Summary
Traditionelle Techniken zur Herstellung Polyacrylamid (PA)-Gelen, die fluoreszierenden Sonden beinhalten, zwischen denen ein Gel zwischen einem haftenden Oberfläche und einem Glasträger. Hier zeigen wir, dass die Beschichtung diese Folie mit Poly-D-Lysin (PDL) und fluoreszierende Sonden lokalisiert die Sonden innerhalb von 1,6 um von der Geloberfläche.
Abstract
PA Gele sind seit langem als Plattform, um die Zell Zugkräfte aufgrund der Herstellung und der Möglichkeit, sowohl ihre elastischen Eigenschaften zu erleichtern Studie verwendet worden. Wenn das Substrat mit einem extrazellulären Matrixprotein beschichtet ist, Zellen haften an dem Gel und gelten Kräfte, wodurch das Gel zu verformen. Die Verformung ist abhängig von der Zell Traktion und die elastischen Eigenschaften des Gels. Wenn der Verformungsbereich der Oberfläche bekannt ist, kann unter Verwendung von Oberflächentraktionselastizitätstheorie berechnet werden. Gel Verformung wird üblicherweise durch die Einbettung von fluoreszierenden Marker Perlen gleichmäßig in das Gel gemessen. Die Sonden zu verdrängen, wie das Gel verformt. Die Sonden in der Nähe der Oberfläche des Gels nachgeführt. Die von diesen Sonden berichtet Verschiebungen werden als Oberflächenverschiebungen berücksichtigt. Deren Tiefe von der Oberfläche, werden ignoriert. Diese Annahme stellt Fehler in Zugkraft Auswertungen. Für die präzise Messung von Zellkräften, ist es entscheidend für die Lage der Kugeln bekannt sein. Wir haben uns entwickelteine Technik, einfache Chemie verwendet, um fluoreszierende Markierungsperlen, 0,1 und 1 um Durchmesser zu beschränken, in PA-Gelen, innerhalb 1,6 um von der Oberfläche. Wir Mantel eine Deck mit Poly-D-Lysin (PDL) und fluoreszierenden Beads. PA-Gel-Lösung wird dann zwischen dem Deckglas und einem haftenden Oberfläche angeordnet ist. Die fluoreszierende Kügelchen Transfer zum Gel-Lösung während der Aushärtung. Nach der Polymerisation enthält das PA-Gel fluoreszierende Kügelchen in ein Flugzeug in der Nähe der Gel-Oberfläche.
Introduction
Die mechanische Interaktion einer lebenden Zelle mit seinem lokalen Umfeld hat gemeinhin mit PA-Gele untersucht. Diese Substrate basieren auf einem einfachen, gut charakterisierten Protokoll von Dembo Wang 1997 1. Einer der Hauptvorteile dieser Substrate aufgebaut ist, dass ihre Steifigkeit kann durch Änderung der Konzentration bestimmter Bestandteile des Gel-Lösung eingestellt werden. Dies bietet eine Plattform, um Zellen wünschenswert 'Interaktion mit Umgebungen von unterschiedlichen Steifigkeiten zu studieren. Bei PA-Gele werden mit der extrazellulären Matrix (ECM) Proteinen beschichtet, Zellen haften an ihnen, Krafterzeugung. Als Ergebnis der Zellkraft, verformt sich das Gel als ein elastischer Körper. Diese Verformung ist abhängig von der Größe des durch die Zellen und die elastischen Eigenschaften des Gels aufgebrachte Kraft. Verschiedene Studien haben PA-Gele eingesetzt, um zelluläre Traktionskräfte zu untersuchen.
In einer Variation des PA-Gel Herstellung werden fluoreszierende Mikrosphären (Beads) eingebettet tberall das Gel auf Zell Zugkräfte auf Gelen unterschiedlicher Steifigkeiten 2 zu quantifizieren. Nach Zellkraftanwendung, verdrängen die Perlen von ihrer ursprünglichen Lage nach Gel Deformation. Das Feld Verformung der einzelnen Wulst Verschiebungen gemessen. Diese Verformung Feld wird mit Elastizitätstheorie und die elastischen Eigenschaften des Gels, um die Zugkräfte berechnen genutzt. Diese Messungen geben Aufschluss darüber, wie Zellen mechanisch zu erfassen und die Interaktion mit den lokalen Mikroumgebung 3.
In vielen weit verbreiteten PA-Gel Herstellungsprotokolle werden die Perlen in der gesamten PA-Gel im flüssigen, nicht polymerisierten Zustand vermischt. Ein vollständig polymerisiert PA-Gel enthält fluoreszierende Kügelchen in seinem Volumen. Bei der Berechnung von Zelltraktionskräfte, sind Perlen die meisten in der Nähe der Gel-Oberfläche (Zell-Substrat-Schnittstelle) überwacht. Die Verschiebungen dieser Kügelchen werden als auf der Zellkulturoberfläche zur Vereinfachung der Kraft auftreten BERECHNUNGn. Die tatsächliche Position der Wülste innerhalb der Tiefe des Gels wird nicht berücksichtigt. Jedoch in einem elastischen Medium (wie PA-Gel), eine Wulst näher zu einem Kraftangriffspunkt bewegt sich mehr als ein Wulst, die weiter von dem Punkt entfernt ist. Somit Behandeln der Verschiebung eines Punktes (am Wulst Position) entfernt von der Oberfläche, wie die an der Oberfläche führt zu einer Unterschätzung der zellulären Zugkräfte. Der Fehlergrad ist abhängig vom Abstand der Schweißraupe an der Oberfläche. Der Fehler kann nicht ohne die Kenntnis der Lage der Wulst geschätzt werden.
