Abstract
Während der Spermatogenese bei Säugetieren und in Drosophila melanogaster, entwickeln männlichen Keimzellen in einer Reihe von grundlegenden Entwicklungsprozessen. Dazu gehört die Differenzierung von einer Stammzellpopulation, mitotische Verstärkung, und Meiose. Darüber hinaus postmeiotischen Keimzellen durchlaufen eine dramatische morphologische Umformung sowie eine globale epigenetische Rekonfiguration der Keimbahn Chromatin-Histon-zu-Protamin-Schalter.
Untersuchung der Rolle von einem Protein in postmeiotischen Spermatogenese Mutagenese oder andere genetische Werkzeuge oft von wesentlicher embryonalen, vorge meiotischen oder meiotischen Funktionen des untersuchten Proteins behindert. Die postmeiotischen Phänotyp einer Mutante eines solchen Proteins kann durch einen früheren Entwicklungs Block verdeckt werden oder die Interpretation des Phänotyps kompliziert werden könnte. Der Modellorganismus Drosophila melanogaster bietet einen Bypass für dieses Problem: intakte Hoden undsogar Zysten von Keimzellen von der frühen Puppen seziert der Lage sind, ex vivo in Kulturmedium zu entwickeln. Die Nutzung von solchen Kulturen ermöglicht mikroskopische Abbildung von lebenden Keimzellen in den Hoden und der Keimbahn-Zysten. Wichtig ist, dass die kultivierten Hoden und Keimzellen auch zugänglich pharmakologische Inhibitoren werden, wodurch Manipulation der enzymatischen Funktionen erlauben während der Spermatogenese, einschließlich postmeiotischen Stufen.
Das vorgestellte Protokoll beschreibt, wie man sezieren und zu pflegen Puppen Hoden und Keimbahn-Zysten. Informationen über die Entwicklung des Puppen Hoden und Kulturbedingungen werden neben Mikroskop-Bilddaten des lebenden Hoden und Keimbahn-Zysten in Kultur bereitgestellt. Wir beschreiben auch eine pharmakologische Assays zu postmeiotischen Spermatogenese, durch einen Test zur Förderung der Histon-zu-Protamin-Schalter mit dem Histon-Acetyltransferase-Inhibitor Anacardsäure beispielhaft zu studieren. Im Prinzip könnte diese Kultivierungsmethode angepasst werden, um viele O-Adressether Forschungsfragen in Pre-und Post-meiotischen Spermatogenese.
Introduction
Die Entwicklung der männlichen Keimzellen vieler Arten ist eine sequentielle Verfahren. Es wird von einer Reihe von entscheidenden Ereignisse, die in der Bildung von morphologisch und epigenetically hoch spezialisierte Spermatozoen gipfelt gekennzeichnet. In Drosophila melanogaster, Keimbahn-Stammzellen an der Spitze des Hodens Kluft asymmetrisch zu einer neuen Stammzelle und der Spermatogonie, dh die Tochterzelle, die Differenzierung verpflichtet ist (siehe Abbildung 1 für eine Übersicht) geben 1,2 . Die Spermatogonie erfährt vier Runden mitotische Teilungen und mit dem Beginn der Meiose, eine Phase des Wachstums und der eindrucksvollen Transkriptionsaktivität genannt Spermatozyten Bühne. Die Zellen aus einer Ursprungs Spermatogonie bleiben miteinander verbunden und zu entwickeln als Synchronbündel durch zwei somatische Zellen-Struktur als eine Zyste bezeichnet gewickelt. Nach Beendigung der Meiose ist die Morphologie der männlichen Keimzellen völligreorganisiert (schematisch in 1 gezeigt). Zunächst runden Spermatiden länglich, um die hydrodynamische Kopfstruktur bilden, und die Geißel entwickelt. 5 - schließlich werden die Spermazellen, die voneinander durch einen Komplex, der Apoptose-verwandten Mechanismus genannt Individualisierung 3 getrennt.
In vielen Spezies, einschließlich Drosophila melanogaster und Säugerspezies, die morphologischen Veränderungen der Keimzellen sind durch eine bemerkenswerte epigenetische Umlagerung des haploiden männlichen Keimbahn-Chromatin begleitet, genannt die Histon-zu-Protamin Schalter (Druckschalter) 6 - 9. Eventuell fast alle kanonischen Histon und viele Histon-Variante Moleküle aus der DNA abgezogen und durch kleine basische Proteine, Protamine, was zu der sehr kompakten nucleoprotamine spezifische Struktur des Chromatins von reifem Sperma ersetzt. Allgemeine Eigenschaften der HP-Schalter sind Ter Ersatz von kanonischen Histone zuerst Histonvarianten, dann durch Übergangs Proteine und schließlich durch Protamine. 12 - all das wird durch mehrere Änderungen an epigenetischen Markierungen, wie zB ein Anstieg der Acetylierung von Histon H4 Ebenen kurz vor Histon Entfernung 7,10 begleitet.
Die meisten, wenn nicht alle der oben genannten Verfahren sind für die Entwicklung von reifen, vollständig fruchtbare Samen. Dies gilt nicht nur in Drosophila, sondern auch bei Menschen, wie Säuger Spermatogenese teilt eine beträchtliche Ähnlichkeit mit dem wirbellosen System 1,8,9. Studium männlichen Keimzellentwicklung wird stark in der Drosophila-Modellsystem erleichtert. Fliegen sind genetisch sehr gut zugänglich. Der Erzeugung von Mutanten sowie die Einrichtung von Flug Stämme, die Fusionsgene oder RNA-Interferenz-Konstrukte nimmt wenig Aufwand. Jedoch in der Studie von postmeiotischen Spermatogenese, die Verwendung von Mutanten einesd einfachen genetischen Werkzeuge könnte eine Grenze zu erreichen. In Drosophila Spermatogenese, hört Transkription fast vollständig mit dem Eintritt in meiotischen Teilungen. 16 - So wird postmeiotischen Spermatogenese vor allem auf translational drückt und gespeichert mRNAs in einer erweiterten meiotischen Prophase 13 synthetisiert basiert. Daher Tools wie RNA-Interferenz oder die Verwendung von nicht-bedingte Mutanten sind nicht geeignet für die Untersuchung speziell auf die post-meiotischen Rollen von Gen-Produkte, die auch wesentliche Funktionen in der Vor-oder meiotischen Reifekeimzellentwicklung zu erfüllen.
Ein Vorteil von Drosophila, die in solchen Fällen ausgenutzt werden kann, ist die Fähigkeit des intakten Hoden seziert und sogar Zysten von Keimzellen ex vivo in einem Kulturmedium zu entwickeln 4,12,17 - 20. Die Präparation und Kultivierung von Hoden oder Keimbahn-Zysten lassen sich nicht nur mikroskopische Beobachtung der Keimzellentwicklung in lebenden Zellen, sondern einelso die Verwendung pharmakologischer Tests mit beispielsweise Inhibitoren der Enzymkomplexe, wie Histonacetyltransferasen (Hut), Histon-Deacetylasen (HDACs), Topoisomerasen, oder das Proteasom. So ist es möglich, während der enzymatischen Funktionen postmeiotischen Spermatogenese zu manipulieren und die Entwicklungsergebnisse unabhängig von embryonalen, Pre-meiotischen oder meiotischen Funktionen 4,12 überwachen.
