Summary
As técnicas tradicionais para a fabricação de poliacrilamida (PA) géis contendo sondas fluorescentes envolvem imprensando um gel entre uma superfície aderente e uma lâmina de vidro. Aqui, mostramos que este revestimento de lâmina com poli-D-lisina (PDL) e sondas fluorescentes localiza as sondas para dentro de 1,6 pM a partir da superfície do gel.
Abstract
PA géis têm sido muito utilizadas como uma plataforma para estudar as forças de tracção da célula devido à facilidade de fabrico e a capacidade para sintonizar as suas propriedades elásticas. Quando o substrato é revestido com uma proteína da matriz extracelular, as células aderem ao gel e aplicar forças, fazendo com que o gel para se deformar. A deformação de tracção depende da célula e as propriedades elásticas do gel. Se o campo de deformação da superfície é conhecido, a superfície de tracção pode ser calculada usando a teoria de elasticidade. Gel de deformação é normalmente medida por incorporação de grânulos de marcadores fluorescentes para o gel de modo uniforme. As sondas deslocam como o gel se deforma. As sondas perto da superfície do gel são rastreados. Os deslocamentos relatados por estas sondas são considerados como deslocamentos de superfície. As profundidades da superfície são ignorados. Esta hipótese apresenta erro na avaliação da força de tração. Para a medição precisa das forças de células, é essencial para a localização dos grânulos a ser conhecido. Nós desenvolvemosuma técnica que utiliza a química simples para limitar grânulos marcadores fluorescentes, 0,1 e 1 m de diâmetro, em géis de PA, dentro de 1,6 uM da superfície. Nós revestir uma lamela com poli-D-lisina (PDL) e esferas fluorescentes. Solução gel PA é então espremido entre a lamela e uma superfície aderente. As contas fluorescentes transferir para a solução de gel durante a cura. Após a polimerização, o gel PA contém pérolas fluorescentes num plano perto da superfície do gel.
Introduction
A interação mecânica de uma célula viva com o seu ambiente local tem sido comumente estudada utilizando géis PA. Estes substratos de contar com um protocolo simples, bem caracterizado estabelecida por Dembo e Wang, em 1997, 1. Uma das principais vantagens destes substratos é que a sua rigidez pode ser ajustado por modificação das concentrações de componentes específicos da solução de gel. Isso fornece uma plataforma desejável estudar a interação das células com ambientes de diferentes rigidez. Quando géis PA são revestidos com proteínas (ECM) de matriz extracelular, as células aderir a elas, a geração de força. Como resultado da força da célula, o gel se deforma como um corpo elástico. Esta deformação depende da intensidade da força aplicada pelas células e as propriedades elásticas do gel. Vários estudos têm empregado géis PA para investigar forças de tração celulares.
Numa variação de fabricação de gel PA, microesferas fluorescentes (esferas) são incorporados turante o gel para quantificar as forças de tração na célula em géis de diferentes rigidezes 2. Após a aplicação da força de células, as contas de deslocar da sua posição inicial após a deformação de gel. O campo de deformação é medida a partir dos deslocamentos individuais grânulo. Este campo é utilizado com deformação teoria da elasticidade e as propriedades elásticas do gel para calcular as forças de tracção. Essas medidas fornecem uma visão de como as células perceber e interagir com seu microambiente local 3 mecanicamente.
Em muitos PA protocolos de fabricação de gel utilizado, as contas são misturados em todo o gel PA na sua, não polimerizada estado líquido. Um gel de PA totalmente polimerizado contém pérolas fluorescentes todo o seu volume. Ao calcular as forças de tração na célula, contas a maioria perto da superfície do gel (interface de célula-substrato) são monitorados. Os deslocamentos destes grânulos são assumidos como ocorrem na superfície da cultura de células para manter a simplicidade da força CÁLCULOn. A localização exacta dos grânulos dentro da profundidade do gel é ignorado. No entanto, em um meio elástico (tal como gel de PA), um grânulo mais perto de um ponto de aplicação de força irá mover-se mais do que uma camada que está mais longe do ponto. Assim, tratando o deslocamento de um ponto (no local do grânulo) distal a partir da superfície como os resultados que a superfície em uma subestimação de trações celulares. O grau de erro depende da distância do rebordo a partir da superfície. O erro não pode ser estimado sem o conhecimento da localização do rolete.