Der Bedarf für ein einfaches Verfahren, um die Kügelchen in der Nähe des Zellkulturoberfläche beschränkt ist durch einige Techniken angegangen. Eine Möglichkeit ist es, die Dichte der Kügelchen während des gesamten Gels zu erhöhen, so dass es eine ausreichende Zahl der Raupen in der oberen Brennebene, um die Bewegung sehr nahe an der Oberfläche zu messen. Ein weiteres Verfahren beinhaltet den Aufbau eines konfokalen Abbildungskammer zur lebenden Zellen, so daß das Licht vonnur die Perlen in der obersten Bildebene gesammelt 4. Eine andere Methode besteht darin überlagern eine extrem dünne Schicht der PA-Gel mit Perlen auf eine bereits polymerisierte Gel ohne Perlen 5. Ein Nachteil jedes dieser Techniken ist, dass die genaue Lage der Kügelchen in dem Gel nicht bekannt ist. Dies bringt Fehler in die Berechnung der Verschiebungsfeld der Perlen und damit die Berechnung der Zellkräfte. Ein weiteres Verfahren beinhaltet die Konjugation von Kügelchen auf die Oberfläche eines bereits polymerisiert PA-Gel mit Sulfo-SANPAH 6. Diese Technik gewährleistet die Kügelchen sind in der Tat nur auf der Oberseite des PA-Gel, aber das Ausmaß, in dem sie in der Tiefe des Gels eingebettet sind, ist unbekannt. Dies könnte möglicherweise eine lokale Topographie für die Zellen, die das Zellverhalten verändern könnte, als vor der Arbeit hat vorgeschlagen, dass Zellen können mehrere Mikrometer Kraft weg 7 zu spüren. Kürzlich wurde eine Technik zum Mustern PA-Gelen mit 1 um Durchmesser fluorescent Fibronektin Punktmarkierungen in einem Array regularisiert wurde 8 etabliert. In diesem Fall wird die Tiefe der Fluoreszenzmarker bekannt, und ist im wesentlichen Null, da die Fibronektin Muster indirekt auf die Gel-Oberfläche gedruckt. Allerdings ist dieses Verfahren nicht eine kontinuierliche Umgebung, in der Zellen zu befestigen, wie das ECM-Protein ist mit 1 um Durchmesser Dots begrenzt. Ein Verfahren zum Tracker Perlen vollständige Integration in PA-Gelen und beschränken sie auf einem bekannten Ort ganz in der Nähe der Oberfläche muss noch erarbeitet werden.
Hier entwickeln wir eine Technik, um ein um bis um Durchmesser fluoreszierende Kügelchen zu einer Brennebene in der Nähe des Zellkulturfläche innerhalb PA-Gel zu beschränken. Ein Gel wird typischerweise durch Anordnen unpolymerisierten flüssigen Gel-Lösung zwischen zwei Glasplatten gehärtet. Eine der Platten wird funktionalisiert, so dass das Gel haftet stark zu. Die andere ist nicht funktionalisierten und nach der Gel härtet entfernt. Wir ändern dieses abnehmbare Glas sun-Schnittstelle durch Beschichten mit einer Schicht von Perlen. Auf, zwischen denen die flüssige Gel zwischen der funktionalisierten und dem Wulst beschichtete Glasoberfläche, die Perlen Transfer auf das Gel, während es der Aushärtung. Dies begrenzt die Entfernung der Perlen "Integration in das Gel in 1,6 um der Oberfläche. Glasbodenpetrischalen werden als Haftgrund, auf dem das Gel ausgehärtet wird verwendet. Um einen flachen oberen Gel-Oberfläche während der Polymerisation zu bilden, ist eine kreisförmige Deckglas zu Sandwich verwendet das Gel mit dem Glasbodenpetrischale. Gel vor der Herstellung wird die obere Deckglas mit Poly-D-Lysin (PDL) beschichtet, wodurch eine positive Oberflächenladung. Die PDL wird mit Druckluft ausgeblasen, und eine Lösung von Perlen in Wasser auf die Deckgläser aufgebracht. Wir nutzen carboxylierten fluoreszierenden Mikrokügelchen, die eine negative Ladung tragen, und interagieren mit der positiv geladenen Oberfläche erstellt durch Behandlung mit PDL. Nach dem Ausblasen des Wulstes Lösung aus dem Deckglas mit Druckluft, eine einzelne Schicht ausPerlen bleibt elektrostatisch auf die Trockendeckglas verbunden. Der PDL-Beschichtung beeinträchtigt nicht die Haftung des Glases an der Geloberfläche, da die Glas-Objektträger nicht beschädigt und der PA-Gel vollständig intakt entfernt.
Die Glasbodenpetrischalen werden adhärenten durch Behandlung mit 97% 3-aminopropyl-trimethoxysliane und 0,5% Glutaraldehyd gemacht. PA-Gelen gewünschten Steifigkeiten werden durch Mischen von geeigneten Konzentrationen von Bisacrylamid und Acrylamid über ein Standard-Verfahren 9 erstellt. Ein Tropfen des Gels Lösung wird auf die Glasbodenpetrischale pipettiert. Das Deckglas, das die Kügelchen nach Sandwich verwendet das Gel mit der Petrischale. Wenn das Gel ausgehärtet ist, wird die obere Deckglas so dass die Kügelchen in der PA-Gel innerhalb 1,6 um von der Oberfläche entfernt eingebettet.
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Protocol
Herstellung und Funktionalisierung von PA-Gelen unterschiedlicher Steifigkeiten mit fluoreszierenden Mikrosphären in der Nähe der Zellkulturoberfläche eingebettet.
1. Funktionalisierung der Top Glasplättchen
- Saubere Glasdeckgläschen (# 1.0, 12 mm Durchm.) Mit Wasser und Seife, gefolgt von Ethanol zu Fremd Staub zu entfernen.
- Ort Glasplättchen auf einer geriebenen Oberfläche (dh Pipettenspitzenhalter), so dass sie sich nicht berühren, um eine einfache Interaktion mit den Deck erleichtern.
- Beschichten der gesamten Oberfläche der Deckgläser mit Poly-D-Lysin (0,1 mg / ml) für 1 h (1A).