In pharmakologischen Tests, die wir zuvor analysierten die Acetylierung abhängige Lokalisation eines Proteins während der Meiose Bromodomäne Prophase sowie die Relevanz der Histon-Acetylierung Stufen für die epigenetischen Schalter in HP postmeiotischen Spermatogenese durch spezifische Inhibitoren Targeting Hüte und HDACs 12,21. Zur Förderung der Druckschalter in diesen Assays wurde unter Verwendung eines Flug Stamm, der das Fusionsgene histone2AvD-RFP und protamineB-eGFP 12,22 in den endogenen Muster ausdrückt möglich gemacht, und die Beobachtung, dassdie ersten Spermatiden in Puppen Hoden passieren die HP-Schalter zwischen 24 und 48 h APF 12.
Das vorgestellte Protokoll beschreibt die Präparation der Hoden und Zysten von Drosophila Puppen, den Kulturbedingungen und pharmakologischer Test mit intakten Puppen Hoden. Zu diesem Zweck Puppen Hoden bei rund 24 Stunden nach der Pupariumbildung (APF) seziert werden (siehe Abbildungen 1 und 2). Zu diesem Zeitpunkt wurden die Hoden nicht Verbindungen zu anderen Geweben und sind nur von einer dünnen äußeren Hülle, die eine bessere Penetration durch die Inhibitorverbindungen ermöglicht 23,24 umgeben. Die Hoden Bohnen- oder birnenförmige Organe, die leicht in Kultur genommen werden kann. Diese Hoden seziert, kultiviert und mit spezifischen Inhibitoren behandelt. Anschließend werden die Wirkungen der Inhibitoren mittels Immunfluoreszenz analysiert und Fluoreszenzmikroskopie von Fusionsproteinexpressions überwacht, und durch Vergleich der Kern Morphollogie der behandelten Keimzellen, um die von unbehandelten Keimzellen. Die in diesem Protokoll vorgeBedingungen erlauben auch die Live-Darstellung der Entwicklung von Hoden und Keimbahn-Zysten in der Kultur.
Protocol
Ethik-Anweisung:
Die in diesem Protokoll beschriebenen experimentellen Verfahren beinhalten ausschließlich mit Drosophila melanogaster arbeiten und unterliegen nicht der Tierschutzgesetze in Deutschland.
1. Herstellung der Medien, Tools und Fliegen
- Bereiten modifizierten handelsüblichen pulverförmigen M3-Wachstums-Medium ohne Kaliumbicarbonat 17. ACHTUNG: Reizt die Augen und die Haut. Ergänzung des Mediums mit 10% fötalem Rinderserum, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin. Verwenden Sie hitzeinaktiviert und insekten Kultur-geprüft fetales Rinderserum für beste Ergebnisse. Filtern des Vollmedium (nachstehend als Medium bezeichnet), durch ein 0,2 um-Flaschenaufsatz-Filter-Einheit und Speicher in Aliquots bei -20 ° C. Vor Gebrauch Filter (0,2 um Spritzenfilter Spitze) das Medium erneut auf Niederschläge zu entfernen.
- Bereiten Inhibitor-Stammlösungen für die pharmakologischen Tests. DISSOLve die Chemikalien in dem entsprechenden Lösungsmittel und Speicher in Teilmengen. Zum Beispiel wird eine Stammlösung von 28,69 mM Anacardsäure (ACHTUNG: Reizt die Augen und die Haut) in Dimethylsulfoxid.
- Werkzeuge vorzubereiten für die Störung der Puppen seziert Hoden und Präparation der einzelnen Zysten. Verwenden Sie zwei scharfe und steife Nadeln, anstatt einer Pinzette. Die Kapillare Kraft, die zwischen den beiden Armen einer Zange entwickelt macht die Präparation der einzelnen Zysten in kleinen Mengen Medium sehr schwierig. Verwenden Sie zum Beispiel die Spitze eines Edelstahl Insektenstift in einer Impföse Halter eingesetzt.
- Um angemessene Alter Puppen, Samen ca. 10 große Kulturfläschchen (Rohre mit 4 cm Durchmesser) mit einer ausreichenden Anzahl von erwachsenen Fliegen (ca. 40-60 Linie) zu erhalten. Um die HP Switch analysieren, verwenden Fliegen H2AvD-RFP und ProtamineB-eGFP exprimieren in ihrer endogenen Muster 12,16,22. Die Fläschchen unter Standardbedingungen bei 25 inkubieren; ° C für ca. 4-5 Tage bis dritten Larvenstadium kriechen und starten Verpuppung an den Wänden der Fläschchen 25.
2. Kennzeichnung oder Sammel Weiß Pre-Puppen für Dissection Erhalten 24 h alten Puppen
- Um den Einfluss von bestimmten Chemikalien auf der HP-Schalter zu testen, Puppen sezieren Hoden bei ca. 24 h APF 12. Inszeniert Puppen zu erhalten, nehmen die vorbereiteten Flugkulturfläschchen mit Verpuppung Larven (siehe Abschnitt 1.4) und zu identifizieren, wie viele weiße Pre-Puppen wie möglich. Pre-Puppen während der erste Schritt in der Verpuppung erscheinen als unbeweglich, nicht-Fütterung, sondern verkürzt Larven mit umgestülpten Luftlöcher und weiß gefärbte Puppenhülle. Die Puppenhülle wird tan-braun innerhalb von 30 bis 60 min, die die nächste Stufe der Puppenentwicklung 26 zeigt.
- Markieren die Positionen der Pre-Puppen mit einer dauerhaften Markierung auf der Außenseite der Phiolen. Die Fläschchen Inkubation bei 25 ° C für ca. 24 h.
- Alternativwählen Sie die Pre-Puppen von der Seite der Fläschchen mit einem kleinen Pinsel mit PBS-Puffer befeuchtet. Dann überweisen Sie den Pre-Puppen an der Seite ein frisches 50 ml Reaktionsgefäß und Inkubation bei 25 ° C für ca. 24 h.
3. Präparation Pupal Hoden bei ca. 24 Stunden nach der Pupariumbildung
- Verteilen Sie einige Tropfen (ca. 80 ul jeder) des Mediums auf einem 10 cm Kunststoffzellkultur oder eine Petrischale. Mit einer breiten Pinzette oder einem Pinsel mit mittlerer befeuchtet, nehmen die Puppen an der 24-Stunden-APF Bühne aus den Fläschchen inkubiert (siehe Abschnitt 2). Übertragen einer Puppe zu jedem Mediumtropfen auf dem Teller.
- Für die Präparation, verwenden Sie ein Stereo-Mikroskop mit einer Faseroptik-Lichtquelle ausgestattet. Die Hoden oben RT während der Präparation nicht erhitzen, da dies die richtige Entwicklung in der Kultur zu verhindern.
- Sezieren Puppen mit zwei Paaren von Nr. 5 Pinzette. Mit einem Paar, greifen die Puppe an seinem hinterstenTeil (die hinteren Luftlöcher) und halten sie in Position.
- Besorgen Sie sich die vorderen Luftlöcher mit der anderen Pinzette und öffnen Sie das Puppenkiemendeckel an seinem vorderen Ende. Ziehen Sie die Puppenhülle, bis zumindest ein Teil des Brustkorbs ausgesetzt ist.