A necessidade de um método simples para limitar grânulos muito perto da superfície da cultura de células foi tratada por algumas técnicas. Uma maneira é a de aumentar a densidade dos grânulos durante todo o gel de modo a que haja um número suficiente de esferas no plano focal de cima para medir o movimento muito perto da superfície. Outra técnica envolve a construção de uma câmara de imagem confocal de imagem de células vivas, tais que a luz a partir deapenas as contas no plano superior mais focal é coletado 4. Um método diferente envolve a sobreposição de uma camada extremamente fina de gel PA contendo contas em cima de um gel já polimerizado sem contas 5. Uma desvantagem de cada uma destas técnicas é que o local exacto dos grânulos dentro do gel não seja conhecida. Isto introduz erro no cálculo do campo de deslocamento dos grânulos e, assim, o cálculo das forças de células. Outra técnica envolve a conjugação de grânulos para a superfície de topo de um gel de AP já polimerizado usando Sulfo-SANPAH 6. Esta técnica assegura que os grânulos são, de facto apenas no topo do gel de AP, mas o grau em que eles são incorporados na profundidade do gel é desconhecido. Isto pode, potencialmente, criar uma topografia local para as células, o que poderia alterar o comportamento celular, como o trabalho anterior sugeriu que as células podem sentir forças vários microns de distância 7. Recentemente, uma técnica de padronização géis PA com 1 mícron de diâmetro fluorescent marcadores fibronectina pontos em uma matriz regularizada foi estabelecido 8. Neste caso, a profundidade dos marcadores fluorescentes é conhecido, e é essencialmente zero, enquanto o padrão impresso é indirectamente fibronectina na superfície do gel. No entanto, este método não proporcionar um ambiente no qual as células contínua pode anexar, como a proteína de ECM está limitada a um um de diâmetro pontos. Um método para integrar plenamente contas rastreador dentro géis PA e confiná-los em um local conhecido muito perto da superfície ainda não foi estabelecida.
Aqui, nós desenvolvemos uma técnica para limitar sub mícrons de diâmetro de partículas fluorescentes uM para um plano focal muito perto da superfície de cultura de células dentro de gel de PA. Um gel é geralmente curado por ensanduichamento solução gel líquido não polimerizado entre duas chapas de vidro. Uma das placas é funcionalizado de modo a que o gel adira fortemente a ele. A outra é não funcionalizados e é removido após a cura do gel. Nós modificar este vidro removível surface revestindo-o com uma camada de grânulos. Após a ensanduichar o gel líquido entre a superfície de vidro funcionalizada e a pérola revestida, a transferência de contas para o gel, ao passo que se a cura. Isto limita a distância de integração dos grânulos no gel a cerca de 1,6 uM da superfície. Pratos de Petri de vidro de fundo são usados como a superfície aderente em que o gel é curado. Para formar uma superfície superior plana de gel durante a polimerização, uma lamela circular de vidro é usado para o gel de sanduíche com a placa de Petri com fundo de vidro. Antes da fabricação de gel, a parte superior da tampa deslizante de vidro é revestido com poli-D-lisina (PDL), obtendo-se uma carga de superfície positiva. O PDL é soprado com ar comprimido, e com uma solução de pérolas em água é depositada sobre as lamelas. Nós utilizamos microesferas fluorescentes carboxilados, que carregam uma carga negativa, e interagir com a superfície carregada positivamente criado por tratamento com PDL. Após a solução de sopro grânulo fora da lamela com ar comprimido, de uma única camada decontas permanece eletrostático acoplado à tampa de deslizamento seco. O revestimento PDL não afecta a adesividade da superfície de vidro para o gel, como as lâminas de vidro são sem danos e removido do gel de AP totalmente intacta.
As placas de Petri de fundo de vidro são feitos aderente por tratamento com 97% de 3-aminopropil-trimethoxysliane e 0,5% de glutaraldeído. Géis PA de rigidez desejados são criados através da mistura de concentrações adequadas de bisacrilamida e acrilamida através de um procedimento padrão 9. Uma gota da solução de gel é pipetada para o fundo uma placa de Petri de vidro. A lamela de vidro contendo as pérolas é usada para sanduíche do gel com a placa de Petri. Quando o gel é curado, o topo da tampa deslizante é removido, deixando as pérolas embutidas no gel PA dentro de 1,6 pM a partir da superfície.
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Protocol
Fabrico e funcionalização géis PA variando de rigidez com microesferas fluorescentes incorporadas perto da superfície da cultura de células.
1. Funcionalização o tampo de vidro lamínulas
- Limpo lamelas de vidro (# 1,0, 12 mm de diam.) Com sabão e água, seguida por etanol, para remover o pó estranhos.
- Tampa de vidro lugar desliza sobre uma superfície ralado (ou seja, o titular da ponteira) de tal forma que eles não estão tocando para facilitar a facilidade de interação com as lamelas.
- Bata de toda a superfície da tampa desliza com poli-D-lisina (0,1 mg / ml) durante 1 hora (Figura 1A).
- Durante este tempo, realizar uma diluição de 1: a solução de colóide de 0,1 um de diâmetro de 10.000, microesferas fluorescentes vermelhas com desionizada (DI) de água para se obter uma densidade de partícula de cerca de 1 por microesfera 20 mM 2 sobre a superfície do gel. Ver Figura 2 para os resultados de várias diluições. Este dilution pode ser modificado para atender a necessidade de experimentos específicos.
- Coloque a solução diluída em um banho de água de ultra-sons durante 30 min.