- Während dieser Zeit führen eine 1: 10.000-Verdünnung der kolloidalen Lösung von 0,1 um Durchmesser, rot fluoreszierenden Mikrokügelchen mit deionisiertem (DI) Wasser, um eine Partikeldichte von ungefähr 1 Mikrokügelchen pro 20 um 2 auf der Gel-Oberfläche zu erhalten. Abbildung 2 zeigt die Ergebnisse von verschiedenen Verdünnungen. Diese dilution modifiziert werden, um die Notwendigkeit spezieller Experimente gerecht werden.
- Legen Sie die verdünnte Lösung in einem Ultraschall-Wasserbad für 30 min.
- Nach 1 Stunde, mit einer Pinzette vorsichtig anheben jedes Deckglas und mit Luft trocknen. Bringen Sie die trockenen Deckgläser an den Gitteroberfläche.
- Entfernen Sie die verdünnte Kolloidlösung aus dem Ultraschallbad und Pipette 150 ul auf jedes Deckglas. Lassen Sie für 10 Minuten (Abbildung 1B).
- Mit einer Pinzette vorsichtig anheben jedes Deckglas und mit Luft trocknen. Rückkehr des trockenen Deckgläser an den geriebenen Oberfläche und dunkel lagern, bis sie verwendet.
2. Vorbereitung PA Gel direkt auf dem Glasbodenpetrischalen
- Vorheiz Heizplatte auf 100 ° C.
- Legen Sie die gewünschte Anzahl der Glasboden-Petrischalen (35 mm-Schale mit 14 mm Mikro gut, # 1.0) auf einer ebenen Fläche in einem Laborabzug.
- Decken Sie die Glas Teil jeder Petrischale Mikro gut mit 97% 3-aminopropyl-trimethoxysliane (3-APTES) für 7 min für die chemische Aktivierung. Vorsicht geboten, um ein unbeabsichtigtes Heraustropfen von 3-APTES auf die Oberfläche des Kunststoffs in der Petrischale zu vermeiden, um den Abbau des Polystyrols zu verhindern.
- Nach 7 min, füllen Sie die Petrischale mit DI-Wasser und in den Abfallbehälter zu entsorgen.
- Wiederholen Sie Schritt 2.4 3x für jedes Gericht, und dann schütteln Sie die Petrischale, um zusätzliche Wasser zu entfernen. Legen Sie die Petrischalen auf der heißen Platte, bis das Glasteil trocken ist.
- Entfernen Sie die Petrischalen von der heißen Platte und zu einer ebenen Fläche in einem Laborabzug.
- In einer chemischen Abzugshaube, machen eine Lösung von 0,5% Glutaraldehyd und decken das Glasteil jeder Petrischale gut mit der Lösung für 30 min. Vorsicht geboten, um ein unbeabsichtigtes Heraustropfen von Glutaraldehyd auf die Oberfläche des Kunststoffs in der Petrischale zu vermeiden, um den Abbau des Kunststoffs zu vermeiden.
- Nach 30 min, füllen Sie die Petrischale mit DI-Wasser und entsorgen in den Abfallbehälter zu spülen und entfernen Sie die glutaraldehyde.
- Wiederholen Sie Schritt 2.4 3x für jedes Gericht, und dann schütteln Sie die Petrischale, um zusätzliche Wasser zu entfernen. Legen Sie die Petrischalen auf der heißen Platte, bis das Glasteil trocken ist.
- Vor dem Vermischen der Komponenten des PA-Gel-Lösung, bewegen Sie die funktionalisierte Glasträger in die chemischen Abzugshaube, so dass sie leicht zugänglich sind, so dass für die schnelle sandwich des Gels mit dem Glasbodenpetrischalen nach dem Mischen der Gel-Lösung.
- In ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen, mischen 40% Bisacrylamid, 2% Acrylamid und Acrylsäure unmittelbar nacheinander in den in Tabelle 1 aufgeführten Konzentrationen (von 10 veröffentlichten Protokoll angepasst), um die gewünschte Matrix Elastizität zu erzielen.
- Mit 100 mM HEPES, 10% Ammoniumpersulfat und TEMED in den in Tabelle 1 aufgeführten Mengen, die gewünschte Elastizität, um den Matrix-Gel-Lösung zu vervollständigen.
- Unmittelbar pipettiert 15 ul Gel-Lösung auf die Mitte des Glasteilsder Petrischalen.
- Sofort abholen eine funktionalisierten Deckglas mit einer Pinzette.
- Flip das Deckglas über, so dass die fluoreszierende Kügelchen sind auf der Seite Kontakt mit Gel-Lösung.
- Lag das Deckglas vorsichtig auf die Oberseite des jetzt Flüssigkeit PA-Gel, so dass die funktionalisierte Seite ist in Kontakt mit dem Gel (Abbildung 1C). Hinweis: Die besten Ergebnisse wird eine zweite Person für die Rolle der Zugabe des Deckglases, um die Möglichkeit der teilweisen Polymerisation zu vermeiden, während Pipettieren Flüssigkeit PA-Gel-Lösung auf mehrere Petrischalen empfohlen.
- Flip alle Petrischalen über mit der Vermeidung von Schwerkraft Auswirkungen auf fluoreszierende Nanopartikel Polymerisation in unteren Ebenen der PA-Gel unterstützen.
- Warten Sie mindestens 35 Minuten, oder bis der Stammlösung von PA-Gel hat sichtlich in seiner Zentrifugenröhrchen polymerisiert.
- Drehen Sie die Petrischalen wieder um und füllen sie mit PBS, um mit dem Entfernen der Deckglas zu unterstützen.
- Kontakt mit dem Glasteil der Petrischale und der Außenlinie des Deckglas sorgfältig zu machen, mit einer Pinzette, um den Umfang des Deckglases zu kratzen. Führen mehrere Zyklen, bis das Deckglas verdrängt wird. Entfernen Sie das Deckglas und entsorgen in einem richtigen Abfallbehälter für spitze Gegenstände.
