udvikler i kultur, som det fremgår af figur 3A -3 C (se også supplerende video 1). En puppe testikel, dissekeret ved ca. 45 timers APF, blev inkuberet i medium i 6 timer og filmede hver 5 min. Inden for denne tidsramme, flere cyster i spermatider dukke fra HP skifte scene og vise en lys ProtamineB-eGFP signal (figur 3A '-3 C, åbne pile).
Som nævnt ovenfor, mandlige kønsceller i Drosophila testiklerne udvikle sig som synkroniserede bundter af sammenkoblede celler, navngivne cyster 1. 4A viser en oversigt over cyster dissekeret fra en puppe testis på omkring 24 timer APF. Pre-meiotiske stadier, Meiotiske stadier, tidlig post-meiotiske stadier, og også cyster i det tidlige kano scenen med aflange kerner før HP-kontakten kan findes (figur 1 og 4B -4 E). De isolerede cyster er meget skrøbelige og skal behandles forsigtigt. De to somatiske celler, der danner cyste kuvert let kan forstyrres mekanisk. Kim-line stamceller har evnen til at overleve og fortsætte med at dividere efter genetisk fjernelse af de somatiske cyste celler in vivo 30. Det er blevet rapporteret, at in vitro kimceller af 16-celle stadiet adskilt fra somatisk kuvert videreudvikle og differentiere 19. Faktisk bemærkede vi i vores kultur, der formentlig sent spermatocytter afsluttet meiotiske divisioner med sprængte cyster celler, omend meget sjældent. Hyppigst, ophørte disse forstyrret cyster udvikling. Efter den præsenterede protokol, intakte cyster kan i nogle tilfælde devElop ex vivo i dyrkningsmedium for maksimalt 72 timer. Vi observerede imidlertid, at et rimeligt antal af cyster overleve i op til 48 timers inkubation. Inden for denne tidsramme, de dyrkede cyster er i stand til at udvikle sig fra den primære spermatocyte etape indtil efter meiotiske divisioner samt fra det runde kerner scenen med histon-baserede kromatin indtil slutningen kano fase, HP skifte 12. Dette tillader live billeddannelse af vitale processer i spermatogenesen, som for eksempel spermatocytter ind meiotiske divisioner (figur 5 og supplerende 2 video). Til dette eksperiment blev RFP-mærkede histon variant H2AvD anvendes som kromosom markør. Den primære spermatocyte fase strækker sig ca. 3 dage i vivo 31. Derfor, for at indspille meiotiske divisioner, valgte vi cyster med spermatocytter der havde synligt startet chromatinkondensering (figur 5A, region 2). Meiotiske deling starter i spermatocytterpå den ene side af cyste og derefter følger en bølge i de resterende spermatocytter (i figur 5A fra region 2 til område 1, se også supplerende 2 video). Kondensering af kromatin fører snart til hurtig bevægelse kromosomer, der er synlige som lyse pletter (figur 5A, region 2). Efter 30 minutter er de første spermatocytter i denne region allerede telofase (figur 5B, pilespidser). De kromosomer yngre område 1 arrangere på metafaseplade 20 minutter senere (figur 5C). De komplet telofase og er klar til at gennemgå cytokinese omkring 15 min senere (figur 5D). Anafase, telofase og cytokinese varede ca 10 min i denne optagelse (Supplemental 2 video).
I pattedyr, såvel som i Drosophila, en udtalt stigning i histon H4 acetylering markerer starten af histon fjernelse og HP-kontakten under post-meiotiskspermatogenesen 6,11. Det er blevet foreslået, at denne epigenetiske modifikation er et væsentligt element eller endda udløsende faktor for udviklingsmæssige program HP skifte 10,32. Tidligere behandlede vi Drosophila puppe testikler i kultur med inhibitorer rettet Hatte og HDAC at påvirke acetyleringsreaktionen niveau af histon H4 under post-meiotiske stadier 12. I disse farmakologiske assays fandt vi, at histonacetylering er afgørende for udviklingen af spermatogenesen fra etaper med histon-baserede kromatin til etaper med protamin-baserede kromatin.