- Depois de 1 hora, use uma pinça para levantar cuidadosamente cada lamínula e seque com o ar. Retorne os lamínulas secos à superfície ralado.
- Remover a solução de colóide diluído a partir do banho de ultra-sons e uma pipeta de 150 uL em cada lamela. Deixe descansar por 10 min (Figura 1B).
- Use uma pinça para levantar cuidadosamente cada lamínula e seque com o ar. Retorne a tampa seca desliza para a superfície e loja ralado no escuro até que esteja pronto para uso.
2 Preparando PA Gel Diretamente na Glass Bottom placas de Petri
- Placa de aquecimento de pré-aquecimento a 100 ° C.
- Coloque para fora o número desejado de fundo de vidro placas de Petri (35 milímetros prato com 14 milímetros micro-bem, # 1.0) em uma superfície plana em um exaustor química.
- Cubra a parte de vidro de cada placa de Petri micro-bem com 97% 3-Aminopropil-trimethoxysliane (3-APTES) para 7 min para ativação química. Tomar cuidado para evitar o gotejamento inadvertida dos 3-APTES à superfície do plástico na placa de Petri a fim de evitar a degradação do poliestireno.
- Após 7 min, preencher a placa de Petri com água DI e dispor em recipiente de resíduos.
- Repita o passo 2.4 3x para cada prato, em seguida, apertar a placa de Petri para remover a água extra. Colocar as placas de Petri sobre a placa quente até que a porção de vidro é seco.
- Retirar as placas de Petri a partir da placa de aquecimento e voltar para uma superfície plana numa hote química.
- Em uma coifa química, fazer uma solução de glutaraldeído a 0,5% e a porção de cobertura de vidro de cada placa de Petri bem com a solução durante 30 min. Tomar cuidado para evitar o gotejamento inadvertida do glutaraldeído para a superfície do plástico na placa de Petri a fim de evitar a degradação do plástico.
- Após 30 min, preencher a placa de Petri com água DI e dispor em recipiente de resíduos para lavar e remover o glutaraldehyde.
- Repita o passo 2.4 3x para cada prato, em seguida, apertar a placa de Petri para remover a água extra. Colocar as placas de Petri sobre a placa quente até que a porção de vidro é seco.
- Antes de misturar os componentes da solução de gel de PA, mover as lâminas de vidro funcionalizadas no exaustor de fumos química de tal modo que eles são facilmente acessíveis, o que permite a rápida ensanduichar do gel com o fundo de vidro pratos de Petri depois de misturar a solução de gel.
- Num tubo de centrífuga de 15 mL, misturar 40% bisacrilamida, 2% de acrilamida, e de ácido acrílico em sucessão imediata, nas concentrações listadas na Tabela 1 (adaptado do protocolo publicado 10) para atingir a desejada elasticidade da matriz.
- Adicionar 100 mM de HEPES, 10% de persulfato de amónio e TEMED em quantidades indicadas na Tabela 1 correspondem a elasticidade da matriz desejada para completar a solução de gel.
- Imediatamente pipeta 15 ul de solução de gel para o centro da porção de vidrodas placas de Petri.
- Imediatamente pegar uma tampa de deslizamento de vidro funcionalizado com uma pinça.
- Vire a tampa de deslizamento de vidro sobre tal que as partículas fluorescentes estão na tomada de lado o contato com a solução de gel.
- Coloque a tampa deslizante suavemente no topo do gel-líquido PA agora de tal modo que o lado funcionalizado está em contacto com o gel (Figura 1C). Nota: Para obter melhores resultados, uma segunda pessoa é recomendado para a função de adicionar o deslizamento da tampa, a fim de evitar a possibilidade de a polimerização parcial, enquanto pipetando solução líquida gel PA em várias placas de Petri.
- Virar todas as placas de Petri sobre para ajudar a evitar os efeitos da gravidade sobre nanopartículas fluorescentes polimerização em níveis mais baixos do gel PA.
- Aguarde pelo menos 35 minutos, ou até que a solução estoque de gel PA visivelmente polimerizado em seu tubo de centrífuga.
- Virar as placas de Petri de volta e enchê-los com PBS para ajudar com a remoção da tampa de deslizamento.
- Com cuidado, faça contato com a parte de vidro da placa de Petri e os contornos da lamínula, usando uma pinça para raspar a circunferência da lamela. Execute vários ciclos até que a lamínula é desalojado. Retire a tampa de deslizamento e descarte em um recipiente de resíduos perfurocortantes adequada.
- Após a remoção de todos os lamelas, contas fluorescentes terá transferido para o gel (Figura 1E). Cubra os géis PA completamente com PBS, coloque a tampa placa de Petri em cada prato, e armazenar a 4 ° C.
3. Funcionalização gel PA com fibronectina
- Preparar as seguintes soluções de pré-misturados tal como descrito no protocolo estabelecido 11: solução Soak (NaCl 137 mM, 5% (v / v) de glicerol) e 2x tampão de conjugação (0,2 H 2 (N-morfolino) etanossulfónico (MES), 10 % (v / v) de glicerol, pH 4,5).
