En ny metod för att lokalisera Reporter Fluorescent Pärlor Nära Cell Culture Yta för Traction Force Microscopy

Summary

Traditionella tekniker för att tillverka polyakrylamid (PA) geler som innehåller fluorescerande prober innebär sandwich en gel mellan en vidhäftande yta och en glasskiva. Här visar vi att belägga denna slid med poly-D-lysin (PDL) och fluorescerande prober lokaliserar probema till inom 1,6 nm från gelytan.

Abstract

PA geler har länge använts som en plattform för att studera celldragkrafter på grund av lätta att bearbeta och möjligheten att ställa sina elastiska egenskaper. När substratet är belagd med en extracellulär matrisprotein, celler vidhäfta till gelén och applicera krafter, vilket gör att gelén att deformeras. Deformationen beror på cell dragkraft och de elastiska egenskaperna hos gelén. Om deformationen fältet av ytan är känd, kan ytan dragkraft beräknas med elasticitetsteorin. Gel deformation mäts vanligen genom att bädda fluorescerande markör pärlor jämnt in i gelén. Sonderna förflyttar eftersom gelen deformeras. Probema nära ytan av gelén spåras. De förskjutningar som rapporterats av dessa sönder betraktas som ytan förskjutningar. Deras djup från ytan ignoreras. Detta antagande introducerar fel i dragkraft utvärderingar. För exakt mätning av cell krafter, är det kritiskt för platsen av pärlorna att vara känd. Vi har utvecklaten teknik som utnyttjar enkel kemi för att begränsa fluorescerande markörpärlor, 0,1 och 1 ^ m i diameter, i PA-geler, inom 1,6 um av ytan. Vi belägga en täckglas med poly-D-lysin (PDL) och fluorescerande pärlor. PA gellösning sedan inklämd mellan täckglas och en vidhäftande yta. De fluorescerande pärlor överföra till gellösningen under härdning. Efter polymerisation innehåller PA-gelen fluorescerande pärlor på ett plan nära gelytan.

Introduction

Den mekaniska växelverkan av en levande cell med sin omgivning har ofta studerats med hjälp av PA-geler. Dessa substrat förlita sig på en enkel, väl karakteriserad protokoll fastställts av Dembo och Wang 1997 ^1. En av de största fördelarna med dessa substrat är att deras styvhet kan ställas in genom att ändra koncentrationen av specifika komponenter i gellösningen. Detta ger en önskvärd plattform för att studera celler interaktion med miljöer av olika stelheter. När PA geler är belagda med extracellulära matrix (ECM) proteiner, celler följa dem, genererar kraft. Som ett resultat av cell kraft deformerar gelén som en elastisk kropp. Denna deformation beror på storleken av den kraft som appliceras av cellerna och de elastiska egenskaperna hos gelén. Olika studier har anställt PA geler för att undersöka cellulära dragkrafter.

I en variant av PA gel tillverkning, är fluorescerande mikrosfärer (pärlor) inbäddade throughout gelen att kvantifiera celldragkrafter på geler av olika stelheter ^2. Vid cellkraft ansökan pärlorna tränga undan från sin ursprungliga plats efter gel deformation. Deformationen fältet mäts från de enskilda pärla förskjutningar. Denna deformation fält utnyttjas med elasticitetsteorin och de elastiska egenskaperna hos gelén för att beräkna de dragkrafter. Dessa mätningar ger insikt om hur celler mekaniskt känna och interagera med sina lokala mikromiljö ^3.

I många allmänt använda PA gel tillverkningsprotokoll, är pärlorna blandade i hela PA-gelen i flytande, opolymeriserad tillstånd. En fullt polymeriserade PA gel innehåller fluorescerande pärlor i hela dess volym. Vid beräkning celldragkrafter, är pärlor de flesta nära gelytan (cell-substrat gränssnitt) övervakas. De förskjutningar av dessa pärlor antas ske på cellodlingsytan för enkelhet i kraft calculation. Den faktiska placeringen av pärlorna inom djupet av gelén inte beaktas. Men i ett elastiskt medium (t.ex. PA-gel), en pärla närmare en punkt där kraften appliceras kommer att flytta mer än en kula som är längre bort från punkten. Således behandlar förskjutningen av en punkt (vid pärlan plats) distalt från ytan som är i ytan leder till en underskattning av cellulära tractions. Graden av fel beror på avståndet av vulsten från ytan. Felet kan inte beräknas utan kunskap om placeringen av vulsten.

Behovet av en enkel metod för att begränsa pärlor mycket nära cellodlingsytan har tagits upp av några tekniker. Ett sätt är att öka densiteten hos pärlorna genom hela gelén sådan att det finns ett tillräckligt antal pärlor i den övre fokalplanet för att mäta rörelse mycket nära ytan. En annan teknik innebär att bygga en konfokal avbildning kammare för levande cell imaging så att ljuset frånbara pärlorna i det översta fokalplan samlas ^4. En annan metod innefattar att överlagra ett extremt tunt skikt av PA-gel innehållande pärlor på toppen av en redan polymeriserad gel utan pärlor ^5. En nackdel med var och en av dessa tekniker är att den exakta placeringen av pärlorna i gelén inte är känd. Detta introducerar fel i beräkningen av förskjutningsfältet av pärlorna, och sålunda beräkningen av cellkrafter. En annan teknik involverar konjugering av pärlor till den övre ytan av en redan polymeriserad PA-gel med användning av Sulfo-SANPAH ^6. Denna teknik säkerställer pärlorna faktiskt endast på toppen av PA-gel, men i vilken utsträckning de är inbäddade i djupet av gelén är okänd. Detta skulle kunna skapa en lokal topografi för cellerna, som kunde ändra cellens beteende, som tidigare arbete har föreslagit att cellerna kan känna av kraft flera mikrometer bort ^7. Nyligen, en teknik för mönstring PA geler med 1 um diameter fluorescent fibronektin dot markörer i en reglerats matris bildades ^8. I detta fall är djupet hos de fluorescerande markörer kända, och är i huvudsak noll, eftersom den fibronektin mönstret indirekt tryckt på gelytan. Men denna metod inte ger en sammanhängande miljö som cellerna kan fästa, som ECM-proteinet är begränsat till prickar diameter 1 pm. En metod för att helt integrera tracker pärlor inom PA-geler och begränsa dem till en känd plats mycket nära ytan har ännu inte fastställts.

