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Bioengineering

Un nuevo método para la localización de cuentas fluorescentes Reporter cerca de la superficie de la célula de la cultura para Microscopía de Fuerza de Tracción

Published: September 16, 2014 doi: 10.3791/51873
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Mechanical Science and Engineering, University of Illinois at Urbana-Champaign

Summary

Las técnicas tradicionales para la fabricación de poliacrilamida (PA) geles que contienen sondas fluorescentes implican intercalando un gel entre una superficie adherente y un portaobjetos de vidrio. Aquí, mostramos que el revestimiento de esta diapositiva con poli-D-lisina (PDL) y sondas fluorescentes localiza las sondas dentro de 1,6 m de la superficie del gel.

Abstract

Geles de PA han sido utilizados como plataforma para estudiar las fuerzas de tracción de células debido a la facilidad de fabricación y la capacidad de sintonizar sus propiedades elásticas. Cuando el sustrato se recubre con una proteína de la matriz extracelular, las células se adhieren al gel y se aplican fuerzas, haciendo que el gel se deforme. La deformación depende de la tracción celular y las propiedades elásticas del gel. Si se conoce el campo de deformación de la superficie, la superficie de tracción puede calcularse utilizando la teoría de la elasticidad. La deformación del gel se mide comúnmente mediante la incorporación de perlas de marcador fluorescente de manera uniforme en el gel. Las sondas desplazan como el gel se deforma. Las sondas cerca de la superficie del gel se realiza un seguimiento. Los desplazamientos reportados por estas sondas se consideran como desplazamientos de superficie. Se ignoran sus profundidades desde la superficie. Esta suposición introduce un error en la evaluación de la fuerza de tracción. Para la medición precisa de las fuerzas de células, es crítico para la ubicación de las perlas para ser conocida. Hemos desarrolladouna técnica que utiliza la química sencilla para confinar perlas de marcadores fluorescentes, 0,1 y 1 m de diámetro, en geles de PA, dentro de 1,6 m de la superficie. Nos capa de un cubreobjetos con poli-D-lisina (PDL) y perlas fluorescentes. PA solución de gel se intercala después entre el cubreobjetos y una superficie adherente. Las perlas fluorescentes se transfieren a la solución de gel durante el curado. Después de la polimerización, el gel PA contiene perlas fluorescentes en un plano cerca de la superficie del gel.

Introduction

La interacción mecánica de una célula viva con su medio ambiente local comúnmente se ha estudiado el uso de geles PA. Estos sustratos se basan en un protocolo simple, bien caracterizado establecido por Dembo y Wang en 1997 1. Una de las principales ventajas de estos sustratos es que su rigidez puede ser sintonizada mediante la modificación de las concentraciones de los componentes específicos de la solución de gel. Esto proporciona una plataforma conveniente para estudiar la interacción células con ambientes de diferentes rigideces. Cuando geles PA se recubren con la matriz extracelular (ECM), las proteínas, las células se adhieren a ellos, la generación de la fuerza. Como resultado de la fuerza de células, el gel se deforma como un cuerpo elástico. Esta deformación depende de la magnitud de la fuerza aplicada por las células y las propiedades elásticas del gel. Varios estudios han empleado geles PA para investigar las fuerzas de tracción celulares.

En una variación de la fabricación de gel de PA, microesferas fluorescentes (bolas) están incrustados turante el gel para cuantificar las fuerzas de tracción de células en geles de diferentes rigideces 2. Tras la aplicación de la fuerza de células, las bolas se desplazan desde su ubicación inicial después de la deformación gel. El campo de la deformación se mide a partir de los desplazamientos de cuentas individuales. Este campo se utiliza la deformación con la teoría de la elasticidad y las propiedades elásticas del gel para calcular las fuerzas de tracción. Estas mediciones proporcionan una idea de cómo las células detectan mecánicamente e interactuar con su microambiente local de 3.

En muchos protocolos de fabricación gel ampliamente utilizados PA, las perlas se entremezclan en todo el gel de PA en su estado no polimerizado líquido. Un gel de PA totalmente polimerizado contiene perlas fluorescentes en todo su volumen. Al calcular las fuerzas de tracción de células, la mayoría de los granos cerca de la superficie del gel (interfaz célula-sustrato) son monitoreados. Los desplazamientos de estas perlas se supone que se produzca en la superficie de cultivo celular para la simplicidad en la fuerza CÁLCULOn. Se tiene en cuenta la ubicación real de las perlas dentro de la profundidad del gel. Sin embargo, en un medio elástico (como PA gel), un cordón más cerca de un punto de aplicación de la fuerza se moverá más de un cordón que está más lejos del punto. Por lo tanto, el tratamiento de la desplazamiento de un punto (en la ubicación del talón) distal de la superficie como que los resultados de superficie en una subestimación de tracciones celulares. El grado de error depende de la distancia del talón de la superficie. El error no puede ser estimada sin el conocimiento de la ubicación de la perla.