- Nach Entfernen aller Deckgläser, werden fluoreszierende Kügelchen auf das Gel (Abbildung 1D) übertragen haben. Decken Sie die PA-Gelen vollständig mit PBS, legen Sie die Petrischale Deckel auf jedes Gericht, und bei 4 ° C.
3. Funktionalisierung PA-Gel mit Fibronektin
- Bereiten Sie die folgenden vorgemischte Lösungen wie in einem festgelegten Protokoll 11 beschrieben: Weichen-Lösung (137 mM NaCl, 5% (v / v) Glycerin) und 2x Konjugation Puffer (0,2 M 2 (N -morpholino) ethansulfonsäure (MES), 10 % (v / v) Glycerol, pH 4.5).
- Verwenden Sie eine Vakuumpumpe in einem biologischen Haube, alle PBS aus den Glasboden-Gerichte, die die PA-Gelen zu entfernen.
- Pipettete einweichen Lösung auf jedes Gel, so dass das Gel vollständig untergetaucht. Inkubieren bei Raumtemperatur für mindestens 1 Stunde.
- Warm 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimid-Hydrochlorid (EDC) und N -hydroxysulfosuccinimide (NHS) auf Raumtemperatur.
- Mischen 10x Lösungen von EDC (150 mm, 19 mg / ml in DI-Wasser) und NHS (250 mm, 29 mg / ml in DI-Wasser).
- 1 Teil 10x EDC, 1 Teil 10x NHS, 3 Teile DI-Wasser und 5 Teile 2x Konjugationspuffer.
- Verwenden Sie eine Vakuumpumpe in einem biologischen Haube, um die Eintauchlösung zu entfernen. Sicherstellen, dass alle Flüssigkeit aus dem Gel Oberfläche entfernt.
- Fügen Sie genug NHS / EDC-Lösung, um das Gel Oberfläche bedecken und füllen Sie den Glasboden und der Petrischale (150-250 ul). Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 Minuten im Dunkeln.
- Tau-Fibronektin bei Raumtemperatur. Einmal aufgetaut, mischen sterile DI-Wasser, ein 50 ug / ml Fibronektin-Lösung zu erstellen.
- Verwenden Sie eine Vakuumpumpe in einem biologischen Kapuze, die NHS / EDC Lösungen entfernention. Sicherstellen, dass alle Flüssigkeit aus dem Gel Oberfläche entfernt.
- Jeweils 150 ul Fibronectin-Lösung zu jeder Gel. Inkubieren bei Raumtemperatur für 35 min, um für die Befestigung von Fibronektin ermöglichen.
- Nach 35 min, fügen PBS zu jeder Petrischale und bei 4 ° C bis zu 2 Wochen.
4. Traction Force-Experimente
- Wärmezelle Medien, PBS und Trypsin zu 37 ° C in einem Wasserbad.
- Spülen Gele 5x mit sterilem PBS, Absaugen des PBS zwischen Spülungen, und lassen Sie in der Haube bedeckt.
- 1 ml Trypsin pro 25 cm 2-Kolben mit Zellen. Nachdem die Zellen aus Kolben angehoben, verdünnt das Trypsin mit Zellmedium und zählen Sie die Zellen. Basierend auf Gel-Oberfläche, bestimmt die Anzahl der Zellen pro Gel für eine endgültige Zellaussaatdichte von 3.000 Zellen / cm 2 erforderlich. Verdünnen oder zu konzentrieren Suspension, so daß 150 ul der Zellmediengemisch enthält diese Anzahl von Zellen. Aliquoten 150 ul Zell suspensIons auf jedem Gel.
- Platzieren Sie die Petrischalen, die Zellen in einem Inkubator für 30 min. Dann vorsichtig die Petrischalen und füllen den Rest der Petrischale mit den Medien (ca. 2 ml), so dass die Oberfläche der Schale vollständig eingetaucht ist.
- Legen Sie die Petrischalen wieder in den Inkubator, bis der Bildaufnahme.
- Bereiten Sie das Mikroskop und Datenerfassungssystem für die Bildgebung: Legen Sie die 40x Wasserimmersionsobjektiv, legen Sie die Differentialinterferenzkontrast (DIC) Prisma, wählen Sie die mCherry oder gleichwertige fluoreszierend Filter, und schalten Sie die Klimakammer.
- Wenn für die Bildgebung vorbereitet, entfernen Sie eine Petrischale aus dem Inkubator und legen Sie sie sanft auf den Mikroskoptisch. Entfernen Sie die Petrischale Deckel für DIC-Bildgebung.
- Suchen Sie eine einzelne Zelle und erfassen ein einzelnes Standbild von der Zelle an der DIC.
- Ohne den Mikroskoptisch, schalten Sie den Aufnahmemodus zur Fluoreszenz. Konzentrieren Sie sich auf die fluoreszierenden Mikrosphären und record ein Bild der Mikrokügelchen.
- Zellmedien vorsichtig aus der Petrischale mit einer Pipette und fügen Sie 0,05% Trypsin-EDTA.
- Bild die Mikrosphären unter der Zelle, nachdem die Zellen abgelöst.
- Verwendung Particle Image Velocimetry (PIV)-Analyse in ImageJ 12, um den Verschiebungsfeld aufgrund zellulärer Kräfte zu berechnen.