- Weiterhin die Puppe in Position durch seine hintersten Ende zu halten. Um den Innendruck der Puppe zu lösen, legen Sie beide Arme einer Zange in den Kopfbereich der Puppe.
- Rippen der Puppe durch Öffnen der Zange und Bewegen der Zange in der vorderen Richtung offen. Stellen Sie sicher, dass die mit dieser Bewegung erzeugt Öffnung so groß wie möglich im ersten Versuch ist. Um eine Beschädigung der Puppe an ihrem hinteren Ende, bevor der Druck freigegeben worden, da dies in die Hoden, die direkt durch die kleine Öffnung geschoben und am häufigsten gestört führen.
- Beachten Sie, dass, sobald die Puppe geöffnet wird, drückt die freiInnenDruck der Puppe aus Agglomeraten von Fettkörperzellen und Gewebe durch die large Öffnung in der Kopfregion. Prüfen, ob die Puppen Hoden haben bereits von der Puppe mit diesem Material geschoben worden; Dies erfolgt in einigen Fällen. Die Hoden sind nicht auf andere Gewebe nach 24 Stunden APF verbunden sind und deshalb leicht von der Puppe 23 ausgestoßen werden.
- Vermeiden Sie drückte die Puppe mit der Zange, da dies die Hoden beschädigen, wenn sie in der Puppe bleiben. Erhöhen Sie die Größe der Öffnung mit einer Pinzette.
- Halten Sie dann die Puppe an seinem hintersten Ende. Schließen Sie die anderen Pinzette und sanft Strähne aus dem Inhalt der Puppe von posterior nach anterior der Hoden aus der Puppe zu lösen.
- Sammeln Sie die Hoden, indem Sie sie in eine vorgeschnitten 200 ul Pipettenspitze. Versuchen, nur eine sehr kleine Menge des Mediums zu übertragen, um die Anzahl der Fettkörperzellen mit den Hoden übertragen verringern. Legen Sie die Hoden in das Medium in einer frischen Kulturschale. Mehrmals mit Medium waschen die Hoden, bis nur noch wenige Fettkörperzelles bleiben.
- Für Live-Bildgebung, übertragen Hoden zu einem Glasbodenkulturschale mit mittleren und verwenden eine umgekehrte Imaging Mikroskop. Für pharmakologische Tests, mit Schritt 5 fortfahren.
4. Präparation der männlichen Keim Online-Zysten und Live-Imaging
- Übertragen eine oder mehrere Puppen Hoden auf einem Glasbodenkulturschale.
- Verwenden Sie ein Stereo-Mikroskop mit Glasfaserbeleuchtung und zwei Edelstahl-Nadeln (siehe Abschnitt 1.3) für die Dissektion der männlichen Keimbahn-Zysten.
- Mit einer Nadel vorsichtig versuchen zu fassen ein Hoden an seinem vorderen oder hinteren Ende. Halten Sie es in Position. Stecken Sie das andere Nadel in den Hoden und stören die Hoden Mantel durch Bewegen der Nadel seitwärts. Viele der Zysten aus dem Hoden durch diese Bewegung freigegeben werden.
- Weiterhin die Hoden in der Position mit einer Nadel zu halten. Sanft Serie aus den verbleibenden Zysten aus dem Hoden mit der anderen Nadel.
- Separate aggregiert Zysten entweder durch Gently Verschieben einer Nadel seitlich durch die Cluster von Zysten oder durch die Übertragung der Zysten in ein frisches Kulturschale mit Medium mit einer 200 ul Pipettenspitze.
- Bewegen Sie die Kulturschale mit einem invertierten Mikroskop für Live-Imaging-Abbildung einzelner Zysten. Dispergieren Zysten wieder mit einer Nadel, falls erforderlich.
- Identifizieren Sie die Stufe der Zysten durch Verwendung Phasenkontrast-und Fluoreszenzmikroskopie.
- Konzentrieren Sie sich auf eine Zyste der gewünschten Bühne. Ausrichtung und Lage der Zyste bestätigen häufig während längerer Abbildungsexperimente, wie die Zysten nicht auf dem Boden der Kulturschale anhaften, und neigen daher dazu, unscharf zu schweben.
HINWEIS: Die Beschichtung der Schale mit Poly-L-Lysin zur Immobilisierung ist nachteilig für die Entwicklung der frühen Keimbahn-Zysten. Stattdessen können einzelne Zysten isoliert werden. Mit etwas Übung ist es möglich, einzelne aus einer bestimmten Zyste durch sehr sanftes Drücken Sie es mit der Nadel. Dadurch wird die Übertragung einzelner Zysten separate Kult erlaubenUre Gerichte mit einem Glas Pasteur-Pipette mit einer gezogenen Spitze, die in das Sichtfeld des Mikroskops passt. Die isolierten Zysten dann leicht in den Kulturschalen auch nach langfristiger Inkubation verlegt werden.
5. Pharmakologische Assay mit intakten Pupal Hoden
- Füllen Sie jede Vertiefung einer 24-Well-Zellkulturplatte mit 500 ul Medium für einen Versuch von 12 Wiederholungen. Transfer eines Puppen Hoden in jede Vertiefung, mit einem vorgeschnitten 200 ul Pipettenspitze.
- Erfragen Gegenwart Protamine in den isolierten Hoden mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop. Die Hoden sollten frei von ProtamineB-eGFP-Signal, das anzeigt, dass die HP Schalter nicht in einem der Zysten getroffen werden. Ersetzen Hoden, die bereits ProtamineB-eGFP-positive Zysten zeigen.
- Auf die ersten 12 Wells, 500 ul Medium, das verdünnt Inhibitorverbindung (Anacardinsäure), um die gewünschte Endkonzentration zu erreichen(150 uM) in 1 ml Medium pro Well. Verwenden Sie die restlichen Brunnen als unbehandelte Kontrollen; Add 500 ul Medium mit der gleichen Menge des Lösungsmittels so mit dem Inhibitor-Verbindungen verwendet. Hinweis: Wenn viele Verbindungen und Lösemittel verwendet werden, kann es effizienter sein, Medium alleine als Kontrolle verwendet und um den Einfluss der Erhöhung der Lösungsmittelkonzentrationen in getrennten Experimenten getestet.
- Inkubieren der Platte bei 25 ° C für 24 Stunden im Dunkeln.
- Überprüfen erneut auf die Gegenwart von Protamine in den Hoden inkubiert, wie oben beschrieben. Die Steuer Hoden sollte nun eine oder mehrere ProtamineB-eGFP-positive Zysten, die durch den Übergang HP Schalter zeigt.
- Mit einer Pipette mit einer 200 ul Spitze, übertragen Sie die Hoden zu Poly-L-Lysin-beschichtete Objektträger, stellen Squash Vorbereitungen und Fleck mit geeigneten fluoreszierenden Antikörpern wie anderswo 12,27,28 beschrieben.