La necesidad de un método simple para confinar perlas muy cerca de la superficie de cultivo celular ha sido abordada por algunas técnicas. Una forma es aumentar la densidad de los granos a través de todo el gel de tal manera que hay un número suficiente de perlas en el plano focal superior para medir el movimiento muy cerca de la superficie. Otra técnica consiste en la construcción de una cámara de imagen confocal de imágenes de células vivas de tal manera que la luz desólo las perlas en el plano superior más focal se recoge 4. Un método diferente implica la superposición de una capa extremadamente delgada de gel de PA que contiene perlas en la parte superior de un gel ya polimerizado sin talones 5. Un inconveniente de cada una de estas técnicas es que no se conoce la ubicación exacta de las perlas dentro del gel. Esto introduce un error en el cálculo del campo de desplazamiento de las perlas, y por lo tanto el cálculo de las fuerzas de células. Otra técnica implica la conjugación de perlas a la superficie superior de un gel de PA ya polimerizado usando sulfo-SANPAH 6. Esta técnica asegura las perlas son de hecho sólo en la parte superior del gel de PA, pero el grado en que están incrustados en la profundidad del gel es desconocido. Esto podría crear una topografía local para las células, lo que podría alterar el comportamiento de células, como el trabajo previo ha sugerido que las células pueden sentir la fuerza de varias micras de distancia 7. Recientemente, una técnica para modelando geles PA con 1 m de diámetro fluorescent marcadores de puntos de fibronectina en una matriz regularizado se estableció 8. En este caso, la profundidad de los marcadores fluorescentes se conoce, y es esencialmente cero, como el patrón de fibronectina se imprime indirectamente sobre la superficie del gel. Sin embargo, este método no proporciona un medio continuo en el que las células pueden adherirse, como la proteína ECM se limita a 1 m de diámetro puntos. Un método para la plena integración de los granos de seguimiento dentro de los geles de PA y confinarlos en una ubicación conocida muy cerca de la superficie aún no se ha establecido.

Aquí, desarrollamos una técnica para limitar sub-micras de perlas fluorescentes de diámetro micras a un plano focal muy cerca de la superficie de cultivo de células dentro PA gel. Un gel se curan típicamente intercalando solución de gel líquido no polimerizado entre dos placas de vidrio. Una de las placas se funcionaliza para que el gel se adhiere fuertemente a él. La otra es sin funcionalizar y se retira después de las curas de gel. Modificamos este vidrio extraíble dorface por recubrimiento con una capa de perlas. Al intercalar el gel líquido entre el funcionalizado y la superficie de cristal bola recubierta, la transferencia de los granos al gel mientras se está curando. Esto limita la distancia de la integración de las perlas 'en el gel dentro de 1,6 m de la superficie. Platos de Petri con fondo de vidrio se utilizan como la superficie adherente en la que se cura el gel. Para formar una superficie superior plana de gel durante la polimerización, un cubreobjetos de vidrio circular se utiliza para intercalar el gel con la placa de Petri con fondo de vidrio. Antes de la fabricación del gel, el cubreobjetos de vidrio superior está recubierta con poli-D-lisina (PDL), produciendo una carga superficial positiva. La PDL se sopla con aire comprimido, y una solución de perlas en agua se deposita sobre los cubreobjetos. Utilizamos microperlas fluorescentes carboxilados, que llevan una carga negativa, e interactuar con la superficie de carga positiva creada por el tratamiento con PDL. Después de soplar la solución del grano de la cubreobjetos con aire comprimido, una sola capa decuentas sigue siendo electrostáticamente acoplan a la hoja de la cubierta seca. El recubrimiento PDL no afecta a la adhesividad de la copa a la superficie del gel, ya que los portaobjetos de vidrio no están dañados y se retira del gel de PA completamente intacto.

Los platos de Petri con fondo de cristal se hacen adherentes mediante tratamiento con 97% 3-aminopropil-trimethoxysliane y 0,5% de glutaraldehído. PA geles de rigideces deseadas se crean mediante la mezcla de concentraciones apropiadas de bisacrilamida y acrilamida a través de un procedimiento estándar 9. Una gota de la solución de gel se pipeta en la placa de Petri con fondo de cristal. La hoja de la cubierta de vidrio que contiene las perlas se utiliza para intercalar el gel con la placa de Petri. Cuando se cura el gel, la hoja de la cubierta superior se retira dejando las microesferas incrustadas en el gel de PA dentro de 1,6 m desde la superficie.

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Protocol

La fabricación de geles y funcionalización PA de diferente rigidez con microesferas fluorescentes incrustados cerca de la superficie de cultivo de células.