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Representative Results
Konfokale Bildgebung wurde verwendet, um festzustellen, dass die Perlen waren in der Tat unter der Gel-Oberfläche und ihre genaue Position innerhalb des Gels Tiefe zu quantifizieren. Fluoreszierende Kügelchen mit einer anderen Wellenlänge als die im Inneren des Gels ließ man auf der Oberfläche absetzen, und der Abstand zwischen den eingebetteten fluoreszierenden Nanopartikeln und die auf der Oberfläche wurde unter Verwendung eines Schwerpunkts Identifikationsalgorithmus. Die Lage des Wulstes auf der Gel-Oberfläche dient als Referenz für die obere Oberfläche des Gels, wo-Zellen anwenden Kraft auf die Einhaltung der Oberfläche. Eine schematische Darstellung der beiden Szenarien betrachtet (grüne Kügelchen in dem Gel mit roten Perlen auf der Oberfläche, und umgekehrt) ist in 3 gezeigt. Der Algorithmus interpoliert die Z-Höhe des dreidimensionalen Zentroidposition. Wir wiederholten diesen Vorgang für drei Steifigkeit Gelen (1, 10, und 40 kPa) und zwei (Durchmesser) fluoreszierende Kügelchen (0,1 um rote und 1 um gelb-grün). Der Abstandzwischen einem Wulst innerhalb des Gels und seine nächsten Nachbarn einer anderen Wellenlänge wurde bestimmt basierend auf dem dreidimensionalen Schwerpunkt. 4 zeigt die räumliche Verteilung der Kügelchen (an der oberen Fläche und eingebettet) und der Projektionsansicht auf der YZ-Ebene. Die letztere liefert die Tiefen aller Kügelchen von der Oberfläche des Gels.
Die durchschnittliche Tiefe von 0,1 um Kügelchen 619 nm, 467 nm, 278 nm für die PA-Gelen Steifigkeits 1, 10 und 40 kPa, bzw. (5A). Die entsprechenden Tiefe 1 um Durchmesser Kügelchen -20 nm in 40 kPa Gelen, 12 nm in 10 kPa Gele und 1.255 nm in 1 kPa Gele (5B). Konfokale Bildgebung wurde auch Gele mit Perlen in der gesamten Gel verteilt durchgeführt, wie das traditionell für PA-Gele für die Traktionskraft-Mikroskopie Studien bestimmt ist. Die Tiefe der Kügelchen im ganzen Gel dispergiert PA wurde mit dem gleichen Algorithmus bewertet zuvor beschrieben, und ist mit dem D gegenepths unter Verwendung der Technik, die wir hier präsentieren. 6 zeigt die Variabilität der Wulst Dispersion innerhalb der Tiefe eines PA-Gel unter Verwendung von herkömmlichen Herstellungsverfahren.
Fibroblasten heften sich an die Oberfläche, wenn PA-Gel mit Fibronektin funktionalisiert. Das Verschiebungsfeld für einen Fibroblasten-Zelle und der entsprechenden fluoreszierenden Kügelchen Schicht sind in Abbildung 7 dargestellt. Perlen in der Nähe der Peripherie des Bildes erscheinen leicht unscharf. Dies ist nicht ein mechanischer Defekt auf dem Teil des Gels, wenn das Glas nach der Entfernung aus dem Gel vollständig intakt bleibt. Es ist vielmehr das Ergebnis einer optischen Effekt aufgrund des Wasserimmersionsobjektiv in diesem Experiment verwendet. Nach der Zugabe von Trypsin zum Medium, wird die Zelle von der Oberfläche freigesetzt, was die Rückkehr der verformten PA Geloberfläche in seinen ursprünglichen Zustand. Ein Kreuzkorrelationsalgorithmus wurde verwendet, um die Deformationsfeld basierend auf Verschiebungen Wulst 10 zu berechnen. DieVerschiebung der Karte veranschaulicht eine dominante Polarisierung der Zelle Zugkräfte in der y-Richtung.
Abbildung 1. Illustration der Funktionalisierung Verfahren zur oberen Glasdeckgläser mit PDL und fluoreszierende Kügelchen. (A) Glasdeckgläschen (blau) werden mit 0,1 mg / ml PDL (orange) für 1 h inkubiert. Druckluft wird verwendet, um zu blasen die Deckgläser trocken und entfernen Sie die PDL. (B) Glasdeckgläser werden mit einer Lösung von 100 nm Durchmesser fluoreszierende Kügelchen für 5-10 min mit Druckluft inkubiert und dann entfernt. Eine Schicht von Perlen bleibt elektrostatisch auf das Deckglas Nach dem Entfernen der oberen Abdeckung Schlupf folgenden PA-Gel polymerizat gekoppelt. (C) Deckgläser mit Perlen funktionalisiert sind, um Sandwich-PA-Gel mit einem aktivierten Glasoberfläche verwendet. (D)Ionen, die Perlen innerhalb und in unmittelbarer Nähe der Oberfläche des Gels. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. PA Gel-Oberfläche, die 0,1 Mikrometer Durchmesser fluoreszierende Kügelchen. Vor der PDL behandelten oberen Deckglas mit Perlen Beschichtung wurde die Wulst-Lösung (A) 10.000-fach (3,64 x 10 8 Perlen / ml) und (B) verdünnt 20.000-fach (1,82 x 10 8 Perlen / ml). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
![Figur 3]("/files/ftp_upload/51873/51873fig3highres.jpg")
Abbildung 3. Zell-Substrat-Grenzfläche mit Kügelchen in der Nähe der Oberfläche des Gels lokalisiert. Eine schematische Darstellung zwei Szenarien, in denen Wulst Ort innerhalb eines PA Gel wurde mittels konfokaler Mikroskopie und einen Schwerpunktsbestimmungsalgorithmus quantifiziert. Das erste Szenario ist in (A) gezeigt Rot 100 nm Durchmesser Perlen im Inneren des Gels und grün 1 Mikrometer Durchmesser Perlen auf der Oberfläche und in der zweiten (B) Green 1 um-Kugeln mit einem Durchmesser innerhalb des Gels und rot 100 nm Durchmesser Perlen auf die Oberfläche. (C) Eine Karikatur Darstellung einer Zelle (gelb) zu einem Gel (blau) mit roten Perlen im Inneren des Gels in der Nähe der Oberfläche und eine grüne Raupe sitzt auf seiner Oberfläche lokalisiert geklebt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen diese Zahl.