- Use uma bomba de vácuo em uma capa biológico para remover toda a PBS dos pratos com fundo de vidro contendo os géis PA.
- Pipetate embebe a solução para cada gel de tal forma que o gel é completamente submerso. Incubar à temperatura ambiente durante pelo menos 1 hr.
- Quente 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida (EDC) e N -hydroxysulfosuccinimide (NHS) a temperatura ambiente.
- Misturar 10x soluções de EDC (150 mM, 19 mg / ml em água desionizada) e NHS (250 mM, 29 mg / ml em água desionizada).
- Misture uma parte de 10x EDC, uma parte 10x NHS, 3 partes de água DI e 5 peças 2x tampão conjugação.
- Usar uma bomba de vácuo com um capuz biológico para remover a solução de impregnação. Certifique-se de todo o fluido é removido da superfície do gel.
- Adicionar suficiente solução de NHS / EDC, para se cobrir a superfície do gel e encher o poço com fundo de vidro da placa de Petri (150-250 uL). Incubar à temperatura ambiente durante 30 min no escuro.
- Fibronectina Descongelar à temperatura ambiente. Uma vez descongelado, misturar água estéril DI para criar um / ml solução de fibronectina 50 ug.
- Usar uma bomba de vácuo com um capuz biológico para remover as solu NHS / EDCção. Certifique-se de todo o fluido é removido da superfície do gel.
- Adicionar 150 ul de solução de fibronectina para cada gel. Incubar à temperatura ambiente durante 35 min para permitir a ligação da fibronectina.
- Após 35 minutos, adiciona-PBS a cada prato de Petri e armazenar a 4 ° C durante até 2 semanas.
4. Experimentos TRACCÇÃO
- Meios de célula quente, PBS, e tripsina a 37 ° C em um banho de água.
- Lavar géis 5x com PBS estéril, aspirar o PBS entre lavagens, e deixe coberto na capa.
- Adicionar 1 ml de tripsina por cada 25 cm2 de frasco contendo células. Após as células são levantadas a partir de frasco, diluir a tripsina com meio celular e contar as células. Com base na área superficial do gel, determinar o número de células necessário por gel para uma densidade final de células de semeadura de 3000 células / cm 2. Dilui-se ou concentrar-se a suspensão de modo a que 150 uL da mistura de células-media contém este número de células. Alíquota de 150 mL de suspens celularesião positivo para cada gel.
- Colocar as placas de Petri contendo as células numa incubadora durante 30 min. Em seguida, remove cuidadosamente os pratos de Petri e encher o restante da placa de Petri com meios de comunicação (aproximadamente 2 ml) de tal modo que a superfície do prato é completamente submerso.
- Colocar as placas de Petri de volta na incubadora até que a aquisição de imagem.
- Prepare o sistema de aquisição de microscópio e dados para geração de imagens: inserir a objetiva de imersão 40x de água, insira o contraste de interferência diferencial (DIC) Prisma, selecione o mCherry ou filtro fluorescente equivalente, e ligue a câmara ambiental.
- Quando preparado para imagens, remover uma placa de Petri da incubadora e coloque-o suavemente sobre o estágio do microscópio. Remover a tampa do prato de Petri para DIC imagiologia.
- Localize uma única célula e capturar uma única imagem da célula na DIC.
- Sem mover o estágio do microscópio, mude o modo de imagem para fluorescência. Concentre-se nas microesferas fluorescentes e record uma imagem das microesferas.
- Remover cuidadosamente a partir de meio celular a placa de Petri com uma pipeta e adicionar 0,05% de tripsina-EDTA.
- Imagem das microesferas sob a célula após as células têm destacado.
- Velocimetria de imagem (PIV) Use análise de partículas no ImageJ 12 para calcular o campo de deslocamento devido a forças de celulares.
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Representative Results
Imagiologia confocal foi utilizada para determinar que os grânulos eram de facto sob a superfície do gel e para quantificar a sua localização precisa dentro da profundidade de gel. As contas fluorescentes de um comprimento de onda diferente do que os que estão dentro do gel foram deixadas a assentar sobre a superfície, e a distância entre as nanopartículas fluorescentes incorporadas e aqueles em que o revestimento foi calculada utilizando um algoritmo de identificação centróide. A localização do cordão na superfície do gel serve como uma referência para a superfície superior das células aplicar força sobre a aderência à superfície do gel onde. Um esquema de dois cenários considerados (esferas verdes no gel com esferas vermelhas sobre a superfície, e vice-versa) é mostrado na Figura 3. O algoritmo de interpolação à altura z da localização centróide tridimensional. Repetimos este processo por três géis de rigidez (1, 10 e 40 kPa) em duas dimensões (diâmetro) partículas fluorescentes (0,1 um vermelho e 1 mícron verde-amarelo). A distânciaentre um talão no interior do gel e a sua vizinha mais próxima de um comprimento de onda diferente foi determinada com base na sua centróide tridimensional. Figura 4 mostra a distribuição espacial dos grânulos (na superfície de topo e incorporado) e a vista projectada no plano YZ. Esta última oferece as profundezas de todas as esferas da superfície do gel.