1. funcionalizar los Cubreobjetos Top Glass

  1. Limpie cubreobjetos de vidrio (# 1.0, 12 mm diam.) Con agua y jabón, seguido de etanol para eliminar el polvo extraño.
  2. Coloque la cubierta de vidrio se desliza en un (es decir, soporte de punta de pipeta) superficie de rallado de tal manera que no se toquen para facilitar la facilidad de interacción con los cubreobjetos.
  3. Escudo toda la superficie de la cubierta se desliza con poli-D-lisina (0,1 mg / ml) durante 1 h (Figura 1A).
  4. Durante este tiempo, realizar una dilución de 1: 10.000 de la solución coloidal de 0,1 m de diámetro, las microesferas fluorescentes rojas con agua desionizada (DI) agua para obtener una densidad de partícula de aproximadamente 1 microesfera por 20 m 2 en la superficie del gel. Ver Figura 2 para los resultados de varias diluciones. Esta dilution puede ser modificado para satisfacer la necesidad de experimentos específicos.
  5. Coloque la solución diluida en un baño de agua ultrasónico durante 30 min.
  6. Después de 1 hora, utilizar pinzas para levantar cuidadosamente cada hoja de la cubierta y secar con aire. Devolver los cubreobjetos secos a la superficie rallada.
  7. Retire la solución coloidal diluida del baño ultrasónico y pipeta de 150 l en cada hoja de la cubierta. Dejar durante 10 min (Figura 1B).
  8. Utilice las pinzas para levantar cuidadosamente cada hoja de la cubierta y secar con aire. Volver la cubierta seca se desliza sobre la superficie rallada y almacenar en la oscuridad hasta que la necesite.

2. Preparación de Gel PA Directamente en placas de Petri de vidrio de fondo

  1. Placa Precalentar a 100 ° C.
  2. Coloque el número deseado de fondo de cristal cajas de Petri (35 mm plato con 14 mm micro-bueno, # 1.0) sobre una superficie plana en una campana para vapores químicos.
  3. Cubra la parte de vidrio de cada plato micro-así Petri con 97% de 3-aminopropil-trimethoxysLiane (3-APTES) durante 7 minutos para la activación química. Tome precauciones para evitar el goteo involuntario de los 3-APTES a la superficie del plástico en la placa de Petri para evitar la degradación del poliestireno.
  4. Después de 7 min, llenar la cápsula de Petri con agua DI y disponer en el recipiente de residuos.
  5. Repita el paso 2.4 3x para cada plato, y luego agitar la placa de Petri para eliminar el exceso de agua. Colocar las cápsulas de Petri en la placa caliente hasta que la parte de vidrio es seco.
  6. Retire las placas de Petri de la placa caliente y volver a una superficie plana en una campana para vapores químicos.
  7. En una campana de humos químicos, hacer una solución de 0,5% de glutaraldehído y para abarcar la parte de vidrio de cada placa de Petri bien con la solución durante 30 min. Tome precauciones para evitar el goteo involuntario del glutaraldehído a la superficie del plástico en la placa de Petri para evitar la degradación del plástico.
  8. Después de 30 min, llenar la cápsula de Petri con agua DI y disponer en un contenedor de residuos para enjuagar y eliminar el glutaraldehyde.
  9. Repita el paso 2.4 3x para cada plato, y luego agitar la placa de Petri para eliminar el exceso de agua. Colocar las cápsulas de Petri en la placa caliente hasta que la parte de vidrio es seco.
  10. Antes de mezclar los componentes de la solución de gel de PA, mover los portaobjetos de vidrio funcionalizadas en la campana de humos química tal que sean fácilmente accesibles, lo que permite la intercalación rápida del gel con el fondo de cristal placas de Petri después de mezclar la solución de gel.
  11. En un tubo de centrífuga de 15 ml, mezclar 40% de bisacrilamida, 2% de acrilamida y ácido acrílico en sucesión inmediata en las concentraciones que se indican en la Tabla 1 (adaptada de protocolo publicado 10) para lograr la elasticidad de la matriz deseada.
  12. Añadir HEPES 100 mM, persulfato de amonio al 10%, y TEMED en cantidades enumeradas en la Tabla 1 correspondientes a la elasticidad matriz deseada para completar la solución de gel.
  13. Inmediatamente pipetear 15 l de solución de gel en el centro de la parte de vidriode los platos de Petri.
  14. Recoger inmediatamente una hoja de cubierta de vidrio funcionalizado con pinzas.
    1. Voltear la hoja de la cubierta de vidrio sobre tal manera que las perlas fluorescentes son en la toma de contacto lateral con solución de gel.
    2. Coloque la hoja de la cubierta suavemente en la parte superior del gel líquido ahora-PA tal que el lado funcionalizado está en contacto con el gel (Figura 1C). Nota: Para obtener los mejores resultados, una segunda persona se recomienda para el papel de la adición de la hoja de la cubierta con el fin de evitar la posibilidad de polimerización parcial mientras pipeteo solución de gel PA líquido sobre varias placas de Petri.
  15. Voltear todos los platos de Petri a ayudar con evitar los efectos de la gravedad sobre nanopartículas fluorescentes de polimerización en niveles inferiores del gel de PA.
  16. Espere por lo menos 35 minutos, o hasta que la solución madre de PA gel ha polimerizado visiblemente en su tubo de centrífuga.
  17. Voltear las cajas de Petri volver una y llenarlos con PBS para ayudar con la eliminación de la hoja de la cubierta.
  18. Cuidadosamente hacer contacto con la parte de vidrio de la placa de Petri y el contorno de la hoja de la cubierta, con unas pinzas para raspar la circunferencia de la hoja de la cubierta. Realice varios ciclos hasta que se desprendió la hoja de la cubierta. Retire la hoja de la cubierta y deseche en un contenedor para desechos cortopunzantes adecuada.
  19. Después de eliminar todos los cubres, perlas fluorescentes se han transferido al gel (Figura 1D). Cubra los geles PA completo con PBS, coloque el plato de Petri tapa en cada plato, y se almacenan a 4 ° C.

