कर्षण बल माइक्रोस्कोपी के लिए सेल संस्कृति सतह के पास लोकलाइजिंग रिपोर्टर फ्लोरोसेंट मोती के लिए एक उपन्यास विधि
Summary
फ्लोरोसेंट जांच युक्त polyacrylamide (पीए) जैल fabricating के लिए परंपरागत तकनीकों एक पक्षपाती सतह और एक गिलास स्लाइड के बीच एक जेल sandwiching शामिल है. यहाँ, हम पाली डी lysine (पीडीएल) और फ्लोरोसेंट जांच के साथ इस स्लाइड कोटिंग जेल सतह से माइक्रोन 1.6 के भीतर जांच localizes कि दिखा.
Abstract
पीए जैल लंबे निर्माण और धुन उनके लोचदार संपत्तियों की क्षमता में आसानी के कारण सेल कर्षण बलों का अध्ययन करने के लिए एक मंच के रूप में इस्तेमाल किया गया है. सब्सट्रेट एक बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन के साथ लेपित है, जब कोशिकाओं जेल का पालन करना और जेल ख़राब करने के कारण बलों लागू होते हैं. विरूपण सेल कर्षण और जेल की लोचदार संपत्तियों पर निर्भर करता है. सतह के विरूपण क्षेत्र में जाना जाता है, तो सतह कर्षण लोच सिद्धांत का उपयोग कर की गणना की जा सकती है. जेल विरूपण सामान्यतः समान रूप से जेल में फ्लोरोसेंट मार्कर मोती embedding द्वारा मापा जाता है. जेल विकृत रूप में जांच विस्थापित. जेल की सतह के पास जांच के ट्रैक हैं. इन जांच द्वारा रिपोर्ट displacements सतह displacements के रूप में माना जाता है. सतह से उनकी गहराई अनदेखी कर रहे हैं. यह धारणा कर्षण बल के मूल्यांकन में त्रुटि का परिचय. मोती के स्थान में जाना जाने के लिए सेल बलों की सटीक मापन के लिए, यह महत्वपूर्ण है. हम विकसित किया हैसतह से 1.6 माइक्रोन के भीतर पीए जैल में, फ्लोरोसेंट मार्कर मोती, व्यास में 0.1 और 1 माइक्रोन सीमित करने के लिए सरल रसायन विज्ञान का इस्तेमाल करता है कि एक तकनीक,. हम कोट पाली डी lysine (पीडीएल) और फ्लोरोसेंट मोतियों के साथ एक coverslip. पीए जेल समाधान तो coverslip और एक पक्षपाती सतह के बीच sandwiched है. फ्लोरोसेंट मोती इलाज के दौरान जेल समाधान के लिए स्थानांतरण. Polymerization के बाद, पीए जेल जेल सतह के लिए एक विमान बंद पर फ्लोरोसेंट मोती होते हैं.
Introduction
अपने स्थानीय वातावरण के साथ एक बैठक सेल के यांत्रिक बातचीत सामान्यतः पीए जैल का उपयोग कर अध्ययन किया गया है. ये substrates इन substrates के मुख्य लाभ में से 1. एक 1997 में Dembo और वांग द्वारा स्थापित एक सरल, अच्छी तरह से विशेषता प्रोटोकॉल पर भरोसा उनकी कठोरता जेल समाधान के विशिष्ट घटकों की सांद्रता संशोधित करके देखते जा सकता है. यह अलग कठोर के वातावरण के साथ कोशिकाओं 'बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक वांछनीय मंच प्रदान करता है. पीए जैल बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन के साथ लेपित रहे हैं, कोशिकाओं बल पैदा करने, उन्हें का पालन करें. सेल बल का एक परिणाम के रूप में, जेल एक लोचदार शरीर के रूप में विकृत. इस विकृति कोशिकाओं और जेल की लोचदार संपत्तियों से लागू बल के परिमाण पर निर्भर करता है. विभिन्न अध्ययनों से सेलुलर कर्षण बलों की जांच के लिए पीए जैल कार्यरत है.
पीए जेल निर्माण का एक रूपांतर में, फ्लोरोसेंट microspheres (मोती) टी एम्बेडेड रहे हैंअलग कठोर 2 की जैल पर सेल कर्षण बलों यों जेल hroughout. सेल बल आवेदन पर, मोती जेल विरूपण के बाद उनके प्रारंभिक स्थान से विस्थापित. विरूपण क्षेत्र व्यक्तिगत मनका displacements से मापा जाता है. इस विकृति क्षेत्र लोच सिद्धांत और कर्षण बलों की गणना करने के लिए जेल की लोचदार संपत्तियों के साथ उपयोग किया जाता है. इन मापों कोशिकाओं यंत्रवत् भावना और उनके स्थानीय microenvironment 3 के साथ बातचीत के रूप में कैसे अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं.