A profundidade média dos grânulos é de 0,1 uM 619 nm, 467 nm, 278 nm para geles de rigidez PA 1, 10, e 40 kPa, respectivamente (Figura 5A). As profundidades correspondentes para um diâmetro uM grânulos são -20 nm, em géis de 40 kPa, 12 nm, em géis de 10 kPa e 1255 nm, em géis de 1 kPa (Figura 5B). Imagiologia confocal também foi realizada em geles com grânulos dispersos por todo o gel, como tem sido tradicionalmente usado para géis PA destina-se para estudos de microscopia de força de tracção. A profundidade de grânulos dispersos por todo o gel de PA foi medida usando o mesmo algoritmo descrito anteriormente e é comparada com a depths usando a técnica que aqui apresentamos. Figura 6 ilustra a variação da dispersão do grânulo dentro da profundidade de um gel de AP utilizando métodos tradicionais de fabricação.
Os fibroblastos aderir à superfície do gel de AP quando funcionalizado com fibronectina. O campo de deslocamento para uma célula de fibroblasto e a correspondente camada de partículas fluorescentes são mostrados na Figura 7. Grânulos perto da periferia da imagem aparece ligeiramente fora de foco. Este não é um defeito mecânico na parte do gel, tal como o vidro permanece completamente intacta após a remoção do gel. Em vez disso, é o resultado de um efeito óptico devido à objectiva de imersão em água utilizado nesta experiência. Após a adição de tripsina para a forma, a célula é libertado a partir da superfície, o que resulta no retorno da superfície de gel de PA deformada ao seu estado original. Um algoritmo de correlação cruzada foi utilizado para calcular a área de deformação com base em deslocamentos de talão 10. Adeslocamento mapa ilustra uma polarização dominante das forças de tração na célula na direção y.
Figura 1 Ilustração do processo de funcionalização para cobertura de vidro top desliza com PDL e partículas fluorescentes. deslizamentos (A) da tampa de vidro (azul) são incubadas com 0,1 mg / ml de PDL (laranja), durante 1 hora. O ar comprimido é utilizado para soprar a tampa desliza seco e remover o PDL. Deslizamentos (B) da tampa de vidro são incubados com uma solução de 100 nm de diâmetro esferas fluorescentes durante 5-10 minutos, e, em seguida, removido por aplicação de ar comprimido. Uma camada de grânulos electrostático permanece acoplado à lamela. (C) lamelas funcionalizadas com esferas de gel são utilizados para sanduíche PA com uma superfície de vidro activada. (D) Após a remoção da parte superior da lâmina de cobertura seguinte PA polymerizat gelion, as contas estão localizados dentro e muito perto da superfície do gel. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. superfície PA Gel Contendo 0,1 um de diâmetro fluorescentes grânulos. Antes do revestimento da tampa de deslizamento superior de vidro tratadas com PDL com grânulos, a solução foi diluída talão (A) 10.000 vezes (3,64 x 10 8 contas / ml) e (B) 20.000 vezes (1,82 x 10 8 contas / ml). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A Figura 3 da interface substrato-celular com esferas localizadas próximo da superfície do gel. Um esquema de dois cenários em que posição dentro do grânulo de um gel de PA foi quantificada usando a microscopia confocal e um algoritmo de identificação centróide. O primeiro cenário é mostrado em (A) Red contas nm de diâmetro 100 dentro do gel e 1 mM contas verdes diâmetro na superfície, ea segunda em (B) Verdes 1 contas micrometros de diâmetro dentro do gel e contas vermelhas 100 nm de diâmetro em a superfície. (C) A ilustração dos desenhos animados de uma célula (amarelo) aderiu a um gel (azul) com contas vermelhas localizadas no interior do gel perto de sua superfície e um cordão verde sentado em sua superfície. Clique aqui para ver uma versão maior esta figura.