Representative Results
Der Hoden in Drosophila Männchen bereits im Embryo gebildet und besteht in der Körperhöhle während des Larvenstadien. Dritten Larvenstadium zeigen kleine, runde Hoden, umgeben von einer Schicht aus zukünftigen Pigmentzellen und Fettkörpergewebe (2A) eingebettet. Hoden bei männlichen Erwachsenen entfernt sind lang, Rohrschlangen, die von einer Schicht von Muskelzellen aus dem Genitalscheibe und einer Pigmentschicht 24 stamm abgedeckt sind. Interessanterweise enthalten Larven Hoden nur Keimbahn-Zellen von Pre-und Reifestufen Reife, bis die primäre Spermatozyten Bühne, die meiotische Prophase entspricht (siehe auch Abbildung 1) 23. Die ersten Jahrgänge der männlichen Keimzellen durch Meiose passieren während Pupariumbildung. Bei ca. 24 h APF haben postmeiotischen Stufen mit länglichen Flagellen bereits entwickelt, und alle Kerne enthalten Histon H2AvD-RFP (Abbildungen 1 und 2B). Keine der Spermatiden zogen wurden ter Druckschalter, da keine ProtamineB-eGFP-Signal kann durch Fluoreszenzmikroskopie (2C) detektiert werden. Häufig sind die Hoden zu diesem Zeitpunkt präpariert enthalten eine Autofluoreszenzstruktur variabler Größe erinnert an ein Agglomerat von Fettkörperzellen oder ein bis mehrere Tropfen Öl (2C, Pfeilspitze). Diese Struktur im Hoden ist auch mit einem Phasenkontrastmikroskop sichtbar. Bis heute haben wir keine Beschreibung der Art der in der Literatur gefunden. Hoden bei 36 h APF seziert erscheinen gestreckt und in einigen Fällen schon beginnen sich zu kräuseln (2D). Sie haben bereits zu den Geweben des Genitaltrakts aus dem Genital Imaginalscheibe 23,24 out wachsenden angebracht. Weiterhin enthalten sie häufig die ersten Spermatiden über den Druckschalter, wie durch die ProtamineB-eGFP-Signal (1 und 2D, Pfeil). Nach 48 h APF, haben die Hoden weiter verlängert und deutlich zu starten Eisstockschießen amproximalen Ende. Mehrere Keimbahn-Zysten mit Protamin-positiven Kerne sichtbar (Abbildung 2E, Pfeil).
Wenn Hoden bei 24 Stunden APF zerlegt werden in Kultur für 24 Stunden gehalten, sie nicht wie in der intakten fly längliche (vergleiche Figur 2D und 2E mit 6A). Dies ist möglicherweise aufgrund des Fehlens von Positionssignalen und Wachstum normalerweise von der Entwicklungsgenitaltrakt Kontaktieren der Hoden an seinem hinteren Spitze 23,29 gesendet. Darüber hinaus hat der Muskelschicht der Hülle Hoden nicht entwickeln, weil werdende Myotuben kann nicht von der Genitalscheibe wandern in die Hoden 24. Der Hoden-Hülle in dieser Situation nur die dünne Pigmentschicht-scheint nicht ausreichend in Kultur wachsen, um die zunehmende Zahl von Entwicklungskeimzellen innerhalb der Hülle. Die Keimzellen wachsen, sich teilen und differenzieren unabhängig von den Hoden Scheide. Daher, nach mehr als 36 hr in der Kultur, werden die frühen Hoden häufig platzen, und die weitere Entwicklung nicht beachtet wird. , In einem kürzeren Zeitrahmen ist es jedoch möglich, Zeitraffer-Ex-vivo-Live-Bilder der gesamten Hoden Entwicklung in Kultur aufnehmen, wie von 3A -3 C belegt (siehe auch Zusatz Video 1). Ein Puppen Hoden, bei ca. 45 h APF seziert, wurde im Medium für 6 h inkubiert und abgebildet alle 5 min. Innerhalb dieses Zeitrahmens, mehrere Zysten von Spermatiden ergeben sich aus der HP Schaltstufe und zeigen eine helle ProtamineB-eGFP-Signal (3A '-3 C, offene Pfeile).
Wie oben erwähnt, männliche Keimzellen im Hoden zu entwickeln, wie Drosophila synchronisiert Bündel von miteinander verbundenen Zellen, genannt Zysten 1. 4A zeigt einen Überblick über die Zysten von einer Puppen Hoden bei rund 24 h APF seziert. Pre-Reifestufen, Reifestufen, frühe postmeiotischen Stufen und auch Zysten in der frühen Phase Kanu mit länglichen Kernen vor dem HP Switch kann (Abbildungen 1 und 4B -4 E) gefunden werden. Die isolierten Zysten sind sehr empfindlich und sollten vorsichtig behandelt werden. Die beiden Körperzellen, die Hülle der Zyste bilden kann leicht mechanisch zerstört werden. Keimbahn-Stammzellen haben die Fähigkeit zu überleben und nach der Teilungs genetischen Ablation der somatischen Zellen in vivo Zyste 30. Es ist berichtet worden, dass in vitro, Keimzellen der 16-Zell-Stadium von ihrem somatischen Umschlag getrennt weiter zu entwickeln und zu differenzieren 19. In der Tat, bemerkten wir in unserem Kultursystem, die vermutlich Ende Spermatozyten abgeschlossen meiotischen Teilungen mit einer gestörten Zyste Zellen, wenn auch sehr selten. Am häufigsten hörten diese gestört Zysten Entwicklung. Nach dem Protokoll vorgestellt, intakte Zysten vielleicht in einigen Fällen develop ex vivo in Kulturmedium für maximal 72 Stunden. Wir beobachteten jedoch, dass eine angemessene Anzahl von Zysten überleben bis zu 48 h Inkubation. In diesem Zeitrahmen sind die kultivierten Zysten in der Lage, von der primären Spermatozyten Bühne bis nach Reifeteilungen sowie aus dem runden Kernen Bühne mit Histon-basierte Chromatin bis in die späten Kanu Stadium jenseits des HP-Schalter 12 zu entwickeln. Dies erlaubt die Bildgebung von lebenswichtigen Prozessen in der Spermatogenese, wie beispielsweise Eingabe Spermatozyten meiotischen Teilungen (Abbildung 5 und Zusatzvideo 2). Für dieses Experiment wurde das RFP-markiertes Histon Variante H2AvD als Chromosomenmarker verwendet. Der primäre Spermatozyten Bühne erstreckt sich über ca. 3 Tage im vivo 31. Deshalb, um zu meiotischen Teilungen aufnehmen, haben wir uns mit Zysten Spermatozyten, die sichtbar begonnen hatte Chromatin-Kondensation (5A, Region 2). Reifeteilung beginnt in Spermatozytenauf einer Seite der Zyste und folgt in einer Welle in den verbleibenden Spermatozyten dann (in 5A von Region zu Region 2 1, siehe auch Zusatzvideo 2). Kondensation des Chromatins führt bald zu schnell bewegenden Chromosomen, die als helle Flecken (5A, Region 2) sichtbar sind. Nach 30 min werden die ersten Spermatozyten dieser Region bereits in der Telophase (5B, Pfeilspitzen). Die Chromosomen der jüngeren Region 1 arrangieren am Metaphaseplatte 20 min später (5C). Sie komplette Telophase und sind bereit, Zytokinese ca. 15 min später (5D) zu unterziehen. Anaphase, Telophase dauerte, und Zytokinese ca. 10 min in dieser Aufnahme (Supplemental Video 2).