Figurerne 6 og 7 viser repræsentative resultater af farmakologiske under anvendelse anacardic syre til at målrette hatte i puppe testikler. Testikler ved 24 timers APF blev dissekeret fra en flue stamme udtrykker H2AvD-RFP og ProtamineB-eGFP. ProtamineB-eGFP protein var fraværende i disse tidlige puppe testikler (Figur 6A og B). Efter 24 timerr i kultur, kontrolforanstaltningerne testikler viste ProtamineB-eGFP signaler, som tydede på, at de første cyster havde udviklet sig ud over HP-kontakten (Figur 6A «, åbne pilespidser). Dette var ikke tilfældet med testiklerne blev behandlet med 150 pM anacardic syre (figur 6B). Testis squash præparater og immunofluorescensteknikker analyser giver mere detaljerede oplysninger (Figur 7). I den ubehandlede kontrol, kan kernerne i relativt store primære spermatocytter anerkendes af deres karakteristiske mønster af tre regioner i rigt farvede DNA, der svarer til de store kromosomer (4C niveau) Drosophila (figur 7A, kolonne 1). Acetylering af histon H4, er tydeligt påviseligt på dette stadium (figur 7B, kolonne 1). Den første fase efter meiotiske divisioner er kendt som Nebenkern fase og er kendetegnet ved forholdsvis store, runde kerner (se figur 4C, ikke vist i figur 7). Den næste fase er vist i figur 7 er identificeret ved flagellært vækst og den runde form af kimen cellekerner, som allerede er meget mindre end i tidligere stadier (figur 7A, kolonne 2) og viser meget lav til næsten-detekterbare niveauer af histon H4 acetylering (figur 7B, kolonne 2). Den runde form derefter elongates (figur 7A, kolonne 3) og acetylering af histon H4, er igen klart påviselig (figur 7B, kolonne 3). De spermatider derefter nå kanoen form stadium, hvor HP-kontakten finder sted, og histoner erstattes af protaminer (figur 7A - 7 C, kolonne 4 og 5). Efter kano stadium de protaminated kerner derefter yderligere langstrakt i en meget tynd nål form i modne sædceller (ikke vist her).
Testis squash præparater af testikler behandlet med anacardic syre viste forskellige resultater (figur 7D </ Strong> - 7 F). Kromatin i kimceller behandlet med anacardic syre optrådte mere kondenseret end den ubehandlede kontrol (sammenlign figur 7D, behandles og 7A, kontrol). Immunofluorescens analyser viste, at acetylering af H4 var stærkt formindsket eller endog fraværende i kerner af kønsceller behandlet med anacardic syre (figur 7E). Det er kendt, at højt acetylerede histoner er forbundet med områder af åben kromatin, mens chromatin regioner, som mangler histonacetylering ofte viser en undertrykkende struktur 33. Derfor er det ikke overraskende, at behandling med anacardic syre påvirket chromatin struktur af de behandlede kim cellekerner. Vigtigere, blev der ikke protaminreaktive positive kerner af sen kano scenen eller uden identificeret i behandlede testikler (Figur 7F). Således er vores data er konsistente med den ide, at HAT aktivitet er afgørende for spermiogenesis at fortsætte tilbagem histon-baseret kromatin til protamin-baserede chromatin faser.
Figur 1. Oversigt over Drosophila spermatogenesen. Det venstre panel viser rækkefølgen af faser i kim-celle udvikling fra en stamcelle til individualiseret sædceller. Skematiske tegninger viser den karakteristiske kernemorfologi af kønsceller. En spermatogonium skiller at producere 16 sammenkoblede spermatocytter i en cyste. I denne fase de fleste af de afskrifter, der er nødvendige til post-meiotisk udvikling produceres, translationalt undertrykt, og lagres. Hovedparten af transkriptionsaktivitet slutter med ikrafttræden den meiotiske divisioner. Histon-til-protamin switch i kromatin finder sted mellem den tidlige og sene kano scenen. Etaper med en histon-baserede kromatin er højetændte i rød; etaper med en protamin-baserede kromatin er markeret med grønt. Søjlerne i det højre panel angiver stadier af kønsceller, som normalt kan findes i udviklingen af testikler i larver, pupper på ca 24 og 36 timer efter puparium dannelse (APF), og voksne fluer.