Abbildung 4. Die konfokale Scheibe (XY, Mitte) und Begleit YZ (links) Projektionsansichten eines Gels mit roten Perlen 0,1 um im Gel eingebettet und 1 um Perlen auf der Oberfläche. Die Einheiten für alle Achsen sind in Nanometern. Gelegentliche Vorkommen von roten Perlen über oder in der gleichen Ebene wie grüne Perlen zu geringe Überlappung der Fluoreszenzemissionsspektren für rot (mCherry) und grün (GFP) zugeschrieben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Histogramme der Tiefe der Kügelchen in der Nähe der oberen Oberfläche des PA-Gel beschränkt. Steifigkeiten 1 kPa, 10 kPa, und 40kPa werden von blau, rot, und schwarz dargestellt sind. Eine Gauß-Kurve wurde zu jedem Datensatz und der x-Wert entsprechend seiner Amplitude wird als durchschnittliche Tiefe von Perlen interpretiert passen. Zwei Szenarien wurden untersucht:. (A) 0,1 um Perlen im Inneren des Gels mit 1 um Perlen auf der Oberfläche, und (B) 1 um Perlen im Inneren des Gels mit 0,1 um Perlen auf der Oberfläche Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version davon zu sehen Figur.
Abbildung 6. Histogramme der Tiefe der Perlen mit einem traditionellen Herstellungsverfahren (schwarz) im gesamten PA-Gel eingebettet willkürlich und Perlen in der Nähe der oberen Schicht der PA-Gel mit dieser Technik (rot) für PA-Gele der Steifigkeit A) 1 kPa lokalisiert, B) 10 kPa,und C) 40 kPa. Inset zeigt die Tiefe der Sicken in beiden Gel-Typen innerhalb der oberen höchstens 10 um des Gels. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 7. Verschiebungsfeld aufgrund des Zell Traktion. (A) Phasenkontrastbild eines Fibroblasten auf 10 kPa Gel. (B) Verschiebungsfeld durch Zug von der Fibroblasten erzeugt wird. (C) Fluoreszenzbild von 0,1 Mikrometer Durchmesser Perlen unter einer Zelle vor der Trypsinierung Farbbalken zeigt an, Perlen Verschiebung in Nanometern.. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 8. Abbildung der durchschnittliche Lage der Perlen im Inneren des Gels relativ zu einer anderen Größe / Wellenlänge Wulst sitzt auf der Gel-Oberfläche. Die Steifigkeit der PA-Gel nimmt von links nach rechts (40 kPa, 10 kPa, 1 kPa). (A) Red 0,1 Mikrometer Durchmesser Perlen im Inneren des Gels und grün 1 Mikrometer Durchmesser Perlen auf der Oberfläche. (B) Green 1 Mikrometer Durchmesser Perlen im Inneren des Gels und roten Kugeln mit einem Durchmesser von 0,1 um auf der Oberfläche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen .
Abbildung 9. Distribution der theoretischen Werte für τ / μ auf verschiedenen Tiefen Wulst basiert. Perlen 0,1 um Durchmesser wurden entweder gleichmäßig verteilt oder lokalisiert in der Nähe der Oberfläche (A) 1 kPa Gele, (B) 10 kPa Gelen, und (C) 40 kPa Gele . Die Gold-Pfeil zeigt den Wert von τ / μ für den Fall z = 0, in der Perlen sind auf der Gel-Oberfläche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| E (kPa) | 40% Acrylamid (ul) | BIS (Konzentration) | 2% BIS (ul) | 100 mM HEPES (ul) | 0,1 | 625 | 0.00009 | 22,5 | 4225 |
| 0,25 | 625 | 0,0001 | 25 | 4222,5 | |||||
| 0,5 | 625 | 0,00011 | 27,5 | 4220 | |||||
| 0,75 | > 625 | 0,0002 | 50 | 4197,5 | |||||
| 1 | 625 | 0,0003 | 75 | 4172,5 | |||||
| 1,5 | 625 | 0,0004 | 100 | 4147,5 | |||||
| 2 | 625 | 0,0005 | 125 | 115px; "> 4122,5||||||
| 2.5 | 625 | 0,0006 | 150 | 4097,5 | |||||
| 3 | 625 | 0,0008 | 200 | 4047,5 | |||||
| 3,5 | 625 | 0,0009 | 225 | 4022,5 | |||||
| 4 | 0,001 | 250 | 3997,5 | ||||||
| 4,5 | 625 | 0,0012 | 300 | 3947,5 | |||||
| 5 | 625 | 0,0014 | 350 | 3897,5 | |||||
| 5.5 | 625 | 0,0016 | 400 | ||||||
| 6 | 625 | 0,0018 | 450 | 3797,5 | |||||
| 6.5 | 625 | 0,002 | 500 | 3747,5 | |||||
| 7 | 625 | 0,0022 | 550 | 3697,5 | |||||
| 7,5 < / Td> | 625 | 0,0024 | 600 | 3647,5 | |||||
| 8 | 1000 | 0,001 | 250 | 3622,5 | |||||
| 10 | 1000 | 0,0013 | 325 | 3547,5 | |||||
| 15 | 1000 | 0,002 | 1px; "> 5003372,5 | ||||||
| 20 | 1000 | 0,0027 | 675 | 3197,5 | |||||
| 30 | 1000 | 0,0037 | 925 | 2947,5 | |||||
| 40 | 1000 | 0,0048 | 1200 | 2672,5 |
Tabelle1. PA-Gel chemischen Konzentrationen basierend auf Elastizitätsmodul. Für eine gewünschte PA Gelelastizitätsmodul sollten die aufgeführten Konzentrationen von Acrylamid, Bisacrylamid und HEPES-Puffer mit 5 ul Acrylsäure ergänzt werden 25 ul 10% Ammoniumpersulfat (APS) und 2,5 ul TEMED.
| z (um) | u x ((τ / μ) um) |
| 0 | 0.750 |
| 0.394 | |
| 1 | 0.237 |
| 1,5 | 0.164 |
| 2 | 0.124 |
| 2.5 | 0,100 |
| 3 | 0,083 |
| 3,5 | 0,071 |
| 4 | 0,062 |
| 4,5 | 0,056 |
| 0,050 |
Tabelle 2. Verschiebungen als Funktion τ / μ entsprechende Tiefe z, von Kügelchen aus der Gel-Oberfläche bezogen auf Boussinesq Theorie.