3. de funcionalización PA gel con fibronectina

  1. Preparar las siguientes soluciones premezcladas como se describe en un protocolo establecido 11: Empapar solución (NaCl 137 mM, 5% (v / v) de glicerol) y tampón 2x conjugación (0,2 M 2 (N morfolino) etanosulfónico (MES), 10 % (v / v) de glicerol, pH 4,5).
  2. Utilice una bomba de vacío en una campana biológica para eliminar todo el PBS de los platos con fondo de vidrio que contienen los geles PA.
  3. PipetTE remojo solución sobre cada gel tal que el gel esté completamente sumergido. Incubar a temperatura ambiente durante al menos 1 h.
  4. 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida caliente (EDC) y N -hydroxysulfosuccinimide (NHS) a temperatura ambiente.
  5. Mezclar 10x soluciones de EDC (150 mM, 19 mg / ml en agua DI) y NHS (250 mM, 29 mg / ml en agua DI).
  6. Mezclar 1 parte 10x EDC, 1 parte de 10x NHS, 3 partes de agua DI, y 5 partes 2x tampón de conjugación.
  7. Utilice una bomba de vacío en una campana biológica para eliminar la solución de remojo. Asegúrese de que todo el fluido se retira de la superficie del gel.
  8. Agregue suficiente solución NHS / EDC para cubrir la superficie del gel y llenar el pozo con fondo de cristal de la placa de Petri (150-250 l). Incubar a temperatura ambiente durante 30 min en la oscuridad.
  9. Fibronectina Descongelar a temperatura ambiente. Una vez descongelada, la mezcla de agua DI estéril para crear una solución de fibronectina 50 g / ml.
  10. Utilice una bomba de vacío en una campana biológica para eliminar las solu NHS / EDCción. Asegúrese de que todo el fluido se retira de la superficie del gel.
  11. Añadir 150 l de solución de fibronectina a cada gel. Incubar a temperatura ambiente durante 35 min para permitir la unión de la fibronectina.
  12. Después de 35 min, añadir PBS a cada placa de Petri y se almacenan a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas.

4. Experimentos de tracción Fuerza

  1. Medios de calentamiento de células, PBS, y tripsina a 37 ° C en un baño de agua.
  2. Enjuague geles 5x con PBS estéril, aspirar el PBS entre enjuagues, y dejar tapado en la campana.
  3. Añadir 1 ml de tripsina por 25 cm 2 a las células del frasco que contiene. Después las células se levantan de matraz, diluir la tripsina con medio celular y contar las células. Basado en el área de superficie del gel, determinar el número de células requeridas por gel para una densidad de siembra de células final de 3000 células / cm 2. Diluido o concentrado de suspensión de tal manera que 150 l de la mezcla de células-media contiene este número de células. Alícuotas de 150 l de suspens celularesde iones a cada gel.
  4. Colocar las cápsulas de Petri que contenían las células en una incubadora durante 30 min. A continuación, retirar con cuidado las placas de Petri y llenar el resto de la placa de Petri con los medios de comunicación (aproximadamente 2 ml) tal que la superficie de la placa está completamente sumergido.
  5. Colocar las placas de Petri de nuevo en la incubadora hasta que la adquisición de imágenes.
  6. Prepare el sistema de adquisición de microscopio y datos para la imagen: inserte el objetivo de inmersión en agua 40x, inserte el contraste de interferencia diferencial (DIC) de prisma, seleccione el mCherry o filtro fluorescente equivalente, y encienda la cámara ambiental.
  7. Cuando se prepara para la imagen, retire una placa de Petri de la incubadora y colóquelo sobre la platina del microscopio. Retire la tapa de la placa de Petri para imágenes DIC.
  8. Localice una sola célula y capturar una imagen fija de la celda en la DIC.
  9. Sin mover la platina del microscopio, cambiar el modo de imagen a la fluorescencia. Centrarse en las microesferas fluorescentes y recOrd una imagen de las microesferas.
  10. Retire cuidadosamente los medios de comunicación célula a partir de la placa de Petri con una pipeta y añadir 0,05% de tripsina-EDTA.
  11. Imagen de las microesferas bajo la celda después de que las células han desprendido.
  12. El uso de imágenes de partículas velocimetría (PIV) Análisis en ImageJ 12 para calcular el campo de desplazamientos debido a las fuerzas celulares.