Här utvecklar vi en teknik för att begränsa under im till um diameter fluorescerande pärlor till ett fokalplan mycket nära cellodlingsytan inom PA-gel. En gel är vanligen botas genom sandwiching opolymeriserad lösning flytande gel mellan två glasplattor. En av plattorna är funktionaliserad så att gelén vidhäftar kraftigt till det. Den andra är icke-funktionaliserad och tas bort efter gel botemedel. Vi ändra denna borttagbara glas surface genom beläggning med ett skikt av pärlor. Vid sandwich den flytande gel mellan funktion och pärlan belagda glasytan, den pärlor överföring till gelén medan den härdar. Detta begränsar avståndet pärlorna integration i gelen inom 1,6 um av ytan. Glas-botten petriskålar användes som den vidhäftande ytan på vilken gelén härdas. För att bilda en plan övre gelytan under polymerisationen, är ett cirkulärt täckglas användes för att sandwich gelén med glasbotten petriskål. Före gel tillverkning, är det övre täckglas belagda med poly-D-lysin (PDL), vilket gav en positiv ytladdning. PDL blåses bort med tryckluft, och en lösning av pärlorna i vatten avsätts på täckglas. Vi använder karboxylerade fluorescerande mikropärlor, som bär en negativ laddning, och interagera med den positivt laddade ytan skapas genom behandling med PDL. Efter blåsning vulsten lösning utanför täckglas med tryckluft, ett enda skikt avpärlor förblir elektro kopplad till torra täckglas. Den PDL beläggningen påverkar inte vidhäftningen av glaset till gelytan, eftersom glas är oskadade och tas bort från PA gelen helt intakt.

De glasbottnade petriskålar görs vidhäftande genom behandling med 97% 3-aminopropyl-trimethoxysliane och 0,5% glutaraldehyd. PA geler av önskade stelheter skapas genom att blanda lämpliga koncentrationer av bisakrylamid och akrylamid via ett standardförfarande ^9. En droppe av gellösningen pipetteras på glasbotten petriskål. Glastäckglas innehåller pärlorna används för att smörgås gelén med petriskål. När gelén härdas är det övre täckremsa avlägsnas och lämnar de pärlor inbäddade i PA-gel inom 1,6 | im från ytan.

Protocol

Tillverka och funktionalisering PA geler av olika styvheter med fluorescerande mikrosfärer inbäddade nära cellodlingsytan. 1 funktionalisering av Top täckglas Rena glastäckglas (# 1,0, 12 mm diam.) Med tvål och vatten, följt av etanol för att avlägsna ovidkommande damm. Placera täckglas på en riven yta (dvs pipettspets hållare), så att de inte vidrör för att underlätta enkel interaktion med täckglas. Bestryk hela ytan av täckglas med …

Representative Results

Konfokal avbildning användes för att bestämma att pärlorna faktiskt var nedanför gelytan och kvantifiera deras exakta läge inom gelén djup. Fluorescerande pärlor av en annan våglängd än inne i gelén fick sätta sig på ytan, och avståndet mellan de inbäddade fluorescerande nanopartiklar och de som på ytan beräknades med hjälp av en centroid identifieringsalgoritm. Placeringen av pärlan på gelytan tjänar som referens för den övre ytan av gel-där celler gäller kraft vid vidhäftning till ytan. En s…

Discussion

Vid användning av denna teknik, är det viktigt att pärlan lösningen är korrekt utspädd och pärlorna väljs utifrån önskad diameter, PA gel substrat stelhet och storlekstabellen av de fenomen som utforskas i önskad experimentet.

Försiktighet bör iakttas vid späda pärla lösningen före funktion bästa täckglas. Mellanrummet mellan pärlorna på gelén yta kan förändras genom förändring av utspädningsfaktorn för den kolloidala lösningen. Utspädning av lösningen för myc…

Materials

Name	Company	Catalog Number
Reagents
97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES)	Sigma-Aldrich	281778
70% Glutaraldehyde	Polysciences, Inc.	111-30-8
1M HEPES buffer solution	Sigma-Aldrich	83264
40% Acrylamide	Sigma-Aldrich	A4058
2% Bisacrylamide	Sigma-Aldrich	M1533
0.1 um Fluorescent microspheres (mCherry)	Invitrogen	F8801
Fibronectin, Human, 1mg	BD Biosciences	354008
Ammonium Persulfate	Bio-RAD	161-0700
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Bio-RAD	161-0801
Poly-D-Lysine	Millipore	A-003-E
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)	Thermo Scientific	22980
N-hydroxysulfosuccinimide (NHS)	Thermo Scientific	24500
.05% Trypsin-EDTA (1X)	Life Technologies	25300-054
NaCL	Sigma-Aldrich	S9888
Acrylic Acid	Sigma-Aldrich	147230
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7757
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M3671
Materials
35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass	In Vitro Scientific	D35-14-1-N
Glass cover slips, 12 mm diam.	Ted Pella, Inc.	26023