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Discussion
Bei Verwendung dieser Technik ist es wichtig, dass der Wulst Lösung wird auf geeignete Weise verdünnt, und die Perlen werden auf der Basis gewünschten Durchmesser gewählt, PA Gelsubstrat Steifigkeit und der Größenskala der Phänomene, die in der gewünschten Experiment untersucht wird.
Vorsicht ist bei der Verdünnung der Lösung vor der Wulst Funktionalisierung oberen Glasplättchen genommen werden. Der Abstand zwischen den Wülsten auf der Gel-Oberfläche kann durch Veränderung der Verdünnungsfaktor der Kolloidlösung verändert werden. Verdünnen der Lösung zu viel wird die Anzahl der Perlen, die Kopplung an die Deckglas zu reduzieren und letztlich die Zahl der Perlen im Gel. Verdünnen der Lösung zu gering kann eine zu hohe Dichte der Kügelchen in dem Gel, so dass sie in Kontakt sind, und können nicht voneinander unterschieden werden, ergeben. Zwar ist es oft unmöglich, das Vorhandensein von Nanoteilchen Aggregation vollständig zu vermeiden, die Anwendung von Ultraschallwellen zu der verdünnten Lösung effektiv minimiert nanoparticle Aggregation. Wir haben festgestellt, dass ein 10.000-fachen Verdünnung der in diesem Protokoll verwendeten Kolloidlösung gibt eine Perlenkonzentration von 3,64 x 10 8 Perlen / ml, und ergibt eine wünschenswerte Partikeldichte von 0,05 Perlen / um 2 für 0,1 Mikrometer Durchmesser Perlen. A 1: 20.000-Verdünnung (1,82 x 10 8 Kügelchen / ml) liefert einen Durchschnitt von 52 um 2 pro Teilchen Figur 2 zeigt Bilder von der Oberfläche des Gels mit verschiedenen Verdünnungen.. Es sei darauf hingewiesen, dass die Variabilität in der Anzahl von Kügelchen, die auf das Gel zu übertragen. Dies ist auf die Variabilität mit dem Entfernen der Wulst-Lösung aus dem Deckglas mit Druckluft während der Funktionalisierung verbunden fällig. Im Allgemeinen haben wir gefunden, dass die Erhöhung der Verdünnungsfaktor, der durch mindestens einen Faktor von zwei führt durchweg in mindestens einer zweifachen Zunahme der Fläche pro Perle.
Es ist auch wichtig, um eine Perlengröße (Durchmesser), die in vollständige Eintauchen von T führt zu wählener Wulst im Inneren des Gels auf PA-Polymerisation. Gel Steifigkeit beeinflusst die Position der Perlen, wie in 5A gezeigt. 0,1 Mikrometer Durchmesser Perlen, erhöht sich die Sickentiefe mit abnehmender Steifigkeit. Dies könnte ein Ergebnis der inversen Beziehung zwischen Porengrße und PA Gelsteifheit 13 sein. Für alle drei Steifigkeit Gelen getestet werden die Perlen konsistent innerhalb des Gels lokalisiert und innerhalb von 1 um von der Geloberfläche wie in 8A dargestellt. Die durchschnittliche Lage von 1 um Perlen innerhalb des Gels variiert auch mit Steifigkeit. Sie sind in den 1 kPa Gele eingebettet tiefer (etwa 1,25 um). Für die 10 und 40 kPa Gele, die Lage der Spitze 1 um Kugeln mit einem Durchmesser im Bereich von etwa 0,5 um bis 0,5 um über unter dem Gel (5) Oberfläche, was bedeutet, dass die Perlen gelegentlich durch die Oberseite des Gels herausragen (Abbildung 8B). Dies ist nachteilig, weil es topogra führtPHY für die Zellen, und die Topographie ist bekannt, Zell-Substrat-Wechselwirkungen 14 beeinflussen. Daher ist es notwendig, aufmerksam zu sein bei der Wahl Perlen für diese Technik bei der Herstellung von Gelen einer bestimmten Steifigkeit. Von den beiden genutzt, um diese Methode zu charakterisieren Perlengrößen, beweist 0,1 Mikrometer Durchmesser die optimale Größe. Andere Perlengrößen in dieser Technik verwendet werden, sondern mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie kalibriert werden, da wir hier beschreiben, um die genaue Tiefe, in die die Kügelchen während der Gelpolymerisation lokalisiert verstehen.
Diese Technik verbessert die räumliche Auflösung der Perlen in PA-Gel durch Erhöhung der Anzahl von unterscheidbaren Teilchen in dem Sichtfeld. Lokalisieren der Perlen auf eine Schicht in der Nähe der Oberseite des Gels nicht wesentlich auf die Steifigkeit des Verbund Gel. IsoStress Verbundtheorie verwendet wird, um das zusammengesetzte Elastizitätsmodul E c zu berechnen, nur die 1 um dicke Schicht aus Gel mit BEAds als
wobei E f das Elastizitätsmodul der Polystyrolkügelchen (3 GPa) ist, E der Elastizitätsmodul m der Gelmatrix (10 kPa), und V f und V m die Volumenanteile der Beads und Gel-Matrix auf. Da die Kügelchen enthalten nur 0,03% des Volumens, E c = 10,0025 kPa nicht wesentlich anders als der Elastizitätsmodul eines isotropen Gel Steifigkeit 10 kPa. Ein etabliertes Verfahren zur Herstellung von PA-Gelen reduziert die Polymerisationszeit auf 30 sec, wodurch die Wirkung der Schwerkraft auf die Verteilung der Perlen während der Polymerisation 15 minimiert. Die Methode beruht auf der länger (~ 30 min) Polymerisationszeit für die Kügelchen in dem Gel zu polymerisierenso daß sie nicht die Gel-Oberfläche vorstehen. Da die Lokalisierung der Perlen auf eine einzelne Schicht nicht wesentlich den Verbund Gel Steifigkeit und die längere Polymerisationszeit hilft bei der Übertragung von Perlen in der Gel-Matrix beeinflussen, wissen wir nicht jede Maßnahme, um die Polymerisation zu Zeit in unsere Technik zu reduzieren integrieren.