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Representative Results

Confocal de imágenes se utilizó para determinar que las perlas eran de hecho por debajo de la superficie del gel y para cuantificar su ubicación precisa dentro de la profundidad de gel. Perlas fluorescentes de una longitud de onda diferente que aquellos en el interior del gel se dejaron sedimentar en la superficie, y la distancia entre las nanopartículas fluorescentes embebidos y los de la superficie se calculó utilizando un algoritmo de identificación centroide. La ubicación del talón sobre la superficie del gel sirve como una referencia para la superficie superior del gel-en donde las células se aplican fuerza en la adhesión a la superficie. Un esquema de los dos escenarios considerados (cuentas verdes en el gel con los granos rojos en la superficie, y viceversa) se muestra en la Figura 3. El algoritmo interpola el z-altura de la ubicación centroide tridimensional. Hemos repetido este proceso durante tres geles de rigidez (1, 10, y 40 kPa) y dos tamaño (diámetro) perlas fluorescentes (0,1 m y 1 m rojo-amarillo-verde). La distanciaentre una perla dentro del gel y su vecino más cercano de una longitud de onda diferente se determinó basándose en su centro de gravedad en tres dimensiones. Figura 4 muestra la distribución espacial de los granos (en la parte superior de la superficie y embebidos) y la vista proyectada en el plano YZ. Esta última ofrece la profundidad de todas las cuentas de la superficie del gel.

La profundidad media de 0,1 m perlas es 619 nm, 467 nm, 278 nm para geles de rigidez PA 1, 10, y 40 kPa, respectivamente (Figura 5A). Las profundidades correspondientes a 1 m de diámetro son los granos -20 nm en 40 geles kPa, 12 nm en 10 geles kPa y 1255 nm en 1 geles kPa (Figura 5B). Confocal de imágenes también se realizó en geles con perlas dispersas por todo el gel como se ha utilizado tradicionalmente para geles PA destinados a estudios de microscopía de fuerza de tracción. La profundidad de los granos dispersos por todo el gel de PA se midió utilizando el mismo algoritmo descrito anteriormente y se compara con el depths utilizando la técnica que aquí presentamos. Figura 6 ilustra la variabilidad de dispersión del grano dentro de la profundidad de un gel PA utilizando métodos de fabricación tradicionales.

Los fibroblastos se adhieren a la superficie del gel PA cuando funcionalizado con fibronectina. El campo de desplazamiento para una célula de fibroblastos y la capa de perlas fluorescentes correspondientes se muestran en la Figura 7. Beads cerca de la periferia de la imagen aparezca ligeramente fuera de foco. Esto no es un defecto mecánico en la parte del gel, como el vidrio permanece completamente intacto tras la eliminación del gel. Más bien, es el resultado de un efecto óptico debido a la objetivo de inmersión en agua utilizada en este experimento. Tras la adición de tripsina al medio, la célula se libera de la superficie, dando como resultado el retorno de la superficie del gel PA deformado a su estado original. Un algoritmo de correlación cruzada se utilizó para calcular el campo de deformación basado en desplazamientos de talón 10. Elmapa de desplazamiento ilustra una polarización dominante de las fuerzas de tracción de células en la dirección y.

Figura 1
Figura 1 Ejemplo de proceso de funcionalización de la cubierta superior de cristal se desliza con PDL y perlas fluorescentes. resbalones (A) de la cubierta de cristal (azul) se incuban con 0,1 mg / ml PDL (naranja) durante 1 hora. El aire comprimido se utiliza para soplar la cubierta se desliza en seco y eliminar el PDL. Resbalones (B) cubierta de vidrio se incuban con una solución de perlas fluorescentes 100 nm de diámetro durante 5-10 min, y luego se retira mediante la aplicación de aire comprimido. Una capa de perlas electrostáticamente permanece acoplado a la cubreobjetos. (C) cubreobjetos funcionalizado con perlas de gel se utilizan para PA sándwich con una superficie de vidrio activada. (D) Después de retirar la hoja de la cubierta superior siguiente polymerizat gel de PAion, las perlas se encuentran dentro y muy cerca de la superficie del gel. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Gel PA superficie que contiene perlas fluorescentes 0,1 m de diámetro. Antes de recubrir la hoja de la cubierta superior de vidrio tratado con PDL con los granos, la solución se diluyó talón (A) 10 000 veces (3,64 x 10 8 cuentas / ml) y (B) 20.000 veces (1,82 x 10 8 cuentas / ml). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 Figura 3. interfaz célula-sustrato con cuentas localizadas cerca de la superficie del gel. Un esquemática de dos escenarios en los que se cuantificó ubicación del talón dentro de un gel de PA mediante microscopía confocal y un algoritmo de identificación centroide. El primer escenario se muestra en (A) 100 bolas rojas nm de diámetro en el interior del gel y verde 1 m perlas de diámetro en la superficie, y el segundo en (B) Verde 1 cuentas micras de diámetro en el interior del gel y 100 bolas nm de diámetro de color rojo en la superficie. (C) Una ilustración de dibujos animados de una célula (amarillo) se adhirió a un gel (azul) con los granos rojos localizados en el interior del gel cerca de su superficie y un cordón verde que se sienta en su superficie. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. rebanada Confocal (XY, centro) y acompaña YZ (izquierda) vistas de proyección de un gel con rojos 0.1 micras perlas incrustadas en el gel y 1 micras granos en la superficie. Las unidades para todos los ejes están en nanómetros. Apariciones ocasionales de los granos rojos por encima o en el mismo plano que los granos verdes se atribuye a un ligero solapamiento en los espectros de emisión de fluorescencia de color rojo (mCherry) y verde (GFP). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. Histogramas de la profundidad de los granos confinados cerca de la superficie superior de PA gel. Rigidez 1 kPa, 10 kPa, y 40kPa están representados por azul, rojo, y negro, respectivamente. Una curva de Gauss se ajusta a cada conjunto de datos y el valor de x correspondiente a su amplitud se interpreta como la profundidad media de los granos. Dos escenarios fueron probados:. (A) 0,1 micras cuentas dentro del gel con 1 m granos en la superficie, y (B) 1 micras cuentas dentro del gel con 0,1 micras granos en la superficie Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6. Histogramas de la profundidad de perlas incrustado arbitrariamente largo de PA gel utilizando un método de fabricación tradicional (negro) y perlas localizadas cerca de la capa superior de gel de PA utilizando esta técnica (rojo) para geles de rigidez PA A) 1 kPa, B) 10 kPa,y C) 40 kPa. recuadro muestra la profundidad de las cuentas en los dos tipos de gel dentro de la parte superior más de 10 m del gel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7
Imagen del campo 7. Desplazamiento debido a la tracción de la célula. Imagen de contraste (A) Fase de un fibroblasto el 10 kPa gel. (B) Desplazamiento campo generado por la tracción generada por el fibroblasto. Barra de color indica el desplazamiento del grano en nanómetros. (C) Fluorescencia imagen de 0,1 micras de diámetro perlas debajo de una célula antes de la tripsinización. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.