Figur 2. Drosophila testikler på forskellige stadier af udvikling. (A) Fase-kontrast billede af en lidt klemt hel-mount testiklerne hos en tredjeparts-stadiums larve (L3). Kun præ-meiotiske og meiotiske stadier kan findes. Spermatogonia er begrænset til den forreste spids under nav-regionen (stjerne). Den resterende testikel er fyldt med spermatocytter (åben pil). (B) Fase-kontrast billede af en lidt knust testikel ved ca. 24 timer efter puparium dannelse (APF). Ud over spermatocytter (åben pil) testiklerne indeholder spermatider i Nebenkern fase (åbne pilespidser), med runde kerner og spermatider i forlængede etaper med voksende flageller (dobbelt åben pilespids) (C - E). Hele-mount puppe testikler udtrykker H2AvD-RFP og ProtamineB-eGFP (overlejringer af fase-kontrast og eGFP og RFP fluorescensbilleder). (C) puppe testikel dissekeret på ca 24 timers APF. Arrowhead markerer auto-fluorescens af formodede fedt kroppens celler. D) puppe testis dissekeret på ca 36 timer APF viser den første ProtamineB-eGFP-positiv cyste (pil). (E) puppe testis ved ca. 48 timer APF med en gruppe af ProtamineB-eGFP-positive cyster (pil). I alle tal dele Stjernerne angiver navet regionen. Skalapanelerne: 100 um.ANK "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Levende billeddannelse af histon-til-protamin afbryder i en puppe testikel voksende ex vivo. (A) fasekontrast-billede af en puppe testis udtrykker H2AvD-RFP og ProtamineB-eGFP taget i kultur på ca 45 timer efter puparium dannelse (APF). Sædblæren er angivet med en udfyldt pil. En paragonium (dobbelt pilespids) forbliver fastgjort til testiklerne. (A ') eGFP og RFP fluorescens testis vist i (A). Den åbne pil angiver en ProtamineB-eGFP-positiv cyste. Målestokken:. 100 um (B) Efter 2 timer 30 min i kultur, flere andre cyster (åben pil) dukke op fron histon-til-protamin overgang. (C) Efter yderligere ca. 3 timer i kultur, dvs, i alt 5 timer 29 min i kultur, en gruppe af cyster (åben pil) med stærke ProtamineB-eGFP signal er synlig ved den proximale ende af testiklerne. Se også Supplerende video 1. I alle tal dele stjerner angiver hub regionen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Isoleret cyster af kønsceller på forskellige stadier af udvikling. (A) Cyster dissekeret fra en testikel ved ca. 24 timer efter puparium dannelse (APF). Overlay af fasekontrast-og H2AvD-RFP fluorescens (rød) billeder. Målestok: 100 um.(B - E) Forstørrelser af enkelte cyster i forskellige stadier. Overlay kontrast differential interferens (DIC) og H2AvD-RFP fluorescensbilleder. Målestokken:. 20 um (B) cyste på 16 spermatocytter (C) cyste af 64 runde spermatider på Nebenkern stadium.. Den Nebenkern struktur udvikler sig fra sammenvoksede mitokondrier og er synlig i DIC billeder ved siden af kernen (åben pilespids). (D) cyste af spermatider med runde H2AvD-RFP-positive kerner og forlængede flageller (åben pilespids angiver et forlængede Nebenkern struktur, der ledsager voksende axoneme). (E) Apikal spidsen af en cyste af spermatider på det tidlige kano fase, som viser en langstrakt nuklear form. Den udstrakt aflange flageller er kun delvist synlig. Klik her for at se en større version af denne fIGUR.
Figur 5. Live-billeddannelse af en enkelt 16-spermatocyte cyste undergår meiose I ex vivo. Fluorescensbilleder af en cyste i kultur udtrykker H2AvD-RFP. Afbildet er karakteristiske faser af meiose I. spermatocytter i cyste passere gennem meiotiske afdelinger i en bølge-lignende måde. (A) Kromosom kondensation starter i kerner på den ene side af cyste (2) og fortsætter gennem cyste (pilens retning ). Kerner i den modstående omegn (1) udgør et tidligere trin i chromatinkondensering, hvor histon-tætte områder markerer de tre store kromosomer kan stadig anes. Spermatocytter i regionen (2) indeholder fuldt kondenserede kromosomer, synlige som lyse fluorescerende pletter. (B) Efter 300, min, de første spermatocytter i regionen (2) er i telofase (åbne pilespidser), mens kromosom kondens fortsætter i regionen (1) (C) I de sidste spermatocytter af regioner (1), er kromosomer (pilespidser) arrangeret. på metafaseplade 20 min senere. (D) Inden for en anden 15 minutter, vises de sidste spermatocytter have afsluttet telofase og er nu klar til at gennemgå cytokinese (åbne pilespidser). Se også Supplerende video 2 Målestok:.. 50 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Anacardic syre hæmmer histon-til-protamin afbryder i dyrkede puppe testikler. Puppe testikler expressi ng H2AvD-RFP og ProtamineB-eGFP og dissekeret ved 24 timer efter puparium dannelse (APF) blev inkuberet i 24 timer i medium uden inhibitor (kontrol A, A ', DMSO, dimethylsulfoxid) eller i medium suppleret med 150 uM anacardic syre ( B, B '). Hub regioner, der er angivet med en asterisk. (A, B) Ingen ProtamineB-eGFP-positive cyster kan observeres efter dissektion. (A ') Efter 24 timer inkubation nogle cyster gennemgik histon-til-protamin switch og ProtamineB-eGFP-positiv cyster (åbne pilespidser) kan iagttages. (b ') Testes behandlet med anacardic syre ikke udvikler ProtamineB-eGFP-positive cyster. Målestokken:. 100 um Klik her for at se en større version af dette tal.