Unsere Technik veranschaulicht, um die Perlen zu einer bekannten Tiefe innerhalb PA-Gel, das die Messung der Substratverformung und damit die Berechnung der Zell Zugkräfte verbessert lokalisieren. Ein theoretischer Ansatz, um die zellulären Zugkräfte quantifizieren wurde bereits berichtet worden 16,17. Dieser Ansatz behandelt das Gel Substrat als Halb unendlich Feststoff in elastischen Halbraum. Boussinesq Lösung verwendet, um die inverse Problem der Berechnung Zugkräfte von einem Verschiebungsfeld zu lösen. Wir beschäftigen eine vereinfachte Version der Boussinesq Integral um den Fehler in Wegmessung quantifizieren aufgrund Perlen distalen aus dem Gel surface 18. Die Gleichung für die Verschiebung in einer gegebenen Richtung auf der Grundlage einer aufgebrachten Schubspannung τ, über einen gegebenen Radius R ist gegeben durch
wobei u x die Verschiebung in x-Richtung, ist μ der Schubmodul ist und z die Tiefe der Sicken von der Geloberfläche. Für verschiedene Stellen der Kügelchen über die gesamte Tiefe des Gels sind entsprechende Verschiebungen in Tabelle 2 gezeigt.
Für die hier dargestellten Fall ist der Radius schätzungsweise eine durchschnittliche focal adhesion Größe von 1 um liegen. Wenn die Kügelchen werden als die mit den Zellen (Z = 0) koplanar ist, wird die Verschiebung von 0,75 τ / μ angegeben. Wenn die Perlen nur 1 um unterhalb der Gel-Oberfläche, wird die Verschiebung um 0,24 τ / μ angegeben. Diesrepräsentiert die größer als eine dreifache Verringerung der Verschiebung von einem Wulst koplanar mit der Oberfläche zu einer Stelle unterhalb 1 um. Dies bringt Fehler in die Berechnung der Oberflächentraktionskräfte auf der Basis der Bewegung des eingebetteten Kügelchen, deren genaue Positionen innerhalb des Gels sind nicht bekannt. Die Variation in der Traktion durch τ / μ definiert als eine Funktion der Tiefe der Kügelchen in dem Gel für beide vorgeschlagenen und traditionelle Herstellungsverfahren wesentlich ist. 9 zeigt die Verteilung der Kräfte (durch das Verhältnis τ gegeben μ /) auf der Basis auf Boussinesq Theorie, von der Berechnung unter Verwendung der Verteilung der Wulst Tiefen z, in der optischen Tiefe des Feldes, wenn Kügelchen gleichförmig in dem Gel verteilt und nahe der Oberfläche lokalisiert führen. Die genaue Messung der Zellkraft würde, wenn die Perlen wurden in der gleichen Ebene wie die Zellen, in denen z = 0 und τ / μ = 0,0133. Im Vergleich zu diesem Fall τ / μ erhöht sich um 118%, 80% und 50% für 1 kPa, 10 kPa und 40 kPa Gelen bzw. als Kügelchen in der Nähe der Oberfläche unter Verwendung der Technik, die wir vorschlagen, lokalisiert. Wenn Kügelchen gleichmäßig über das Gel Tiefe verteilt, erhöht τ / μ eine zusätzliche 60%, 80% und 150% über die Erhöhung der Lokalisierung Kügelchen in der Nähe der Oberfläche induziert, 1 kPa, 10 kPa und 40 kPa Gele sind. Dies entspricht einem Gesamtvolumen von knapp 200% Fehler in Traktion Berechnungen, wenn die Perlen in der gesamten Tiefe Gel verteilt. So lokalisieren Sie die Perlen zu einer bekannten Tiefe innerhalb des Gel verbessert die Genauigkeit in Verschiebungsmessungen und Zell Zugkräfte.
Das hier beschriebene Verfahren stellt einen neuen Weg, um PA-Gel Substrate für Zugkraft Mikroskopie, dass die Kügelchen in der Nähe der Oberfläche lokalisiert Gel herzustellen. Beschränkt man die Perlen zu einer bekannten Tiefe in PA-Gel bietet neue Informationen über die tatsächliche Verschiebung von Perlen auf Zellkraftanwendung, die Schaffung UhrErz genaues Bild davon, wie die Zellen deformieren ihre darunterliegende Substrat.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Die Autoren möchten die interdisziplinäre Innovation Initiative Program der Universität von Illinois bestätigen, gewähren 12035. SK wurde UIUC von National Science Foundation (NSF) Zuschuss finanziert 0.965.918 IGERT: Ausbildung der nächsten Generation von Forschern in Zelluläre und Molekulare Mechanik und Bio-Nanotechnologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| 70% Glutaraldehyde | Polysciences, Inc. | 111-30-8 | |
| 1 M HEPES buffer solution | Sigma-Aldrich | 83264 | |
| 40% Acrylamide | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| 2% Bisacrylamide | Sigma-Aldrich | M1533 | |
| 0.1 µm Fluorescent microspheres (mCherry) | Invitrogen | F8801 | |
| Fibronectin, Human, 1 mg | BD Biosciences | 354008 | |
| Ammonium persulfate | Bio-RAD | 161-0700 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-RAD | 161-0801 | |
| Poly-D-lysine | Millipore | A-003-E | |
| 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) | Thermo Scientific | 22980 | |
| N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) | Thermo Scientific | 24500 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Life Technologies | 25300-054 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Acrylic acid | Sigma-Aldrich | 147230 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Materials | |||
| 35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass | In Vitro Scientific | D35-14-1-N | |
| Glass cover slips, 12 mm diam. | Ted Pella, Inc. | 26023 | |
References
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