Figura 8. Ilustración de ubicación del promedio de los granos en el interior del gel relativa a una perla de tamaño / longitud de onda diferente que se sienta en la superficie del gel. La rigidez de las disminuciones de gel de PA de izquierda a derecha (40 kPa, 10 kPa, 1 kPa). (A) 0,1 micras de diámetro perlas rojas dentro del gel y verde 1 m perlas de diámetro en la superficie. Verdes 1 m de diámetro perlas en el interior del gel y rojo 0,1 micras de diámetro granos en la superficie (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra .

Figura 9
Figura 9. Distribution de valores teóricos para τ / μ basa en varias profundidades de talón. Perlas de 0,1 m de diámetro o bien se dispersa o localizada cerca de la superficie en (A) 1 kPa geles, (B) 10 geles kPa, y (c) 40 kPa geles uniformemente . La flecha de oro indica el valor de τ / μ para la z = 0 caso, en el que los granos se encuentran en la superficie del gel. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

115px; "> 4122.5 1px; "> 500
E (kPa) 40% de acrilamida (l) BIS (concentración) 2% BIS (l) HEPES 100 mM (l) 0,1 625 0.00009 22.5 4225
0.25 625 0.0001 25 4222.5
0,5 625 0.00011 27.5 4220
0.75 > 625 0.0002 50 4197.5
1 625 0.0003 75 4172.5
1.5 625 0.0004 100 4147.5
2 625 0.0005 125
2.5 625 0.0006 150 4097.5
3 625 0.0008 200 4047.5
3.5 625 0.0009 225 4022.5
4 0.001 250 3997.5
4.5 625 0.0012 300 3947.5
5 625 0.0014 350 3897.5
5.5 625 0.0016 400
6 625 0.0018 450 3797.5
6.5 625 0.002 500 3747.5
7 625 0.0022 550 3697.5
7.5 < / Td> 625 0.0024 600 3647.5
8 1000 0.001 250 3622.5
10 1000 0.0013 325 3547.5
15 1000 0.002 3372.5
20 1000 0.0027 675 3197.5
30 1000 0.0037 925 2947.5
40 1000 0.0048 1200 2672.5

Tabla1. PA Gel Concentraciones químicos a base de módulo de Young. Para un módulo elástico gel PA deseada, las concentraciones que se indican de acrilamida, bisacrilamida, y tampón HEPES debe complementarse con ácido acrílico 5 l, 25 l de persulfato de amonio al 10% (APS), y 2,5 l TEMED.

7PT "width =" 62 "> 5
z (m) u x ((τ / μ) micras)
0 0.750
0.394
1 0.237
1.5 0.164
2 0.124
2.5 0.100
3 0.083
3.5 0.071
4 0.062
4.5 0.056
0.050

Tabla 2. Desplazamientos como una función de τ / μ correspondiente a la profundidad, z, de los granos de la superficie del gel basado en la teoría de Boussinesq.

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Discussion

Cuando se utiliza esta técnica, es esencial que la solución de bolas se diluye apropiadamente y las perlas se eligen basándose en diámetro deseado, PA rigidez sustrato gel, y la escala de tamaño de los fenómenos que se explora en el experimento deseado.