68 / 51868fig7highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 7. Anacardic syre påvirker histon H4 acetylering og kromatin struktur spermatider Squash præparater af sædcelleantal kerner fra puppe testikler (24 timers APF), der udtrykker ProtamineB-eGFP inkuberet i 24 timer uden inhibitor (A - C). Eller med 150 pM anacardic syre (D - F). DNA farves med Hoechst farvestof (A og D). H4 acetylering analyseret immunofluorescently (B og E). Tilstedeværelse af protaminer overvåges med ProtamineB-eGFP signal (C og F). Efter behandling med anacardic syre, vises kromatin stærkt komprimeret (D) og H4 acetylering signalet reduceres fuldstændigt i alle sædcelleantal trin (E). Desuden anacardic-syrebehandledetestikler viser ingen cyster af sen kano scenen eller uden for og ingen ProtamineB-eGFP signal (F). Målestokken:. 10 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende video 1. Levende billeddannelse via eGFP og RFP fluorescens af histon-til-protamin afbryder i en puppe testikel voksende ex vivo. Video af 6 timer tidsforløb billeddannelse illustrerer histon-til-protamin overgang af stigningen i forekomsten af ProtamineB- eGFP-positive cyster. Billeder blev erhvervet hver 5 min. For detaljer, se figur 3. (Se "suppl_video_1.MOV" under Downloads).
Supplerende Video 2. Levende billeddannelse af en enkelt 16-spermatocytter cyste undergår meiose I ex vivo. Time-lapse fluorescerende billeddannelse af encyste i kultur udtrykker H2AvD-RFP i løbet af 80 min. Denne video viser de karakteristiske faser af meiose I. Billederne blev optaget hver 1 min. For detaljer, se figur 5. (Se "suppl_video_2.MOV" under Downloads).
Discussion
Den præsenterede protokol beskriver to forskellige applikationer baseret både på evnen til at dissekere Drosophila testikler og enkelt kim-line cyster på et givet udviklingstrin og i ex vivo-udviklingen af disse celler og væv i en dyrkningsskål. En ansøgning er den farmakologiske manipulation af vitale processer i løbet af sæd udvikling. Vigtigere er det, dette giver adgang til post-meiotisk spermatogenese, der ikke nemt opnået ved hjælp af funktionelle analyser baseret på flyve genetik. Den anden anvendelse er mikroskopisk observation af levende og udvikle kønsceller og testikler. Især denne ansøgning fordele fra evnen af Drosophila-celler og organer i kultur til at overleve og udvikle sig ved stuetemperatur og under normale atmosfære. Derfor et inverteret billeddannelse mikroskop udstyret med et opvarmet fase (opvarmning til standard avl temperatur på 25 ° C) er tilstrækkelig til at opnå meningsfulde resultater i levende billeddannelse eksperimenter. Yderligeremere, mange transgene flyve stammer, der udtrykker fluorescerende protein-mærkede proteiner til direkte billedvisning eksisterer eller kan let etableres.
For at opnå puppe testikler eller kim-line cyster af en bestemt udviklingsstadiet, er det afgørende, at man er fortrolig med timingen af Drosophila udvikling. Den præcise timing for hver fase kan variere blandt laboratorier, dyrkningsbetingelser og flyve stammer og skal etableres empirisk. Som beskrevet ovenfor, er det især vigtigt for farmakologiske assays, for eksempel rettet mod HP switch. For sådanne eksperimenter, er det tilrådeligt at altid tjekke for spermatider med en ProtamineB-eGFP signal, før den egentlige inhibitor test, fordi timingen kan variere lidt selv inden for et befolkning.