Figura 4 fatia confocal (XY, centro) e acompanha YZ (esquerda) visualizações projeção de um gel com vermelho 0,1 mM contas embutidas no gel e 1 mM contas na superfície. As unidades para todos os eixos estão em nanômetros. Ocorrências ocasionais de contas vermelhas acima ou no mesmo plano que contas verdes é atribuída a ligeira sobreposição nos espectros de emissão de fluorescência para o vermelho (mCherry) e verde (GFP). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 Os histogramas da profundidade de grânulos confinados perto da superfície de topo do gel de AP. Rigidezes 1 kPa, 10 kPa e 40kPa são representados por azul, vermelho e preto, respectivamente. A curva de Gauss estava apto para cada conjunto de dados e o valor de x correspondente à sua amplitude é interpretado como a profundidade média de contas. Dois cenários foram testados:. (A) 0,1 mM contas dentro do gel com 1 mM contas na superfície, e (B) 1 mM contas dentro do gel com 0,1 mM contas na superfície por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 histogramas da profundidade de esferas encaixado arbitrariamente ao longo gel PA usando um método de fabricação tradicional (preto) e grânulos localizadas perto do topo da camada de gel de PA usando esta técnica (vermelho) para geles de rigidez PA A) 1 kPa, B) 10 kPa,e C) de 40 kPa. encarte mostra a profundidade das contas em ambos os tipos de gel dentro do superior mais 10 m do gel. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7 campo Deslocamento devido à tração celular. O contraste da imagem (A) da fase de um fibroblasto em gel de 10 kPa. (B) Deslocamento de campo gerado por tracção gerados pela fibroblastos. Barra de cores indica o deslocamento talão em nanômetros. (C) Fluorescência imagem de 0,1 mM esferas de diâmetro debaixo de um celular antes de tripsinização. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8 Ilustração da localização média de grânulos no interior do gel em relação a um cordão de tamanho / comprimento de onda diferente sentada sobre a superfície do gel. A rigidez do gel decresce PA da esquerda para a direita (40 kPa, de 10 kPa, 1 kPa). (A) Red 0,1 mM esferas de diâmetro interior do gel e verde contas de um um de diâmetro na superfície. (B) Verdes 1 mM esferas de diâmetro interior do gel e miçangas vermelhas diâmetro 0,1 mM na superfície. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura .
Figura 9 Distribution dos valores teóricos para τ / μ baseado em várias profundidades de talão. grânulos de 0,1 um de diâmetro ou foram uniformemente dispersas ou localizadas próximo da superfície de (A) uma kPa géis, (B) de 10 géis kPa, e (c) de 40 géis kPa . A flecha de ouro indica o valor de τ / μ para a z = 0 caso, em que contas são na superfície do gel. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| E (kPa) | 40% de acrilamida (ul) | BIS (concentração) | 2% BIS (ul) | HEPES 100 mM (pi) | 0,1 | 625 | 0,00009 | 22.5 | 4225 |
| 0,25 | 625 | 0,0001 | 25 | 4.222,5 | |||||
| 0,5 | 625 | 0.00011 | 27.5 | 4220 | |||||
| 0,75 | > 625 | 0,0002 | 50 | 4.197,5 | |||||
| 1 | 625 | 0,0003 | 75 | 4.172,5 | |||||
| 1.5 | 625 | 0,0004 | 100 | 4.147,5 | |||||
| 2 | 625 | 0,0005 | 125 | 115px; "> 4122,5||||||
| 2,5 | 625 | 0,0006 | 150 | 4.097,5 | |||||
| 3 | 625 | 0,0008 | 200 | 4.047,5 | |||||
| 3.5 | 625 | 0,0009 | 225 | 4.022,5 | |||||
| 4 | 0,001 | 250 | 3.997,5 | ||||||
| 4,5 | 625 | 0,0012 | 300 | 3.947,5 | |||||
| 5 | 625 | 0,0014 | 350 | 3.897,5 | |||||
| 5.5 | 625 | 0,0016 | 400 | ||||||
| 6 | 625 | 0,0018 | 450 | 3.797,5 | |||||
| 6.5 | 625 | 0.002 | 500 | 3.747,5 | |||||
| 7 | 625 | 0,0022 | 550 | 3.697,5 | |||||
| 7,5 < / Td> | 625 | 0,0024 | 600 | 3.647,5 | |||||
| 8 | 1000 | 0,001 | 250 | 3.622,5 | |||||
| 10 | 1000 | 0,0013 | 325 | 3.547,5 | |||||
| 15 | 1000 | 0.002 | 1px; "> 5003.372,5 | ||||||
| 20 | 1000 | 0,0027 | 675 | 3.197,5 | |||||
| 30 | 1000 | 0,0037 | 925 | 2.947,5 | |||||
| 40 | 1000 | 0,0048 | 1200 | 2672.5 |
Tabela1. PA Gel concentrações químicas baseadas em Módulo de Young. Para um módulo de elasticidade do gel PA desejado, as concentrações indicadas de acrilamida, bisacrilamida, e tampão HEPES deve ser suplementado com 5 mL de ácido acrílico, 25 ul de 10% de persulfato de amónio (APS), e 2,5 l TEMED.
| z (mm) | u x ((τ / μ) im) |
| 0 | 0.750 |
| 0.394 | |
| 1 | 0,237 |
| 1.5 | 0,164 |
| 2 | 0,124 |
| 2,5 | 0.100 |
| 3 | 0.083 |
| 3.5 | 0,071 |
| 4 | 0.062 |
| 4,5 | 0,056 |
| 0.050 |
Quadro 2: Deslocamentos como uma função de τ / μ correspondente à profundidade, z, de grânulos a partir da superfície do gel com base na teoria de Boussinesq.