Bei Säugetieren als auch in Drosophila, ein ausgeprägter Anstieg der Histon H4 Acetylierung markiert den Beginn der Histon-Entfernung und der HP-Schalter während postmeiotischenSpermatogenese 6,11. Es wurde vorgeschlagen, dass diese epigenetische Veränderung ist eine wesentliche Komponente oder auch Trigger des Entwicklungsprogramms der Druckschalter 10,32. Bisher behandelten wir Drosophila Puppen Hoden in der Kultur mit Inhibitoren Targeting Hüte und HDACs, um die Acetylierung von Histon H4 Niveau während postmeiotischen Stufen 12 beeinflussen. In dieser pharmakologischen Tests haben wir festgestellt, dass die Histon-Acetylierung ist für das Fortschreiten der Spermatogenese von Stufen mit Histon-basierten Chromatin zu Stufen mit Protamin-basierten Chromatin.
Die 6 und 7 zeigen repräsentative Ergebnisse einer pharmakologischen Test unter Verwendung Anacardsäure zu Hüte in Puppen Hoden Ziel. Hoden bei 24 Stunden APF wurden aus einer Fliege Stamm H2AvD-RFP und ProtamineB-eGFP exprimierenden seziert. ProtamineB-eGFP Protein war in diesen frühen Puppen Hoden (6A und B) fehlt. Nach 24 hr in Kultur zeigten die Kontroll Hoden ProtamineB-eGFP-Signale, die zeigten, dass die erste Zysten hatte über den Druckschalter (6A ', offene Pfeile) entwickelt. Dies war nicht der Fall bei den mit 150 uM Anacardinsäure (6B ') behandelt Hoden. Hoden Squash Vorbereitungen und Immunfluoreszenz-Analysen bieten detaillierte Informationen (Abbildung 7). In der unbehandelten Kontrolle, können die Kerne der relativ großen primären Spermatozyten durch ihre charakteristische Muster von drei Regionen reich gefärbten DNA, die zu den Haupt Chromosomen entsprechen (4C-Pegel) von Drosophila (7A, Spalte 1) erkannt werden. Acetylierung von Histon H4 ist in dieser Phase (7B, Spalte 1) deutlich erkennbar. Die erste Stufe nach meiotischen Teilungen als Nebenkern Stufe bekannt und wird von ziemlich großen, runden Kernen gekennzeichnet (siehe Figur 4C, in 7 nicht gezeigt). Die in 7 gezeigte nächste Schritt ist durch Flagella Wachstum und die runde Form der Keimzellkernen, die bereits viel kleiner sind als in früheren Stufen (7A, Spalte 2) und sehr niedrige nahezu nicht nachweisbare Mengen von Histon H4 Acetylierung identifiziert (7B, Spalte 2). Die runde Form dann verlängert (7A, Spalte 3), die Acetylierung von Histon H4 ist wieder deutlich nachweisbar (7B, Spalte 3). Die Spermatiden erreichen dann die Kanuform Stadium, in dem der HP-Switch stattfindet und Histonen durch Protamine ersetzt (7A - 7 C-, Spalten 4 und 5). Nach der Kanu Bühne, dann die Kerne protaminated weiter in einer sehr dünnen Nadel längliche Form in der reifen Spermien (hier nicht gezeigt).
Hoden Squash Zubereitungen der Hoden mit Anacardsäure behandelt wurden, zeigten unterschiedliche Ergebnisse (7D </ Strong> - 7 F). Das Chromatin in Keimzellen mit Anacardinsäure behandelt erschienen mehr als die der unbehandelten Kontrolle (vergleiche Figur 7D, behandelt und 7A, Kontrolle) kondensiert. Immunfluoreszenz-Analysen zeigten, dass die Acetylierung von H4 wurde stark vermindert oder in Kernen von Keimzellen mit Anacardsäure (7E) behandelt gar nicht vorhanden. Es ist bekannt, daß hoch acetylierte Histone mit Bereichen offener Chromatin assoziiert, während Chromatinregionen die Histonacetylierung fehlt zeigen häufig eine repressive Struktur 33. Daher ist es nicht überraschend, dass die Behandlung mit Anacardinsäure beeinflusst die Chromatinstruktur der behandelten Keimzellkerne. Wichtig ist, wurden keine Protamin-positiven Kerne der späten Phase Kanu oder darüber hinaus in behandelten Hoden (7F) identifiziert. So mit der Idee sind unsere Daten, dass die HAT-Aktivität ist wichtig für Spermiogenese zu her gehenm Histon-basierte Chromatin zu Protamin-basierte Chromatin Stufen.
Abbildung 1. Übersicht über Drosophila Spermatogenese. Die linke Abbildung zeigt die Reihenfolge der Stufen in Keimzellentwicklung aus einer Stammzelle bis hin zu individualisierten Spermien. Schematische Zeichnungen zeigen das charakteristische Kernmorphologie der Keimzellen. Eine Spermatogonie teilt, um 16 miteinander verbundenen Spermatozyten in einer Zyste zu produzieren. Während dieser Phase die meisten der Transkripte für postmeiotischen Entwicklung benötigt werden hergestellt, translational reprimiert und gespeichert. Der Großteil der Transkriptionsaktivität endet mit dem Eintritt in die Reifeteilungen. Die Histon-zu-Protamin-Schalter in der Chromatin zwischen der frühen und späten Phase Kanu statt. Stufen mit einer Histon-basierte Chromatin hoch sindbeleuchtet in rot; Stufen mit einer Protamin-basierte Chromatin sind grün markiert. Die Balken auf der rechten Seite zeigen die Stadien der Keimzellen, die normalerweise in den Entwicklungs Hoden in Larven gefunden werden kann, Puppen bei ca. 24 und 36 Stunden nach der Pupariumbildung (APF) und erwachsenen Fliegen.