Efter protokollen ovenfor, bør gøre det muligt forsøgslederen at dissekere testikler fra tidlige puppe stadier som intakte organer fri for vedlagte fedt kropsvæv. Disse testikler og, i endnu højere grad, isoleret geRM-line cyster er meget skrøbelige. Derfor er det afgørende at udvikle håndelag og erfaring er nødvendig for at håndtere og overføre testikler og cyster ved hjælp af pincet, kanyler og pipetter. Især undersøgelser rettet meiotisk og tidlig udvikling post-meiotisk kim-celle ville drage fordel af dette. Selv om det er forholdsvis let at dissekere cyster sene spermatider med lang flageller fra voksne testikler, er det vanskeligt at opnå tidligere stadier. Dissekere disse cyster fra tidlige puppe testikler efter denne protokol er meget mere effektiv. Husk på, at i en sædvanlig flue stamme, vil kun ca 50% af pupper være mand. Derfor klar til at dissekere mindst dobbelt så mange pupper som antallet af testikler påkrævet. Alternativt er det muligt at identificere mandlige L3 larver hjælp af et stereo-mikroskop, da testiklerne kan identificeres som gennemskinnelige runde organer indlejret i de laterale fedt kropsvæv i den intakte larve 23,34, og at samle dem i friske kultur hætteglas, kanbruges til at vælge præ-pupper for iscenesættelse og dissektioner. Det er også muligt at identificere mandlige pre-pupper 35.
Vi bemærkede, at både de isolerede kim-line cyster og de intakte puppe testikler i kultur er følsomme over for lys, som er også blevet rapporteret tidligere 18. Denne lysfølsomhed kan også holde til nogle kemiske forbindelser, der anvendes i farmakologiske assays. Derfor er det bedst at holde dyrkningsskålene af et assay i mørke under inkubation. Ligeledes, når planlægningen af time-lapse imaging eksperimenter med udviklingslande testikler og især isolerede cyster, huske på, at alt for lange eksponeringstider og / eller for høj målehastigheder kan hæmme ex vivo udvikling. Den passende samplingfrekvens skal bestemmes ved forsøg.
Bakteriel og / eller svampeinfektion og over-vækst i dyrkningsskålene udgør et alvorligt problem. Inficerede kultur retter med alt for mange bakterier understøtter ikke ex vivo develing af testiklerne og cyster. Derfor beskrevne dyrkningsmedium indeholder penicillin og streptomycin (se trin 1.1), men under langvarig inkubation kan disse antibiotika blive nedbrudt og deres aktivitet måske aftage. Dette kunne være en af årsagerne til den begrænsede tid for overlevelse (max. 72 timer) af dyrkede cyster observeret ved brug af protokollen ovenfor. Alligevel denne tidsramme ikke kunne udvides ved løbende udskiftning af dyrkningsmediet i skålene. Vi konkluderer, at andre faktorer kan påvirke overlevelsen i kultur, såsom en manglende vækst signaler fra andre væv i kønsorganerne. På den anden side, post-meiotisk udvikling er hurtigere i Drosophila end i pattedyr. I Drosophila, spermiogenesis tager cirka 90 timer, og HP-kontakten finder sted mellem 50 og 60 timer efter meiose 9,12. Således sædvanlige overlevelsestid på omkring 48 timer opnået med denne protokol er velegnet til at følge centrale udviklingsprocesser in spermatogenesis, såsom meiotiske divisioner eller HP switch. Selv om bakteriel eller svampekontaminering kan undgås ved hjælp af rene værktøjer og medier, har fremlagt protokol ikke gøre brug af strengt sterile arbejdsforhold, fordi fluer og flyve testikler allerede indeholder bakterier, når rejst under standardbetingelser. Alligevel kan nogle anvendelser af denne kultur teknik gavn af fluer dissekeret eller endda rejst under aseptiske betingelser (protokoller, se 17,36,37).
Farmakologiske analyser afhænger af anvendelsen af kemiske forbindelser, der virker som inhibitorer eller aktivatorer af forskellige enzymer. Forbindelserne, der almindeligvis anvendes i sådanne forsøg afviger ofte meget i deres mål specificitet. Som en fordel, det giver mulighed for at målrette hele enzymklasser, for eksempel med anacardic syre hæmmende P300 / CBP PCAF og MYST familiemedlemmer HATS 38. Ulempen ved dette kunne være potentiel off-mål eller cytotoksiske virkninger INDUCed af sådanne forbindelser. Derfor bør hver anvendt i et assay med puppe testikler eller cyster forbindelse testes for dets cytotoksicitet og specifik virkning ved forskellige koncentrationer. Desuden kan små variationer i de dyrkningsbetingelser, Forbindelse Koncentration eller aktivitet, og variationer i cellepermeabilitet føre til variation af de inducerede virkninger. Derfor er det nødvendigt at overvåge behandlingens succes i hvert forsøg. For eksempel, når vi anvendte anacardic syre ved 150 uM, observerede vi lille variation i styrken af chromatinkondensering fænotype mellem og undertiden i nogle testikler, mens acetylering af histon H4 konsekvent faldt.