कई व्यापक रूप से इस्तेमाल पीए जेल निर्माण प्रोटोकॉल में, मोती अपने तरल, unpolymerized राज्य में पीए जेल भर intermixed कर रहे हैं. एक पूरी तरह से polymerized पीए जेल इसकी मात्रा भर फ्लोरोसेंट मोती होते हैं. सेल कर्षण बलों जब कंप्यूटिंग, जेल सतह (सेल सब्सट्रेट अंतरफलक) के पास सबसे मोती निगरानी कर रहे हैं. इन मोतियों की displacements के बल calculatio में सादगी के लिए सेल संस्कृति सतह पर हो ग्रहण कर रहे हैंएन. जेल की गहराई के भीतर मोतियों की वास्तविक स्थान की अवहेलना कर रहा है. हालांकि, एक लोचदार मध्यम में (जैसे पीए जेल के रूप में), बल आवेदन की एक बात करने के लिए करीब एक मनका आगे दूर बिंदु से है कि एक मनका से अधिक कदम होगा. इस प्रकार, सेलुलर tractions की एक मूल्यवान समझना में सतह परिणामों में उस के रूप में सतह से बाहर (मनका स्थान पर) एक बिंदु के विस्थापन का इलाज. त्रुटि की डिग्री सतह से मनका की दूरी पर निर्भर करता है. त्रुटि मनका के स्थान की जानकारी के बिना अनुमान नहीं किया जा सकता.
बहुत सेल संस्कृति सतह के पास मोती सीमित करने के लिए एक सरल विधि के लिए जरूरत कुछ तकनीकों के द्वारा संबोधित किया गया है. एक तरह से बहुत सतह के पास गति को मापने के लिए शीर्ष फोकल हवाई जहाज़ में मोतियों की एक पर्याप्त संख्या में हैं कि इस तरह पूरे जेल भर में मोती के घनत्व को बढ़ाने के लिए है. एक और तकनीक जैसे प्रकाश से उस लाइव सेल इमेजिंग के लिए एक confocal इमेजिंग कक्ष निर्माण शामिलसबसे ऊपरी फोकल हवाई जहाज़ में केवल मोतियों 4 एकत्र किया जाता है. एक अलग तरीका मोती 5 बिना एक पहले से ही polymerized जेल के शीर्ष पर मोती युक्त पीए जेल की एक अत्यंत पतली परत overlaying शामिल है. इन तकनीकों में से प्रत्येक का एक दोष जेल के भीतर मोतियों की सटीक स्थान ज्ञात नहीं है कि है. इस मोती का विस्थापन क्षेत्र, और इस तरह सेल बलों की गणना की गणना में त्रुटि का परिचय. एक और तकनीक sulfo-SANPAH 6 का उपयोग कर एक पहले से ही polymerized पीए जेल के ऊपर की सतह को मोती के विकार शामिल है. इस तकनीक मोती केवल पीए जेल के शीर्ष पर वास्तव में कर रहे हैं सुनिश्चित करता है, लेकिन वे जेल की गहराई में एम्बेडेड रहे हैं किस हद तक अज्ञात है. पहले काम कोशिकाओं बल कई माइक्रोन दूर 7 समझ सकते हैं कि सुझाव दिया गया है के रूप में यह संभवतः, सेल व्यवहार को बदल सकता है जो कोशिकाओं, के लिए एक स्थानीय स्थलाकृति बना सकते हैं. हाल ही में, 1 माइक्रोन व्यास च के साथ पीए जैल patterning के लिए एक तकनीकएक नियमित सरणी में luorescent फ़ाइब्रोनेक्टिन डॉट मार्करों 8 स्थापित किया गया था. इस मामले में, फ्लोरोसेंट मार्कर की गहराई में जाना जाता है, और फ़ाइब्रोनेक्टिन पैटर्न का परोक्ष रूप से जेल सतह पर मुद्रित किया जाता है, के रूप में अनिवार्य रूप से शून्य है. हालांकि, इस पद्धति ईसीएम प्रोटीन 1 माइक्रोन व्यास डॉट्स तक सीमित है के रूप में कोशिकाओं, संलग्न कर सकते हैं जिस पर एक सतत वातावरण प्रदान नहीं करता है. पूरी तरह से बहुत सतह के पास एक ज्ञात स्थान पर पीए जैल के भीतर ट्रैकर मोतियों को एकीकृत करने और उन्हें सीमित करने के लिए एक विधि अभी तक स्थापित किया जाना है.