Abbildung 2. Drosophila Hoden in verschiedenen Stadien der Entwicklung. (A) Phasenkontrastbild eines leicht gequetscht ganze-mount Hoden eines dritten Larvenstadium Larve (L3). Nur Vor-und Reifestufen Reife gefunden werden kann. Spermatogonien sind an der vorderen Spitze unterhalb der Nabenbereich (Sternchen) beschränkt. Die restlichen Hoden mit Spermatozyten (offener Pfeil). (B) Phasenkontrast-Bild einer leicht gequetscht Hoden bei ca. gefüllt 24 Stunden nach der Pupariumbildung (APF). Zusätzlich zu Spermatozyten (offener Pfeil), enthält die Hoden Spermatiden in der Nebenkern Stufe (offene Pfeilspitzen), mit runden Kernen und Spermatiden in Verlängerung Stufen mit wachsender Geißeln (Doppel offene Pfeilspitze) (C - E). Whole-Mount-Puppen Hoden ausdrücken H2AvD-RFP und ProtamineB-eGFP (Überlagerungen von Phasenkontrast-und Fluoreszenz eGFP und RFP Bilder). (C) Pupal Hoden bei ca. 24 h APF seziert. Pfeilspitze markiert Autofluoreszenz von vermeintlichen Fettkörperzellen. D) Pupal Hoden bei ca. 36 h APF seziert zeigt den ersten ProtamineB-eGFP-positive Zyste (Pfeil). (E) Pupal Hoden bei ca. 48 h APF mit einer Gruppe von ProtamineB-eGFP-positive Zysten (Pfeil). In allen Figurenteile, Sternchen zeigen die Nabenbereich. Maßstabsbalken: 100 um.ank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Live-Bildgebung des Histon-zu-Protamin-Switch in einem Puppen Hoden wachsen ex vivo. (A) Phasenkontrast-Bild von einem Puppen Hoden H2AvD-RFP und ProtamineB-eGFP nach Pupariumbildung (APF) in Kultur bei ca. 45 h genommen ausdrückt. Die Samenblase wird von einem gefüllten Pfeil angezeigt. Ein paragonium (Doppelpfeil) bleibt auf der Hoden befestigt. (A ') und eGFP RFP Fluoreszenz des in (A) gezeigt, Hoden. Der offene Pfeil eine ProtamineB-eGFP-positive Zyste. Maßstab:. 100 um (B) Nach 2 Stunden 30 Minuten in der Kultur, mehrere weitere Zysten (offener Pfeil) entstehen from die Histon-zu-Protamin Übergang. (C) Nach einer zusätzlichen ca. 3 Stunden in Kultur, das heißt, ist ein insgesamt 5 h 29 min in Kultur eine Gruppe von Zysten (offener Pfeil) mit starken ProtamineB-eGFP-Signal an dem proximalen Ende des Hodens sichtbar. Siehe auch Zusatz video 1. In allen Figurenteile, Sternchen zeigen die Nabenbereich. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Isolierte Zysten von Keimzellen in verschiedenen Stadien der Entwicklung. (A) Zysten aus einem Hoden seziert bei ca. 24 Stunden nach der Pupariumbildung (APF). Überlagerung von Phasenkontrast-und Fluoreszenz H2AvD-RFP (rot) Bilder. Maßstab: 100 um.(B - E) Vergrößerungen einzelner Zysten verschiedenen Stadien. Überlagerung von Differentialinterferenzkontrast (DIC) und H2AvD-RFP-Fluoreszenzbilder. Maßstab:. 20 um (B) Zyste von 16 Spermatozyten (C) Zyste von 64 runden Spermatiden am Nebenkern Bühne.. Die Nebenkern Struktur entwickelt sich aus verschmolzen Mitochondrien und ist an der DIC Bildern sichtbar neben dem Zellkern (offene Pfeilspitze). (D) Zyste der Spermatiden mit runden H2AvD-RFP-positiven Kerne und verlängert Geißeln (offene Pfeilspitze zeigt eine Verlängerung Nebenkern Struktur, die begleitet wachsenden Axonem). (E) Apical Spitze einer Zyste der Spermatiden in der frühen Phase Kanu zeigt einen langgestreckten Kernform. Das umfassend längliche Flagellen sind nur teilweise sichtbar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses f ansehenBBILDUNG.
Abbildung 5. Live-Darstellung von einem einzigen 16-Spermatozyten Zyste Meiose I ex vivo. Fluoreszenzbilder von einer Zyste in der Kultur H2AvD-RFP ausdrückt. Dargestellt sind charakteristische Phasen der Meiose I Spermatozyten in der Zyste passieren meiotischen Teilungen in einer wellenartigen Weise. (A) Chromosomenkondensation beginnt in Kerne an einer Seite der Zyste (2) und schreitet durch die Zyste (Pfeilrichtung ). Kerne in dem gegenüberliegenden Bereich (1) stellen eine frühere Stufe der Kondensation des Chromatins, wo Histon-dichte Bereiche Kennzeichnung der drei Haupt Chromosomen noch erkennbar. Spermatozyten in der Region (2) enthalten Chromosomen vollständig kondensiert, sichtbar als helle fluoreszierende Flecken. (B) Nach 300, min die ersten Spermatozyten im Bereich (2) sind in der Telophase (offene Pfeilspitzen), während die Chromosomenkondensation weiter in der Region (1) (C) in den letzten Spermatozyten der Region (1), die Chromosomen (Pfeilspitzen) angeordnet sind. am Metaphaseplatte 20 min später. (D) In einem weiteren 15 min, erscheinen die letzten Spermatozyten zu Telophase abgeschlossen haben und sind nun bereit, Zytokinese (offene Pfeilspitzen) zu unterziehen. Siehe auch Zusatz Video 2 Skala bar.:. 50 um Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6. Anacardsäure hemmt die Histon-zu-Protamin-Schalter in kultivierten Puppen Hoden. Pupal Hoden Expressi (, A, A ', DMSO, Dimethylsulfoxid Kontrolle) oder in Medium mit 150 uM Anacardsäure ergänzt (ng H2AvD-RFP und ProtamineB-eGFP und bei 24 Stunden nach Pupariumbildung seziert (APF) wurden für 24 h in Medium ohne Inhibitor inkubiert B, B '). Hub Regionen durch Sternchen gekennzeichnet. (A, B) nach der Sektion können keine ProtamineB-eGFP-positive Zysten beobachtet werden. (A ') Nach 24 Stunden Inkubation unterzog einige Zysten die Histon-zu-Protamin-Schalter und ProtamineB-eGFP-positive Zysten (offene Pfeilspitzen) beobachtet werden kann. (B ') mit Hoden Anacardsäure behandelt entwickeln sich nicht ProtamineB-eGFP-positive Zysten. Maßstab:. 100 um Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 7. Anacardsäure wirkt Histon H4 Acetylierung und die Chromatinstruktur von Spermatiden Squash Zubereitungen Spermatid Kerne von Puppen Hoden (24 h APF) ausdrückt ProtamineB-eGFP inkubiert für 24 Stunden ohne Inhibitor (A - C). Oder mit 150 uM Anacardsäure (D - F). DNA mit Hoechst-Farbstoff (A und D) gefärbt. H4 Acetylierung analysiert immunofluorescently (B und E). Gegenwart Protamine mit ProtamineB-eGFP Signal (C und F) überwacht. Nach der Behandlung mit Anacardinsäure, wird das Chromatin stark verdichtet (D) und der H4 Acetylierung Signal vollständig in allen Stufen Spermatiden (E) reduziert. Darüber hinaus ist die Anacardinsäure-säurebehandeltenHoden zeigen keine Zysten in der letzten Kanu Bühne oder darüber hinaus, und keine ProtamineB-eGFP-Signal (F). Maßstab:. 10 um Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Zusatz Video 1. Live Bildgebung mittels eGFP und RFP Fluoreszenz des Histon-zu-Protamin-Schalter in einem Puppen Hoden wachsenden ex vivo. Video von 6 h Zeitverlauf zeigt die Abbildungs Histon-zu-Protamin-Übergang durch den Anstieg der Häufigkeit von ProtamineB- eGFP-positive Zysten. Bilder wurden alle 5 Minuten gewonnen. Details siehe Abbildung 3. (Siehe "suppl_video_1.MOV" unter Downloads).
Zusatz Video 2. Live-Imaging von einer einzelnen 16-Spermatozyten Zyste Meiose I ex vivo. Zeitraffer-Fluoreszenz-Imaging von aZyste in der Kultur H2AvD-RFP exprimierenden im Laufe von 80 min. Dieses Video zeigt die charakteristischen Stadien der Meiose I. Die Bilder wurden alle 1 min erworben. Details siehe Abbildung 5. (Siehe "suppl_video_2.MOV" unter Downloads).