Farmakologiske assays med Drosophila testikler i kultur er blevet anvendt til at analysere før og efter meiotiske mekanismer spermatogenesen 4,12,14,21. Da det er vanskeligt at få adgang post-meiotisk spermatogenese med genetiske værktøjer til at målrette spillere med essential præ-meiotiske og meiotiske funktioner, udgør et alternativ denne ex vivo fremgangsmåde. Desuden principielt metoden kan tilpasses til puls-chase-eksperimenter for at følge udviklingen af behandlede kønsceller over tid. Vi har imidlertid endnu ikke undersøgt denne mulighed. Gør brug af tidlig puppe testiklerne er en fordel i farmakologiske assays. For det første kan den tynde ydre kappe af de unge puppe testikler (ca. 24 timer APF) muliggøre forbedret permeabilitet af kemiske forbindelser. For det andet, når man studerer den post-meiotisk HP switch, de puppe testikler dissekeret på 24 timers APF fra Protamine-GFP-udtrykkende fluelinen muliggøre en direkte udlæsning af, hvorvidt HP kontakten blev påvirket eller ej.
Til dato har flere protokoller for ex vivo dyrkning af Drosophila organer og væv, herunder testikler og kim-line cyster blevet udviklet (se fx 4,14,17,20,39,40). Dyrkningsmediet, og de generelle betingelser, der anvendesi protokollen præsenteres her blev etableret i 1979 17. Kulturen system blev senere tilpasset til in vivo billeddannelse af individualisering mekanisme sene post-meiotiske cyster isoleret fra voksne testikler 4. Tidligere har vi rapporteret, at disse betingelser understøtter også overlevelse og differentiering af meiotisk og tidlige post-meiotiske kønsceller i deres cyster for omkring 48 timer 12. I modsætning til andre dyrkningssystemer 19 den observerede udviklingsmæssige timing i disse kulturer var omtrent overens med timingen bestemmes ud fra faste prøver (for detaljer, se 12). H2AvD-RFP og Protamin-GFP-fluorescens-signaler kan anvendes til at visualisere den nukleare morfologi og kromatin sammensætning af kimceller i kultur. Vi fandt, at for en klar identifikation af udviklingsstadier i kultur, det er fordelagtigt i forhold til andre kriterier, såsom coiling af cyster. Vigtigere, har fremlagt protokol ikke indebærer tilsætning af flyve extRACT eller andre grunde end kalvefosterserum vækstfaktorer. Desuden viser vi her, at de betingelser er forenelige med fluorescens mikroskopi billeddannelse af meiotiske divisioner ex vivo i kultur. Billeder kan opnås med en rimelig opløsning i en nem-at-bruge medium, der understøtter en langsigtet udvikling. Dette er i modsætning til protokoller gør det muligt på kort sigt (ca. 3 timer) observationer i Voltalef olie 41,42.
De ovenfor beskrevne til dyrkning og farmakologisk behandling af puppe testikler og enkelt mandlige kim-line cyster procedurer er let at tilpasse til de mange genetiske, epigenetiske, cellebiologiske, eller udviklingsmæssige spørgsmål, som kan forsket i Drosophila spermatogenesen. Dette omfatter især forskning med fokus på kim-line stamceller. Det er blevet påvist, at stamceller udvikling kan følges i levende billeddannelse af dyrkede voksne testikler 20,43. Men den peristaltiske bevægelse af det modne testis sheath forstyrrer billedet købet. Derfor er enten billedbehandling gjort ved hjælp af fragmenterede testikler 43 eller antallet af imaging eksperimenter udført skal øges for at tage højde for mistede datasæt 20. Tidlige puppe testikler (24 timers APF) er endnu ikke lukket med muskelceller. Selv lidt ældre testikler (36-45 timers APF) synes at vise nogle peristaltiske bevægelser (sammenlign figur 3 og supplerende video 1). Derfor dyrkning af unge puppe testikler som intakte organer kunne tjene som et alternativ.