Se debe tener cuidado al diluir la solución del grano antes de la funcionalización de los mejores cubreobjetos de vidrio. La separación entre los granos en la superficie del gel puede ser alterado cambiando el factor de dilución de la solución coloidal. La dilución de la solución demasiado reducirá el número de cuentas que se acoplan a la hoja de la cubierta y en última instancia reducir el número de perlas en el gel. La dilución de la solución demasiado poco puede producir una densidad demasiado alta de perlas en el gel tal que están en contacto y no se pueden distinguir uno de otro. Si bien a menudo es imposible evitar por completo la presencia de la agregación de nanopartículas, la aplicación de ondas ultrasónicas a la solución diluida minimiza eficazmente nanagregación oparticle. Hemos encontrado que una dilución 10000 veces de la solución coloidal utilizado en este protocolo da una concentración de perlas de 3,64 x 10 8 perlas / ml, y se obtiene una densidad de partícula deseable de 0,05 granos / 2 micras de 0,1 micras de diámetro perlas. Una dilución 1: 20.000 (1,82 x 10 8 cuentas / ml) produce un promedio de 52 micras por partícula 2 La Figura 2 muestra imágenes de la superficie de los geles con diferentes diluciones.. Cabe señalar que existe variabilidad en el número de cuentas que transfieren al gel. Esto es debido a la variabilidad asociada con la eliminación de la solución del talón desde el cubreobjetos con aire comprimido durante la funcionalización. En general, hemos encontrado que el aumento del factor de dilución en al menos un factor de dos consistentemente resulta en al menos un aumento del doble en la zona por perla.

También es fundamental para elegir un tamaño de grano (diámetro) que se traducirá en una inmersión total de tCuenta de él en el interior del gel de PA tras la polimerización. La rigidez del gel afecta a la ubicación de perlas como se muestra en la Figura 5A. Para 0,1 micras de diámetro perlas, la profundidad del grano aumenta con la disminución de la rigidez. Esto podría ser un resultado de la relación inversa entre el tamaño de poro y la rigidez de gel de PA 13. Para todos los tres geles de rigidez probados, las perlas se localizan consistentemente dentro del gel, y dentro de 1 m de la superficie del gel como se ilustra en la Figura 8A. La ubicación promedio de 1 m perlas dentro del gel también varía con la rigidez. Ellos se incrustan más profunda (aproximadamente 1,25 m) en los geles de 1 kPa. Para los geles 10 y 40 kPa, la localización de la parte superior de 1 m de diámetro perlas oscila entre aproximadamente 0,5 m por encima de 0,5 m por debajo de la gel (Figura 5) de la superficie, lo que significa que las perlas de vez en cuando sobresalen a través de la parte superior del gel (figura 8B). Esto es perjudicial porque introduce topografía de las células, y la topografía se sabe que afectan a las interacciones célula-sustrato 14. Por lo tanto, es necesario tener en cuenta la elección de los granos de esta técnica en la preparación de geles de una rigidez específica. De los dos tamaños de perlas utilizados para caracterizar este método, 0,1 m de diámetro demuestra el tamaño óptimo. Otros tamaños de grano se pueden utilizar con esta técnica, pero deben ser calibrados usando microscopía confocal como se describe aquí, para entender la profundidad exacta a la que las perlas están localizados durante la polimerización del gel.

Esta técnica mejora la resolución espacial de los granos en gel de PA al aumentar el número de partículas distinguibles dentro del campo de visión. La localización de las perlas a una capa cerca de la parte superior del gel no afecta significativamente a la rigidez del material compuesto de gel. Isostress teoría de material compuesto se utiliza para calcular el módulo elástico compuesto, E c, sólo la capa de 1 m de espesor de gel que contiene beads como

Ecuación 1

donde E f es el módulo elástico de las perlas de poliestireno (3 GPa), E m es el módulo elástico de la matriz de gel (10 kPa), y v y v f m son las fracciones en volumen de los granos y de matriz de gel, respectivamente. Debido a que las perlas comprenden solamente 0,03% del volumen, E c = 10,0025 kPa no es significativamente diferente que el módulo elástico de un gel isotrópico de rigidez 10 kPa. Un método establecido para la fabricación de geles de PA reduce el tiempo de polimerización a 30 seg, minimizando así el efecto de la gravedad sobre la distribución de los granos durante la polimerización 15. Nuestro método se basa en la más larga (~ 30 min) tiempo de polimerización para que las perlas se polimerizan en el gelde tal manera que no sobresalgan de la superficie del gel. Debido a la localización de las perlas a una sola capa no afecta significativamente a la rigidez de gel compuesto, y el tiempo de polimerización ayudas más tiempo en la transferencia de los granos en la matriz de gel, no incorporamos cualquier medida para reducir el tiempo de polimerización en nuestra técnica.