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Discussion
Ao utilizar esta técnica, é essencial que a solução do grânulo é adequadamente diluída e os grânulos são escolhidos com base no diâmetro desejado, PA rigidez substrato de gel, e a escala de tamanho dos fenómenos que é explorado na experiência desejada.
O cuidado deve ser tomado ao diluir a solução talão antes de funcionalização top lamínulas de vidro. O espaçamento entre as esferas na superfície do gel pode ser alterada alterando o factor de diluição da solução coloidal. A diluição da solução muito vai reduzir o número de pérolas que a par da lamela e, finalmente, reduzir o número de pérolas em gel. A diluição da solução muito pouco pode produzir muito alta densidade de grânulos no gel de modo a que eles estão em contacto e não podem ser distinguidas umas das outras. Enquanto que é muitas vezes impossível evitar completamente a presença de agregação de nanopartículas, a aplicação de ondas de ultra-sons para a solução diluída minimiza eficazmente nanagregação oparticle. Verificou-se que uma diluição de 10.000 vezes da solução coloidal utilizada no presente protocolo dá uma concentração de grânulo de 3,64 x 10 8 contas / ml, e produz uma densidade de partícula de 0,05 desejável grânulos / mM 2 para 0,1 uM grânulos de diâmetro. Uma diluição de 1: 20000 (1,82 x 10 8 contas / ml) produz uma média de 52 mM 2 por partícula Figura 2 mostra imagens da superfície de gel com diferentes diluições.. Deve notar-se que existe uma variabilidade do número de esferas que transferem para o gel. Isto é devido a variabilidade associada com a remoção da solução a partir do cordão de cobertura de vidro com ar comprimido durante a funcionalização. Em geral, verificou-se que o aumento do factor de diluição, pelo menos, um factor de dois resulta consistentemente em pelo menos um aumento de duas vezes na área por pérola.
Também é fundamental para escolher um tamanho talão (diâmetro) que irá resultar em imersão completa de tele talão no interior do gel após polimerização PA. Gel rigidez afecta o local de grânulos, como mostrado na Figura 5A. Para 0,1 uM grânulos de diâmetro, a profundidade do grânulo aumenta com a diminuição da rigidez. Este poderia ser um resultado da relação inversa entre o tamanho dos poros e PA rigidez gel 13. Para todos os três géis rigidez testados, os grânulos são consistentemente localizado dentro do gel, e dentro de 1 um de superfície de gel, tal como ilustrado na Figura 8A. A localização média de um uM grânulos dentro do gel também varia com a rigidez. Eles são incorporados mais profundo (aproximadamente 1,25 mm) para os géis de 1 kPa. Para os 10 e 40 kPa géis, o local do início de uma uM grânulos de diâmetro varia de cerca de 0,5 um a 0,5 um de cima abaixo do gel (Figura 5) da superfície, o que significa que os grânulos ocasionalmente sobressaem através da superfície do gel (Figura 8B). Isto é prejudicial porque introduz topography para as células, ea topografia é conhecido por afetar as interações célula-substrato 14. Assim, é necessário estar atento a escolha de contas para esta técnica na preparação de géis de uma rigidez específica. Dos dois tamanhos de contas utilizadas para caracterizar este método, 0,1 mícron de diâmetro comprova o tamanho ideal. Outros tamanhos de grânulo podem ser utilizados com esta técnica, mas deve ser calibrado usando microscopia confocal, como descrito aqui, para compreender a profundidade exacta a que os grânulos são localizadas durante a polimerização em gel.
Esta técnica melhora a resolução espacial dos grânulos em gel de PA através do aumento do número de partículas distintas dentro do campo de visão. Localizando as esferas para uma camada de perto do topo do gel que não altere significativamente a rigidez do gel compósito. Teoria Isostress compósito é utilizado para calcular o módulo de elasticidade do composto, E c, de apenas a camada de 1 um de espessura de gel contendo beads quanto
E onde f é o módulo de elasticidade das esferas de poliestireno (3 GPa), e m é o módulo de elasticidade da matriz de gel (10 kPa), e v e m v m são as fracções de volume dos grânulos e da matriz de gel, respectivamente. Uma vez que os grânulos compreendem apenas 0,03% do volume, E c = 10,0025 kPa não é significativamente diferente do que o módulo de elasticidade de um gel de rigidez isotrópica 10 kPa. Um método estabelecido para a fabricação de geles de PA reduz o tempo de polimerização a 30 seg, minimizando, assim, o efeito da gravidade sobre a distribuição dos grânulos durante a polimerização 15. O nosso método baseia-se no tempo (~ 30 min) Tempo de polimerização para que as esferas se polimerizar no gelde tal modo que eles não ficam salientes da superfície do gel. Devido a localização dos grânulos de uma camada única não afecta significativamente a rigidez de gel de composto, e o tempo de polimerização mais auxiliares na transferência dos grânulos na matriz de gel, que não incorporam qualquer medida para reduzir o tempo de polimerização na nossa técnica.