Endvidere, når beherskes, evnen til at dissekere puppe testiklerne og i sidste ende isoleret cyster kimcelleudviklingen vil tillade yderligere ansøgninger bruger enkelte cyster som en kilde til en homogen, omend små, cellepopulationen. For eksempel er det således muligt at udføre RT-qPCR at analysere den transkriptionelle regulering af bestemte gener under definerede stadier af spermatogenese, som det allerede er blevet påvist
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anacardic acid | Merck Millipore | 172050 | brand: Calbiochem (EMD Millipore) |
| Anti-acetyl-Histone H4 | Merck Millipore | 06-598 | brand: Upstate |
| AxioCam MRm | Zeiss | ||
| AxioObserver.Z1 inverted microscope | Zeiss | ||
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D8418 | |
| Dumont 5-Inox forceps | Dumont | multiple suppliers | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Sigma | F4135 | |
| Fiber optical illuminator | multiple suppliers | ||
| Glass Bottom Microwell Dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)-Cy5 | Dianova | 711-175-152 | |
| Hoechst | Sigma | B1155 | |
| Inoculation loop or pin holder | multiple suppliers | ||
| Austerlitz INSECT PINS stainless steel needles, size 0 | Plano GmbH | N5018 | In our hands both of these pin sizes worked well in the dissections. The minutiens are less rigid but have a smaller tip diameter. |
| Austerlitz INSECT PINS stainless steel minutiens, diam. 0.1 mm | Plano GmbH | N5014 | |
| Multiwell plates, 24-wells | Becton Dickinson | 351147 | brand: Falcon |
| Pen Strep | invitrogen | 15070 | brand: Gibco |
| Shields and Sang M3 Insect Medium | Sigma | S8398 | |
| Stemi SV6 binocular | Zeiss |
References
- Fuller, M. T. Genetic control of cell proliferation and differentiation in Drosophila spermatogenesis. Semin. Cell Dev. Biol. 9 (4), 433-444 (1998).
- de Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis. Development. 138 (14), 2861-2869 (2011).
- Tokuyasu, K. T., Peacock, D. W. J., Hardy, R. W. Dynamics of spermiogenesis in Drosophila melanogaster. Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 124 (4), 479-506 (1972).
- Noguchi, T., Miller, K. G. A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Development. 130 (9), 1805-1816 (2003).
- Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Can’t live without them, can live with them: roles of caspases during vital cellular processes. Apoptosis. 14 (8), 980-995 (2009).
- Govin, J., Caron, C., Lestrat, C., Rousseaux, S., Khochbin, S. The role of histones in chromatin remodelling during mammalian spermiogenesis. Eur. J. Biochem. 271 (17), 3459-3469 (2004).
- Hecht, N., Behr, R., Hild, A., Bergmann, M., Weidner, W., Steger, K. The common marmoset (Callithrix jacchus) as a model for histone and protamine expression during human spermatogenesis. Hum. Reprod. 24 (3), 536-545 (2009).
- Kanippayoor, R. L., Alpern, J. H. M., Moehring, A. J. Protamines and spermatogenesis in Drosophila and Homo sapiens. Spermatogenesis. 3 (2), (2013).
- Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. Chromatin dynamics during spermiogenesis. Biochim. Biophys. Acta. , (2013).
- Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells. Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).
- Rathke, C., Baarends, W. M., Jayaramaiah-Raja, S., Bartkuhn, M., Renkawitz, R., Renkawitz-Pohl, R. Transition from a nucleosome-based to a protamine-based chromatin configuration during spermiogenesis in Drosophila. J. Cell Sci. 120 (9), 1689-1700 (2007).
- Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. Histone H4 acetylation is essential to proceed from a histone- to a protamine-based chromatin structure in spermatid nuclei of Drosophila melanogaster. Syst. Biol. Reprod. Med. 56 (1), 44-61 (2010).
- Olivieri, G., Olivieri, A. Autoradiographic study of nucleic acid synthesis during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Mutat. Res. Fund. Mol. Mech. Mut. 2 (4), 366-380 (1965).
- Gould-Somero, M., Holland, L. The timing of RNA synthesis for spermiogenesis in organ cultures ofDrosophila melanogaster testes. Wilhelm Roux Arch. Entwickl. Mech. Org. 174 (2), 133-148 (1974).
- Barreau, C., Benson, E., Gudmannsdottir, E., Newton, F., White-Cooper, H. Post-meiotic transcription in Drosophila testes. Development. 135 (11), 1897-1902 (2008).
- Barckmann, B., Chen, X., et al. Three levels of regulation lead to protamine and Mst77F expression in Drosophila. Dev. Biol. 377 (1), 33-45 (2013).
- Cross, D. P., Shellenbarger, D. L. The dynamics of Drosophila melanogaster spermatogenesis in in vitro cultures. J. Embryol. Exp. Morphol. 53 (1), 345-351 (1979).