Nuestra técnica muestra cómo localizar las perlas a una profundidad conocida dentro de gel de PA, lo que mejora la medición de la deformación del sustrato, y por lo tanto el cálculo de las fuerzas de tracción celular. Un enfoque teórico para cuantificar las fuerzas de tracción celulares se ha informado anteriormente 16,17. Este enfoque trata el sustrato como un gel semi-sólido infinito en el espacio medio elástico. La solución de Boussinesq se utiliza para resolver el problema inverso del cálculo de las fuerzas de tracción de un campo de desplazamiento. Empleamos una versión simplificada de la integral de Boussinesq para cuantificar el error en la medición de desplazamiento debido a las perlas distales de la s gelurface 18. La ecuación para el desplazamiento en una dirección dada sobre la base de una tensión de cizallamiento aplicada, τ, a lo largo de un radio dado, R, viene dada por

Ecuación 2

donde u x es el desplazamiento en la dirección x, μ es el módulo de cizallamiento, y z es la profundidad de las perlas de la superficie del gel. Por diversas ubicaciones de los granos a lo largo de la profundidad del gel, los desplazamientos correspondientes se muestran en la Tabla 2.

Para el caso mostrado aquí, el radio se estima en un tamaño de adhesión focal media de 1 m. Si se supone que las perlas para ser coplanar con las células (z = 0), el desplazamiento viene dado por 0,75 τ / μ. Si las perlas son sólo 1 m por debajo de la superficie del gel, el desplazamiento viene dado por 0,24 τ / μ. Estemayor que representa una reducción de tres veces en el desplazamiento de un cordón coplanar con la superficie a una ubicación por debajo de 1 m. Esto introduce un error en el cálculo de las fuerzas de tracción de superficie basado en el movimiento de los granos implícitos cuyos lugares dentro del gel precisa se desconoce. La variación en la tracción definido por τ / μ, como una función de la profundidad de las perlas en el gel tanto para los métodos de fabricación propuestos y tradicionales es significativa. Figura 9 muestra la distribución de fuerzas basa (dado por la relación τ / μ) en la teoría de Boussinesq que el resultado de cálculo utilizando la distribución de profundidades de talón, Z, dentro de la profundidad óptica de campo cuando los granos están distribuidos uniformemente en el gel y localizados cerca de la superficie. La medición más precisa de la fuerza celular se produciría si los granos estaban en el mismo plano que las células, donde z = 0 y τ / μ = 0,0133. En comparación con este caso, τ / μ aumenta en 118%, 80% y 50% para 1 kPa, 10 kPa y 40 kPa geles, respectivamente, cuando los granos están localizados cerca de la superficie utilizando la técnica que proponemos. Cuando perlas se distribuyen de manera uniforme en toda la profundidad de gel, τ / μ aumenta un 60% adicional, 80% y 150% más allá del aumento inducido por la localización de perlas cerca de la superficie, por 1 kPa, 10 kPa y 40 kPa geles, respectivamente. Esto representa un total de casi 200% de error en los cálculos de tracción cuando las perlas se distribuyen en toda la profundidad de gel. Por lo tanto, la localización de las perlas a una profundidad conocida dentro del gel mejora la precisión en las mediciones de desplazamiento y las fuerzas de tracción celular.

La técnica descrita aquí presenta una nueva manera de preparar sustratos de gel de PA para aplicaciones de microscopía de fuerza de tracción tales que las perlas se localizan cerca de la superficie del gel. El confinamiento de las perlas a una profundidad conocida dentro PA gel proporciona nueva información sobre el desplazamiento real de perlas de aplicación de la fuerza sobre las células, creando ammineral imagen precisa de cómo las células están deformando su sustrato subyacente.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Los autores desean dar las gracias al Programa Iniciativa Interdisciplinar de Innovación de la Universidad de Illinois, conceder 12035. SK fue financiado en UIUC de la Fundación Nacional de Ciencia (NSF) de Grant 0965918 IGERT: Formación de la Generación de Investigadores Siguiente Celular y Molecular Mechanics y BioNanotecnología.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES) Sigma-Aldrich 281778
70% Glutaraldehyde Polysciences, Inc. 111-30-8
1 M HEPES buffer solution Sigma-Aldrich 83264
40% Acrylamide Sigma-Aldrich A4058
2% Bisacrylamide Sigma-Aldrich M1533
0.1 µm Fluorescent microspheres (mCherry) Invitrogen F8801
Fibronectin, Human, 1 mg BD Biosciences 354008
Ammonium persulfate Bio-RAD 161-0700
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-RAD 161-0801
Poly-D-lysine Millipore A-003-E
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)  Thermo Scientific 22980
N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) Thermo Scientific 24500
0.05% Trypsin-EDTA (1X) Life Technologies 25300-054
NaCl Sigma-Aldrich S9888
Acrylic acid  Sigma-Aldrich 147230
Glycerol Sigma-Aldrich G7757
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) Sigma-Aldrich M3671
Materials
35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass In Vitro Scientific D35-14-1-N
Glass cover slips, 12 mm diam. Ted Pella, Inc. 26023

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References

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Bioingeniería Número 91 la mecánica de células poliacrilamida (PA) gel microscopía de fuerza de tracción perlas fluorescentes poli-D-lisina (PDL) la superficie de cultivo de células
Un nuevo método para la localización de cuentas fluorescentes Reporter cerca de la superficie de la célula de la cultura para Microscopía de Fuerza de Tracción
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Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy. J. Vis. Exp. (91), e51873, doi:10.3791/51873 (2014).

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