A nossa técnica demonstra como para localizar os grânulos a uma profundidade conhecida dentro de gel de AP, o que melhora a medição de deformação do substrato e, assim, o cálculo das forças de tracção célula. A abordagem teórica para quantificar as forças de tração celulares foi previamente relatada 16,17. Esta abordagem trata o substrato de gel como um sólido semi-infinito de metade do espaço elástico. A solução de Boussinesq é utilizada para resolver o problema inverso, para calcular as forças de tracção a partir de um campo de deslocamento. Empregamos uma versão simplificada do integrante Boussinesq para quantificar o erro na medição de deslocamento devido a esferas distais do gel surface 18. A equação para o deslocamento de uma dada direcção com base numa tensão de corte aplicada, τ, ao longo de um dado raio, R, é dada pela
onde u x é o deslocamento na direcção x, μ é o módulo de cisalhamento, e z é a profundidade dos rebordos da superfície do gel. Para vários locais de esferas toda a profundidade do gel, deslocamentos correspondentes estão apresentados na Tabela 2.
Para o caso mostrado aqui, o raio é calculado para ser um tamanho de adesão focal média de 1 um. Se os grânulos são assumidas ser coplanar com as células (z = 0), o deslocamento é dado por 0,75 τ / μ. Se os grânulos são apenas 1 um abaixo da superfície do gel, o deslocamento é dado por 0,24 τ / μ. Esterepresenta uma redução maior do que três vezes a partir de um deslocamento no mesmo plano com a superfície do grânulo de um local 1 uM abaixo. Isto introduz erro no cálculo das forças de tracção superficiais baseados no movimento dos grânulos embebidos cujas localizações dentro do gel precisa é desconhecida. A variação de tracção definida por τ / μ, como uma função da profundidade das esferas no gel para ambos os métodos de fabrico tradicionais e propostas é significativa. Figura 9 mostra a distribuição de forças (dada pela razão τ / μ) baseado em teoria Boussinesq que resultam de computação, utilizando a distribuição de profundidades de talão, z, no interior da profundidade de campo óptico quando esferas são distribuídas uniformemente no gel e localizada perto da superfície. A medição mais precisa da força da célula resultaria se contas estavam no mesmo plano que as células, onde z = 0 e τ / μ = 0,0133. Quando comparado com o caso, τ / μ aumenta em 118%, 80%, e 50% para 1 kPa, 10 kPa e 40 kPa géis, respectivamente, quando grânulos são localizados perto da superfície, utilizando a técnica propomos. Quando as esferas são distribuídas uniformemente por todo o fundo do gel, τ / μ aumenta um adicional de 60%, 80% e 150% para além do aumento induzido por localizar grânulos perto da superfície, para a 1 kPa, 10 kPa e 40 kPa géis, respectivamente. Isto representa um total de cerca de 200% de erros nos cálculos de tracção, quando os grânulos são distribuídos por todo o fundo do gel. Assim, localizando as contas a uma profundidade conhecida no interior do gel melhora a precisão nas medições de deslocamento e forças de tração celular.
A técnica aqui descrita apresenta um modo novo para preparar substratos gel PA para aplicações de microscopia de força de tracção, que os grânulos são localizadas próximo da superfície do gel. Limitando as contas a uma profundidade conhecida dentro gel PA fornece novas informações sobre o deslocamento real de contas sobre a aplicação de força das células, criando amminério quadro preciso de como as células estão deformando seu substrato subjacente.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer ao Programa Iniciativa Interdisciplinar de Inovação da Universidade de Illinois, conceder 12035. SK foi financiado pelo UIUC da National Science Foundation (NSF) Grant 0.965.918 IGERT: formação da próxima geração de Pesquisadores em Celular e Mecânica Molecular e bionanotecnologia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| 70% Glutaraldehyde | Polysciences, Inc. | 111-30-8 | |
| 1 M HEPES buffer solution | Sigma-Aldrich | 83264 | |
| 40% Acrylamide | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| 2% Bisacrylamide | Sigma-Aldrich | M1533 | |
| 0.1 µm Fluorescent microspheres (mCherry) | Invitrogen | F8801 | |
| Fibronectin, Human, 1 mg | BD Biosciences | 354008 | |
| Ammonium persulfate | Bio-RAD | 161-0700 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-RAD | 161-0801 | |
| Poly-D-lysine | Millipore | A-003-E | |
| 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) | Thermo Scientific | 22980 | |
| N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) | Thermo Scientific | 24500 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Life Technologies | 25300-054 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Acrylic acid | Sigma-Aldrich | 147230 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Materials | |||
| 35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass | In Vitro Scientific | D35-14-1-N | |
| Glass cover slips, 12 mm diam. | Ted Pella, Inc. | 26023 | |
References
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