Discussion
Das vorgestellte Protokoll beschreibt zwei verschiedene Anwendungen sowohl auf der Basis der Fähigkeit, Drosophila Hoden und Einzelkeimbahn-Zysten bei einer gegebenen Entwicklungsstufe und auf die ex-vivo-Entwicklung der Zellen und Gewebe in der Kulturschale zu sezieren. Eine Anwendung ist die pharmakologische Manipulation der Lebensvorgänge während Spermienentwicklung. Wichtig ist, ermöglicht dies den Zugang zu postmeiotischen Spermatogenese, die nicht einfach mit Hilfe der funktionellen Analysen auf der Basis Fliegengenetik gewonnen wird. Die andere Anwendung ist die mikroskopische Beobachtung lebender und Entwicklung von Keimzellen und Hoden. Gerade diese Anwendung profitiert von der Fähigkeit der Drosophila-Zellen und Organe in Kultur, um zu überleben und zu entwickeln, bei RT und unter normaler Atmosphäre. Daher ist eine invertierte Abbildungsmikroskop mit einem Heiztisch (Erhitzen auf Standardzüchtungstemperatur von 25 ° C) ausgestattet ist ausreichend, um sinnvolle Ergebnisse in Live-Imaging Experimente erhalten. Weitermehr, viele transgenen Fliegen Stämme, fluoreszierende Protein-markierte Proteine für die Live-Darstellung vorhanden oder kann leicht festgestellt werden.
Um Puppen Hoden oder Keimbahn-Zysten von einer bestimmten Entwicklungsstufe zu erhalten, ist es wichtig, dass man mit dem Timing der Drosophila-Entwicklung vertraut ist. Der genaue Zeitpunkt für jede Stufe kann zwischen den Laboratorien, Kulturbedingungen variieren und fliegen Stämme und muss empirisch ermittelt werden. Wie oben dargelegt, ist dies besonders wichtig für pharmakologische Tests, die beispielsweise gezielt die HP-Schalter. Für solche Experimente, ist es ratsam, immer überprüfen, für Spermatiden mit einem ProtamineB-eGFP-Signal vor der eigentlichen Hemmstofftest, da der Zeitpunkt kann etwas auch innerhalb einer Population variieren.
Nach dem Protokoll über den Experimentator sollte ermöglichen, Hoden vom frühen Puppenstadien als intakte Organe frei von Fett angebracht Körpergewebe zu sezieren. Diese Hoden und, mehr noch, isoliert germ-line Zysten sind sehr zerbrechlich. Daher ist es entscheidend, die manuelle Geschicklichkeit und Erfahrung für den Umgang mit und die Übertragung Hoden und Zysten mit einer Pinzette, Nadeln, und Pipetten notwendig zu entwickeln. Insbesondere Studien Targeting meiotischen und frühen post-meiotischen Keimzellentwicklung würde davon profitieren. Zwar ist es vergleichsweise einfach, Zysten späten Spermatiden mit langen Geisseln von erwachsenen Hoden zerlegen, ist es schwierig zu früheren Stadien zu erhalten. Sezieren diese Zysten von der frühen Puppen Hoden nach diesem Protokoll ist viel effizienter. Beachten Sie, dass in einer üblichen Fliegenstamm, nur ca. 50% der Puppen wird männlich. Daher herzustellen, mindestens doppelt so viele Puppen wie die Anzahl der Hoden erforderlich sezieren. Alternativ ist es möglich, männlich L3 Larven zu identifizieren unter Verwendung eines Stereomikroskops, wie die Hoden kann als durchscheinende runde Organe in den seitlichen Fettkörpergewebe des intakten Larve 23,34 eingebettet identifiziert werden, und sie in frisches Kulturflaschen sammeln, könnenverwendet werden, um vor-Puppen für die Inszenierung und Dissektionen holen werden. Es ist auch möglich, männliche vorge Puppen 35 identifizieren.
Wir haben festgestellt, dass sowohl die isolierten Keimbahn-Zysten und die intakten Puppen Hoden in Kultur sind lichtempfindlich, was auch schon zuvor 18 berichtet. Diese Lichtempfindlichkeit könnte auch für einige in der pharmakologischen Tests verwendeten chemischen Verbindungen halten. Daher ist es am besten, die Kulturschalen eines Tests in der Dunkelheit während der Inkubation zu halten. Ebenso bei der Planung Zeitraffer-Imaging Experimente mit der Entwicklung der Hoden und vor allem, isoliert Zysten, bedenken Sie, dass zu lange Belichtungszeiten und / oder zu hohe Abtastraten können ex vivo Entwicklung hemmen. Die entsprechende Abtastrate sollte experimentell ermittelt werden.
Bakterien und / oder Pilzinfektionen und Überwachstum in den Kulturschalen stellt ein schwerwiegendes Problem. Infizierte Kulturschalen mit zu vielen Bakterien nicht unterstützt ex vivo devewicklung der Hoden und Zysten. Daher enthält das beschriebene Kulturmedium Penicillin und Streptomycin (siehe Schritt 1.1), aber während der Langzeit-Inkubation, können diese Antibiotika abgebaut werden und ihre Aktivität kann abnehmen. Dies könnte einer der Gründe für die begrenzte Zeit des Überlebens (max. 72 h) bei Verwendung des obigen Protokolls beobachtet kultiviert Zysten. Doch dieses Zeitrahmens nicht durch regelmäßige Erneuerung des Kulturmediums in den Schalen verlängert. Wir schließen, dass andere Faktoren das Überleben in Kultur beeinflussen, wie beispielsweise einen Mangel an Wachstumssignale aus anderen Geweben des Genitaltraktes. Auf der anderen Seite, ist postmeiotischen Entwicklung in Drosophila schneller als bei Säugetieren. Bei Drosophila nimmt Spermiogenese etwa 90 Stunden, und der HP-Schalter zwischen 50 und 60 Stunden nach der Meiose stattfindet 9,12. Somit ist die übliche Überlebenszeit von etwa 48 Stunden mit diesem Protokoll erreicht gut geeignet, um die Schwenkentwicklungsprozesse in spe folgenrmatogenesis wie meiotischen Teilungen oder der HP-Schalter. Obwohl bakterielle oder Pilzbefall kann mit sauberem Werkzeug und Medien vermieden werden kann, hat das vorgestellte Protokoll nicht strikt Verwendung von sterilen Arbeitsbedingungen, weil Fliegen machen und fliegen Hoden enthalten bereits Bakterien, wenn sie unter Standardbedingungen erhöht. Dennoch könnten einige Anwendungen dieser Kulturtechnik von Fliegen seziert profitieren oder sogar unter aseptischen Bedingungen erhöht (für Protokolle, siehe 17,36,37).