यहाँ, हम बहुत पीए जेल के भीतर सेल संस्कृति सतह के निकट एक फोकल हवाई जहाज़ को माइक्रोन व्यास फ्लोरोसेंट मोतियों के लिए उप माइक्रोन विवश करने के लिए एक तकनीक का विकास. एक जेल में आम तौर पर दो गिलास प्लेट के बीच unpolymerized तरल जेल समाधान sandwiching से ठीक हो जाता है. जेल दृढ़ता से यह का पालन करता है, ताकि प्लेटों में से एक functionalized है. अन्य unfunctionalized है और जेल इलाज के बाद निकाल दिया जाता है. हम यह हटाने योग्य गिलास सु संशोधितमोतियों की एक परत के साथ यह कोटिंग से rface. Functionalized और मनका लेपित कांच की सतह के बीच तरल जेल sandwiching पर, जेल के लिए मोती स्थानांतरण यह इलाज किया जाता है. यह सतह से 1.6 माइक्रोन के भीतर जेल में मोती 'एकीकरण की दूरी की सीमा. गिलास नीचे पेट्री डिश जेल ठीक हो जाता है, जिस पर पक्षपाती सतह के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं. Polymerization के दौरान एक फ्लैट टॉप जेल सतह के रूप में, एक परिपत्र कांच कवर पर्ची सैंडविच के लिए गिलास नीचे पेट्री डिश के साथ जेल प्रयोग किया जाता है. जेल निर्माण के लिए पहले, शीर्ष गिलास को कवर पर्ची एक सकारात्मक सतह प्रभारी उपज, पाली डी lysine (पीडीएल) के साथ लेपित है. पीडीएल संपीड़ित हवा के साथ उड़ रहा है, और पानी में मोतियों की एक समाधान कवर फिसल जाता है पर जमा किया जाता है. हम एक नकारात्मक चार्ज करना जो carboxylated फ्लोरोसेंट microbeads, उपयोग, और पीडीएल के साथ इलाज के द्वारा बनाई सकारात्मक आरोप लगाया सतह के साथ बातचीत. संपीड़ित हवा की एक परत के साथ coverslip बंद मनका समाधान उड़ाने के बादमोती electrostatically ड्राई कवर पर्ची के लिए युग्मित रहता है. कांच स्लाइड undamaged और पूरी तरह से बरकरार पीए जेल से निकाल दिया है पीडीएल कोटिंग, जेल सतह पर कांच की चिपचिपाहट को प्रभावित नहीं करता.
गिलास नीचे पेट्री डिश में 97% 3 aminopropyl-trimethoxysliane और 0.5% glutaraldehyde के साथ इलाज के द्वारा पक्षपाती बना रहे हैं. वांछित कठोर का पीए जैल एक मानक प्रक्रिया 9 के माध्यम से bisacrylamide और acrylamide का उचित सांद्रता के मिश्रण से बनाया जाता है. जेल समाधान की एक छोटी बूंद गिलास नीचे पेट्री डिश पर pipetted है. मोती युक्त कांच कवर पर्ची सैंडविच के लिए पेट्री डिश के साथ जेल प्रयोग किया जाता है. जेल ठीक हो जाता है, शीर्ष कवर पर्ची सतह से 1.6 माइक्रोन के भीतर पीए जेल में एम्बेडेड मोती छोड़ने हटा दिया जाता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस तकनीक का उपयोग करते हैं, यह मनका समाधान ठीक से पतला है और मोती वांछित व्यास के आधार पर चुना जाता है कि आवश्यक है, पीए जेल सब्सट्रेट कठोरता, और वांछित प्रयोग में पता लगाया है कि घटना के आकार के पैमाने.
<p …Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों अंतःविषय अभिनव पहल कार्यक्रम, इलिनोइस विश्वविद्यालय को स्वीकार करना होगा, 12035 अनुदान. एसके राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (NSF) अनुदान से UIUC में वित्त पोषित किया गया 0965918 IGERT: सेलुलर और आणविक यांत्रिकी और BioNanotechnology में शोधकर्ताओं की अगली पीढ़ी के प्रशिक्षण.
Materials
| Name | Company | Catalog Number |
| Reagents | ||
| 97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES) | Sigma-Aldrich | 281778 |
| 70% Glutaraldehyde | Polysciences, Inc. | 111-30-8 |
| 1M HEPES buffer solution | Sigma-Aldrich | 83264 |
| 40% Acrylamide | Sigma-Aldrich | A4058 |
| 2% Bisacrylamide | Sigma-Aldrich | M1533 |
| 0.1 um Fluorescent microspheres (mCherry) | Invitrogen | F8801 |
| Fibronectin, Human, 1mg | BD Biosciences | 354008 |
| Ammonium Persulfate | Bio-RAD | 161-0700 |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-RAD | 161-0801 |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E |
| 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) | Thermo Scientific | 22980 |
| N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) | Thermo Scientific | 24500 |
| .05% Trypsin-EDTA (1X) | Life Technologies | 25300-054 |
| NaCL | Sigma-Aldrich | S9888 |
| Acrylic Acid | Sigma-Aldrich | 147230 |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 |
| Materials | ||
| 35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass | In Vitro Scientific | D35-14-1-N |
| Glass cover slips, 12 mm diam. | Ted Pella, Inc. | 26023 |
References
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