- Rebollo, E., González, C. Time-Lapse Imaging of Male Meiosis by Phase-Contrast and Fluorescence Microscopy. Drosophila Cytogenetics Protocols. Henderson, D. S. , Humana Press. 77-87 (2004).
- Kawamoto, T., Kawai, K., Kodama, T., Yokokura, T., Niki, Y. Autonomous differentiation of Drosophila spermatogonia in vitro. Dev. Growth Differ. 50 (7), 623-632 (2008).
- Sheng, X. R., Matunis, E. Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output. Development. 138 (16), 3367-3376 (2011).
- Leser, K., Awe, S., Barckmann, B., Renkawitz-Pohl, R., Rathke, C. The bromodomain-containing protein tBRD-1 is specifically expressed in spermatocytes and is essential for male fertility. Biol. Open. 1 (6), 597-606 (2012).
- Jayaramaiah Raja, S., Renkawitz-Pohl, R. Replacement by Drosophila melanogaster Protamines and Mst77F of Histones during Chromatin Condensation in Late Spermatids and Role of Sesame in the Removal of These Proteins from the Male Pronucleus. Mol. Cell. Biol. 25 (14), 6165-6177 (2005).
- Bodenstein, D. The postembryonic development of Drosophila. Biology of Drosophila. Demerec, M. , Wiley and Sons. 275-367 (1950).
- Susic-Jung, L., Hornbruch-Freitag, C., Kuckwa, J., Rexer, K. H., Lammel, U., Renkawitz-Pohl, R. Multinucleated smooth muscles and mononucleated as well as multinucleated striated muscles develop during establishment of the male reproductive organs of Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 370 (1), 86-97 (2012).
- Ashburner, M., Roote, J., et al. Laboratory Culture of Drosophila. Drosophila Protocols. Sullivan, W., et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 585-599 (2000).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66 (1), 57-80 (1981).
- Hime, G. R., Brill, J. A., Fuller, M. T. Assembly of ring canals in the male germ line from structural components of the contractile ring. J. Cell Sci. 109, 2779-2788 (1996).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M., et al. Cytological analysis of spermatocyte growth and male meiosis in Drosophila melanogaster. Drosophila Protocols. W, S. ullivan, et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 87-109 (2000).
- Stern, C. The growth of testes in Drosophila. I. The relation between vas deferens and testis within various species. J. Exp. Zool. 87 (1), 113-158 (1941).
- Lim, J. G. Y., Fuller, M. T. Somatic cell lineage is required for differentiation and not maintenance of germline stem cells in Drosophila testes. PNAS. 109 (45), 18477-18481 (2012).
- Fuller, M. T. Spermatogenesis. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-147 (1993).
- Braun, R. E. Packaging paternal chromosomes with protamine. Nature Genet. 28 (1), 10-12 (2001).
- Görisch, S. M., Wachsmuth, M., Tóth, K. F., Lichter, P., Rippe, K. Histone acetylation increases chromatin accessibility. J. Cell Sci. 118 (24), 5825-5834 (2005).
- Demerec, M., Kaufmann, B. P. Drosophila Guide: Introduction to the Genetics and Cytology of Drosophila melanogaster. , Carnegie Institution of Washington. Washington, D.C. (1996).
- Wang, W., Yoder, J. H. Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (56), (2011).
- Sang, J. H. The Quantitative Nutritional Requirements of Drosophila Melanogaster. J. Exp. Biol. 33 (1), 45-72 (1956).
- Meynadier, G. Aseptic rearing of invertebrates for tissue culture. In: Invertebrate tissue culture. Vago, C. 1, Academic Press. New York. (1971).
- Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Price, B. D. Inhibition of histone acetyltransferase activity by anacardic acid sensitizes tumor cells to ionizing radiation. FEBS Lett. 580 (18), 4353-4356 (2006).
- Aldaz, S., Escudero, L. M., Freeman, M. Live imaging of Drosophila imaginal disc development. PNAS. 107 (32), 14217-14222 (2010).
- Niki, Y., Yamaguchi, T., Mahowald, A. P. Establishment of stable cell lines of Drosophila germ-line stem cells. PNAS. 103 (44), 16325-16330 (2006).
- Church, K., Lin, H. P. P. Kinetochore microtubules and chromosome movement during prometaphase in Drosophila melanogaster spermatocytes studied in life and with the electron microscope. Chromosoma. 92 (4), 273-282 (1985).
- Rebollo, E., González, C. Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes. EMBO rep. 1 (1), 65-70 (2000).
- Cheng, J., Hunt, A. J. Time-lapse Live Imaging of Stem Cells in Drosophila Testis. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 11, 2E.2.1-2E.2.8 (2009).