Pharmakologische Tests hängen von der Verwendung von chemischen Verbindungen, die als Inhibitoren oder Aktivatoren von verschiedenen Enzymen wirkt. Die üblicherweise in solchen Experimenten verwendeten Verbindungen oft sehr unterschiedlich in ihrer Zielspezifität. Als Vorteil bietet diese das Potenzial, ganze Enzymklassen zielen, zum Beispiel mit Anacardsäure Hemmung p300 / CBP, PCAF und MYST Familienmitglieder von HATs 38. Die Kehrseite der Medaille könnten mögliche Off-Target-oder zytotoxische Effekte INDUC seinvon solchen Verbindungen hrsg. Daher sollte jede Verbindung in einem Assay mit Puppen Hoden oder Zysten verwendet für seine Zytotoxizität und spezifische Wirkung bei verschiedenen Konzentrationen getestet werden. Darüber hinaus können leichte Abweichungen in den Kulturbedingungen, die Konzentration der Verbindung oder Aktivität, und Variationen in der Zelldurchlässigkeit, um die Variabilität der induzierten Effekten führen. Daher ist es notwendig, den Erfolg der Behandlung in jedem Experiment überwacht. Zum Beispiel, wenn wir verwendet Anacardinsäure bei 150 uM, beobachteten wir geringe Variabilität in der Festigkeit der Chromatin-Kondensation zwischen Phänotyp und manchmal innerhalb einiger Hoden, während die Acetylierung von Histon H4 konsequent verringert.
Pharmakologische Tests mit Drosophila Hoden in Kultur wurden verwendet, um vor und nach der Meiose Mechanismen der Spermatogenese 4,12,14,21 analysieren. Da es schwierig ist, postmeiotischen Spermatogenese mit genetischen Werkzeuge zugreifen, um Spieler mit Essentia Ziell Vor-und Reife meiotischen Funktionen, stellt diese ex vivo Ansatz eine Alternative. Weiterhin Im Prinzip könnte das Verfahren angepasst ist, um Experimente-Chase-Impuls, um die Entwicklung von behandeltem Keimzellen über die Zeit zu verfolgen. Allerdings haben wir noch nicht diese Möglichkeit geprüft. Die Nutzung der frühen Puppen Hoden ist ein Vorteil in der pharmakologischen Tests. Erstens könnte die dünne Außenhülle der jungen Puppen Hoden (ca. 24 h APF) verbesserte Durchlässigkeit von chemischen Verbindungen zu ermöglichen. Zweitens, wenn die Untersuchung der postmeiotischen HP-Schalter, die Puppen Hoden bei 24 Stunden von der APF Protamin-GFP-exprimierenden Fliegenschnur seziert ermöglichen einen direkten Auslesen, ob der HP-Schalter betroffen war oder nicht.
Bis heute mehrere Protokolle für die Ex-vivo-Kultivierung von Drosophila Organen und Geweben einschließlich Hoden und Keimbahn-Zysten sind entwickelt worden (siehe zB 4,14,17,20,39,40). Die Kultivierungsmedium und die allgemeinen Bedingungenin der hier vorgestellten wurden im Jahr 1979 gegründet Protokoll 17. das Kultursystem wurde später auf in vivo-Bildgebung des Mechanismus Individualisierung im Spät postmeiotischen Zysten aus adulten Hoden isoliert 4 angepasst. Bisher haben wir berichtet, dass diese Bedingungen Überleben und die Differenzierung der meiotischen und frühen post-meiotischen Keimzellen unterstützt auch in ihrer Zysten für rund 48 HR 12. Im Gegensatz zu anderen Kultursystemen 19 war der beobachtete Entwicklungszeitpunkt in diesen Kulturen etwa im Einklang mit der von Festproben bestimmt (für Details siehe 12) Timing. H2AvD-RFP und Protamin-GFP-Fluoreszenz-Signale können verwendet werden, um die Kernmorphologie und Chromatin Zusammensetzung der Keimzellen in Kultur zu visualisieren. Wir fanden, dass zur eindeutigen Identifizierung von Entwicklungsstufen in der Kultur, das ist gegenüber anderen Kriterien wie Wickeln von Zysten vorteilhaft. Wichtig ist, dass das vorgestellte Protokoll nicht Zusatz von Flug ext beinhaltenract oder anderen als fetales Rinderserum Wachstumsfaktoren. Darüber hinaus zeigen wir hier, dass die Bedingungen mit der Fluoreszenzmikroskopie Bildgebung von meiotischen Teilungen ex vivo in Kultur kompatibel sind. Bilder können mit hinreichender Auflösung in einem einfach zu bedienenden Medium, das langfristige Entwicklung unterstützt, erhalten werden. Dies steht im Gegensatz zu Protokollen ermöglicht kurzfristig (ca. 3 h) Beobachtungen in Voltalef Öl 41,42.
Die oben für den Anbau und pharmakologische Behandlung von Hoden und Puppen einzigen männlichen Keimbahn-Zysten beschriebenen Verfahren sind leicht an den vielen genetischen, epigenetischen und zellbiologischen, oder Entwicklungs Fragen, die in Drosophila Spermatogenese erforscht werden kann. Dies umfasst insbesondere die Forschung mit Schwerpunkt auf Keimbahn-Stammzellen. Es hat sich gezeigt, dass Stammzellen Entwicklung kann durch die Bildgebung von kultivierten adulten folgen Hoden 20,43. Allerdings ist die peristaltische Bewegung der reifen Hoden sheath stört Bildaufnahme. Daher wird entweder Bildgebung mit fragmentierten Hoden 43 oder die Anzahl der Bilderzeugungsversuche durchgeführt, muss erhöht werden, um die verlorene Datensätzen 20 Konto erfolgen. Frühe Puppen Hoden (24 h APF) sind noch nicht mit Muskelzellen umgeben. Auch etwas ältere Hoden (36-45 h APF) scheinen einige Peristaltik zeigen (vergleiche Abbildung 3 und Supplemental Video 1). Daher könnte Anbau von jungen Puppen Hoden als intakte Organe als Alternative dienen.
Darüber hinaus einmal gemeistert, die Fähigkeit, Puppen Hoden sezieren und schließlich isoliert Keimbahn-Zysten weitere Anwendungen mit einzelnen Zysten als Quelle von einer homogenen, wenn auch klein, Zellpopulation zu ermöglichen. Zum Beispiel ist es somit möglich, RT-qPCR durchführen, um die transkriptionelle Regulation spezifischer Gene in definierten Stufen der Spermatogenese zu analysieren, wie bereits gezeigt,
Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anacardic acid | Merck Millipore | 172050 | brand: Calbiochem (EMD Millipore) |
| Anti-acetyl-Histone H4 | Merck Millipore | 06-598 | brand: Upstate |
| AxioCam MRm | Zeiss | ||
| AxioObserver.Z1 inverted microscope | Zeiss | ||
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D8418 | |
| Dumont 5-Inox forceps | Dumont | multiple suppliers | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Sigma | F4135 | |
| Fiber optical illuminator | multiple suppliers | ||
| Glass Bottom Microwell Dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)-Cy5 | Dianova | 711-175-152 | |
| Hoechst | Sigma | B1155 | |
| Inoculation loop or pin holder | multiple suppliers | ||
| Austerlitz INSECT PINS stainless steel needles, size 0 | Plano GmbH | N5018 | In our hands both of these pin sizes worked well in the dissections. The minutiens are less rigid but have a smaller tip diameter. |
| Austerlitz INSECT PINS stainless steel minutiens, diam. 0.1 mm | Plano GmbH | N5014 | |
| Multiwell plates, 24-wells | Becton Dickinson | 351147 | brand: Falcon |
| Pen Strep | invitrogen | 15070 | brand: Gibco |
| Shields and Sang M3 Insect Medium | Sigma | S8398 | |
| Stemi SV6 binocular | Zeiss |
References
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